CN101309933A - 毒素偶联的Eph受体抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及采用与毒素偶联的抗－EphA2或抗－EphA4抗体来诱导癌细胞或其他超增生性细胞的细胞死亡或停滞的组合物和方法。
Description
本申请要求2005年9月7日提交的美国临时专利申请号60/714,362以及2005年11月14日提交的美国临时专利申请号60/735,966的优先权，各申请通过引用纳入本文。
发明领域
[001]本发明提供了采用与毒素偶联的抗-EphA2或抗-EphA4抗体来诱导癌细胞或其他超增生性细胞(hyperproliferative cell)的细胞死亡或停滞的组合物和方法。
发明背景
癌症
[002]赘生物，或肿瘤，是异常的未受控细胞生长导致的赘生物质，它可以是良性或恶性的。良性肿瘤通常保留在原位。恶性肿瘤可统称为癌。术语“恶性的”通常表示所述肿瘤可侵袭或破坏相邻的身体结构并扩散到远端部位从而造成死亡(回顾可见Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，第二版，费城WBS公司(W.B.Saunders Co.，Philadelphia)，第68-122页)。癌症可出现在身体的许多部位，并根据其起源而行为各异。癌性细胞会破坏它们所起源的一部分机体，然后向机体的其他部位扩散并在那里开始新的生长和造成更大破坏。
[003]每年有120万美国人患上癌症。癌症是美国的第二大死因，如果以这种趋势继续发展，预计到2010年癌症将称为第一大死因。肺癌和***癌是美国的头号男性癌症杀手。肺癌和乳腺癌是美国的头号女性癌症杀手。在美国，每两名男性中就有一人将在其生命的某个时刻被诊断出癌症。在美国，每三名女性中就有一人将在其生命的某个时刻被诊断出癌症。目前的治疗方法，如外科手术、化疗和放疗，通常要么无效要么有严重的副作用。
转移
[004]对生命最具威胁的癌症形式通常发生于当一群肿瘤细胞获得向身体的远端和外源部位定居的能力时。这些转移的细胞通过打破通常限制细胞在相异组织中定居的局限性而存活。例如，典型的***上皮细胞如果转移到肺部则通常将无法生长或存活，但肺部转移是造成乳腺癌发病率和死亡率的主要原因。最近的证据暗示，转移性细胞在身体内传播的出现远早于原发性肿瘤的临床表现。在检测出或除去原发性肿瘤之后这些微小转移细胞可保持休眠数月或数年。因此，更好地理解转移性细胞能在外源微环境内生长和存活的机制对于改进设计用于抵御转移性癌症的疗法以及作出早期检测和定位转移的诊断至关重要。
癌细胞信号传导
[005]癌症是一种异常信号转导疾病。异常的细胞信号传导打破了细胞生长和存活的贴壁依赖限制(Rhim等，Critical Reviews in Oncogenesis8：305，1997；Patarca，Critical Reviews in Oncogenesis 7：343，1996；Malik等，Biochimica et Biophysica Acta 1287：73，1996；Cance等，Breast CancerRes Treat 35：105，1995)。酪氨酸激酶活性由ECM贴壁诱导，实际上，酪氨酸激酶的表达或功能在恶性细胞中通常升高(Rhim等，Critical Reviews inOncogenesis 8：305，1997；Cance等，Breast Cancer Res Treat 35：105，1995；Hunter，Cell 88：333，1997)。基于恶性细胞生长必需酪氨酸激酶活性这一事实，酪氨酸激酶已经称为新疗法的靶点(Levitzki等，Science 267：1782，1995；Kondapaka等，Molecular&Cellular Endocrinology 117：53，1996；Fry等，Current Opinion in BioTechnology 6：662，1995)。不幸的是，与特异性靶向肿瘤细胞相关的障碍通常限制了这些药物的应用。具体地说，酪氨酸激酶活性对于良性组织的功能和存活通常至关重要(Levitzki等，Science 267：1782，1995)。为最小化间接毒性，关键是要鉴定然后靶向在肿瘤细胞内选择性过表达的酪氨酸激酶。
受体酪氨酸激酶的Eph家族
[006]受体的Eph家族是受体酪氨酸激酶(RTK)中最大的家族(Gale等，1997，Cell Tissue Research 290(2)：227-241和Dodelet等，2000，Oncogene 19(49)：5614-9)。Eph受体以及它们的膜结合肝配蛋白配体是调节细胞粘附、形状和运动性的细胞-细胞通讯的重要介质。Eph RTK信号传导事件控制胚胎发育的多个方面，尤其是神经***的发育(回顾见Kullander等，2002，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.3：473和Mamling等，2002，Trends Biochem Sci 27：514-520。Eph亚家族的受体通常具有单个激酶结构域以及包含富含Cys结构域和2个纤连蛋白III型重复的胞外区(见图18)。可根据肝配蛋白受体胞外结构域序列的类似性以及它们对肝配蛋白-A和肝配蛋白-B配体的亲和力将它们分成两组。Eph受体的许多成员已被鉴定为癌症发生和进展的重要标记和/或调节物(参见，例如，Thaker等，2004，Clin.Cancer Res.10：5145；Fox BP等，2004，Biochem.Biophys.Res.Commun.318：882；Nakada等，2004，Cancer Res.64：3179；Coffman等，2003，Cancer Res.63：7907；也可回顾见Dodelet等，2000，Oncogene19：5614)。对于已知与癌症有关的Eph受体，EphA2和EphA4的作用和表达模式已被充分表征。
[007]EphA2在成人上皮细胞内表达，发现EphA2在其中水平较低并在细胞-细胞粘附部位富集(Zantek等，1999，Cell Growth&Diff10：629；Lindberg等，1990，Mol&Cell Biol 10：6316)。由于EphA2结合锚定于细胞膜的肝配蛋白A1-A5因此这种亚细胞定位是重要的(EphNomenclature Committee，1997，Cell 90：403；Gale等，1997，Cell&Tissue Res 290：227)。配体结合的主要后果是EphA2的自磷酸化(Lindberg等，1990，同上)。然而，不同于其他受体酪氨酸激酶，EphA2在缺乏配体结合或磷酸酪氨酸内含物时保留酶活性(Zantek等，1999，同上)。EphA2和肝配蛋白-A1在包括乳腺、***、结肠、肺、肾、皮肤和食管癌症在内的许多不同肿瘤的转化细胞内上调(Ogawa等，2000，Oncogene19：6043；Zelinski等，2001，Cancer Res 61：2301；Walker-Daniels等，1999，Prostate41：275；Easty等，1995，Int J Cancer 60：129；Nemoto等，1997，Pathobiology 65：195；Hess等，2001，Cancer Res 61(8)：3250-5)。
[008]EphA4在脑、心、肺、肌肉、肾、胎盘、胰腺(Fox等，1995，Oncogene 10：897)以及黑素细胞(Easty等，1997，Int.J.Cancer 71：1061)中表达。EphA4结合肝配蛋白A1、A2、A3、A4、A5、B2和B3(Pasquale，1997，Curr.Opin.In Cell Biology 9：608)，还结合配体B61、AL 1/RAGS、LERK4、Htk-L和Elk-L3(Martone等，1997，Brain Research 771：238)。配体结合导致EphA4的酪氨酸残基自磷酸化(Ellis等，1996，Oncogene12：1727)。EphA4酪氨酸磷酸化形成含Src同源域2/3(SH2/SH3)的蛋白质结合区，如胞质酪氨酸激酶p59fyn(Ellis等，同上；Cheng等，Cytokine andGrowth Factor Reviews 13：75，2002)。非洲爪蟾胚胎中EphA4的活化导致依赖于钙粘着蛋白的细胞粘附丢失(Winning等，Differentiation 70：46，2002；Cheng等，同上)，这提示了EphA4在肿瘤血管发生中的作用；然而，EphA4在癌症进展中的作用还不清楚。EphA4在乳腺癌、食管癌和胰腺癌中似乎上调(Kuang等，Nucleic Acids Res.26：1116，1998；Meric等，Clinical Cancer Res.8：361，2002；Nemoto等，Pathobiology 65：195，1997；Logsdon等，Cancer Res.63：2649，2003)，但在黑色素瘤组织中下调(Easty等，同上)。
[009]EphB2和EphB4受体在某些肿瘤组织中也过表达。主要发现EphB4在具有高级别恶性-2的浸润性导管型乳腺癌中过表达(Berclaz等，1996，Biochem Biophys Res Commun 226：869)，而EphB2在大多数胃部肿瘤中过表达(Kiynokawa等，1994，Cancer Res 54：3645)。同时，这两种受体在许多肿瘤细胞系中过表达(Berclaz等，同上；Kiynokawa等，同上；Bennett等，1995，PNAS USA92：1866)。EphB2和EphB4在结肠癌组织中都上调(Liu等，2002，Cancer 94：934；Stephenson等，2001，BMC Mol Biol2：15)。此外，EphB2和EphB4对于胚胎以及可能肿瘤的血管发生也是重要的(Wang等，1998，Cell 93：741；Gerety，S.S.等1999Mol Cell 4：403)。
癌症疗法
[010]抗转移药开发的一个瓶颈是用来设计和评价这些药物的试验***。大多数常规癌症疗法靶向正在快速生长的细胞。然而，癌细胞不一定生长得较快，而是它可以在正常细胞不能存活和生长的条件下存活和生长(Lawrence和Steeg，1996，World J.Urol.14：124-130)。正常细胞和恶性细胞行为间的这些基本差异为治疗寻靶提供了机会。微小转移肿瘤已在全身扩散这一范例强调了需要在外源和三维微环境下评价潜在化疗药。许多标准癌症药物试验测量肿瘤细胞在典型细胞培养条件(即，单层生长)下的生长和存活。然而，二维试验中的细胞行为通常不能可靠地预测肿瘤细胞的体内行为。
[011]目前，癌症疗法可包括外科手术、化疗、激素疗法和/或放射治疗以消除患者体内的肿瘤细胞(参见，例如，Stockdale，1998，“癌症患者管理原则”(Principles of Cancer Patient Management)，选自Rubenstein和Federman编的《科学美国：医学》(Scientific American：Medicine)，第3卷，第12章，第IV部分)。所有这些方法对于患者而言都有显著缺点。例如，外科手术可能由于患者的健康问题而无法实施或者不为患者所接受。此外，外科手术可能不能完全除去肿瘤组织。放疗仅当肿瘤组织对于辐射的敏感性高于正常组织时才有效，且放疗也会引发严重的副作用。激素疗法很少单独施用，且尽管有效也只是通常在已经用其他治疗方法除去大部分癌细胞后用来预防或延迟癌症复发。
[012]至于化疗，现在有许多用来治疗癌症的化疗药。大部分癌症化疗方法通过抑制DNA合成发挥作用(参见，例如，Gilman等，《古得曼和吉尔曼：治疗方法的药理学基础》(Goodman and Gilman’s：ThePharmacological Basis of Therapeutics)，第八版(帕加蒙出版社(PergamonPress)，纽约，1990))。照此，化疗药本身是非特异性的。除了几乎所有化疗药都有毒，化疗还会造成显著的且通常危险的副作用，包括严重的恶心、骨髓抑制、免疫抑制等(参见，例如，Stockdale，1998，“癌症患者管理原则”(Principles of Cancer Patient Management)，选自Rubenstein和Federman编的《科学美国人：医学》(Scientific American：Medicine)，第3卷，第12章，第10部分)。此外，即便施用化疗药的组合，许多肿瘤细胞对化疗药具有耐药性或会产生耐药性。
[013]癌症疗法现在还包括生物疗法或免疫疗法。生物疗法/免疫疗法的数量有限，且尽管比化疗药更具特异性但许多仍同时靶向健康细胞和癌性细胞。此外，这种疗法会产生诸如皮疹或肿胀、流感样症状(包括发热、咳嗽或疲劳)、消化道问题或过敏反应之类的副作用。
[014]因此，明显需要有其他癌症治疗方法，尤其需要对靶癌细胞更加特异的治疗方法。Eph受体家族的成员被鉴定为肿瘤细胞标记，这使得它们成为有力的治疗靶点。因此，可特异性寻靶并破坏异常表达Eph受体家族一个或多个成员的肿瘤细胞的癌症治疗方法将是治疗和预防癌症的有力工具。
治疗癌症的抗体
[015]抗体是结合特定抗原的免疫球蛋白。在包括人类和小鼠在内的大多数哺乳动物中，抗体由配对的多肽重链和轻链构成。各链由两个不同的区域构成，成为可变区(Fv)和恒定区(Fc)。轻链和重链Fv区域含有该分子的抗原结合决定簇并负责结合靶抗原。Fc区决定了抗体的类型(或同种型)(例如IgG)并负责结合许多天然蛋白质从而引发重要的生化事件。
[016]抗体的Fc区与包括Fc受体和其他配体在内的许多配体相互作用，赋予一系列称为效应功能的重要功能。IgG类Fc受体的一个重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体和免疫***细胞分支之间的通讯(Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ravetch等，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290)。在人类中，该蛋白质家族包括：FcγRI(CID64)，包括同种型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC；以及FcγRIII(CID16)，包括同种型FcγRIIIA和FcγRIIB(Jefferis等，2002，Immunol Lett 82：57-65)。这些受体通常具有介导与Fc结合的胞外结构域、跨膜区、以及可能介导细胞内的一些信号传导事件的胞内结构域。这些不同的FcγR亚型在不同细胞类型上表达(回顾见Ravetch等，1991，Annu Rev Immunol 9：457-492)。例如，在人类中，发现FcγRIIIB仅在中性白细胞上表达，而发现FcγRIIIA在巨噬细胞、单核细胞、中性杀伤(NK)细胞以及T细胞一个亚群上表达。
[017]Fc/FcγR复合物的形成使效应细胞集中到抗原结合部位，这通常在细胞内导致信号传导事件和重要的后续免疫应答，如释放炎性介质、B细胞激活、胞吞作用、吞噬作用以及细胞毒攻击。介导细胞毒和吞噬效应功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。表达FcγR的非特异性细胞毒细胞识别结合于靶细胞的抗体并随后造成靶细胞溶胞的细胞介导反应称为依赖于抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)(Raghavan等，1996，AnnuRev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetie等，2000，Annu Rev Immunol18：739-766；Ravetch等，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290)。注意，介导ADCC的主要细胞(primary cell)，NK细胞仅表达FcγRIIIA，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII(Ravetch等，1991，同上)。
[018]另一种重要的Fc配体是补体蛋白C1q。结合于C1q的Fc介导称为依赖于补体的细胞毒性(CDC)的过程(回顾见Ward等，1995，TherImmunol 2：77-94)。C1q能够结合6种抗体，尽管结合两种IgG就足以激活补体级联。C1q与C1r与C1s丝氨酸蛋白酶形成复合物从而形成补体途径的C1复合物。
[019]抗体的一些关键特征包括但不限于：对靶的特异性、能够介导免疫效应机制、以及在血清中较长的半衰期，这些使得抗体以及相关免疫球蛋白分子成为有力的治疗方法。许多单克隆抗体目前正处于开发阶段或者已经在治疗上使用以治疗包括癌症在内的各种病症。这些抗体的例子包括：米迪缪尼公司麦迪免疫公司(MedImmune)的Vitaxin
，一种人源化的整联蛋白αvβ3抗体(例如，PCT公开WO 2003/075957)；基因技术公司(Genentech)的赫赛汀(Herceptin)
，一种批准用于治疗乳腺癌的人源化抗-Her2/neu抗体(例如，U.S.5,677,171)；塞图科公司(Centocor)的CNTO 95，一种人整联蛋白αv抗体(PCT公开WO 02/12501)；IDEC/基因技术公司/罗氏公司(IDEC/Genentech/Roche)的Rituxan
，一种批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗-CD20抗体(例如，U.S.5,736,137)；以及免疫克隆公司(ImClone)的Erbitux
，一种抗-EGFR抗体(例如，U.S.4,943,533)。
[020]抗体破坏肿瘤细胞的可能机制有多种，包括通过阻断所需的生长途径来抗增殖、导致凋亡的胞内信号传导、增强受体的下调和/或逆转、ADCC、CDC、以及促进适应性免疫反应(Cragg等，1999，Curr OpinImmunol 11：541-547；Glennie等，2000，Immunol Today 21：403-410)。然而，尽管被广泛使用，在临床使用中还未对抗体进行优化且许多抗体的抗癌潜能并非最佳。因此，明显需要增强抗体破坏靶癌细胞的能力。
抗体-药物偶联物
[021]增强抗体抗肿瘤潜能的一种有效方法涉及将细胞毒药物或毒素与能够被靶细胞内在化的mAb相连。这些试剂分别称为抗体-药物偶联物(ADC)和免疫毒素。当施用于患者之后，ADC和免疫毒素通过它们的抗体部分结合于靶细胞并变得内在化，从而使得药物或毒素能够发挥它们的效力。参见，例如，美国专利申请公开号US2005/0180972A1、US2005/0123536A1。也可参见，例如，Hamblett等，Clin Canc Res，10：7063-7070，1999/10/15，Law等，Clin Canc Res，10：7842-7851，2004/12/01，Francisco等，Neoplasia，102(4)：1458-1465，2003/08/15，Russell等，Clin Canc Res，11：843-852，2005/01/15，Doronina等，Nat Biotech，21(7)：778-784，2003/07，所有文献通过引用全文纳入本文。
[022]文中对参考文献的引用或讨论不能理解为承认它们是本发明的现有技术。
发明概述
[023]本发明提供了一种特异性结合于EphA2的内在化的抗体药物偶联物(ADC)，其中，所述ADC偶联于毒素。本发明还提供了一种ADC，其中，所述ADC包含毒素、自我牺牲性(self-immolative)间隔区和接头。一实施方式中，所述接头是Val-Cit接头。在其他实施方式中，所述毒素是抗-微管蛋白剂。在进一步的实施方式中，所述毒素是奥瑞斯他汀(auristatin)，例如，奥瑞斯他汀E、奥瑞斯他汀F、MMAE或MMAF。
[024]本发明还提供了一种抑制癌细胞生长的方法，该方法包括给予对象药学上有效量的组合物，所述组合物包含(a)本发明的ADC；和(b)药学上可接受的载体。一实施方式中，所述癌细胞是黑色素瘤癌细胞、***癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞或胰腺癌细胞。
[025]本发明还提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括给予对象药学上有效量的组合物，所述组合物包含(a)本发明的ADC；和(b)药学上可接受的载体。再在另一个实施方式中，所述癌症选自黑色素瘤、***癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌和胰腺癌。
定义
[026]文中，术语“激动剂”指包括蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子或小分子(小于10kD)在内的能增强其他分子的活性、激活或功能的任何化合物。EphA2或EphA4激动剂能促进EphA2或EphA4蛋白的磷酸化和降解。识别EphA2或EphA4的EphA2或EphA4抗体还可以抑制或不抑制癌细胞表型(例如，软琼脂中的集落形成或在三维基底膜或胞外基质制品中形成管状网络)，并且相对于非癌细胞可优选结合或不结合暴露于癌细胞的EphA2或EphA4表位，并且可以具有或不具有较低的Koff速率。
[027]文中，术语“免疫特异性结合于Eph受体”及类似术语指特异性结合于至少一种Eph受体或其片段的肽、多肽、蛋白质、融合蛋白和抗体或其片段。术语″免疫特异性″可与术语术语″特异性″替换使用。免疫特异性结合于至少一种Eph受体或其片段的肽、多肽、蛋白质或抗体可以较低亲和力结合其他的肽、多肽或蛋白质，所述亲和力通过例如免疫测定、BIAcore、或本领域已知的其他试验测定。免疫特异性结合于至少一种Eph受体或其片段的抗体或片段可与相关抗原交叉反应。优选地，免疫特异性结合于至少一种Eph受体或其片段的抗体或片段优先结合至少一种Eph受体胜过结合其他抗原。然而，在“免疫特异性结合于Eph受体”的抗体的定义中，本发明具体包括具有多种特异性的抗体(例如，对两种或多种不连续抗原具有特异性的抗体(回顾见Cao等，2003，Adv Drug Deliv Rev 55：171；Hudson等，2003，Nat Med 1：129))。例如，双特异性抗体具有融合在一起的两种不同的结合特异性。在这种最简单的情况中，双特异性抗体将结合单个靶抗原上的两个相邻表位，这样的抗体不会与其他抗原(如上所述)交叉反应。或者，双特异性抗体可结合两种不同抗原。这样的抗体免疫特异性结合于两种不同分子，但不结合其他不相关分子。当提及一种或多种特定复合物时，另一种类型的多特异性抗体可识别多亚基复合物的共享亚基。此外，特异性结合Eph受体的抗体可与相关Eph受体(或RTK)交叉反应。
[028]例如可通过免疫试验、BIAcore或精通本领域的技术人员已知的其他技术来鉴定特异性结合于Eph受体或其片段的抗体或片段。采用诸如(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等实验技术测得，特异性结合于Eph受体或其片段的抗体或其片段结合Eph受体或其片段时的亲和力高于结合任何交叉反应性抗原的亲和力。抗体特异性的讨论可参见，例如，Paul编的《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，第二版，1989，雷温出版社(Raven Press)，纽约，第332-336页。
[029]术语“特异性结合于EphA2或EphA4的抗体或其片段”在文中指特异性结合于EphA2或EphA4多肽或者EphA2或EphA4多肽片段且不特异性结合其他非-EphA2或非-EphA4多肽的抗体或其片段。优选地，特异性结合于EphA2或EphA4多肽或其片段的抗体或片段不与其他抗原发生非特异***叉反应(例如，在合适的免疫试验中，非-EphA2或非-EphA4蛋白如BSA无法与其竞争结合)。例如，可通过免疫试验或精通本领域的技术人员已知的其他技术来鉴定特异性结合于EphA2或EphA4多肽的抗体或片段。本发明的抗体包括但不限于：合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、抗-独特型(抗-Id)抗体、以及上述任何一种的表位-结合片段。具体地说，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合于EphA2或EphA4抗原的抗原结合位点(例如，抗-EphA2或抗-EphA4抗体的一个或多个互补决定区(CDR))的分子。优选地，特异性结合于EphA2或EphA4多肽或其片段的激动抗体或其片段优选结合EphA2或EphA4而不会明显激动其他分子或活性。
[030]文中，术语“癌症”指某种疾病，其所涉及的细胞具有转移至远端部位的潜能和显示不同于非癌细胞的表型性状，所述表型性状例如指能在三维基底物(例如软琼脂)中形成集落或在三维基底膜或胞外基质制品，例如MATRIGELTM中形成管状网络或网状基质。非癌细胞不能在软琼脂中形成集落，也不能在三维基础膜或胞外基质制品中形成清晰的球状结构。癌细胞在其发育过程中获得一系列特征性功能，虽然是通过不同机制。这种功能包括规避凋亡、生长信号的自给自足、对抗-生长信号不敏感、组织侵入/转移能力、无限复制潜能和持久的血管生成。术语“癌细胞”指包括癌前期和恶性癌细胞。
[031]文中，术语“癌细胞表型抑制”指化合物防止或降低软琼脂中的癌细胞集落形成或者在三维基底膜或胞外基质制品或检测到癌细胞表型减少的任何其他方法中管状网络形成的能力，所述其他方法例如检测细胞增殖接触抑制增加的试验(例如，减少单层细胞培养中的集落形成)。当将癌细胞表型抑制化合物加入已经形成癌细胞集落的软琼脂时它还可造成集落减少或消除，或者可降低或消除三维基底膜或胞外基质制品中的管状网络的程度。抑制癌细胞表型的EphA2或EphA4抗体还可以激动或不激动EphA2或EphA4并且可以具有或不具有较低的Koff速率。
[032]文中，术语“递送载体”指可用来将治疗药或预防药施用于对象，尤其是人的物质。递送载体可优先将治疗/预防药递送到特定的细胞亚类。例如，借助递送载体的固有特征或者通过与载体相偶联的部分、包含在其内的部分(或者与载体结合的部分，从而使得该部分和该递送载体维持在一起，进而使得该部分足以靶向递送载体)使递送载体靶向某些类型的细胞，所述部分，例如，通过结合代表所靶向的细胞亚类特征性细胞表面分子而特异性结合特定的细胞亚类。递送载体还可提高要递送的试剂的体内半衰期和/或要递送的试剂的生物利用度。递送载体的非限制性例子是病毒载体、病毒样颗粒、聚阳离子载体、肽载体、脂质体和杂交载体。在具体的实施方式中，所述递送载体不直接偶联于结合EphA2和/或EphA4的部分。在其他实施方式中，所述递送载体不是结合EphA2和/或EphA4的抗体。
[033]文中，术语“衍生物”在蛋白药物(例如，蛋白质、多肽、肽和抗体)的上下文中指含有因引入氨基酸残基取代、缺失和/或添加而改变的氨基酸序列的蛋白药物。术语“衍生物”在文中指，例如但不限于，包含EphA2或EphA4多肽的氨基酸序列的多肽、EphA2或EphA4多肽的片段、特异性结合于EphA2或EphA4多肽的抗体、或特异性结合于EphA2或EphA4多肽的抗体片段，它们已经通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变(即，突变)。一些实施方式中，抗体衍生物或其片段在CDR中包含一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加。与非衍生抗体相比，抗体衍生物可具有基本相同的、更好的或更差的结合能力。在具体的实施方式中，CDR的1、2、3、4或5个残基已被取代、删除或加入(即，被突变)。术语“衍生物”在文中还指经修饰的蛋白药物，即通过将某类型的分子与该蛋白药物共价相连。术语“衍生物”在文中还指，例如但不限于，已经过修饰的EphA2或EphA4多肽，EphA2或EphA4多肽的片段，特异性结合于EphA2或EphA4多肽的抗体，或特异性结合于EphA2或EphA4多肽的抗体片段，即将任何类型的分子共价结合到多肽。例如但不限于，可利用已知的保护/阻断基团、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质连接等而通过例如糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化、衍生化来修饰EphA2或EphA4多肽、EphA2或EphA4多肽的片段、抗体、或抗体片段。可采用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来修饰EphA2或EphA4多肽的衍生物、EphA2或EphA4多肽的片段、抗体、或抗体片段，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，蛋白药物的衍生物可含有一个或多个非典型氨基酸。例如，EphA2或EphA4多肽的衍生物、EphA2或EphA4多肽的片段、抗体、或抗体片段可含有一个或多个非典型氨基酸。一实施方式中，多肽衍生物具有与这里所述的EphA2或EphA4多肽、EphA2或EphA4多肽的片段、抗体、或抗体片段类似或相同的功能。在其他实施方式中，与未改变的多肽相比，EphA2或EphA4多肽的衍生物、EphA2或EphA4多肽的片段、抗体、或抗体片段具有的活性不同。例如，衍生的抗体或其片段可与其表位更牢固地结合或更耐蛋白水解。
[034]术语“表位”在文中指在动物中，优选在哺乳动物中，最优选在小鼠或人类中具有抗原性或免疫原性活性的EphA2或EphA4多肽的部分。具有免疫原性活性的表位是能在动物中引起抗体反应的EphA2或EphA4多肽的部分。具有抗原性活性的表位是通过本领域熟知的任何方法，例如通过免疫试验测得的与抗体特异性结合的EphA2或EphA4多肽的部分。抗原性表位不必是免疫原性的。
[035]文中，术语“EphA2”或“EphA4”指已经由Eph命名委员会(EphNomenclature Committee)(Eph命名委员会，1997，Cell，90：403-404)鉴定并认可的任何Eph受体多肽。在具体的实施方式中，EphA2或EphA4受体多肽或其片段来自任何物种。一实施方式中，EphA2或EphA4受体多肽或其片段来自人。Eph受体多肽的核苷酸和/或氨基酸序列可在文献或公共数据库(例如，GenBank)中找到，或者可采用精通本领域的技术人员已知的克隆和测序技术来测定该核苷酸和/或氨基酸序列。例如，人EphA2的核苷酸和氨基酸序列的GenBank登录号分别为NM_004431.2和NP_004422.2。人EphA4的核苷酸和氨基酸序列的GenBank登录号分别为NM_004438.3和NP_004429.1。
[036]文中，术语“肝配蛋白”或“肝配蛋白配体”指已经或将由Eph命名委员会(Eph命名委员会，1997，Cell，90：403-404)鉴定并认可的任何肝配蛋白配体。本发明的肝配蛋白包括但不限于：肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2和肝配蛋白B3。在具体的实施方式中，肝配蛋白多肽，尤其是肝配蛋白A1，来自任何物种。在其他实施方式中，肝配蛋白多肽，尤其是肝配蛋白A1，来自人。肝配蛋白多肽的核苷酸和/或氨基酸序列可在文献或公共数据库(例如，GenBank)中找到，或者可采用精通本领域的技术人员已知的克隆和测序技术来测定该核苷酸和/或氨基酸序列。例如，人肝配蛋白A1变体1的核苷酸和氨基酸序列的GenBank登录号分别为NM_004428.2和NP_004419.2。人肝配蛋白A1变体2的核苷酸和氨基酸序列的GenBank登录号分别为NM_182685.1和NP_872626.1。
[037]在涉及本文所述多肽时，术语“片段”所包含的肽或多肽的氨基酸序列中含有EphA2或EphA4多肽或特异性结合于EphA2或EphA4多肽的抗体的氨基酸序列中至少5个毗连氨基酸残基、至少10个毗连氨基酸残基、至少15个毗连氨基酸残基、至少20个毗连氨基酸残基、至少25个毗连氨基酸残基、至少40个毗连氨基酸残基、至少50个毗连氨基酸残基、至少60个毗连氨基酸残基、至少70个毗连氨基酸残基、至少80个毗连氨基酸残基、至少90个毗连氨基酸残基、至少100个毗连氨基酸残基、至少125个毗连氨基酸残基、至少150个毗连氨基酸残基、至少175个毗连氨基酸残基、至少200个毗连氨基酸残基、或至少250个毗连氨基酸残基。优选地，抗体片段是表位-结合片段。
[038]文中，术语“人源化抗体”指非人(例如，鼠科)形式的抗体，该抗体含有少量源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者抗体的超变区残基用非人物种，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类抗体(供者抗体)的具有所需特异性、亲和力和结合能力的超变区残基替代。在一些例子中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基可被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可含有在受者抗体或供者抗体中没有的残基。进行这些修饰可进一步优化抗体性能。人源化抗体通常可含有至少一个，通常两个可变结构域的基本上全部(残基)，其中所有或基本上所有的超变区对应于非人免疫球蛋白的，所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的。人源化抗体还将任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，该部分通常是特异性结合于EphA2或EphA4多肽的人免疫球蛋白的一部分，已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变(即，突变)。一些实施方式中，人源化抗体是衍生物。这种人源化抗体在一个或多个非人CDR中包含氨基酸残基取代、缺失或添加。与非衍生的人源化抗体相比，人源化抗体衍生物可具有基本相同的结合能力、更好的结合能力或更差的结合能力。在具体的实施方式中，CDR的1、2、3、4或5个氨基酸残基已被取代、删除或加入(即，突变)。有关人源化抗体的更多细节见欧洲专利号EP 239,400、EP 592,106和EP 519,596；国际公开号WO 91/09967和WO 93/17105；美国专利号5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886和6,407,213；以及Padlan，1991，MolecularImmunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering7(6)：805-814；Roguska等，1994，PNAS 91：969-973；Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-25；Caldas等，2000，Protein Eng.13：353-60；Morea等，2000，Methods 20：267-79；Baca等，1997，J.Biol.Chem.272：10678-84；Roguska等，1996，Protein Eng.9：895-904；Couto等，1995，Cancer Res.55(23Supp)：5973s-5977s；Couto等，1995，Cancer Res.55：1717-22；Sandhu，1994，Gene 150：409-10；Pedersen等，1994，J. Mol.Biol.235：959-73；Jones等，1986，Nature 321：522-525；Reichmann等，1988，Nature 332：323-329；和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
[039]文中，术语“超变区”指抗体中负责与抗原结合的氨基酸残基。超变区包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，国家卫生研究院公共健康服务部(Public Health Service，National Institutes of Health)，马里兰州贝瑟斯达(Bethesda，MD)，1991)和/或“超变环”的残基(即，轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.，196：，901-917)。Eph099B-208.261和Eph099B-233.152的CDR残基列于表2。“框架区”或“FR”残基是除本文所定义的超变区残基以外的可变区残基。
[040]文中，术语“组合”指使用一种以上的疗法(例如，预防和/或治疗药)。使用术语“组合”时对施用于患有超增生性细胞疾病，尤其是癌症的对象的预防和/或治疗药的顺序没有限制。第一种疗剂(例如，预防药或治疗药)可在给已经患有、正患有或易患超增生性细胞疾病，尤其是癌症的对象施用第二种疗剂(例如，预防药或治疗药)之前(例如，1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同时、或之后(例如，1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)施用。所述疗剂(例如，预防药或治疗药)以一定顺序并在一定时间间隔内施用于对象，从而本发明的疗剂可与其他药剂一起发挥作用以提供优于其他施用方法的益处。任何额外疗剂(例如，预防药或治疗药)可以任何顺序与其它额外疗法(例如，预防药或治疗药)一起给予。
[041]文中，术语“低耐受性”指患者遭受治疗副作用而使得其因不良作用和/或有害副作用超过治疗益处而未从治疗中获益和/或停止治疗的状态。
[042]文中，术语“控制”、“控制的”和“控制方法”指对象从施用疗剂(例如，预防药或治疗药)中获得有益作用，但未导致治愈该疾病。在某些实施方式中，给对象施用一种或多种疗剂(例如，预防药或治疗药)来“控制”疾病，从而防止该疾病进展或恶化。
[043]文中，术语“无反应的/难治的”描述用一种或多种目前可用的疗法(例如，癌症治疗)，例如化疗、放疗、外科手术、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法，特别是特定癌症的标准治疗方案治疗患者时，所述疗法在临床上不足以治疗这些患者，例如对治疗保持不敏感，从而使得他们需要其它有效的治疗。该短语也可描述患者对疗法虽有反应，但受到副作用、复发、产生耐药性等。在各种实施方式中，“无反应的/难治的”表示至少明显有一部分的癌细胞未被杀死或者未能停止它们的细胞分化。文中利用“难治的”在本领域可接受的含义，通过本领域已知的任何方法在体内或体外测定癌细胞是否为“无反应的/难治的”来检验治疗对癌细胞的效果。在各种实施方式中，当治疗期间癌细胞数目未明显减少，或增加时，癌症是“无反应的/难治的”。
[044]文中，术语“增强”指以常规或批准的剂量应用时治疗药的效力提高。
[045]文中，术语“预防”和“防止”指通过施用本发明的疗剂(例如，预防药或治疗药)防止疾病的发生、复发或扩散。
[046]文中，术语“预防药”指可用来防止与EphA2或EphA4过表达相关的疾病或病症和/或细胞超增生性疾病，尤其是癌症的发作、复发或扩散的任何药剂。在具体的实施方式中，术语“预防药”指包含治疗或预防有效量的以下组分的任何组合物：(a)偶联于(或通过其他方式相连)结合EphA2和/或EphA4的部分的递送载体；(b)一种或多种治疗或预防所述超增生性疾病的治疗或预防药；和(c)药学上可接受的载体。在某些实施方式中，术语“预防药”指EphA2或EphA4激动抗体、EphA2或EphA4癌细胞表型抑制抗体、暴露的EphA2或EphA4表位抗体、或以小于3×10-3s-1的Koff结合EphA2或EphA4的抗体(例如，Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA44、或表2-4或6中所列的任何抗体)。在具体的实施方式中，用于本发明组合物和方法的EphA4激动抗体是EA44，这是一种披露于2004年6月7日提交的美国非临时申请序列号10/863,729的抗-EphA4scFV抗体，该申请通过引用全文纳入本文。表达抗-EphA4scFv EA44的细胞已经按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedures)的规定于2004年6月4日保藏于美国模式培养物保藏所(邮政信箱1549，马纳萨斯，弗吉尼亚州20108)，其指定的登录号为PTA-6044。在某些其他实施方式中，术语“预防药”指癌症化疗、放疗、激素疗法、生物疗法(例如，免疫疗法)和/或本发明的EphA2或EphA4抗体。在其他实施方式中，一种以上的预防药可组合给予。
[047]文中，“预防有效量”指疗剂(例如，预防药)的用量足以防止细胞超增生性疾病，优选癌症的发作、复发或扩散。预防有效量也可指疗剂(例如，预防药)的用量足以预防超增生性疾病，尤指癌症的发作、复发或扩散，包括但不限于有超增生性疾病倾向的那些(对象)，例如在遗传上有癌症倾向或之前接触过致癌物的那些(对象)。预防有效量也可指疗剂(例如，预防药)的用量对于预防超增生性疾病可提供预防益处。此外，就本发明的预防药而言，预防有效量指单独的或与其他药剂组合的预防药的用量在预防超增生性疾病时可提供预防益处。与一定用量的本发明EphA2或EphA4抗体的联用时，该术语可包括能改善总体预防效果或能增强另一疗剂(例如，预防药)的预防效力或与之协同作用的用量。
[048]文中，“方案”包括给药时间表和给药方案。
[049]文中，术语“副作用”包括预防药或治疗药的有害和不良影响。不良影响常常是不希望的，但不希望的影响不一定是不良的。预防药或治疗药的不良影响可能是有害的或不适的或危险的。化疗的副作用包括但不限于：胃肠毒性，例如但不限于早期和晚期腹泻和肠胃胀气、恶心、呕吐、食欲不振、白细胞减少、贫血、嗜中性白细胞减少、虚弱、腹部痉挛、发热、疼痛、体重丧失、脱水、脱发、失眠、呼吸困难、眩晕、粘膜炎、口干燥症和肾脏衰竭、以及便秘，对神经和肌肉的影响，对肾脏和膀胱的暂时性或永久性损伤，流感样症状，体液潴留和暂时性或永久性不育。放疗的副作用包括但不限于：疲倦、口干和丧失食欲。生物疗法/免疫疗法的副作用包括但不限于：给药部位发生皮疹或肿胀，流感样症状，例如发热、寒颤和疲倦，消化道问题和过敏反应。激素疗法的副作用包括但不限于：恶心、生育问题、抑郁、丧失食欲、眼睛问题、头痛和体重波动。本领域已知患者通常会经历很多其它不良作用。许多不良作用描述于《医师案头参考》(Physicians’Desk Reference)，(第58版，2004)。
[050]文中，术语“单链Fv”或“scFv”指包含抗体VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于一条多肽链中。Fv多肽一般在VH和VL结构域之间还含有能使scFv形成抗原结合所需结构的多肽接头。scFv的综述见Pluckthun，刊于Rosenburg和Moore编的《单克隆抗体的药理学》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，斯普林格韦格出版社(Springer-Verlag)，纽约，第269-315页，1994。在具体的实施方式中，scFv包括双特异性scFv和人源化scFv。
[051]文中，术语“对象”和“患者”可互换使用。
[052]文中，对象优选是哺乳动物，如非灵长类(例如，奶牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如，猴和人)，最优选人。
[053]文中，术语“寻靶部分”或“结合部分”指当连接于其他试剂(如递送载体或其他化合物)时能增强该试剂向靶组织或具有相同特性的细胞亚类运送，从而提高该试剂在靶组织或细胞亚类中或周围的局部浓度的任何部分。例如，寻靶部分可结合靶组织或细胞亚类中部分或所有细胞表面的分子。在具体的实施方式中，寻靶部分结合EphA2或EphA4。在其他实施方式中，寻靶部分结合癌细胞上的EphA2或EphA4(例如，未结合于配体的EphA2或EphA4)而不结合非癌细胞上的EphA2或EphA4(例如，结合于配体的EphA2或EphA4)。
[054]文中，术语“治疗”、“治疗的”和“治疗方法”指因给予一种或多种治疗药而根除、减轻或缓解了疾病或病症的症状，特别是根除、去除、改进或控制了原发性、区域性或转移性癌症组织。在某些实施方式中，这种术语指因给予患这种疾病的对象一种或多种疗剂(例如，预防药或治疗药)而尽可能降低或延缓了癌症的扩散。
[055]文中，术语“治疗药”指可用来预防、治疗或控制与EphA2或EphA4过表达相关的疾病或病症和/或细胞超增生性疾病或病症，尤其是癌症。在具体的实施方式中，术语“治疗药”指包含治疗或预防有效量的以下组分的任何组合物：(a)偶联于(或通过其他方式相连)结合EphA2和/或EphA4的部分的递送载体；(b)一种或多种治疗或预防所述超增生性疾病的治疗或预防药；和(c)药学上可接受的载体。在某些实施方式中，术语“治疗药”指EphA2或EphA4激动抗体、EphA2或EphA4癌细胞表型抑制抗体、暴露的EphA2或EphA4表位抗体、或以小于3×10-3s-1的Koff结合EphA2或EphA4的抗体(例如，Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA44、或表2-4或6中所列的任何抗体)。在某些其他实施方式中，术语“治疗药”指癌症化疗剂、放疗剂、激素疗剂、生物疗剂/免疫疗剂和/或本发明的EphA2或EphA4抗体。在其他实施方式中，一种以上的治疗药可组合给予。
[056]文中，“治疗有效量”指疗剂(例如，治疗药)的用量足以治疗或控制与EphA2或EphA4过表达相关的疾病或病症和/或细胞超增生性疾病，优选地，该用量足以破坏、改变、控制或除去原发性、区域性或转移性癌症组织。治疗有效量也可指疗剂(例如，治疗药)的用量足以延迟或尽可能降低超增生性疾病的发作，例如，延迟或尽可能降低癌症的扩散。治疗有效量也可指疗剂(例如，治疗药)的用量在治疗或控制癌症时能提供治疗益处。此外，本发明疗剂(例如，治疗药)的治疗有效量指单独的或与其他疗剂组合的治疗药的用量在治疗或控制超增生性疾病时可提供治疗益处。与一定用量的本发明EphA2或EphA4抗体联用时，该术语可包括能改善总体治疗效果、减轻或避免不希望的反应，或能增强另一疗剂(例如，治疗药)的治疗效力或与之协同作用的用量。
[057]文中，术语“疗法”指可用于预防、治疗、控制或改善超增生性疾病的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方式中，术语“疗法”指精通本领域的技术人员如医务人员已知可用于治疗、控制、预防或改善超增生性疾病或该疾病的一种或多种症状的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法。
[058]应理解，本文所称的互补决定区(CDR)残基编号是Kabat等(1991，NIH出版物91-3242，国家技术信息服务部(National TechnicalInformation Service)，弗吉尼亚州斯平费尔德(Springfield，VA))的编号。具体地说，残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)位于轻链可变区，31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)位于重链可变区。注意到抗体与抗体之间差异很大(凭借定义不能显示与Kabat共有序列的同源性)。框架残基的最大比对常需要将“空位”残基***用于Fv区的编号***中。应该知道本文所称的CDR如Kabat等(同上)定义的。此外，处于任何给定Kabat位点编号的某些单个残基的身份在抗体链与抗体链之间可能因物种间或等位基因趋异性(allelic divergence)而不同。
[059]当某术语有两种或多种定义为本领域所采用和/或接受时，除非另有说明，文中的术语定义将包括所有这些含义。一个具体的例子是，采用术语″CDR″来描述在多肽的重链和轻链可变区中发现的非连续抗原结合位点。这种特定区域已由Kabat等(1991，NIH出版物91-3242，国家技术信息服务部，弗吉尼亚州斯平费尔德)和Chothia等(1987，J.Mol.Biol.196：901-17)及MacCallum等(1996，J.Mol.Biol.262：732-45)描述，将它们分别通过引用纳入本文，当将它们相互比较时该定义将包括氨基酸残基的重叠或亚类。尽管如此，采用任何一种定义来表示抗体或其变体的CDR都包括在如文中所定义和使用的术语的范围之内。包含如上文引用的各参考文献所定义CDR的合适氨基酸残基列于下表1以示比较。包含特定CDR的准确残基数将根据CDR的序列和大小而不同。
[060]那些精通本领域的技术人员可按照常规确定哪个残基包含了抗体可变区氨基酸序列中的特定CDR。
表1：CDR的界定
Kabat 1 Chothia 2 MacCallum 3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL，CDR3 89-97 91-96 89-96
1按照Kabat等(同上)的命名法对残基编号
2按照Chothia等(同上)的命名法对残基编号
3按照MacCallum等(同上)的命名法对残基编号
附图简述
[061]为阐述本发明，在图中描绘了本发明的某些实施方式。然而，本发明不限于图中所述实施方式的准确配置和手段。
[062]图1。各种抗-EphA2和抗-EphA4抗体的轻链氨基酸序列。
[063]图2。各种抗-EphA2和EphA4抗体的重链氨基酸序列。
[064]图3。抗-EphA2抗体G5和3F2的可变链氨基酸序列。
[065]图4。抗-EphA2抗体EA2、4H5和10D9的可变链氨基酸序列。
[066]图5。抗-Eph抗体GEA44各种亲和力-成熟形式的可变重链(VH)和轻链(VL)的氨基酸序列。以下抗体重链的氨基酸序列列于该图的上半部：GEA44、1A4、1B10、1D11、1G11、2C9、3A12、3C6、6B7、6B4和11H1(SEQ ID No分别为115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135)。以下抗体轻链的氨基酸序列列于该图的下半部：GEA44、1A4、1B10、1D11、1G11、2C9、3A12、3C6、6B7、6B4和11H1(SEQ ID No分别为116、117、120、122、124、126、128、130、132、134和136)。框中的序列部分表示CDR(Kabat定义)。
[067]图6。泛(pan)-Eph抗体10C12(GEA10C12)可变重链(VH)和可变轻链(VL)的核苷酸和氨基酸序列。可变区重链核苷酸和氨基酸序列列于该图的上半部(SEQ ID No分别为141和140)；可变区轻链核苷酸和氨基酸序列列于该图的下半部(SEQ ID No分别为142和141)。
[068]图7A-7B。各种噬菌体衍生的抗-EphA2抗体可变重链(VH)和轻链(VL)的氨基酸序列和比对。以下抗体重链的氨基酸序列和比对列于图7A：5A8、1C1、1D3、1F12、1H3、2B12(SEQ ID No.分别为53、3、33、13、23和43)。以下抗体轻链的氨基酸序列和比对列于图7B：5A8、1C1、1D3、1F12、1H3、2B12(SEQ ID No.分别为54、4、34、14、24和43)。框中的序列部分表示CDR(Kabat定义)。
[069]图8。抗-EphA2抗体1C1的核酸序列和氨基酸可变区序列(SEQ ID No.1-4)。
[070]图9。抗-EphA2抗体1F12的核酸序列和氨基酸可变区序列(SEQ ID No.11-14)。
[071]图10。抗-EphA2抗体1H3的核酸序列和氨基酸可变区序列(SEQ ID No.21-24)。
[072]图11。抗-EphA2抗体1D3的核酸序列和氨基酸可变区序列(SEQ ID No.31-34)。
[073]图12。抗-EphA2抗体2B12的核酸序列和氨基酸可变区序列(SEQ ID No.41-44)。
[074]图13。抗-EphA2抗体5A8的核酸序列和氨基酸可变区序列(SEQ ID No.51-54)。
[075]图14。抗-EphA2抗体1C1、1F12、1H3、1D3、2B12和5A8恒定区(重链或κ轻链)的核酸序列和氨基酸序列(SEQ ID No.111-114)。
[076]图15A-15B。通过流式细胞术分析比较各种抗-EphA2抗体与各种细胞系的细胞表面结合。图14A比较了抗体1C1、1F12、1H3和3F2在以下细胞系上的结合：A549、Hey-A8、PC3、KC-231、Panc-02.03、SK Mel-28、ACHN、498、D-145、HT-29、SKOV-3和SW-480。图14B比较了抗体1C1、1F12和3F2在以下细胞系上的结合：Balb/3T3、NIH/3T3、CT26、F98、RG2、YPEN。
[077]图16。几种不同抗-EphA2抗体内在化的比较。在MCF-10A细胞系中比较抗-EphA2抗体B233、EA5和B208与对照的内在化。
[078]图17。几种不同抗-EphA2抗体内在化的比较。在以下细胞系中比较抗-EphA2抗体B233、B208、EA2、G5、3F2、1C1、C2、3B2与对照的内在化：PC3、SK Mel-28、HuVec、MCF10A和CT26。
[079]图18。通过免疫荧光证实抗-EphA2抗体G5的内在化。PC3细胞用人α-EphA2mAb(G5；图A和B)或R347同种型对照(图C)标记。然后将细胞在生长条件下培养0(未内在化：图A和C)或60分钟(内在化：图B)以使附于细胞表面的抗体内在化。然后将所有细胞固定(4％甲醛)、透化处理(0.5％Triton X-100)并用AlexaFluor 488-Ab染色，然后加入抗褪色固定培养基并进行荧光显微镜检测。图B证实了G5抗-EphA2抗体的内在化。
[080]图19A-19C。通过免疫荧光证实抗-EphA2抗体1C1(图18A)、1F12(图18B)和3F2(图18C)在HuVec细胞上内在化。
[081]图20。通过免疫荧光证实抗-EphA2抗体1C1和1F12在Ct-26和PC-3细胞上内在化。
[082]图21。在以下细胞系内证实抗-EphA2抗体1C1和1F12能使EphA2磷酸化：CT26、4T1、F98、YPEN1、PC3和ES2。
[083]图22。在HuVec细胞中证实抗-EphA2抗体1C1、1F12和3F2能使EphA2磷酸化。
[084]图23。该图总结了各种抗-EphA2抗体(1C1、1F12、1H3、1D3、2B12和5A8)的特性(活化、内在化和组织交叉反应性(TCR))。
[085]图24。该图总结了抗-EphA2抗体1C1和1F12对受体Eph家族不同鼠科成员的特异性。1C1证实能特异性结合鼠EphA2和4。1F12被证实能结合鼠EphA2、3、4、5、6、7和8，同时还能结合鼠EphB1和2。
[086]图25。显示了单甲基奥瑞斯他汀E的化学结构，包括间隔区部分和VC接头。
[087]图26。显示了单甲基奥瑞斯他汀F的化学结构，包括间隔区部分和VC接头。
[088]图27。显示了单甲基奥瑞斯他汀E和F的化学结构，包括间隔区部分和两个不同接头(缬氨酸-瓜氨酸和马来酰亚胺己酰基-瓜氨酸)。
[089]图28。ADC的偶联。该图显示了典型抗-EphA2抗体的偶联。每个抗体分子通过合适的肽接头平均偶联4个药物接头(Hamblett等，Clinical Cancer Research 2004)。
[090]图29。抗-EphA2抗体与mcMMAF的偶联。该图总结了mcMMAF偶联的1C1、1F12和1H3抗体的产量(mg)和其他特性(％聚合和内毒素浓度)。
[091]图30。含抗-EphA2抗体的不同接头和药物组合对几种不同癌细胞系的体外生长抑制的比较。在SKMEL、PC-3和MDA231细胞系中将偶联于vcMMAF的抗-EphA2抗体G5与偶联于vcMMAE、vcMMAF或mcMMAF的抗-EphA2抗体3F2进行比较。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于3幅不同的图中。
[092]图31。与连接于MMAF的对照1A7抗体相比，连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体EA5的体外生长抑制。测试了以下细胞系：A549、MDA231和A375。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于4幅不同的图中。
[093]图32A-32C。与连接于MMAF的对照1A7抗体、无MMAF的EA5、竞争中的EA5和游离MMAE相比，连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体EA5的体外生长抑制。测试了以下细胞系：MDA231(图32A)、A549(图32B)和A375(图32C)。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。
[094]图33。与连接于MMAF的对照1A7抗体、竞争中的EA5和游离MMAE相比，连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体EA5的体外生长抑制。测试了以下细胞系：HCT-116和SW620。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于2幅不同的图中。
[095]图34。与连接于MMAF的对照1A7抗体、单独的EA5、竞争中的EA5和游离MMAE相比，连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体EA5对MDA-231细胞的体外生长抑制。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于2幅不同的图中。
[096]图35。与连接于MMAF的对照1A7抗体、竞争中的G5和游离MMAE相比，连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体G5对PC-3细胞和MDA-MB-468细胞的体外生长抑制。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于4幅不同的图中。
[097]图36。连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体G5和EA5对A498细胞、PC-3细胞和MDA-MB-468细胞的体外生长抑制。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于3幅不同的图中。
[098]图37。与连接于MMAF的对照R3-47对照抗体、竞争中的G5和单独的G5相比，连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体G5对PC-3细胞、231KC细胞和T-231细胞的体外生长抑制。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于4幅不同的图中。
[099]图38。与竞争中的3F2和游离MMAE相比，抗-EphA2抗体G5vcMMAF、3F2vcMMAF、3F2vcMMAE对正常HuVEC细胞的体外生长抑制。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。结果总结于2幅不同的图中。
[0100]图39。与连接于MMAF的对照R3-47抗体、竞争中的G5和游离MMAE相比，连接于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体G5对PC-3细胞的体外生长抑制。测试的浓度范围为0.001-100μg/ml。
[0101]图40。用偶联于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2抗体G5体外测试的细胞系的总结。
[0102]图41。从一组不同的EphA2阳性细胞系测定的抗-EphA2抗体G5的平均IC50值(μg/ml)。该IC50值由在细胞系上进行的体外生长抑制试验外推得到。
[0103]图42。从一组不同的EphA2阳性细胞系测定的抗-EphA2抗体3F2vcMMAE和3F2mcMMAF的IC50值。该IC50值由在细胞系上进行的体外生长抑制试验外推得到。按照EphA2表达水平由高到低排序，测试的细胞系如下：HEY-A8、PANC.02.03、KC231、PC3、DU-145、ACHN、A498、A549、SKMEL28。
[0104]图43A-43B。从一组不同的EphA2阳性人癌细胞系测定的抗-EphA2抗体3F2mcMMAF、1C1mcMMAF和1F12mcMMAF的IC50值。该IC50值由在细胞系上进行的体外生长抑制试验外推得到。测试的细胞系如下：PC3、KC231、SKOV3和HEY-A8。图44B显示了体内施用可接受的IC50浓度。
[0105]图44。与游离MMAE相比，连接于带有mf接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1、1F12和3F2对MCF10-A和HuVec细胞的体外生长抑制。另一幅图中还总结了EphA2在HUVEC和MCF10-A细胞表面表达以及测试抗体与表面表达的EphA2的结合。
[0106]图45。连接于带有mf接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1、1F12和3F2与竞争中的相同抗体(包括它们未连接的相应抗体)对PC-3细胞的体外生长抑制的比较。测试的浓度范围为0.001-10μg/cc。
[0107]图46。连接于带有mf接头的MMAF以及连接于带有vc接头的MMAE的抗-EphA2抗体1C1和1F12对KC-231和PC3细胞的体外生长抑制。在该组实验中比较了不同批次的偶联抗体。测试的浓度范围为0.001-100μg/cc。
[0108]图47。抗-EphA2ADC的1C1和1F12在EphA2+细胞系中的交叉物种活性。在以下细胞内比较连接于带有mc接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1和1F12和连接于带有mc接头的MMAF的对照R347抗体：F98(大鼠胶质瘤)、PC3(人***癌)、CT26(小鼠结肠癌)和CYNO-MK。测试的浓度范围为0.001-10μg/cc。
[0109]图48。在PC-3人***癌细胞系中体内比较偶联于带有vc接头的MMAF的抗-EphA2G5抗体与未偶联的G5、偶联于MMAF的对照IgG和未偶联的对照IgG。抗体的剂量为20μg和200μg。
[0110]图49。在MDA-MB-231KC人乳腺癌细胞系中体内比较偶联于带有vc接头的MMAF抗-EphA2G5抗体与偶联于MMAF的对照IgG。抗体的剂量为20μg、50μg和100μg。
[0111]图50。在PC3人***癌细胞系中体内比较偶联于带有vc接头的MMAF或带有mc接头的MMAF的抗-EphA2G5抗体与偶联于MMAF的对照IgG和偶联及未偶联的对照R347。抗体的剂量为20μg和200μg。
[0112]图51。在PC-3人***癌细胞系中体内比较偶联于带有vc接头的MMAF的抗-EphA23F2抗体和偶联于带有mc接头的MMAF的抗-EphA23F2抗体与偶联于MMAE或MMAF的对照R347及PBS。对于MMAE偶联物，抗体剂量为3mg/kg(60μg)，对于MMAF，抗体剂量为10mg/kg(200μg)。
[0113]图52。在PC-3人***癌细胞系中体内比较偶联于带有mc接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1和1F12与偶联于MMAF的对照R347及PBS。抗体剂量为3mg/kg(60μg)或1mg/kg(20μg)。
[0114]图53A-53C。在PC-3人***癌细胞系中体内比较偶联于带有vc接头的MMAF或偶联于带有mc接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1和1F12与PBS。抗体剂量为6.0mg/kg(图54A)、3.0mg/kg(图54B)和1.0mg/kg(图54C)。
[0115]图54。在MDA-231KC人乳腺癌细胞系中体内比较偶联于带有mc接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1和1F12与PBS、偶联于MMAF的对照R347及未偶联的抗-EphA2抗体3F2-3M。抗体剂量为1mg/kg(20μg)、3mg/kg(60μg)、6mg/kg(120μg)或10mg/kg(200μg)。
[0116]图55。在MDA-231KC人乳腺癌细胞系中体内比较偶联于带有vc接头的MMAE或偶联于带有mc接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1和1F12与PBS。抗体剂量为1mg/kg(20μg)或6mg/kg(120μg)。
[0117]图56A-56C。在MDA-231KC人乳腺癌细胞系中体内比较偶联于带有vc接头的MMAE或偶联于带有mc接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1和1F12与PBS。抗体的剂量为6.0mg/kg(图57A)、3.0mg/kg(图57B)和1.0mg/kg(图57C)。
[0118]图57。游离MMAE药物的生长抑制。检测了一些不同的小鼠、大鼠、人和猴细胞系在体外对游离MMAE的灵敏度，并总结了得到的IC50(μM)。
[0119]图58。以Balb/c小鼠的体重损失来测量的抗-EphA2ADC的毒性。在体内测试了偶联于带有vc接头的MMAE或偶联于带有mc接头的MMAF的抗-EphA2抗体1C1和1F12以确定相比于施用对照PBS，施药对小鼠体重的影响。vcMMAE抗体的剂量为40mg/kg、50mg/kg和60mg/kg。1C1-mcMMAF抗体的剂量为120mg/kg、180mg/kg和240mg/kg。1F12-mcMMAF抗体的剂量为90mg/kg、120mg/kg、180mg/kg、210mg/kg和240mg/kg。
[0120]图59。抗-EphA2ADC的治疗窗(therapeutic window)。该图总结了基于体外和体内数据观察的1C1-mcMMAF、1C1-vcMMAE、1F12-mcMMAF和1F12-vcMMAE的潜在治疗窗。
发明详述
[0121]受体酪氨酸激酶(RTK)是将信号从胞外环境传入细胞质的跨膜分子。RTK的Eph家族是RTK最大的亚家族。该组以富含半胱氨酸的区域和胞外结构域内的两个III型纤连蛋白重复为特征。Eph受体由细胞表面锚定蛋白的第二个家族-肝配蛋白激活。Eph酪氨酸激酶和肝配蛋白配体的成员都介导受体-配体相互作用之后的信号传导(Bruckner等，1997，Science 275：1640；Holland等，1996，Nature 383：722)。已知这种双向信号传导会影响涉及细胞相互作用的过程，如细胞粘附、细胞迁移和组织边界形成(Boyd等，2001 Sci STKE RE20；Schmucher等，2001，Cell 105：701-4；Kullander等，2002Nat.Rev.Mol.Cell Biol.3：475)。最近已将Eph受体与癌症的发生和进展相关联。
[0122]作为细胞表面分子，Eph受体是抗体定向疗法的易接触的靶分子。例如，在过表达EphA2的肿瘤细胞中，存在的表面受体增加导致不稳定的细胞-细胞接触，这会破坏细胞周期调节并导致肿瘤细胞生长、增殖和侵袭。抗Eph受体家族不同成员(例如EphA2)的裸露抗体已通过受体的磷酸化、内在化和降解而显示出激动剂活性(参见，例如，美国专利号6,927,203，美国临时申请号60/717,209，美国专利申请公开号US2006/0121042-A1，美国专利申请号09/952,560，10/994,129，10/436,782，10/863,729和11/203,251，各专利通过引用全文纳入本文)。一实施方式中，本发明ADC是特异性结合至少一种Eph受体的抗体的变体。本发明ADC特异性结合的Eph受体包括但不限于EphA1、EphA2、EphA3a、EphA3b、EphA4、EphA5a、EphA5b、EphA6、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2a、EphB2b、EphB3、EphB4和EphB6。
[0123]熟练的技术人员将了解，本发明的Eph受体是与已知Eph受体有相当程度同源性的分子(参见，例如，同上)，从而根据其氨基酸序列已经或者可以将其归类为Eph受体家族分子。采用MegaAlign程序(DNASTAR)用Clustal W算法进行已知的人Eph受体的成对比较(Thompson等，1994 Nucleic Acids Res 22：4673-80)。结果(图18)显示，在Eph受体家族成员中，每个蛋白质在多个区域具有高度的类似性。尤其可以预计，精通本领域的技术人员能够产生Eph受体若干区域的抗体，从而允许所述抗体在家族成员之间发生交叉反应或具有更加局限的特异性，使得所述抗体仅以高亲和力特异性结合一个家族成员。为鉴定用于产生蛋白质特异性或结合一种或多种Eph受体的抗体的潜在免疫原性肽，可采用Protean程序(DNASTAR)以Jameson-Wolf算法检测各蛋白质的抗原性指数。可以鉴定Eph受体家族所有成员中抗原性指数最高的区域而在一个或多个家族成员当中高度保守的那些区域将是获得识别一种以上家族成员的抗体的极好候选对象。而采用不太保守的区域将可能产生对一种Eph受体家族成员特异的抗体。
[0124]一实施方式中，本发明ADC优选结合肿瘤细胞上存在的Eph受体且不结合非肿瘤细胞上存在的Eph受体。在其他实施方式中，本发明ADC不染色正常组织，所述正常组织包括但不限于：脑、肺、胰腺、肝脏、***、心、卵巢、皮肤、肾、肠和胃。采用本领域熟知的免疫标记方法容易鉴定抗体的结合和特定染色方式，这些方法包括但不限于：免疫组织化学和荧光激活细胞扫描/分选(FACS)。具体的方法和策略可在Polak和Van Noorden的《免疫组织化学介绍》(Introduction to Immunocytochemistry)，第二版(1997)，纽约斯普林格韦格出版社(Springer Verlag，N.Y.)、Haugland的《荧光探针和研究化学物质手册》(Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals)，第九版(2004)以及俄勒冈州尤金分子探针公司(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg)出版的综合手册和目录等中找到。
[0125]在其他实施方式中，本发明ADC是特异性结合EphA2和/或EphA4的抗体的变体、它们的衍生物、类似物和表位-结合片段，例如但不限于：本文和PCT公开号WO 04/014292、WO 03/094859和美国专利申请序列号10/863,729中披露的那些，各文献通过引用全文纳入本文，以及列于表2-4、6或图1-59中的任何抗体。在具体的实施方式中，本发明ADC是特异性结合EphA2和/或EphA4的抗体，其包括12G3H11和/或3F2和/或12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8和/或表2-4或6或图1-59中所列的任何抗体的全部或部分可变区(例如，一个或多个CDR)。
[0126]本发明还包括对至少一种Eph受体具有高结合亲和力的本发明ADC的应用。在具体的实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体的本发明ADC的结合速率常数或kon速率((Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为：至少105M-1s-1、至少5×105M-s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、或至少108M-1s-1。在进一步的具体的实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体的本发明ADC的结合速率常数或kon速率((Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为：至少约105M-1s-1、至少约5×105M-s-1、至少约106M-1s-1、至少约5×106M-1s-1、至少约107M-1s-1、至少约5×107M-1s-1、或至少约108M-1s-1。在其他实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体的ADC的kon为：至少2×105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、或至少108M-1s-1。在进一步的实施方式中，特异性结合至少一种Eph受体的ADC的kon为：至少约2×105M-1s-1、至少约5×105M-1s-1、至少约106M-1s-1、至少约5×106M-1s-1、至少约107M-1s-1、至少约5×107M-1s-1、或至少约108M-1s-1。
[0127]在其他实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的本发明ADC的Koff速率((Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)为：小于10-1s-1，小于5×10-1s-1，小于10-2s-1，小于5×10-2s-1，小于10-3s-1，小于5×10-3s-1，小于10-4s-1，小于5×10-4s-1，小于10-5s-1，小于5×10-5s-1，小于10-6s-1，小于5×10-6s-1，小于10-7s-1，小于5×10-7s-1，小于10-8s-1，小于5×10-8s-1，小于10-9s-1，小于5×10-9s-1，或小于10-10-1s-1。再在其他实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的本发明ADC的Koff速率((Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)为：小于约10-1s-1，小于约5×10-1s-1，小于约10-2s-1，小于约5×10-2s-1，小于约10-3s-1，小于约5×10-3s-1，小于约10-4s-1，小于约5×10-4s-1，小于约10-5s-1，小于约5×10-5s-1，小于约10-6s-1，小于约5×10-6s-1，小于约10-7s-1，小于约5×10-7s-1，小于约10-8s-1，小于约5×10-8s-1，小于约10-9s-1，小于约5×10-9s-1，或小于约10-10-1s-1。在进一步的实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的ADC的Koff为：小于5×10-4s-1，小于10-5s-1，小于5×10-5s-1，小于10-6s-1，小于5×10-6s-1，小于10-7s-1，小于5×10-7s-1，小于10-8s-1，小于5×10-8s-1，小于10-9s-1，小于5×10-9s-1，或小于10-10s-1。在其他实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的ADC的Koff为：小于约5×10-4s-1，小于约10-5s-1，小于约5×10-5s-1，小于约10-6s-1，小于约5×10-6s-1，小于约10-7s-1，小于约5×10-7s-1，小于约10-8s-1，小于约5×10-8s-1，小于约10-9s-1，小于约5×10-9s-1，或小于约10-10s-1。
[0128]在其他实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的本发明ADC的亲和常数或Ka(kon/koff)为：至少102M-1、至少5×102M-1、至少103M-1、至少5×103M-1、至少104M-1、至少5×104M-1、至少105M-1、至少5×105M-1、至少106M-1、至少5×106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×101M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、至少5×1012M、至少1013M-1、至少5×1013M-1、至少1014M-1、至少5×1014M-1、至少1015M-1、或至少5×1015M-1。在进一步的实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的本发明ADC的亲和常数或Ka(kon/koff)为：至少约102M-1、至少约5×102M-1、至少约103M-1、至少约5×103M-1、至少约104M-1、至少约5×104M-1、至少约105M-1、至少约5×105M-1、至少约106M-1、至少约5×106M-1、至少约107M-1、至少约5×107M-1、至少约108M-1、至少约5×108M-1、至少约109M-1、至少约5×109M-1、至少约1010M-1、至少约5×101M-1、至少约1011M-1、至少约5×1011M-1、至少约1012M-1、至少约5×1012M、至少约1013M-1、至少约5×1013M-1、至少约1014M-1、至少约5×1014M-1、至少约1015M-1、或至少约5×1015M-1。
[0129]再在另一个实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的ADC的解离常数或Kd(koff/kon)为：小于10-2M，小于5×10-2M，小于10-3M，小于5×10-3M，小于10-4M，小于5×10-4M，小于10-5M，小于5×10-5M，小于10-6M，小于5×10-6M，小于10-7M，小于5×10-7M，小于10-8M，小于5×10-8M，小于10-9M，小于5×10-9M，小于10-10M，小于5×10-10M，小于10-11M，小于5×10-11M，小于10-12M，小于5×10-12M，小于10-13M，小于5×10-13M，小于10-14M，小于5×10-14M，小于10-15M，或小于5×10-15M。在进一步的实施方式中，特异性结合于至少一种Eph受体的ADC的解离常数或Kd(koff/kon)为：小于约10-2M，小于约5×10-2M，小于约10-3M，小于约5×10-3M，小于约10-4M，小于约5×10-4M，小于约10-5M，小于约5×10-5M，小于约10-6M，小于约5×10-6M，小于约10-7M，小于约5×10-7M，小于约10-8M，小于约5×10-8M，小于约10-9M，小于约5×10-9M，小于约10-10M，小于约5×10-10M，小于约10-11M，小于约5×10-11M，小于约10-12M，小于约5×10-12M，小于约10-13M，小于约5×10-13M，小于约10-14M，小于约5×10-14M，小于约10-15M，或小于约5×10-15M。
[0130]如上所述，本发明包括的ADC中其抗体部分包含特异性结合于至少一种Eph受体的可变区。本发明还包括特异性结合于至少一种Eph受体的ADC，相对于可比较的分子，其ADCC和/或CDC活性不同且对一种或多种Fc配体(例如，FcγRs，C1q)具有经修饰的结合亲和力。参见，例如，美国专利申请公开号2006/0039904A1。本发明具体包括衍生自抗-Eph受体抗体或其片段的ADC，所述抗体或其片段包括但不限于：Eph099B-102.147(ATCC登录号PTA-4572)，Eph099B-208.261(ATCC登录号PTA-4573)，Eph099B-210.248(ATCC登录号PTA-4574)，Eph099B-233.152(ATCC登录号PTA-5194)，(PCT公开号WO 03/094859，其通过引用全文纳入本文)；EA2(ATCC登录号PTA-4380)、EA3、EA4，EA5(ATCC登录号PTA-4381)，(PCT公开号WO 04/014292，其通过引用全文纳入本文)；LX-13和scFv EA44(ATCC登录号PTA-6044)，(美国专利申请序列号10/863,729，其通过引用全文纳入本文)，G2，和12G3H11以及其类似物、衍生物或片段。尤其预计，本发明ADC可包含12G3H11(见表2)和/或表2-4或6或者图1-59中所列任何抗体的所有或部分可变区(例如，一个或多个CDR)。
[0131]一实施方式中，所述ADC是12G3H11的ADC，这是一种结合EphA2的人源化激动单克隆抗体。重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列在文中分别见SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：166(见图1和2)。在其他实施方式中，本发明ADC与12G3H11结合相同表位或与12G3H11竞争结合EphA2。在另一个实施方式中，特异性结合于Eph受体的本发明ADC不是12G3H11的ADC。
[0132]一实施方式中，所述ADC是3F2的ADC，这是一种结合EphA2的人源化激动单克隆抗体(见美国专利申请11/203,251，其通过引用全文纳入本文)。重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列在文中分别见SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64(图3)。在其他实施方式中，本发明ADC与3F2结合相同表位或与3F2竞争结合EphA2。在另一个实施方式中，免疫-特异性结合于Eph受体的本发明ADC不是3F2的ADC。在其他实施方式中，本发明ADC不是3F2的ADC。
[0133]在其他实施方式中，所述ADC是G5的ADC，这是一种结合EphA2的人源化激动单克隆抗体。G5重链和轻链可变区的氨基酸序列在文中分别见SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104(图1和2)。
[0134]在其他实施方式中，所述ADC是抗-EphA2抗体12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的ADC。这些抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列示于图1-14(SEQ ID NO.165和166、87和88、95和96、103和104、140和142、137和138、63和64、3和4、13和14、23和24、33和34、43和44、以及53和54)。
[0135]一实施方式中，本发明ADC相比其他Eph受体优先结合EphA2。在其他实施方式中，本发明ADC相比其他Eph受体优先结合EphA4。再在其他实施方式中，本发明ADC与一种或多种Eph受体复合物(例如，Eph受体-肝配蛋白配体复合物)发生免疫反应。再在其他实施方式中，本发明ADC特异性结合一种以上Eph受体。特异性结合一种以上Eph受体的ADC所结合的Eph受体组合可用以下公式表示：EphA(x)+EphB(y)；EphA(x)+EphA(x)；EphB(y)+EphB(y)；其中，(x)是1，2、3、3a、3b、4、5、5a、5b、6、7或8，(y)是1、2、2a、2b、3、4、5或6。在具体的实施方式中，与一种以上Eph受体发生特异性免疫反应的ADC结合，例如，EphA2+EphA4，或EphA2+EphA3，或EphA2+EphB4，或EphA4+EphA3，或EphA4+EphB4。尤其预计，特异性结合一种以上Eph受体的ADC是双特异性抗体。还可预计，特异性结合一种以上Eph受体的ADC是结合两种或多种Eph之间共有表位的抗体。还预计，特异性结合一种以上Eph受体的ADC是与一种或多种Eph受体交叉反应的抗体。此外，本发明ADC对一种以上Eph受体(例如，EphA2和EphA4))具有相同的免疫反应性，或者，所述ADC对一种Eph受体的免疫反应可强于对其他受体的。
[0136]本发明包括特异性结合于EphA2的ADC，所述抗体包含的可变重链(“VH”)结构域具有12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261(″B208″)、Eph099B-210.248(″B210″)、Eph099B-233.152(″B233″)、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域的氨基酸序列。本发明还包括特异性结合于EphA2的ADC，所述抗体包含的可变轻链(“VL”)结构域具有12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域的氨基酸序列。本发明还包括特异性结合于EphA2的ADC，所述抗体包含与文中所述的VL结构域或其他VL结构域组合的文中所述的VH结构域。本发明还包括特异性结合于EphA2的ADC，所述ADC包含与文中所述的VH结构域或其他VH结构域组合的文中所述的VL结构域。
[0137]本发明包括特异性结合于EphA4的ADC，所述抗体包含的可变重链(“VH”)结构域具有LX-13或scFv EA44的VH结构域的氨基酸序列。本发明还包括特异性结合于EphA4的ADC，所述抗体包含的可变轻链(“VL”)结构域具有LX-13或scFv EA44的VL结构域的氨基酸序列。本发明还包括特异性结合于EphA4的ADC，所述抗体包含与文中所述的VL结构域或其他VL结构域组合的文中所述的VH结构域。本发明还包括特异性结合于EphA4的ADC，所述ADC包含与文中所述的VH结构域或其他VH结构域组合的文中所述的VL结构域。
[0138]本发明包括特异性结合于Eph受体的ADC，所述抗体包含的VH CDR具有下表2或3中所列任何VH CDR的氨基酸序列。本发明还包括特异性结合于Eph受体的ADC，所述抗体包含的VL CDR具有下表2或3中所列任何VL CDR的氨基酸序列。本发明还包括特异性结合于Eph受体的ADC，所述ADC包含表2或3中所列的一个或多个VH CDR和一个或多个VL CDR。本发明还包括特异性结合于Eph受体的ADC，所述ADC包含下表2或3中所列VHCDR和VLCDR中的一些或所有的任意组合。
表2：12G3H11和3F2的CDR序列
| CDR | 序列 | SEQ ID NO： |
| 12G3H11 VH1 | DYSM N | *** |
| 12G3H11 VH2 | FIRNKANDYTTEYADSVKG | *** |
| 12G3H11 VH3 | YPRHHAMDS | *** |
| 12G3H11 VL1 | RASQSISNNLH | *** |
| 12G3H11 VL2 | YAFQSIS | *** |
| 12G3H11 VL3 | QQANSWPLT | *** |
| 3F2 VH1 | DYSMN | 65 |
| 3F2 VH2 | FIRNKANAYTTEYSASVKG | 66 |
| 3F2 VH3 | YPRYHAMDS | 67 |
| 3F2 VL1 | RASQSISNNLH | 68 |
| 3F2 VL2 | YGFQSIS | 69 |
| 3F2 VL3 | QQANSWPLT | 70 |
表3：1C1、1F12、1H3、1D3、2B12和5A8的CDR序列
| CDR | 序列 | Seq ID No. |
| 1C1VH1 | HYMMA | 5 |
| 1C1VH2 | RIGPSGGPTHYADSVKG | 6 |
| 1C1VH3 | YDSGYDYVAVAGPAEYFQH | 7 |
| 1C1VL1 | RASQSISTWLA | 8 |
| 1C1VL2 | KASNLHT | 9 |
| 1C1VL3 | QQYNSYSRT | 10 |
| 1F12VH1 | RYQMM | 15 |
| 1F12VH2 | SISPSGGVTLYADSVKG | 16 |
| 1F12VH3 | ELLGTVVVPVAWKMRGYFDY | 17 |
| 1F12VL1 | RASQSVSSNLA | 18 |
| 1F12VL2 | GASTRAST | 19 |
| 1F12VL3 | QQYNNWPPLT | 20 |
| 1H3VH1 | MYAMR | 25 |
| 1H3VH2 | VIGPSGGWTPYADSVKG | 26 |
| 1H3VH3 | DRGIYGMDV | 27 |
| 1H3VL1 | RASQGISSYLA | 28 |
| 1H3VL2 | AASTLQS | 29 |
| 1H3VL3 | LELNNYPFT | 30 |
| 1D3VH1 | PYDML | 35 |
| 1D3VH2 | RIGSSGGYTKYADSVKG | 36 |
| 1D3VH3 | ARSVVVSSDAFDI | 37 |
| 1D3VL1 | RASQGISKWLA | 38 |
| 1D3VL2 | GASTLQS | 39 |
| 1D3VL3 | QQYNDYPLT | 40 |
| 2B12VH1 | NYNMY | 45 |
| 2B12VH2 | VIVPSGKTSYADSVKG | 46 |
| 2B12VH3 | SYGGGFDY | 47 |
| 2B12VL1 | RASQDILTWLA | 48 |
| 2B12VL2 | AASSLQS | 49 |
| 2B12VL3 | QQAIRFPLT | 50 |
| 5A8VH1 | YYRMY | 55 |
| 5A8VH2 | SIYSSGGPTYYADSVKG | 56 |
| 5A8VH3 | DMGTGFWSGWGLGSDY | 57 |
| 5A8VL1 | RASQGISSWLA | 58 |
| 5A8VL2 | AASSLQS | 59 |
| 5A8VL3 | QQANSFPLT | 60 |
表4：代表性的抗-Eph受体抗体
| 抗体/杂交瘤 | EphR | ATCC编号 | 保藏日期 | 专利申请号 |
| Eph099B-102.147 | EphA2 | PTA-4572 | 2002-8-7 | WO 03/094859 |
| Eph099B208.261 | EphA2 | PTA-4573 | 2002-8-7 | WO 03/094859 |
| Eph099B-210.248 | EphA2 | PTA-4574 | 2002-8-7 | WO 03/094859 |
| Eph099B-233.152 | EphA2 | PTA-5194 | 2003-5-12 | WO 03/094859 |
| EA2 | EphA2 | PTA-4380 | 2003-5-22 | WO 04/014292 |
| EA5 | EphA2 | PTA-4381 | 2003-5-22 | WO 04/014292 |
| EA44 | EphA4 | PTA-6044 | 2004-6-4 | 10/863,729 |
| 3F2 | EphA2 | 11/203,251 |
[0139]本发明还包括与12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44或者其抗原-结合片段竞争结合Eph受体的ADC。竞争试验是精通本领域的技术人员熟知的，它可用来鉴定此类抗体。在具体的实施方式中，通过熟知的ORIGEN分析可测得，1μg/ml的本发明抗体可防止75％、80％、85％或90％的ORIGEN TAG标记的12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44与生物素-标记的Eph受体结合。
[0140]本发明还提供了包含精通本领域的技术人员已知的框架区的ADC。一实施方式中，本发明抗体或其片段的片段区域是人的或人源化的。
[0141]本发明包括含有12G3H11、3F2、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8LX-13或scFvEA44的氨基酸序列的ADC，所述氨基酸序列除了任何其他取代或改变(例如，Fc取代)还在框架区或可变区内具有突变。一实施方式中，这些抗体内的突变维持或增强了抗体对于它们特异性结合的Eph受体的亲合力和/或亲和力。精通本领域的技术人员已知的标准技术(例如，免疫试验)可用来检测抗体对特定抗原的亲和力。
[0142]本发明包括通常是分离的、编码特异性结合于Eph受体的ADC的抗体部分的核酸分子的应用。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于Eph受体的ADC，所述ADC具有含有一个或多个Fc取代的12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的氨基酸序列。在其他实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于Eph受体的ADC，所述ADC包含的VH结构域具有12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的VH结构域的氨基酸序列。在其他实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于Eph受体的ADC，所述抗体包含的VL结构域具有12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的VL结构域的氨基酸序列。
[0143]本发明包括编码特异性结合于Eph受体的ADC的分离的核酸分子的应用，所述ADC包含的VH CDR具有表2或3中所列任何VH CDR和/或源自表4或6中所列任何抗体重链的VH CDR的氨基酸序列。具体地说，本发明包括编码特异性结合于Eph受体的ADC的分离的核酸分子的应用，所述抗体所包含的1、2或更多VH CDR具有表2或3中所列任何VH CDR和/或源自表4或6中所列任何抗体重链的VH CDR的氨基酸序列。
[0144]本发明包括编码特异性结合于Eph受体的ADC的分离的核酸分子的应用，所述ADC包含的VL CDR具有表2或3中所列任何VL CDR和/或源衍生自表4或6中所列任何抗体轻链的VL CDR的氨基酸序列。具体地说，本发明包括编码特异性结合于Eph受体的ADC的分离的核酸分子的应用，所述抗体所包含的1、2或更多VL CDR具有表2或3中所列任何VL CDR和/或源自表4或6中所列任何抗体轻链的VL CDR的氨基酸序列。
[0145]本发明包括特异性结合于Eph受体的ADC的应用，所述ADC包含本文所述的特异性结合于Eph受体的VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR的衍生物。精通本领域的技术人员已知的标准技术可用来在编码本发明抗体的核苷酸序列中引入突变(例如，加入、删除和/或取代)，这些技术包括，例如，定点诱变和PCR-介导的诱变通常用于产生氨基酸取代。一实施方式中，VH和/或VL CDR衍生物相对于原始的VH和/或VL CDR包含小于25个氨基酸取代，小于20个氨基酸取代，小于15个氨基酸取代，小于10个氨基酸取代，小于5个氨基酸取代，小于4个氨基酸取代，小于3个氨基酸取代，或小于2个氨基酸取代。在其他实施方式中，VH和/或VL CDR衍生物在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即，不是抗体特异性结合于Eph受体的关键氨基酸残基)上进行了保守性氨基酸取代(例如，同上)。或者，例如通过饱和诱变可在全部或部分VH和/或VL CDR编码序列上随机引入突变，并可筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留有活性的突变体。诱变之后可表达编码的抗体并可鉴定抗体的活性。
[0146]本发明包括在可变轻链(VL)结构域和/或可变重链(VH)结构域中具有一个或多个额外氨基酸残基取代的12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的ADC。本发明还包括在一个或多个VL CDR和/或一个或多个VH CDR中具有一个或多个额外氨基酸残基取代的12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的ADC。例如，可在体外和体内检测通过在12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的ADC的VH结构域、VH CDR、VL结构域和/或VL CDR中引入取代而产生的抗体结合Eph受体的能力(通过，例如，免疫试验，包括但不限于ELISA和BIAcore)或者它们介导、预防、治疗、控制或改善癌症或一种或多种癌症症状的能力。
[0147]本发明还包括特异性结合于至少一种Eph受体的ADC或其片段的应用，所述ADC包含的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列与12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的可变重链和/或轻链的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的相同性。本发明还包括特异性结合于至少一种Eph受体的ADC或其片段的应用，所述ADC包含的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列与12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFvEA44的可变重链和/或轻链的氨基酸序列有至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％的相同性。本发明还包括特异性结合于至少一种Eph受体的ADC或其片段的应用，所述抗体或抗体片段包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFvEA44的一个或多个CDR的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的相同性。本发明还包括特异性结合于至少一种Eph受体的ADC或其片段的应用，所述抗体或抗体片段包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的一个或多个CDR的氨基酸序列有至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％的相同性。可通过精通本领域的技术人员已知的任何方法，包括BLAST蛋白质检索来测定两种氨基酸序列相同性百分比。
[0148]本发明还包括特异性结合于至少一种Eph受体的ADC或其片段的应用，所述ADC由在严格条件下与12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，本发明包括特异性结合于Eph受体的ADC或其片段，所述ADC包含的一个或多个CDR由在严格条件下与12G3H11、Eph099B-102.147、B208、B210、B233、EA2、EA3、EA4、EA5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、5A8LX-13或scFv EA44的一个或多个CDR的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。严格杂交条件包括但不限于：约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合在滤膜上的DNA杂交，然后在约50-65℃用0.2×SSC/0.1％SDS洗涤一次或多次；高度严格条件是例如约45℃在6×SSC中与结合在滤膜上的DNA杂交，然后在约60℃用0.1×SSC/0.2％SDS洗涤一次或多次；或本领域技术人员已知的任何其它严格杂交条件(参见，例如Ausubel，F.M.等编，1989，《最新分子生物学方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，第一卷，格林出版合作公司(GreenPublishing Associates，Inc.)和约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)，纽约，第6.3.1页-6.3.6页和第2.10.3页)。
[0149]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体药物偶联物。本发明还提供了结合人EphA2多肽、小鼠EphA2多肽和大鼠EphA2多肽的抗体。在某些实施方式中，单个抗体克隆可结合人、小鼠和大鼠的EphA2多肽。在其他实施方式中，单个抗体克隆仅结合人EphA2，或仅结合小鼠EphA2，或仅结合大鼠EphA2。再在其他实施方式中，单个抗体克隆结合人和小鼠的EphA2，或结合人和大鼠的EphA2，或结合大鼠和小鼠的EphA2。
[0150]具体地说，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的以下抗体或ADC：12G3H11或其抗原-结合片段，Eph099B-102.147或其抗原结合片段，B208或其抗原结合片段，B210或其抗原结合片段，B233或其抗原结合片段，EA2或其抗原结合片段，EA3或其抗原结合片段，EA4或其抗原结合片段，EA5或其抗原结合片段，10C12或其抗原结合片段，4H5或其抗原结合片段，10G9或其抗原结合片段，3F2或其抗原结合片段，5A8LX-13或其抗原结合片段，scFv EA44或其抗原结合片段，1C1或其抗原-结合片段，1F12或其抗原-结合片段，1H3或其抗原-结合片段，1D3或其抗原-结合片段，2B 12或其抗原-结合片段，以及5A8或其抗原-结合片段。一实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体是1C1或其抗原-结合片段(例如，1C1的一个或多个CDR)。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体是1F12或其抗原-结合片段(例如，CDR1F12的一个或多个CDR)。在进一步的实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体是1H3或其抗原-结合片段(例如，1H3的一个或多个CDR)。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体是1D3或其抗原-结合片段(例如，1D3的一个或多个CDR)。再在另一个实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体是2B12或其抗原-结合片段(例如，2B12的一个或多个CDR)。在进一步的实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体是5A8或其抗原-结合片段(例如，5A8的一个或多个CDR)。
[0151]本发明提供了特异性结合EphA2多肽的抗体或ADC，所述抗体所包含的VH结构域具有12G3H11(图1、2；SEQ ID NO.：165)、B233(图1、2；SEQ ID NO.：87)、B208(图1、2；SEQ ID NO.：95)、B210(图1、2)、G5(图1、2；SEQ ID NO.：103)、10C12(图6；SEQ ID NO.：140)、4H5(图4；SEQ ID NO.：138)、10G9(图4)、3F2(图3；SEQ ID NO.：63)、1C1(图7A和8；SEQ ID NO.：3)、1F12(图7A和9；SEQ ID NO.：13)、1H3(图7A和10；SEQ ID NO.：23)、1D3(图7A和11；SEQ ID NO.：33)、2B12(图7A和12；SEQ ID NO.：43)或5A8(图7A和13；SEQ ID NO.：53)的VH结构域的氨基酸序列。
[0152]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含的VH CDR具有下表2或3中所列任一VHCDR的氨基酸序列。具体地说，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含(或者，由其构成)1个、2个、3个、4个、5个或更多个具有下表2或3中所列任何VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。
[0153]一实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：5、15、25、35、45、55或65的氨基酸序列的VH CDR1。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：6、16、26、36、46、56或66的氨基酸序列的VH CDR2。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：7、17、27、37、47、57或67的氨基酸序列的VH CDR3。
[0154]在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：5、15、25、35、45、55或65的氨基酸序列的VHCDR1，和具有SEQ ID NO.：6、16、26、36、46、56或66的氨基酸序列的VH CDR2。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：5、15、25、35、45、55或65的氨基酸序列的VHCDR1，和具有SEQ ID NO.：7、17、27、37、47、57或67的氨基酸序列的VH CDR3。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：6、16、26、36、46、56或66的氨基酸序列的VHCDR2，和具有SEQ ID NO.：7、17、27、37、47、57或67的氨基酸序列的VH CDR3。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：5、15、25、35、45、55或65的氨基酸序列的VHCDR1，具有SEQ ID NO.：6、16、26、36、46、56或66的氨基酸序列的VH CDR2，和具有SEQ ID NO.：7、17、27、37、47、57或67的氨基酸序列的VH CDR3。
[0155]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含的VL结构域具有12G3H11(图1、2；SEQ ID NO.：166)、B233(图1、2；SEQ ID NO.：88)、B208(图1、2；SEQ ID NO.：96)、B210(图1、2)、G5(图3；SEQ ID NO.：104)、10C12(图6；SEQ ID NO.：142)、4H5(图4；SEQ ID NO.：137)、10G9(图4)、3F2(图3；SEQ ID NO.：64)、1C1(图7B和8；SEQ ID NO.：4)、1F12(图7B；SEQ ID NO.：14)、1H3(图7B和10；SEQ ID NO.：24)、1D3(图7B和11；SEQ ID NO.：34)、2B12(图7B和12；SEQ ID NO.：44)或5A8(图7B和13；SEQ ID NO.：54)的VL结构域的氨基酸序列。
[0156]本发明还提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含的VL CDR具有下表2或3中所列任一VL CDR的氨基酸序列。具体地说，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)1个、2个、3个或更多个具有下表2或3中所列任何VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。一实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：8、18、28、38、48、58或68的氨基酸序列的VL CDR1。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：9、19、29、39、49、59或69的氨基酸序列的VL CDR2。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：10、20、30、40、50、60或70的氨基酸序列的VL CDR3。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：8、18、28、38、48、58或68的氨基酸序列的VL CDR1，和具有SEQ IDNO.：9、19、29、39、49、59或69的氨基酸序列的VL CDR2。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：8、18、28、38、48、58或68的氨基酸序列的VL CDR1，和具有SEQ ID NO.：10、20、30、40、50、60或70的氨基酸序列的VL CDR3。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：9、19、29、39、49、59或69的氨基酸序列的VL CDR2，和具有SEQ ID NO.：10、20、30、40、50、60或70的氨基酸序列的VL CDR3。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：8、18、28、38、48、58或68的氨基酸序列的VL CDR1，具有SEQ ID NO.：9、19、29、39、49、59或69的氨基酸序列的VL CDR2，和具有SEQ ID NO.：10、20、30、40、50、60或70的氨基酸序列的VL CDR3，作为该抗体的一部分。
[0157]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含与这里所述的VL结构域或其他已知VL结构域结合的这里所述的VH结构域。本发明还提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含与这里所述的VH结构域或其他已知VH结构域结合的这里所述的VL结构域。
[0158]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含上表2或3中所列的一个或多个VHCDR和一个或多个VLCDR。具体地说，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)：VH CDR1和VL CDR1；VH CDR1和VLCDR2；VH CDR1和VL CDR3；VH CDR2和VL CDR1；VH CDR2和VLCDR2；VH CDR2和VL CDR3；VH CDR3和VH CDR1；VH CDR3和VLCDR2；VH CDR3和VL CDR3；VH1CDR1，VH CDR2和VL CDR1；VHCDR1，VH CDR2和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2和VL CDR3；VHCDR2，VHCDR3和VL CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR2；VHCDR2，VH CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VL CDR1和VL CDR2；VHCDR1，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2，VL CDR1和VL CDR2；VHCDR2，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VHCDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VLCDR1；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR2；VH CDR1，VHCDR2，VH CDR3和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR1和VLCDR2；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VHCDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR1和VLCDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR2，VHCDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR2和VLCDR3；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VHCDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VHCDR2，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；或者上表2或3中所列VH CDR和VL CDR的任意组合。
[0159]一实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：5、15、25、35、45、55或65的氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO.：8、18、28、38、48、58或68的氨基酸序列的VLCDR1。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：5、15、25、35、45、55或65的氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO.：9、19、29、39、49、59或69的氨基酸序列的VLCDR2。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：5、15、25、35、45、55或65的氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO.：10、20、30、40、50、60或70的氨基酸序列的VLCDR3。
[0160]一实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：6、16、26、36、46、56或66的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO.：8、18、28、38、48、58或68的氨基酸序列的VLCDR1。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：6、16、26、36、46、56或66的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO.：9、19、29、39、49、59或69的氨基酸序列的VL CDR2。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ IDNO.：6、16、26、36、46、56或66的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQID NO.：10、20、30、40、50、60或70的氨基酸序列的VL CDR3。
[0161]一实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：7、17、27、37、47、57或67的氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO.：8、18、28、38、48、58或68的氨基酸序列的VLCDR1。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：7、17、27、37、47、57或67的氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO.：9、19、29、39、49、59或69的氨基酸序列的VLCDR2。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含具有SEQ ID NO.：7、17、27、37、47、57或67的氨基酸序列的的VH CDR3和具有SEQ ID NO.：10、20、30、40、50、60或70的氨基酸序列的VLCDR3。
[0162]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体由具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8或其抗原-结合片段的核苷酸序列的核酸序列编码。在具体的实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含的VH结构域由具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域的核苷酸序列的核酸序列编码。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含的VL结构域由具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域的核苷酸序列的核酸序列编码。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含的VH结构域和VL结构域由具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域和VL结构域的核苷酸序列的核酸序列编码。
[0163]在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含的VH CDR由具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR的核苷酸序列的核酸序列编码。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含的VL CDR由具有2G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR的核苷酸序列的核酸序列编码。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含的VH CDR和VL CDR由具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR和VL CDR的核苷酸序列的核酸序列编码。
[0164]本发明提供了一种通常是分离的、编码特异性结合于EphA2多肽的本发明抗体的核酸分子。具体地说，本发明提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8或其抗原-结合片段的氨基酸序列。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体具有1C1的氨基酸序列。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体具有1F12的氨基酸序列。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体具有1H3的氨基酸序列。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体具有1D3的氨基酸序列。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体具有2B12的氨基酸序列。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体具有5A8的氨基酸序列。
[0165]本发明提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域氨基酸序列的VH结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1C1的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1F12的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1H3的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1D3的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有2B12的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有5A8的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域。
[0166]本发明提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)具有上表2或3中所列任何VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。具体地说，本发明提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体包含1个、2个、3个、4个、5个或更多个具有上表2或3中所列任何VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。一实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有上表2或3中所列VH CDR1的氨基酸序列的VH CDR1。在其他实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有上表2或3中所列VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。在其他实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有上表2或3中所列VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
[0167]本发明提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1C1的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1F12的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1H3的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有1D3的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有2B12的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。在具体的实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有5A8的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。
[0168]本发明还提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)具有上表2或3中所列任何VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。具体地说，本发明提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体包含1个、2个、3个或更多个具有上表2或3中所列任何VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。一实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有上表2或3中所列VH CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。在其他实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有上表2或3中所列VHCDR2的氨基酸序列的VL CDR2。在其他实施方式中，分离的核酸分子编码特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含具有上表2或3中所列VH CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
[0169]本发明提供了编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的核酸分子，所述抗体包含上表2或3中所列的一个或多个VH CDR和一个或多个VL CDR。具体地说，本发明提供了一种编码特异性结合于EphA2多肽的抗体的分离的核酸分子，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)VH CDR1和VL CDR1；VH CDR1和VL CDR2；VH CDR1和VL CDR3；VH CDR2和VL CDR1；VH CDR2和VL CDR2；VH CDR2和VL CDR3；VH CDR3和VH CDR1；VH CDR3和VL CDR2；VH CDR3和VL CDR3；VH1 CDR1，VH CDR2和VL CDR1；VH CDR1，VH CDR2和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3和VL CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR2；VH CDR2，VH CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR2，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR1；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；或上表2或3中所列VH CDR和VL CDR的任意组合。
[0170]下面是本发明进一步的具体实施方式，并依次编号：
1.一种EphA2抗体或ADC，其包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域的氨基酸序列的可变重链(VH)结构域，其中，所述抗体特异性结合于EphA2多肽。
2.一种EphA2抗体或ADC，其包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域的氨基酸序列的可变轻链(VL)结构域，其中，所述抗体特异性结合于EphA2多肽。
3.实施方式1所述的抗体或ADC，其还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。
4.一种EphA2抗体或ADC，其包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的CDR的氨基酸序列的互补决定区(CDR)，其中，所述抗体或ADC特异性结合于EphA2多肽。
5.实施方式4所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。
6.实施方式4所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。
7.实施方式5所述的抗体或ADC，还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。
8.实施方式5所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR1的氨基酸序列的VH CDR1。
9.实施方式5所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
10.实施方式5所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
11.实施方式8所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
12.实施方式8所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
13.实施方式9所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
14.实施方式11所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
15.实施方式7所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH的氨基酸序列的VH CDR1。
16.实施方式7所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
17.实施方式7所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
18.实施方式15所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
19.实施方式15所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
20.实施方式16所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
21.实施方式18所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
22.实施方式6所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
23.实施方式6所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
24.实施方式6所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
25.实施方式22所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
26.实施方式22所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
27.实施方式23所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
28.实施方式25所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
29.实施方式7所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
30.实施方式7所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
31.实施方式7所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
32.实施方式29所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
33.实施方式29所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
34.实施方式30所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
35.实施方式32所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
36.实施方式15所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
37.实施方式15所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
38.实施方式15所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
39.实施方式36所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
40.实施方式36所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
41.实施方式37所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
42.实施方式39所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
43.实施方式16所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
44.实施方式16所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
45.实施方式16所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
46.实施方式43所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
47.实施方式43所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
48.实施方式44所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
49.实施方式46所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
50.实施方式17所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
51.实施方式17所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
52.实施方式17所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
53.实施方式50所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
54.实施方式50所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
55.实施方式51所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
56.实施方式53所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
57.实施方式18所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
58.实施方式18所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
59.实施方式18所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
60.实施方式57所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
61.实施方式57所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
62.实施方式58所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
63.实施方式60所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
64.实施方式19所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
65.实施方式19所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
66.实施方式19所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
67.实施方式64所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
68.实施方式64所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
69.实施方式65所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
70.实施方式67所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
71.实施方式20所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
72.实施方式20所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
73.实施方式20所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
74.实施方式71所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
75.实施方式71所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
76.实施方式72所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
77.实施方式74所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
78.实施方式21所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
79.实施方式21所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
80.实施方式21所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
81.实施方式78所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
82.实施方式78所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
83.实施方式79所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
84.实施方式81所述的抗体或ADC，其中，所述抗体或ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
[0171]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含文中所述特异性结合于EphA2多肽的VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR的衍生物。可采用本领域技术人员已知的标准技术将突变(例如，缺失、添加和/或取代)引入编码本发明抗体的核苷酸序列，这些技术包括例如：导致氨基酸取代的定位诱变和PCR-介导的诱变。优选地，该衍生物相对于原始分子包含少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在具体的实施方式中，该衍生物在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即，不是抗体特异性结合于EphA2多肽的关键氨基酸残基)上进行保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是用具有电荷相似的侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基的情况。本领域限定了具有电荷相似的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，例如通过饱和诱变可在全部或部分编码序列上随机引入突变，并可筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留有活性的突变体。诱变之后可表达编码的抗体并可鉴定抗体的活性。
[0172]本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含在可变轻链(VL)结构域和/或可变重链(VH)结构域中具有一个或多个氨基酸残基取代的12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的氨基酸序列。本发明还提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含在一个或多个VL CDR和/或一个或多个VH CDR中具有一个或多个氨基酸残基取代的12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的氨基酸序列。本发明还提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含在一个或多个VH框架和/或一个或多个VL框架中具有一个或多个氨基酸残基取代的12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8或其VH和/或VL结构域的氨基酸序列。例如，可在体外和/或体内检测通过在12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域、VH CDR、VL结构域、VL CDR和/或框架中引入取代而产生的抗体结合EphA2多肽的能力、或者它们抑制或降低EphA2受体活化的能力、或者它们激活EphA2的能力。
[0173]在具体的实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含在严格条件、高度严格条件、或其他严格杂交条件下与编码12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8或其抗原-结合片段的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，所述严格条件例如，在约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合于滤膜的DNA杂交，然后在约50-65℃用0.2X SSC/0.1％SDS洗涤一次或多次，所述高度严格条件例如，在约45℃在6X SSC中与结合于滤膜的核酸杂交，然后在约68℃用0.1X SSC/0.2％SDS洗涤一次或多次，所述其他严格杂交条件是精通本领域的技术人员已知的(参见，例如，Ausubel，F.M.等编，1989，《最新分子生物学方法》，第一卷，格林出版合作公司和约翰威利父子出版公司，纽约，第6.3.1页-6.3.6页和第2.10.3页)。
[0174]在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含VH结构域的氨基酸序列或VL结构域的氨基酸序列，所述氨基酸序列由在文中所述的严格条件下或在精通本领域的技术人员已知的其他严格杂交条件下与编码12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH或VL结构域的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含VH结构域的氨基酸序列和VL结构域的氨基酸序列，所述氨基酸序列由在文中所述的严格条件下或在精通本领域的技术人员已知的其他严格杂交条件下与编码12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VH和VL结构域的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含VH CDR的氨基酸序列或VL CDR的氨基酸序列，所述氨基酸序列由在文中所述的严格条件下或在精通本领域的技术人员已知的其他严格杂交条件下与编码上表2或3中所列任一VH CDR或VL CDR的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含VH CDR的氨基酸序列和VL CDR的氨基酸序列，所述氨基酸序列由在文中所述的严格条件下或在精通本领域的技术人员已知的其他严格杂交条件下与编码上表2或3中所列任一VHCDR和上表2或3中所列任一VL CDR的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。
[0175]在其他实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由在严格条件下与1C1的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为1和2)杂交的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由在严格条件下与1F12的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为11和12)杂交的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由在严格条件下与1H3的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为21和22)杂交的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由在严格条件下与1D3的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为31和32)杂交的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由在严格条件下与2B12的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为41和42)杂交的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由在严格条件下与5A8的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为51和52)杂交的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。
[0176]在其他实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由在严格条件下与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR和/或VL CDR的核苷酸序列(图1-13)杂交的核苷酸序列编码的VH CDR和/或VL CDR。
[0177]在具体的实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8或其抗原-结合片段的氨基酸序列有至少35％，优选至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的氨基酸序列。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域有至少35％，优选至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的VH结构域的氨基酸序列。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域有至少35％，优选至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的VL结构域的氨基酸序列。
[0178]在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含与上表2或3中所列任何VL CDR有至少35％，优选至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的一个或多个VL CDR的氨基酸序列。在其他实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含与上表2或3中所列任一VL CDR有至少35％，优选至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的一个或多个VL CDR的氨基酸序列。
[0179]在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体由与编码1C1的核苷酸序列有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体由与编码1F12的核苷酸序列有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体由与编码1H3的核苷酸序列有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体由与编码1D3的核苷酸序列有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体由与编码2B12的核苷酸序列有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体由与编码5A8的核苷酸序列有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码。
[0180]在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由与1C1的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ IDNO分别为1和2)有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由与1F12的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为11和12)有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由与1H3的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为21和22)有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由与1D3的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为31和32)有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由与2B12的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为41和42)有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由与5A8的VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为51和52)有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码的VH结构域和/或VL结构域。
[0181]在其他实施方式中，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含由与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VHCDR和/或VL CDR的核苷酸序列(图1-13)有至少65％，优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的核苷酸序列编码的VH CDR和/或VL CDR。
[0182]本发明包括与文中所述的抗体竞争结合EphA2多肽的抗体。具体地说，本发明包括与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8或其抗原-结合片段竞争结合EphA2多肽的抗体。在具体的实施方式中，本发明包括在本文所述竞争试验或本领域熟知的竞争试验中能使12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8与EphA2多肽的结合相比对照，例如PBS降低至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，或者25-50％、45-75％、或75-99％的抗体。在其他具体实施方式中，本发明包括在ELISA竞争试验中能使12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8与EphA2多肽的结合相比对照，例如PBS降低至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，或者25-50％、45-75％、或75-99％的抗体。
[0183]ELISA竞争试验可通过以下方式进行：用PBS配制浓度为10μg/ml的重组EphA2。在ELISA 98孔微滴定板的每个孔中加入100μl该溶液并在4-8℃培育过夜。用添加有0.1％吐温的PBS洗涤ELISA平板以除去过量的重组EphA2。加入100μ1用PBS制备的终浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)以封闭非特异性的蛋白质-蛋白质相互作用。室温放置1小时后，洗涤ELISA平板。用封闭液制备浓度范围从1μg/ml到0.01μg/ml的未标记的竞争抗体。对照孔仅含有封闭液或浓度范围从1μg/ml到0.01μg/ml的对照抗体。以1μg/ml的固定终浓度在竞争抗体稀释液中加入用辣根过氧化物酶标记的测试抗体(例如，1C1)。在ELISA平板的孔中一式三份加入100μl测试抗体和竞争抗体混合物，平板于室温培育1小时。洗去剩余未结合的抗体。在各孔中加入100μl辣根过氧化物酶底物以检测结合的测试抗体。将平板于室温培育30分钟，并用自动平板阅读器读取吸光度。计算一式三份孔的平均值。与对照孔相比，与测试抗体充分竞争的抗体测得的吸光度降低。
[0184]在其他实施方式中，本发明包括在本文所述竞争试验或本领域熟知的竞争试验中能使抗体与EphA2多肽的结合相比对照，例如PBS降低至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，或者25-50％、45-75％、或75-99％的抗体，所述抗体包含(或由其构成)12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的抗原-结合片段(例如，但不限于，VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)。
[0185]在其他实施方式中，本发明包括在ELISA竞争试验中能使抗体与EphA2多肽的结合相比对照，例如PBS降低至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，或者25-50％、45-75％、或75-99％的抗体，所述抗体包含(或者，由其构成或基本由其构成)12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的抗原-结合片段(例如，但不限于，VH结构域、VH CDR、VL结构域或VLCDR)。
[0186]本发明包括含有(或者，由其构成或基本由其构成)与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域竞争结合EphA2多肽的VH结构域的多肽或蛋白质。本发明还包括含有(或者，由其构成或基本由其构成)与12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域竞争结合EphA2多肽的VL结构域的多肽或蛋白质。
[0187]本发明包括含有(或者，由其构成或基本由其构成)与上表2或3所列VH CDR竞争结合EphA2多肽的VH CDR的多肽或蛋白质。本发明还包括含有(或者，由其构成)与上表2或3所列VL CDR竞争结合EphA2多肽的VL CDR的多肽或蛋白质。
[0188]特异性结合于EphA2多肽的抗体包括经修饰的衍生物，即，使任何类型的分子共价结合于抗体从而形成共价连接。例如，但不限于此，抗体衍生物包括经修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化、用已知的保护基/封闭基团衍生、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白质、等等。可通过已知的技术进行任何一种化学修饰，所述技术包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，所述衍生物可含有一个或多个非典型氨基酸。
[0189]本发明还提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含精通本领域的技术人员已知的框架区(例如，人或非人框架)。所述框架区可以是天然产生的或共有框架区。优选地，本发明抗体的片段区是人的(人框架区列表可参见，例如，Chothia等，1998，J.Mol.Biol.278：457-479，该文献通过引用全文纳入本文)。
[0190]本发明包括特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含在框架区内具有突变(例如，一个或多个氨基酸取代)的12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的氨基酸序列。在某些实施方式中，特异性结合于EphA2多肽的抗体包含在VH和/或VL结构域的框架区内具有一个或多个氨基酸残基取代的12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的氨基酸序列。
[0191]本发明还包括特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体包含在可变区和框架区内具有突变(例如，一个或多个氨基酸残基取代)的12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的氨基酸序列。
[0192]在某些实施方式中，本发明的抗体不包含某些特异性结合于EphA2多肽的抗体。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是1C1。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是1F12。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是1H3。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是1D3。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是2B12。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是5A8。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是3F2。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是EA5。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是G5。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是EA2。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是B233。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是B208。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是10C12。一实施方式中，本发明的抗体是EphA2结合抗体，前提是所述EphA2结合抗体不是B210。
[0193]在具体的实施方式中，本发明的抗体结合EphA2的带有抗原性表位的肽和多肽，且所述带有抗原性表位的肽和多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列构成：在任何物种中发现的EphA2的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，更优选至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个毗连氨基酸残基，并且，优选地，约15-约30个毗连氨基酸。包含免疫原性或抗原性表位的多肽的长度为至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、或至少35个氨基酸残基。
[0194]带有EphA2表位的肽、多肽及其片段可通过任何常规方法制造。参见，例如，Houghten，R.A.，1985，“快速固相合成大量肽的常规方法：单个氨基酸水平上抗原-抗体的特异性”(General method for the rapidsolid-phase synthesis of large numbers of peptides：specificity ofantigen-antibody interaction at the level of individual amino acids)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135；这种“同时多个肽合成(SMPS)”的方法进一步描述于Houghten等的美国专利号4,631,211(1986)。
[0195]本发明提供了包含文中所述抗体的一个或多个可变区或超变区的肽、多肽和/或蛋白质。优选地，包含本发明抗体的一个或多个可变区或超变区的肽、多肽或蛋白质还包含异源氨基酸序列。在某些实施方式中，这种异源氨基酸序列包含至少5个毗连氨基酸残基、至少10个毗连氨基酸残基、至少15个毗连氨基酸残基、至少20个毗连氨基酸残基、至少25个毗连氨基酸残基、至少30个毗连氨基酸残基、至少40个毗连氨基酸残基、至少50个毗连氨基酸残基、至少75个毗连氨基酸残基、至少100个毗连氨基酸残基或更多个毗连氨基酸残基。这种肽、多肽和/或蛋白质可称为融合蛋白。
[0196]在具体实施方式中，包含本发明抗体的一个或多个可变区或超变区的肽、多肽或蛋白质的长度为10个氨基酸残基、15个氨基酸残基、20个氨基酸残基、25个氨基酸残基、30个氨基酸残基、35个氨基酸残基、40个氨基酸残基、45个氨基酸残基、50个氨基酸残基、75个氨基酸残基、100个氨基酸残基、125个氨基酸残基、150个氨基酸残基或更多氨基酸残基。在某些实施方式中，包含本发明抗体的一个或多个可变区或超变区的肽、多肽或蛋白质特异性结合于EphA2多肽。在其他实施方式中，包含本发明抗体的一个或多个可变区或超变区的肽、多肽或蛋白质不特异性结合EphA2多肽。
[0197]在具体的实施方式中，本发明提供的肽、多肽和/或蛋白质包含文中所述抗体之一的VH结构域和/或VL结构域(见上表2和3)。在进一步的具体实施方式中，本发明提供的肽、多肽和/或蛋白质包含具有上表2或3中所列任何CDR的氨基酸序列的一个或多个CDR。根据这些实施方式，上述肽、多肽或蛋白质还可包含异源氨基酸序列。
[0198]包含一个或多个可变区或超变区的肽、多肽或蛋白质可用于，例如，制造抗-独特型抗体，进而又可用于预防、治疗和/或缓解与疾病或病症(例如，癌症、超增殖或增殖低下疾病)有关的一种或多种症状。所产生的抗-独特型抗体也可用于免疫试验，例如ELISA，以检测包含用于产生该抗-独特型抗体的肽、多肽或蛋白质中所含可变区或超变区的抗体。
[0199]本发明提供了体内半衰期延长的特异性结合于EphA2多肽的抗体。具体地说，本发明提供了特异性结合于EphA2多肽的抗体，所述抗体在对象，优选哺乳动物，最优选人中的半衰期大于3天，大于7天，大于10天，优选大于15天，大于25天，大于30天，大于35天，大于40天，大于45天，大于2个月，大于3个月，大于4个月，或大于5个月。
[0200]为延长抗体(例如，单克隆抗体、单链抗体和Fab片段)在体内的血清循环，例如，可通过将聚乙二醇(PEG)位点特异性偶联于抗体的N-或C-末端或经赖氨酸残基上存在的ε-氨基将惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇连接到带有或不带有多功能接头的抗体。可采用线形或支链聚合物衍生以尽可能减少生物学活性丧失。可通过SDS-PAGE和质谱密切监测偶联程度，从而确保PEG分子与抗体正确偶联。可通过大小排阻层析或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG偶联物相分离。可采用精通本领域的技术人员熟知的方法，例如通过本文所述的免疫试验来检测PEG-衍生的抗体的结合活性以及体内功效。
[0201]也可在IgG恒定区或其FcRn结合片段(优选Fc或绞链-Fc结构域片段)中引入一个或多个氨基酸修饰(即，取代、***或删除)以产生体内半衰期延长的抗体。参见，例如，国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631；国际公开号WO 02/060919；美国专利申请公开号2006/0039904A1和美国专利号6,277,375，各文献通过引用全文纳入本文。
[0202]此外，可将抗体与白蛋白偶联以使该抗体或抗体片段在体内更加稳定或具有更长的体内半衰期。该技术是本领域熟知的，参见，例如，国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号EP 413,622，所有专利通过引用纳入本文。
[0203]为使本发明ADC根据需要起作用，选择要偶联于毒素的抗体的关键是一旦该抗体结合于靶细胞表面(例如EphA2或EphA4)即被该细胞内在化。一旦内在化，偶联的毒素可释放或维持结合，以便在细胞内发挥其毒性效应。
[0204]本发明ADC的抗体部分可包括但不限于：合成抗体、单克隆抗体、寡克隆抗体重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链FvFc(scFvFc)、单链Fv(scFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体。具体地说，用于本发明方法的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。本发明抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
[0205]本发明ADC的抗体部分可来自任何动物来源，其中包括禽类和哺乳动物(例如，人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。优选地，所述抗体是人或人源化单克隆抗体。文中，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白库或分离自表达人基因抗体的小鼠的抗体。
[0206]抗体像所有多肽一样具有等电点(pI)，其通常定义为多肽不携带净电荷时的pH。本领域知道当溶液的pH等于蛋白质的等电点(pI)时蛋白质的溶解度通常最低。可通过改变抗体中可电离残基的数目和位置而调节pI来优化溶解性。例如，可通过合适的氨基酸取代(例如，用带电荷的氨基酸，如赖氨酸取代不带电荷的残基，如丙氨酸)来操纵多肽的pI。不想受任何特定理论的束缚，导致所述抗体pI改变的抗体氨基酸取代可提高该抗体的溶解度和/或稳定性。本领域技术人员知道哪种氨基酸取代对于某具体抗体最适合获得所需pI。可采用各种方法，包括但不限于：等电聚集和各种计算机算法(参见，例如Bjellqvist等，1993，Electrophoresis，14：1023)测定蛋白质的pI。一实施方式中，本发明ADC的pI高于约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、或约9.0。在其他实施方式中，本发明ADC的pI高于6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。一实施方式中，导致本发明ADC的pI发生改变的取代将不会显著降低其对Eph受体的结合亲和力。本文所用的pI值定义为主要荷电形式的pI。可采用各种方法，包括但不限于：等电聚集和各种计算机算法(参见，例如Bjellqvist等，1993，Electrophoresis，14：1023)测定蛋白质的pI。
[0207]抗体Fab结构域的Tm是抗体热稳定性的良好指标，还表明了其储存寿命。Tm较低表明凝聚较多/稳定性较差，而Tm较高表明凝聚较少/稳定性较好。因此，优选Tm较高的抗体。在一个实施方式中，ADC的Fab结构域的Tm值高于至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃或120℃。在另一实施方式中，ADC的Fab结构域的Tm值高于至少约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、约105℃、约110℃、约115℃或约120℃。可采用本领域已知的任何标准方法，例如示差扫描量热法检测蛋白质结构域(例如，Fab结构域)的热解链温度(参见，例如Vermeer等，2000，Biophys.J.，78：394-404；Vermeer等，2000，Biophys.J.，79：2150-2154)。
[0208]本发明ADC的抗体部分可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性。多特异性抗体可特异性结合于所需靶分子的不同表位，或者可特异性结合于靶分子和异源表位，如异源多肽或固体支持材料。参见，例如，国际公开号WO 94/04690；WO 93/17715；WO 92/08802；WO91/00360；和WO 92/05793；Tutt等，1991，J.Immunol.147：60-69；美国专利号4,474,893，4,714,681，4,925,648，5,573,920，and 5,601,819；和Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547；各文献通过引用全文纳入本文)。一实施方式中，对一种Eph受体具有一种结合特异性，而对任何其他抗原(即，另一种Eph受体、肝配蛋白、信号传导或效应分子)具有另一种结合特异性。
[0209]多特异性抗体对至少两种不同抗原具有结合特异性。尽管这种分子通常将仅结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAbs)，但具有额外特异性的抗体如三特异性抗体也包括在本发明之内。BsAb的例子包括但不限于那些一个臂针对整联蛋白αvβ3而另一个臂针对任何其他抗原的抗体。制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，根据两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达来制备全长双特异性抗体，其中的两个链具有不同的特异性(Millstein等，1983，Nature，305：537-539，其通过引用全文纳入本文)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))可能产生不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常是通过亲和层析步骤完成的)相当麻烦，且产量很低。类似的方法披露于WO 93/08829，以及Traunecker等，1991，EMBOJ.，10：3655-3659。更加直接的方法是产生双-二抗，即四价双特异性抗体。产生双-二抗的方法是本领域已知的(见例如，Lu等，2003，J Immunol方法279：219-32；Marvin等，2005，Acta Pharmacolical Sinica 26：649)。
[0210]根据另一种方法，使具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选与包含至少部分绞链区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。一实施方式中，至少一种融合物中存在含有与轻链结合必需位点的第一重链恒定区(CH1)。编码免疫球蛋白重链融合物和可能需要的免疫球蛋白轻链的DNA被***不同表达载体，并共转染入合适的宿主生物。在构建时采用不等比例的三种多肽链可提供最佳产量的实施方式中，这样为调节三种多肽片段的相互比例提供了极大灵活性。然而，当以相等比例表达至少两条多肽链可得到高产量或者当该比例不是特别重要时也可以将两条或所有三条多肽链的编码序列***一种表达载体。
[0211]在该方法的一个实施方式中，所述双特异性抗体由第一臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链(例如，Eph受体)和另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。发现这种不对称结构有助于将所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合物分离，因为只在该双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链而提供了方便的分离方法。此方法见WO 94/04690(通过引用全文纳入本文)。产生双特异性抗体的其它细节可见，例如Suresh等，1986，《酶学方法》(Methodsin Enzymology)，121：210(通过引用全文纳入本文)。根据WO96/27011(通过引用全文纳入本文)所述的另一方法，可工程改造一对抗体分子以尽可能提高从重组细胞培养物中回收异质二聚体(heterodimer)的百分比。优选的界面含有抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在此方法中，用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小侧链的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大侧链氨基酸可在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空穴”。这提供了增加异质二聚体产率超过不要终产物(例如同质二聚体(homodimer))的机制。
[0212]在具体的实施方式中，本发明方法所用的抗体是双特异性T细胞召集抗体(bispecific T cell engager)(BiTE)。双特异性T细胞召集抗体(BiTE)是能将T细胞重定向而抗原特异性消除靶标的双特异性抗体。BiTE分子在其分子一端含有能与T细胞抗原(例如，CD3)结合的抗原结合结构域，(在另一端)含有能与靶细胞上的抗原结合的抗原结合结构域。近年来，纳入本文作为参考的WO 99/54440描述了BiTE。此出版物描述了含有CD19和CD3抗原结合位点的新型单链多功能多肽(CD19×CD3)。该分子源自两种抗体，一种与B细胞上的CD19结合，另一种抗体与T细胞上的CD3结合。这些不同抗体的可变区通过一多肽序列连接，从而产生一种分子。该出版物也描述了利用柔韧性接头连接重链(VH)和轻链(VL)可变结构域从而产生单链双特异性抗体。
[0213]在本发明的一个实施方式中，能与感兴趣多肽(例如，Eph受体和/或肝配蛋白)特异性结合的抗体或配体包含BiTE分子的一部分。例如，可将与感兴趣多肽(例如，Eph受体和/或肝配蛋白)特异性结合的抗体的VH和/或VL(例如，scFV)与抗-CD3结合部分，例如上述分子的该部分融合，从而产生靶向感兴趣多肽(例如，Eph受体和/或肝配蛋白)的BiTE分子。除了针对感兴趣多肽(例如，Eph受体和/或肝配蛋白)的抗体的重链和/或轻链可变结构域外，能与感兴趣多肽(例如，Eph受体和/或肝配蛋白)结合的其它分子可包含BiTE分子，例如受体(例如，Eph受体和/或肝配蛋白)。在另一实施方式中，BiTE分子可包含能与其它T细胞抗原(除CD3以外)结合的分子。例如，本发明一部分涵盖了能与T细胞抗原，例如CD2、CD4、CD8、CD11a、TCR和CD28特异性结合的配体和/或抗体。此清单不是穷尽性而只是说明能与T细胞抗原特异性结合的其它分子可用作BiTE分子的一部分。这些分子可包括抗体或天然配体(例如，LFA3，其天然配体是CD3)的VH和/或VL部分。
[0214]双特异性抗体包括交联的或“异偶联物(heteroconjugate)”抗体。例如，该异质偶联物中的一种抗体可与亲和素偶联，另一抗体与生物素偶联。有人提出，例如这种抗体可使免疫***细胞靶向有害的细胞(美国专利号4,676,980)并可用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP03089)。上述参考资料通过引用各自全文纳入本文。可采用常规的交联方法制备异质偶联物抗体。本领域熟知合适的交联剂和许多交联技术，可参见美国专利号4,676,980。上述参考资料各自通过引用全文纳入本文。
[0215]包括具有两价以上的掺有至少一个本发明绞链修饰的抗体。例如，可制备三特异性抗体。参见，例如Tutt等，J.Immunol.，147：60，1991，通过引用将其纳入本文。
[0216]本发明ADC的抗体部分包括单结构域抗体，包括骆驼化(camelized)单结构域抗体(见例如，Muyldermans等，2001，TrendsBiochem.Sci.26：230；Nuttall等，2000，Cur.Pharm.Biotech.1：253；Reichmann和Muyldermans，1999，J.Immunol.Meth.231：25；国际公开号WO 94/04678和WO 94/25591；美国专利号6,005,079；通过引用将其纳入本文)。
[0217]其它专门考虑的抗体是“寡克隆”抗体。本文所用的术语“寡克隆抗体”指不同单克隆抗体的预定混合物。参见，例如，PCT公开WO95/20401；美国专利号5,789,208和6,335,163，通过引用将它们纳入本文。优选地，寡克隆抗体由在一个细胞中产生的针对一种或多种表位的抗体预定混合物构成。更优选地，寡克隆抗体含有能与共同的轻链配对的多个重链，从而产生具有多特异性的抗体(例如，PCT公开WO 04/009618，通过引用将其纳入本文)。当需要靶向一个靶分子(例如，整联蛋白αvβ3)上的多个表位时，寡克隆抗体特别有用。本领域技术人员知道或能确定哪种类型的抗体或抗体混合物适用于所需目的和需要。
[0218]一实施方式中，本发明的ADC可被化学修饰(例如，可在抗体上连接一个或多个化学部分)或者可被修饰以改变其糖基化，进而改变该抗体的一种或多种功能特性。
[0219]再在其他实施方式中，本发明ADC的糖基化经修饰。例如，可制备去糖基化(aglycosylate)的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化从而，例如提高该抗体对靶抗原的亲和力。这种碳水化合物修饰可伴有，例如抗体序列中一个或多个糖基化位点的改变。例如，可作出一个或多个氨基酸取代以消除一个或多个可变区框架的糖基化位点从而消除该位点的糖基化。这种去糖基化可提高该抗体对抗原的亲和力。美国专利号5,714,350和6,350,861进一步详述了这种方法，各文献通过引用全文纳入本文。
[0220]除此之外或者作为替代，可将ADC制成糖基化类型改变，例如岩藻糖基残基含量降低的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或含有GlcNAc双剖面结构增强的抗体。已证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可伴有，例如在宿主细胞中表达糖基化机制改变的抗体。本领域已描述了糖基化机制改变的细胞，这些细胞可用作宿主细胞来表达本发明重组抗体从而产生糖基化改变的抗体。可参见，例如Shields，R.L.等，(2002)，J.Biol.Chem.，277：26733-26740；Umana等，(1999)，Nat.Biotech.，17：176-1，以及欧洲专利号EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342，各文献通过引用全文纳入本文。
[0221]再在其他实施方式中，本发明ADC的糖基化经修饰。例如，可制备去糖基化(aglycosylate)的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化从而，例如提高该抗体对靶抗原的亲和力。这种碳水化合物修饰可伴有，例如抗体序列中一个或多个糖基化位点的改变。例如，可作出一个或多个氨基酸取代以消除一个或多个可变区框架的糖基化位点从而消除该位点的糖基化。这种去糖基化可提高该抗体对抗原的亲和力。美国专利号5,714,350和6,350,861进一步详述了这种方法，各文献通过引用全文纳入本文。
[0222]除此之外或者作为替代，可将ADC制成糖基化类型改变，例如岩藻糖基残基含量降低的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或含有GlcNAc双剖面结构增强的抗体。已证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可伴有，例如在宿主细胞中表达糖基化机制改变的抗体。本领域已描述了糖基化机制改变的细胞，这些细胞可用作宿主细胞来表达本发明重组抗体从而产生具有改变糖基化的抗体。可参见，例如Shields，R.L.等，(2002)，J.Biol.Chem.，277：26733-26740；Umana等，(1999)，Nat.Biotech.，17：176-1，以及欧洲专利号EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342，各文献通过引用全文纳入本文。
[0223]本发明也包括抗体依赖性细胞介导细胞毒性活性提高的Fc变体抗体。这种Fc变体抗体的非限制性例子公开于美国专利申请11/203,253(2005年8月15日提交，并作为美国专利申请公开号US2006/0039904A1公开)和11/203,251(2005年8月15日提交)，美国临时专利申请60/674,674(2005年4月26日提交)和60/713,711(2005年9月6日提交)，各篇文献全文纳入本文作为参考。
抗体偶联物
[0224]本发明包括利用抗体或其片段与异源试剂重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)以产生融合蛋白同时作为靶分子和抗-EphA2或抗-EphA4试剂。所述异源试剂可以是多肽(或其片段，优选至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)、核酸、小分子(小于1000道尔顿)、或者无机或有机化合物。融合不一定非要直接(融合)，而可通过接头序列融合。可采用本领域已知的方法在体内使用融合于或偶联于异源试剂的抗体以检测、治疗、控制或监测疾病的进展。参见，例如，国际公开WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，1994，Immunol.Lett.39：91-99；美国专利5,474,981；Gillies等，1992，PNAS 89：1428-1432；和Fell等，1991，J.Immunol.146：2446-2452，通过引用将它们全文纳入本文。一些实施方式中，要检测、治疗、控制或监测的疾病是过表达EphA2或EphA4的恶性癌症。在其他实施方式中，要检测、治疗、控制或监测的疾病是与过表达EphA2或EphA4的细胞相关的癌前状态(pre-cancerouscondition)。在具体的实施方式中，所述癌前状态是高级别的***上皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性囊肿病或复合性痣。
[0225]本发明还包括含有融合于或偶联于抗体片段的异源试剂的组合物。例如，所述异源多肽可以融合于或偶联于Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、或其一部分。将多肽融合于或偶联于抗体部分的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；国际公开号WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等，1991，PNAS 88：10535-10539；Zheng等，1995，J.Immunol.154：5590-5600；和Vil等，1992，PNAS89：11337-11341(所述参考文献通过引用全文纳入本文)。
[0226]可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)等技术产生其他融合蛋白，例如EA2-5、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、表2或3或者图1-59中所列的任何抗体、或EA44(或任何其他EphA2/EphA4激动抗体或EphA2/EphA4癌细胞表型抑制抗体或暴露的EphA2/EphA4表位抗体或以小于3×10-3s-1的Koff结合EphA2或EphA4的EphA2/EphA4抗体)的融合蛋白。DNA改组可用来改变本发明抗体或其片段的活性(例如，亲合力较高和解离速率较低的抗体或其片段)。一般可参见美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458，以及Patten等，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama，1998，TrendsBiotechnol.16：76；Hansson等，1999，J.Mol.Biol.287：265；和Lorenzo和Blasco，1998，BioTechniques 24：308(通过引用将这些专利和出版物各自全文纳入本文)。先通过易错PCR、随机核苷酸***或其它方法进行随机诱变，再重组可改变抗体或其片段，或者编码的抗体或其片段。可将编码各部分能与EphA2或EphA4特异性结合的抗体或抗体片段的多核苷酸的一个或多个部分与一种或多种异源试剂的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等等重组(recombine)。
[0227]一实施方式中，可将本发明抗体或者其片段或变体偶联于标记序列(例如肽)以便于纯化。在某些实施方式中，所述标记氨基酸序列是六个组氨酸的肽，例如pQE载体中提供的标签(恰根公司(QIAGEN，Inc.)，加利福尼亚州查特沃斯伊顿大道9259号，91311(Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311))，其中许多可通过商业获得。如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824中所述，六-组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于：对应于衍生自流感血凝素蛋白某表位的血凝素“HA”标签(Wilson等，Cell，37：767，(1984))和“flag”标签。
[0228]在其他实施方式中，本发明的抗体或者其片段或变体偶联于诊断或检测试剂。可将这种抗体用作临床检测过程的一部分来监测或预测癌症的发生或进展，例如测定特定疗法的功效。此外，这种抗体可用于监测或预测与过表达EphA2或EphA4的细胞相关的癌前状态(例如，高级别的***上皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性囊肿病或复合性痣)的发生或进展。一实施方式中，暴露的EphA2或EphA4表位抗体被偶联于诊断或检测试剂。
[0229]可将抗体与可检测物质偶联来实现这种诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于：各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素及亲和素/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于；生物发光物质，例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母蛋白；放射性物质，例如但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；用于各种正电子发射断层显像的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
[0230]在其他实施方式中，本发明的抗体或者其片段或变体偶联于治疗药如细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗药或放射性金属离子(例如，α-射线发射体)。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何试剂。其例子包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、二羟蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***、和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。治疗药包括但不限于：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺)；烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、亚硝基脲氮芥(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)；环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)和顺铂)；蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)；抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))；和抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
[0231]一实施方式中，所述细胞毒剂选自烯二炔(enediyne)、lexitropsin、duocarmycin、紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀、美登醇(maytansinoid)和长春花生物碱。在其他实施方式中，所述细胞毒剂是紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、托泊替康、吗啉代-阿霉素、根霉素、氰基吗啉代-阿霉素、多拉司他汀-10、棘霉素、考布他汀、刺孢霉素(calicheamicin)、美登素、DM-1、奥瑞斯他汀或其他多拉司他汀衍生物，如奥瑞斯他汀E或奥瑞斯他汀F、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(单甲基奥瑞斯他汀E)、MMAF(单甲基奥瑞斯他汀F)、软珊瑚醇或纺锤菌素。MMAE和MMAF的结构描述于图25-27。
[0232]再在其他实施方式中，本发明ADC的细胞毒剂是抗-微管蛋白剂。在更加具体的实施方式中，所述细胞毒剂选自：长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、念珠藻环肽(cryptophysin)、美登醇、考布他汀和多拉司他汀。在更加具体的实施方式中，所述细胞毒剂是长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、epithilone A、epithilone B、诺可唑、秋水仙碱(coichicine)、秋水仙酰胺(colcimid)、雌氮芥、西马多丁、盘皮海绵内酯、美登素、DM-1、奥瑞斯他汀或其他多拉司他汀衍生物，如奥瑞斯他汀E或奥瑞斯他汀F、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(单甲基奥瑞斯他汀E)、MMAF(单甲基奥瑞斯他汀F)、软珊瑚醇或纺锤菌素。
[0233]在具体的实施方式中，本发明ADC的细胞毒剂是MMAE。在其他具体实施方式中，本发明ADC的细胞毒剂是AEFP。在进一步的具体的实施方式中，本发明ADC的细胞毒剂是MMAF。
[0234]毒素、间隔区、接头、序列段(stretcher)等的进一步的例子以及它们的结构可在美国专利申请公开号2006/0074008A1，2005/0238649A1，2005/0123536A1，2005/0180972A1，2005/0113308A1，2004/0157782A1，美国专利号6,884,869B2，美国专利号5,635,483中找到，所有这些通过引用全文纳入本文。
[0235]如本文所讨论的，用于与本发明ADC偶联的药物可包括常规的化疗药，如阿霉素、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、氨甲喋呤、丝裂霉素C、依托泊甙等。此外，也可采用条件性稳定接头将诸如CC-1065类似物、calichiamicin、美登素、多拉司他汀10类似物、根霉素和水螅毒素等有效试剂与ADC相连以形成有效的免疫偶联物。
[0236]在某些实施方式中，本发明ADC所包含的药物对表达EphA2或EphA4的细胞的作用比阿霉素强至少40倍。这种药物包括但不限于：DNA小沟结合剂，包括烯二炔和lexitropsin，duocarmycin，紫杉烷(包括紫杉醇和多西他赛)，嘌呤霉素，长春花生物碱，CC-1065，SN-38，托泊替康，吗啉代-阿霉素，根霉素，氰基吗啉代-阿霉素，棘霉素，考布他汀，纺锤菌素，epithilone A和B，雌氮芥，念珠藻环肽，西马多丁，美登醇，多拉司他汀，例如，奥瑞斯他汀E，多拉司他汀10，MMAE，MMAF，盘皮海绵内酯，软珊瑚醇，和米托蒽醌。
[0237]在某些具体的实施方式中，本发明ADC包含烯二炔部分。在具体的实施方式中，所述烯二炔部分是刺孢霉素。烯二炔化合物通过经Bergman环化产生的双自由基而切割双链DNA。
[0238]在某些具体实施方式中，所述细胞毒剂或细胞抑制剂是奥瑞斯他汀E或奥瑞斯他汀F，或其衍生物。在进一步的实施方式中，所述奥瑞斯他汀E衍生物是由奥瑞斯他汀E和酮酸形成的酯。例如，奥瑞斯他汀E可与对乙酰苯甲酸或苯甲酰戊酸反应分别生成AEB和AEVB。其他奥瑞斯他汀衍生物包括MMAE、MMAF和AEFP。
[0239]与多拉司他汀-10一样，奥瑞斯他汀E的合成和结构及其衍生物在本领域也是已知的，描述于美国专利申请公开号2003/0083263A1和2005/0009751A1；国际专利申请号PCT/US02/13435，美国专利号6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414，所有这些通过引用全文纳入本文。
[0240]在具体的实施方式中，所述药物是DNA小沟结合剂。这种化合物的例子以及它们的合成披露于美国专利号6,130,237，通过引用将其全文纳入本文。在某些实施方式中，所述药物是CBI化合物。
[0241]在本发明的某些实施方式中，本发明ADC包含抗-微管蛋白剂。所述抗-微管蛋白剂是一类熟知的治疗癌症的化合物。抗-微管蛋白剂的例子包括但不限于：紫杉烷(例如，Taxol.RTM.(紫杉醇)，多西他赛)，T67(Tularik)，长春花，和奥瑞斯他汀(例如，奥瑞斯他汀E，AEB，AEVB，MMAE，MMAF，AEFP)。该类所包含的抗微管蛋白剂还有：长春花生物碱，包括长春新碱和长春花碱，长春地辛和长春瑞滨；紫杉烷如紫杉醇和多西他赛和浆果赤霉素衍生物，epithilone A和B，诺可唑，氟尿嘧啶(□luorouraci)和秋水仙酰胺，雌氮芥，念珠藻环肽，西马多丁，美登醇，考布他汀，多拉司他汀，盘皮海绵内酯和软珊瑚醇。
[0242]在具体的实施方式中，所述药物是美登醇(一类抗-微管蛋白剂)。在更加具体的实施方式中，所述药物是美登素。再者，在具体的实施方式中，所述细胞毒剂或细胞抑制剂是DM-1(免疫基因公司(ImmunoGen，Inc.)；也可参见Chari等1992，Cancer Res 52：127-131)。美登素是一种天然产物，它能抑制微管蛋白聚合从而导致有丝***终止和细胞死亡。因此，美登素的作用机制似乎与长春新碱和长春花碱类似。然而，美登素的体外细胞毒性比这些长春花生物碱类强约200-1,000倍。在其他具体实施方式中，所述药物是AEFP。
[0243]在本发明的某些具体实施方式中，所述药物不是长于50、100或200个氨基酸的多肽，例如毒素。在本发明的具体实施方式中，所述药物不是蓖麻毒蛋白。
[0244]在本发明其他的具体实施方式中，本发明ADC不包含一种或多种细胞毒剂或细胞抑制剂，包括以下非相互排除类型的试剂：烷化剂，蒽环类抗生素，抗生素，二氢叶酸拮抗物，抗代谢物，抗微管蛋白剂，奥瑞斯他汀，化疗敏化剂，DNA小沟结合剂，DNA复制抑制剂，duocarmycin，依托泊甙，氟化嘧啶，lexitropsin，亚硝基脲，顺铂，嘌呤抗代谢物，嘌呤霉素，放疗敏化剂，类固醇，紫杉烷，拓扑异构酶抑制剂，长春花生物碱，嘌呤拮抗剂，和二氢叶酸还原酶抑制剂。在更加具体的实施方式中，所述高效药物不是以下一种或多种：雄激素，氨茴霉素(AMC)，天冬酰胺酶，5-氮胞苷，硫唑嘌呤，博来霉素，白消安，丁硫氨酸亚矾胺，喜树碱，卡铂，卡氮芥(BSNU)，CC-1065，苯丁酸氮芥，顺铂，氟尿嘧啶，环磷酰胺，阿糖胞苷，阿糖胞苷(cytidine arabinoside)，细胞松弛素B，达卡巴嗪，放线菌素D(以前称为放线菌素)，柔红霉素，氨烯咪胺，多西他赛，阿霉素，***，5-氟脱氧尿苷，5-氟尿嘧啶，短杆菌肽D，羟基脲，伊达比星，异环磷酰胺，伊立替康，洛莫司汀(CCNU)，氮芥，美法仑，6-巯基嘌呤，氨甲喋呤，光神霉素，丝裂霉素C，米托蒽醌，硝基咪唑，紫杉醇，普卡霉素，丙卡巴肼(procarbizine)，链脲菌素，鬼臼噻吩甙(tenoposide)，6-巯鸟嘌呤，噻替派，托泊替康，长春花碱，长春新碱，长春瑞滨，VP-16，VM-26，硫唑嘌呤，霉酚酸酯，氨甲喋呤，无环鸟苷，gangcyclovir，齐多夫定，阿糖腺苷，利巴韦林(ribavarin)，叠氮胸苷，阿糖胞苷，金刚胺，双脱氧尿苷，碘代脱氧尿苷，膦甲酸钠(poscarnet)，和三氟尿苷。
[0245]在某些实施方式中，所述细胞毒剂或细胞抑制剂是多拉司他汀。在更加具体的实施方式中，所述多拉司他汀为奥瑞斯他汀类型。在本发明的具体实施方式中，所述细胞毒剂或细胞抑制剂是MMAE。在本发明其他的具体实施方式中，所述细胞毒剂或细胞抑制剂是AEFP。在本发明其他的具体实施方式中，所述细胞毒剂或细胞抑制剂是MMAF。
[0246]在其他实施方式中，本发明抗体或者其片段或变体偶联于能修饰特定生物反应的治疗药或药物部分。所述治疗药或药物部分不能认为仅限于典型的化疗药。例如，所述药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如，毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡物质(如TNF-α、TNF-β)、AIM I(参见国际公开号WO97/33899)、AIM II(参见国际公开号WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等，1994，Int.Immunol.，6：1567-1574)、和VEGI(参见国际公开号WO99/23105)；血栓形成药或抗血管发生药，例如制管张素或内皮生长抑制素；或者生物反应修饰剂，如淋巴因子(例如，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-4(“IL-4”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-7(“IL-7”)、白介素-9(“IL-9”)、白介素-15(“IL-15”)、白介素-12(“IL-12”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))、或生长因子(如，生长激素(“GH”))。
[0247]在其他实施方式中，本发明的抗体或者其片段或变体偶联于治疗药，如放射性材料或用于偶联放射性离子的大环螯合剂(放射性材料的例子见上文)。在某些实施方式中，所述大环螯合剂是可经接头分子与抗体相连的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”-四乙酸(DOTA)。这种接头分子将在下文中进一步讨论，它们通常是本领域已知的并描述于Denardo等，1998，Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等，1999，Bioconjug.Chem.10(4)：553；Zimmerman等，1999，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，各篇文献全文纳入本文作为参考。
[0248]在具体的实施方式中，所述偶联抗体是优选结合暴露在癌细胞而不是非癌细胞上的EphA2或EphA4表位的EphA2或EphA4抗体(即，暴露的EphA2或EphA4表位抗体)。在其他具体实施方式中，所述偶联抗体不是EA2或EA4。在其他具体实施方式中，所述偶联抗体不是EA44。
[0249]将治疗性部分偶联于抗体是技术是熟知的。可通过本领域已知的任何方法将各部分偶联于抗体，所述方法包括但不限于：醛/席夫连接键、巯基连接键、酸不稳定连接键、顺式乌头连接键、腙连接键、酶可降解连接键(通常可参见Garnett，2002，Adv.Drug Deliv.Rev.53：171-216)。将治疗性部分偶联于抗体的其他技术也是熟知的，可参见，例如，Arnon等，“癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体”(Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)，刊于《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)，Reisfeld等编，第243-56页(阿兰李斯公司(Alan R.Liss，Inc.)，1985)；Hellstrom等，“用于药物递送的抗体”(Antibodies For Drug Delivery)，刊于《受控药物递送》(Controlled Drug Delivery)，(第二版)，Robinson等编，第623-53页(MD公司(Marcel Dekker，Inc.)，1987)；Thorpe，“癌症治疗中的细胞毒性药物的抗体运载体：综述”(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review)，刊于《单克隆抗体‘84：生物学和临床应用》(Monoclonal Antibodies‘84：Biological And Clinical Applications)，Pinchera等编，第475-506页，(1985)；“癌症治疗中放射性标记抗体的治疗性应用”(Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy)，刊于《癌症检测和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy)，Baldwin等编，第303-16页(学术出版社(Academic Press)，1985)，以及Thorpe等，1982，Immunol.Rev.62：119-58。将抗体融合于或偶联于多肽部分的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,336,603，5,622,929，5,359,046，5,349,053，5,447,851，和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；国际公开号WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等，1991，PNAS 88：10535-10539；Zheng等，1995，J.Immunol.154：5590-5600；和Vil等，1992，PNAS 89：11337-11341。抗体与某部分的融合不一定必须直接融合，而可通过接头序列融合。这种接头分子是本领域常规已知的，描述于Denardo等，1998，Clin Cancer Res.4：2483-90；Peterson等，1999，Bioconjug.Chem.10：553；Zimmerman等，1999，Nucl.Med.Biol.26：943-50；Garnett，2002，Adv.DrugDeliv.Rev.53：171-216，各文献通过引用全文纳入本文。
[0250]可采用两种方法尽可能降低药物在本发明ADC所靶向的细胞外的活性：第一种方法是，可使用结合细胞膜而不是可溶性EphA2或EphA4的抗体，从而药物(包括在前药转化酶作用下产生的药物)集中于活化的淋巴细胞的细胞表面。一种尽可能降低结合于本发明抗体的药物的活性的更优选方法是药物的偶联方式能降低药物活性，除非它们被水解或切离抗体。可采用这种方法将药物连接于带有接头的抗体，所述接头对活化的淋巴细胞的细胞表面环境(例如，存在于活化淋巴细胞的细胞表面的蛋白酶活性)敏感，或者当所述偶联物被活化淋巴细胞摄取时，对偶联物所遇到的活化淋巴细胞的内部环境敏感(例如，在内体或溶酶体环境内，比如借助pH敏感性或蛋白酶敏感性)。可用于本发明的接头的例子披露于美国专利申请公开号2005/0123536A1，2005/0180972A1，2005/0113308A1，2004/0157782A1，和美国专利号6,884,869B2，所有文献通过引用全文纳入本文。
[0251]一实施方式中，所述接头是在溶酶体中被水解的酸不稳定性腙或酰肼基团(参见，例如，美国专利号5,622,929)。在其他实施方式中，可通过其他酸不稳定性接头如顺乌头酸酰胺、原酸酯、缩醛和缩酮将药物连到抗体上(Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville等，1989，Biol.Chem.264：14653-14661)。这种接头在中性pH环境如血液环境下相对稳定，而在低于pH 5(大约是溶酶体的pH)时不稳定。
[0252]在其他实施方式中，采用被胞内蛋白酶切除的肽间隔区(spacer)将药物连于本发明的抗体。目标酶类包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知它们都能够水解二肽药物衍生物从而在靶细胞内释放活性药物(Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123)。采用胞内蛋白水解药物释放的好处在于，当偶联时药物被高度减毒并且偶联物的血清稳定性非常高。
[0253]再在其他实施方式中，所述接头是丙二酸接头(Johnson等，1995.AntiCancer Res.15：1387-93)、马来酰亚氨基苄基(maleimidobenzoyl)接头(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)、或′-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(103：1305-12)。
[0254]如上所述，通常是通过接头将药物偶联于抗体来制备ADC。因此，本发明的大部分ADC除了包含抗-EphA2或EphA4抗体和高度有效的药物和/或促进内在化的药物外，还包含接头。本领域已知的任何接头都可用于本发明的ADC，例如，双官能试剂(如二醛或亚氨酸酯)或分支的腙接头(参见，例如，美国专利号5,824,805，通过引用将其全文纳入本文)。
[0255]在本发明的某些非限制性实施方式中，位于ADC的药物部分和抗体部分之间的接头区域在一定条件下可被切除，其中，接头的切除或释放能从抗体部分中释放出药物部分。优选地，所述接头在胞内环境下易被切除或水解。
[0256]一实施方式中，如果pH改变达到某个值或超过某个值则位于ADC的药物部分和抗体部分之间的接头区域可被切除。在本发明的其他实施方式中，在溶酶体周围，例如在酸性条件(即，pH在5-5.5附近或更低)下所述接头可被切除。在其他实施方式中，所述接头是可被肽酶或蛋白酶切除的肽酰接头，所述酶类包括但不限于溶酶体蛋白酶、膜相关蛋白酶、胞内蛋白酶或内体蛋白酶。典型地，所述接头的长度至少有两个氨基酸，更典型地，其长度至少有三个氨基酸。优选可被表达EphA2或EphA4的癌症(细胞)中存在的酶切割的肽酰接头。例如，可使用可被组织蛋白酶-B切割的肽酰接头(例如，Gly-Phe-Leu-Gly接头)，组织蛋白酶-B是一种在癌组织中高度表达的依赖于硫醇的蛋白酶。其他此类接头描述于，例如，美国专利号6,214,345，通过引用将其全文纳入本文。
[0257]在本发明其他一些非相互排除的实施方式中，与本发明ADC的抗-EphA2或EphA4抗体和药物偶联的接头能促进细胞内在化。在某些实施方式中，ADC的接头-药物部分能促进细胞内在化。在某些实施方式中，选择特定的接头以使完整ADC的结构能促进细胞内在化。
[0258]在本发明的具体实施方式中，缬氨酸-瓜氨酸衍生物被用作接头(val-cit接头)。带有val-cit接头的阿霉素的合成之前已经描述过(Dubowchik和Firestone的美国专利号6,214,345，通过引用将其全文纳入本文)。
[0259]在进一步的具体的实施方式中，所述接头是马来酰亚胺己酰基-瓜氨酸接头或马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头。
[0260]在其他具体实施方式中，所述接头是phe-lys接头。
[0261]在其他具体实施方式中，所述接头是硫醚接头(参见，例如，授予Willner等的美国专利号5,622,929，通过引用将其全文纳入本文)。
[0262]再在另一个具体实施方式中，所述接头是腙接头(参见，例如，授予Greenfield等的美国专利号5,122,368以及授予King等的5,824,805，通过引用将它们全文纳入本文)。
[0263]再在其他一些具体的实施方式中，所述接头是二硫化物接头。本领域已知许多二硫化物接头，其中包括但不限于可用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的接头。SPDB和SMPT(参见，例如，Thorpe等，1987，Cancer Res.，47：5924-5931；Wawrzynczak等，1987，选自《免疫偶联物：癌症放疗和疗法中的抗体偶联物》(Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapyof Cancer)，C.W.Vogel编，牛津大学出版社(Oxford U.Press)，第28-55页；也可参见Thorpe等的美国专利号4,880,935，通过引用将其全文纳入本文)。
[0264]可用于本发明的组合物和方法的各种接头描述于美国专利申请公开号US 2004/0018194A1，通过引用将其全文纳入本文。
[0265]再在本发明的其他实施方式中，抗-EphA2或EphA4抗体-接头-药物偶联物(抗-EphA2或抗-EphA4ADC)的接头单元连接细胞毒剂或细胞抑制剂(药物单元；-D)和抗-EphA2或EphA4抗体单元(-A)。文中，术语抗-EphA2或抗-EphA4ADC包括具有和具有接头单元的抗-EphA2或抗-EphA4抗体药物偶联物。在某些实施方式中，所述接头单元具有以下通式：
[0266]-Ta-Ww-Yy-
[0267]式中：
[0268]-T-是序列段单元；
[0269]a是0或1；
[0270]各-W-独立为氨基酸单元；
[0271]w独立为2-12的整数；
[0272]-Y-是间隔区单元；和
[0273]y是0、1或2。
[0274]序列段单元(-T-)存在时将抗-EphA2或抗-EphA4抗体单元连接于氨基酸单元(-W-)。可存在于抗-EphA2或抗-EphA4抗体上的天然的或经化学处理的有用官能团包括但不限于：巯基，氨基，羟基，糖类的异头羟基，和羧基。优选的官能团是巯基和氨基。巯基可通过还原抗-EphA2或抗-EphA4抗体的分子内二硫键而产生。或者，巯基可通过用2-亚氨基四氢噻吩(iminothiolane)(Traut试剂)或其他巯基生成剂还原抗-EphA2或抗-EphA4抗体赖氨酸部分的氨基而产生。在具体的实施方式中，所述抗-EphA2或抗-EphA4抗体是重组抗体并经工程改造成携带一个或多个赖氨酸。在其他实施方式中，所述重组抗-EphA2或抗-EphA4抗体经工程改造成携带额外的巯基，例如，额外的半胱氨酸。
[0275]在某些具体的实施方式中，所述序列段单元与抗-EphA2或抗-EphA4抗体单元的硫原子形成键。所述硫原子可源自被还原的抗-EphA2或抗-EphA4抗体(A)的巯基(-SH)。在某些其他的具体实施方式中，所述序列段单元经抗-CD30抗体单元的硫原子和序列段单元的硫原子之间的二硫键与抗-CD30抗体单元(A)相连。
[0276]再在其他具体实施方式中，所述序列段的反应性基团含有可与抗-EphA2或抗-EphA4抗体的氨基反应的反应性位点。所述氨基可以是精氨酸或赖氨酸的氨基。合适的胺反应性位点包括但不限于：活化的酯类，如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、酐、酸性氯化物、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
[0277]再在本发明的另一个方面，序列段的反应性官能团包含能与抗-EphA2或抗-EphA4抗体上存在的修饰的糖类基团反应的反应性位点。在具体的实施方式中，所述抗-EphA2或抗-EphA4抗体被酶糖基化以提供糖部分。所述糖可被诸如高碘酸钠等试剂温和氧化，而所得被氧化的糖的羰基单元可与含有诸如酰肼、肟、反应性胺、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼、和芳基酰肼等官能团的序列段缩合，如Kaneko，T.等，Bioconiugate Chem1991，2，133-41所述的那些。
[0278]如果存在间隔区单元，所述氨基酸单元(-W-)将序列段单元(-T-)连接到间隔区单元(-Y-)，而如果不存在间隔区单元则将序列段单元连接到细胞毒剂或细胞抑制剂(药物单元；D)。
[0279]-Ww-是二肽、三肽、四肽、戊肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。所述接头单元的氨基酸单元可被包括但不限于肿瘤相关性蛋白酶在内的酶切割以释放药物单元(-D)，药物单元在释放后在体内被质子化以提供细胞毒药物(D)。
[0280]在一种实施方式中，所述氨基酸单元是苯丙氨酸-赖氨酸二肽(phe-lys或FK接头)。在其他实施方式中，所述氨基酸单元是缬氨酸-瓜氨酸二肽(val-cit或VC接头)。
[0281]所述间隔臂单元(-Y-)当存在时将氨基酸单元连接到药物单元。间隔臂单元通常有两种类型：自我牺牲型和非自我牺牲型。非自我牺牲型间隔臂单元中的部分或所有间隔臂单元在从抗-EphA2或抗-EphA4抗体-接头-药物偶联物或药物-接头化合物上酶切下氨基酸单元后仍旧与药物单元结合。非自我牺牲型间隔臂单元的例子包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)间隔臂单元和甘氨酸间隔臂单元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元或甘氨酸间隔臂单元的本发明抗-EphA2或抗-EphA4抗体-接头-药物偶联物被肿瘤细胞相关性蛋白酶、癌细胞相关性蛋白酶或淋巴细胞相关性蛋白酶酶切时，甘氨酸-甘氨酸-药物部分或甘氨酸-药物部分从A-T-Ww-上切割下来。为释放药物，靶细胞内可发生独立的水解反应以切割甘氨酸-药物单元之间的键。
[0282]自我牺牲型间隔臂的其他例子包括但不限于：与PAB基团在电子上等价的芳香性化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(例如，见Hay等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，9，2237)和邻-或对-氨基苄基缩醛。可采用酰胺键水解后易于环化的间隔臂，如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等，Chemistry，Biology，1995，2，223)、适当取代的环***(Storm等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。在甘氨酸的α-位有取代的含胺药物的消除(Kingsbury等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是可用于本发明的抗体-接头-药物偶联物的自我牺牲型间隔臂策略的例子。
[0283]在具体的实施方式中，本发明ADC的抗-EphA2或EphA4抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头是肽接头。在具体的实施方式中，本发明ADC的抗-EphA2或EphA4抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头是val-cit接头、phe-lys接头、腙接头、或二硫化物接头。在某些实施方式中，本发明ADC的抗-EphA2或EphA4抗体通过肽接头偶联于细胞毒剂。
[0284]在某些实施方式中，本发明的偶联物是抗-EphA2-缬氨酸-瓜氨酸-MMAE(抗-EphA2-val-citMMAE或抗-EphA2-vcMMAE)，或抗-EphA2-缬氨酸-瓜氨酸-MMAF，或抗-EphA2-马来酰亚氨基乙酰基-瓜氨酸-MMAE，或抗-EphA2-马来酰亚氨基乙酰基-瓜氨酸-MMAF，或抗-EphA2-缬氨酸-瓜氨酸-AEFP(抗-EphA2-val-citAEFP或抗-EphA2-vcAEFP)。在具体的实施方式中，本发明的偶联物是G5-缬氨酸-瓜氨酸-MMAE(G5-val-citMMAE或G5-vcMMAE)或G5-缬氨酸-瓜氨酸-AEFP(G5-val-citAEFP或G5-vcAEFP)。
[0285]在进一步的具体的实施方式中，本发明的偶联物是连接到-缬氨酸-瓜氨酸-MMAE、连接到-缬氨酸-瓜氨酸-MMAF、连接到-马来酰亚氨基乙酰基-瓜氨酸-MMAE、连接到马来酰亚氨基乙酰基-瓜氨酸-MMAF、或连接到-缬氨酸-瓜氨酸-AEFP的选自本发明图1-59中所述抗体的抗体。
[0286]在某些实施方式中，本发明的偶联物是抗-EphA4-缬氨酸-瓜氨酸-MMAE(抗-EphA4-val-citMMAE或抗-EphA4-vcMMAE)或抗-EphA4-缬氨酸-瓜氨酸-AEFP(抗-EphA4-val-citAEFP或抗-EphA4-vcAEFP)。
[0287]在其他实施方式中，本发明的偶联物是抗-EphA2-苯丙氨酸-赖氨酸-MMAE(抗-EphA2-phe-lysMMAE或抗-EphA2-fkMMAE)或抗-EphA2-苯丙氨酸-赖氨酸-AEFP(抗-EphA2-phe-lysAEFP或抗-EphA2-fkAEFP)。
[0288]在具体的实施方式中，本发明的偶联物是G5-苯丙氨酸-赖氨酸-MMAE(G5-phe-lysMMAE或G5-fkMMAE)或G5-苯丙氨酸-赖氨酸-AEFP(G5-phe-lysAEFP或G5-fkAEFP)。
[0289]在具体的实施方式中，本发明的偶联物是连接到-苯丙氨酸-赖氨酸-MMAE、或苯丙氨酸-赖氨酸-MMAF、或-苯丙氨酸-赖氨酸-AEFP的选自本发明图1-59中所述抗体的抗体。
[0290]在其他实施方式中，本发明偶联物是抗-EphA4-苯丙氨酸-赖氨酸-MMAE(抗-EphA4-phe-lysMMAE或抗-EphA4-fkMMAE)或抗-EphA4-苯丙氨酸-赖氨酸-AEFP(抗-EphA4-phe-lysAEFP或抗-EphA4-fkAEFP)。
[0291]因此，在具体的实施方式中，本发明提供治疗对象的癌症的方法，所述方法包括给予该对象所述治疗有效量的含有(a)G5-val-cit-MMAE；和(b)药学上可接受的载体的药物组合物。
[0292]在其他具体实施方式中，本发明提供了治疗对象的癌症的方法，所述方法包括给予该对象所述治疗有效量的含有(a)G5-val-cit-AEFP；和(b)药学上可接受的载体的药物组合物。
[0293]在其他具体实施方式中，本发明提供了治疗对象的癌症的方法，所述方法包括给予该对象所述治疗有效量的含有(a)G5-val-cit-MMAF；和(b)药学上可接受的载体的药物组合物。
[0294]在某些实施方式中，本发明ADC的抗-EphA2或EphA4抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头在pH小于5.5时可被切割。在具体的实施方式中，所述接头在pH小于5.0时可被切割。
[0295]在某些实施方式中，本发明ADC的抗-EphA2或EphA4抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头可被蛋白酶切割。在具体的实施方式中，所述蛋白酶是溶酶体蛋白酶。在其它具体实施方式中，所述蛋白酶是膜相关蛋白酶、胞内蛋白酶、或内体蛋白酶等。
[0296]或者，抗体可偶联于第二抗体以形成如美国专利号4,676,980中所述的抗体异质偶联物，该专利通过引用全文纳入本文。
[0297]抗体也可附于固体支持物，这对于靶抗原的免疫试验或纯化特别有用。这种固体支持物包括但不限于：玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
[0298]一实施方式中，本发明的抗体一旦结合即被内在化进入细胞，其中的内在化比对照抗体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％，如本文所述。
[0299]在其他实施方式中，本发明的抗体一旦结合即被内在化进入细胞，其中的内在化比对照抗体高1-10％、10-20％、20-30％、30-40％，40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-110％、110-120％、120-130％、130-140％、140-150％、150-160％、160-170％，如本文所述。
[0300]在其他实施方式中，本发明的抗体一旦结合即被内在化进入细胞，通过使用第二皂苷抗体进行的内在化试验测得，其中的内在化比对照抗体高1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-110％、110-120％、120-130％、130-140％、140-150％、150-160％、160-170％。
[0301]在其他实施方式中，本发明的抗体当与细胞结合时能活化受体并内在化，且不显示出与人类心脏的组织交叉反应性，如本文所述。
[0302]在其他实施方式中，本发明的抗体当与细胞结合时能活化受体并内在化，且当以较低剂量施用时不显示出与人类心脏的组织交叉反应性，如本文所述。
[0303]在其他实施方式中，本发明的抗体当与细胞结合时不会激活受体但能内在化，且不显示出与人类心脏的组织交叉反应性，如本文所述。
[0304]在其他实施方式中，本发明的抗体结合多种细胞类型，测得其平均荧光的升高比对照抗体高至少约10％、至少约100％、至少约500％、至少约1000％、至少约1500％、至少约2000％、至少约2500％、至少约3000％、至少约3500％、至少约4000％、至少约4500％、至少约5000％、至少约5500％、至少约6000％、至少约6500％、至少约7000％、至少约7500％、至少约8000％、至少约8500％、至少约9000％、至少约9500％或至少约10000％，如本文所述。
[0305]在其他实施方式中，本发明的抗体结合多种人细胞类型，其中包括但不限于：A-549，Hey-A8，PC3，KC-231，Panc-02.03，SKMel.28，ACHN，496，D-145，HT-29，SKOV-3，或SW-480，如本文所述。
[0306]在其他实施方式中，本发明的抗体特异性结合小鼠细胞系CT26，如本文所述。
[0307]在其他实施方式中本发明的抗体特异性结合一些大鼠细胞类型，所述类型包括但不限于F98、RG2或YPEN，如本文所述。
[0308]在其他实施方式中，本发明的抗体特异性结合鼠细胞系CT26以及大鼠细胞系F98和YPEN，如本文所述。
[0309]在其他实施方式中，本发明的抗体特异性结合大鼠细胞类型F98和YPEN，所述结合比与大鼠细胞类型RG2的结合高至少约2倍、约5倍、约10倍、或约100倍，如本文所述。
[0310]在其他实施方式中，本发明的抗体特异性结合鼠细胞类型CT26，所述结合比与鼠细胞类型Balb/3T3或NIH3T3的结合高至少约2倍、约5倍、约10倍、或约100倍，如本文所述。
[0311]在其他实施方式中，本发明的抗体当施用于HuVec细胞时能刺激EphA2磷酸化，如本文所述。
[0312]在其他实施方式中，在HuVec细胞试验中，本发明的抗体刺激EphA2磷酸化比对照抗体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％，如本文所述。
[0313]在其他实施方式中，本发明的抗体在小鼠细胞系内刺激EphA2磷酸化比对照抗体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％，所述小鼠细胞系包括但不限于CT26和4T1，如本文所述。
[0314]在其他实施方式中，本发明的抗体在大鼠细胞系F98内刺激EphA2磷酸化比对照抗体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％，如本文所述。
[0315]在其他实施方式中，本发明的抗体在人细胞系内刺激EphA2磷酸化比对照抗体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％，所述人细胞系包括但不限于PC3和ES2，如本文所述。
[0316]在其他实施方式中，本发明的抗体特异性结合鼠Eph蛋白质家族，所述家族包括但不限于mEphA和mEphB。
[0317]在其他实施方式中，本发明的抗体特异性结合于鼠Eph家族的成员，所述成员包括但不限于mEphA2和mEphB2。
[0318]在其他实施方式中，本发明抗体所显示出的IC50剂量比体外IC50低至少约1倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约100倍、或至少约500倍，如本文所述。
[0319]在其他实施方式中，本发明抗体对PC3细胞系的IC50比对KC231细胞系的IC50低至少约2倍、5倍、10倍、或100倍。
[0320]在其他实施方式中，与对照抗体相比，本发明抗体在本文所述的小鼠异种移植模型中对肿瘤生长的抑制是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％。
[0321]在其他实施方式中，与对照抗体相比，本发明抗体在本文所述的小鼠异种移植模型中对肿瘤消退的促进作用是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％。
[0322]在其他实施方式中，与对照抗体相比，本发明抗体在本文所述的小鼠异种移植模型中对肿瘤转移的抑制是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％。
[0323]在其他实施方式中，与对照抗体相比，本发明抗体在本文所述的小鼠异种移植模型中对肿瘤血管发生的抑制是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％。
[0324]在其他实施方式中，与包括但不限于SKMel.28、ACHN、496、D-145、HT-29、SKOV-3或SW-480在内的人细胞系相比，本发明抗体可以至少约2倍、5倍、10倍或100倍优先结合包括但不限于A-549、Hey-A8、PC3、KC-231、Panc-02.03在内的人细胞系，如本文所述。
制造抗体的方法
[0325]可通过本领域已知的任何方法来制造抗体或其片段以合成抗体，具体地说，通过化学合成或优选通过重组表达技术。
[0326]可采用本领域已知的各种技术，包括利用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或它们的组合来制备单克隆抗体。例如，可采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，该技术包括本领域已知和以下文献所指导的那些：Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，(冷泉港实验室出版社，第二版，1988)；Hammerling等，刊于《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)，563-681，(纽约州伊莱斯维尔(Elsevier，N.Y.)，1981)(所述参考文献全文纳入本文作为参考)。本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指源自一个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是指其产生方法。
[0327]本领域熟知利用杂交瘤技术制备和筛选特异性抗体的常规方法。简言之，可用EphA2或EphA4(全长蛋白质或其片段，例如胞外结构域或配体结合结构域)免疫小鼠，一旦检测到免疫反应，例如在小鼠血清中检测到EphA2或EphA4的特异性抗体，即收集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知技术使脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如可从ATCC得到的细胞系SP20细胞)融合。选出杂交瘤，通过有限稀释法克隆。然后通过本领域已知方法检验杂交瘤克隆中分泌能与本发明多肽结合的抗体的细胞。可通过阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生通常含有高水平抗体的腹水。
[0328]因此，可通过以下步骤产生单克隆抗体：培养能分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中所述杂交瘤优选通过将分离自用EphA2或EphA4或其片段免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得；然后筛选融合得到的杂交瘤中分泌能与EphA2或EphA4结合的抗体的杂交瘤克隆。
[0329]可通过本领域技术人员已知的任何技术产生能识别特异性EphA2或EphA4表位的抗体片段。例如，可用酶，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃胰蛋白酶(产生F(ab′)2片段)，通过蛋白酶解切割免疫球蛋白分子来制备本发明的Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。此外，也可采用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生本发明抗体。
[0330]在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域展示于携带其编码多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。具体说，从动物cDNA文库(如人或鼠淋巴组织的cDNA文库)中扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。利用PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFV接头重组并克隆入噬菌粒载体(如pCANTAB 6或pComb 3HSS)。将载体电穿孔进入大肠杆菌(E.coli)并利用辅助噬菌体感染大肠杆菌。这些方法中所用噬菌体常为丝状噬菌体，包括fd和M13，并且常将VH和VL结构域与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可利用抗原，如使用标记抗原，或结合或被捕获于固体表面或珠子的抗原选择或者鉴别表达结合感兴趣的EphA2表位的抗原结合结构域的噬菌体。可用于产生本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括以下文献中披露的方法：Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184：177；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等，1997，Gene 187：9；Burton等，1994，Advances in Immunology 57：191-280；国际申请号PCT/GB91/01134；国际公开号WO 90/02809，WO 91/10737，WO 92/01047，WO 92/18619，WO93/11236，WO 95/15982，WO 95/20401，和WO97/13844；以及美国专利号5,698,426，5,223,409，5,403,484，5,580,717，5,427,908，5,750,753，5,821,047，5,571,698，5,427,908，5,516,637，5,780,225，5,658,727，5,733,743和5,969,108；各文献通过引用全文纳入本文。
[0331]可筛选与EphA2结合，尤其与EphA2或EphA4的胞外结构域结合的噬菌体。也可对激动EphA2或EphA4的活性(例如，提高EphA2或EphA4的磷酸化，降低EphA2或EphA4的水平)或癌细胞表型抑制活性(例如，降低软琼脂中的集落形成或三维基底膜或胞外基质制品如MATRIGELTM中的管状网络形成)或优先结合癌细胞而非非癌细胞上暴露的EphA2或EphA4表位的能力(例如，弱结合与参与细胞-细胞接触的配体相结合的EphA2或EphA4，而良好结合不与参与细胞-细胞接触的配体相结合的EphA2或EphA4)进行筛选。
[0332]如上述参考文献所述，在噬菌体选择后，可分离噬菌体的抗体编码区域并用于产生全抗体，包括人抗体、或任何所需抗原结合片段，并如下述在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。也可使用本领域熟知的重组方法产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的方法，如国际公开号WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques12：864；Sawai等，1995，AJRI34：26；和Better等，1988，Science 240：1041(将所述文献全文纳入本文作参考)所揭示的方法。
[0333]为产生完整抗体，可利用含有VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护该限制性位点的侧翼序列的PCR引物来扩增scFV克隆中的VH或VL序列。采用本领域技术人员已知的克隆技术，可将PCR扩增的VH结构域克隆入表达VH恒定区，例如人γ4恒定区的载体中，将PCR扩增的VL结构域克隆入表达VL恒定区，例如人κ或λ恒定区的载体中。优选地，表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、可变结构域、恒定结构域的克隆位点和选择标记，例如新霉素。也可将VH和VL结构域克隆入表达所需恒定区的载体中。然后采用本领域已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共同转染入细胞系，从而产生能表达全长抗体，例如IgG的稳定或瞬时细胞系。
[0334]对于一些应用，包括在人体内应用抗体和体外检测试验，优选利用人抗体或嵌合抗体。对于治疗性治疗人患者，完全的人抗体或人源化抗体特别理想。可通过本领域已知的各种方法制备人抗体，包括利用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体库的上述嗜菌体展示方法。也参见美国专利号4,444,887和4,716,111；PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；各文献通过引用全文纳入本文。
[0335]也可利用不能表达有功能的内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机或经同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因外，可将人可变区、恒定区和多变区(基因)引入小鼠胚胎干细胞中。可通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座分别或同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能。具体地说，纯合删除JH区阻止了内源性抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞，将其显微注射入胚泡中以产生嵌合型小鼠。然后使嵌合型小鼠交配以产生能表达人抗体的纯合后代。用选择的抗原，例如本发明多肽的全部或一部分以常规方式免疫该转基因小鼠。可采用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，然后经历类别转换和体细胞突变。因此，采用这种技术能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。产生人抗体的该技术的综述可参见Lonberg和Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.，13：65-93。产生人抗体和人单克隆抗体的该技术及产生这种抗体的方案详述可参见，例如国际公开号WO98/24893、WO 96/34096、WO 96/33735；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和5,939,598，各篇文献全文纳入本文作为参考。此外，可雇用例如加州弗里蒙特的抗体制造公司(Abgenix，Inc.，Freemont，CA)和纽约州普林斯顿的麦德莱克斯公司(Medarex，Princeton，NJ)等公司采用上述相似技术提供针对所选择抗原的人抗体。
[0336]嵌合抗体是一个抗体不同部分源自不同免疫球蛋白分子的分子，如具有源于非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法为本领域所熟知。参见，例如，Morrison，1985，Science229：1202；Oi等，1986，BioTechniques 4：214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods 125：191-202；以及美国专利号6,311,415、5,807,715、4,816,567和4,816,397，将其全文纳入本文作参考。包含一个或多个源于非人物种的CDR和源于人免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体可利用本领域熟知数种技术产生，这些技术包括，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539，5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Proteinengineering 7：805；和Roguska等，1994，PNAS 91：969)，链改组(美国专利号5,565,332)。一实施方式中，本发明的嵌合抗体特异性结合EphA2并在人框架区内包含1、2或3个VL CDR，所述VL CDR具有EA2-5、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152的任何VL CDR的氨基酸序列。
[0337]在其他实施方式中，本发明的嵌合抗体特异性结合EphA4并在人框架区内包含1、2或3个VL CDR，所述VL CDR具有EA44的任何VL CDR的氨基酸序列(如2004年6月7日提交的美国非临时申请序列号10/863,729所述)。在其他实施方式中，本发明的嵌合抗体特异性结合EphA2并在人框架区内包含1、2或3个VH CDR，所述VH CDR具有EA2、EA5、12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的任何VH CDR的氨基酸序列。
[0338]在其他实施方式中，本发明的嵌合抗体特异性结合EphA4并在人框架区内包含1、2或3个VH CDR，所述VH CDR具有EA44的任何VH CDR的氨基酸序列(如2004年6月7日提交的美国非临时申请序列号10/863,729所述)。在其他实施方式中，本发明的嵌合抗体特异性结合EphA2并在人框架区内包含1、2或3个VL CDR以及1、2或3个VH CDR，所述VL CDR具有EA2、EA5、12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的任何VL CDR的氨基酸序列，所述VH CDR具有EA2、EA5、12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的任何VH CDR的氨基酸序列。在其他实施方式中，本发明的嵌合抗体特异性结合EphA4并在人框架区内包含1、2或3个VL CDR以及1、2或3个VH CDR，所述VL CDR具有EA44的任何VL CDR的氨基酸序列，所述VH CDR具有EA44的任何VH CDR的氨基酸序列。
[0339]在进一步的实施方式中，本发明的嵌合抗体特异性结合EphA2并在人框架区内包含3个VL CDR和3个VH CDR，所述VL CDR具有EA2、EA5、12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的任何VL CDR的氨基酸序列，所述VH CDR具有EA2、EA5、12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的任何VH CDR的氨基酸序列。
[0340]框架区中的框架残基常用CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选提高或降低抗原结合(能力)。可用本领域熟知的方法鉴定这些框架取代，例如通过对CDR和框架残基的相互作用建模来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，和进行序列比较以鉴定位于特定位置的不寻常框架残基(参见，例如，美国专利号5,585,089；和Riechmann等，1988，Nature332：323，通过引用将其纳入本文)。
[0341]人源化抗体是能与某预定抗原结合的抗体或其变体或其片段，其框架区基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列，其CDR基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列。人源化抗体基本上包含所有的(至少一个，通常两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些CDR，所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。优选地，人源化抗体也包括通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。该抗体一般含有轻链以及至少重链的可变结构域。该抗体也可含有重链的CH1区、绞链区、CH2区、CH3区和CH4区。可从任何类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE及任何同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)选择人源化抗体。恒定结构域通常是需要人源化抗体显示细胞毒性活性的补体结合恒定结构域，通常是IgG1类。当不需要这种细胞毒性活性时，恒定区可以是IgG2类。人源化抗体可含有多种类型或同种型的序列，本领域普通技术人员知道选择特定恒定结构域以优化所需的效应物功能。人源化抗体的框架区和CDR区无需与母抗体序列，例如供体CDR精确对应，或者可通过至少一个残基的取代、***或缺失来诱变共有框架，从而使得该位点的CDR或框架残基不对应于共有抗体或输入抗体(import antibody)。然而，这种突变不是广泛的。通常有至少75％、更常见有90％、最优选大于95％的人源化抗体残基对应于母抗体框架区(FR)和CDR序列的那些残基。
[0342]可采用本领域已知的各种技术制备人源化抗体，这些技术包括但不限于：CDR-嫁接(欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，镶饰或重塑(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，MolecularImmunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering7(6)：805-814；和Roguska等，1994，PNAS 91：969-973)，链改组(美国专利号5,565,332)以及以下文献公开的技术：例如美国专利号6,407,213，5,766,886，5,585,089，国际公开号WO 9317105，Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-25，Caldas等，2000，Protein Eng.13：353-60，Morea等，2000，方法20：267-79，Baca等，1997，J.Biol.Chem.272：10678-84，Roguska等，1996，Protein Eng.9：895-904，Couto等，1995，Cancer Res.55(23Supp)：5973s-5977s，Couto等，1995，CancerRes.55：1717-22，Sandhu，1994，Gene 150：409-10，Pedersen等，1994，J.Mol.Biol.235：959-73，Jones等，1986，Nature 321：522-525，Riechmann等，1988，Nature 332：323，和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。框架区中的框架残基常用CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选提高抗原结合(能力)。可通过本领域熟知的方法鉴定这些框架取代，例如通过对CDR和框架残基的相互作用建模来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，和进行序列比较以鉴定位于特定位置的不寻常框架残基。(参见，例如Queen等，美国专利号5,585,089；Riechmann等，1988，Nature，332：323，通过引用将其纳入本文)。
[0343]此外，进而可采用本领域技术人员熟知的技术利用本发明抗体来产生抗-独特型抗体。(参见，例如，Greenspan和Bona，1989，FASEB J.7：437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147：2429-2438)。本发明提供了应用含有编码本发明抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸的方法。
编码抗体的多核苷酸
[0344]本发明的方法还包括在例如上文所定义的高度严格、中等严格或低严格杂交条件下与编码本发明抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。
[0345]可通过本领域已知的任何方法获得所述多核苷酸并测定该多核苷酸的核苷酸序列。由于已知抗体的氨基酸序列，因此可采用本领域熟知的方法测定编码这些抗体的核苷酸序列，即，已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子的装配方式能产生编码本发明抗体或其片段的核酸。可从化学合成的寡核苷酸装配这种编码抗体的多核苷酸(例如，Kutmeier等，1994，BioTechniques，17：242所述)，简言之，该方法包括合成含有该多肽编码序列各部分的重叠寡核苷酸，退火并连接那些寡核苷酸，然后采用PCR扩增连接的寡核苷酸。
[0346]或者，可从合适来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可得，但该多肽的序列已知(例如，见图19)，则可化学合成或者通过PCR扩增或通过克隆从合适来源(例如，抗体cDNA文库，或由其产生的cDNA文库，或从其中分离的核酸优选多聚A+RNA，表达该抗体的任何组织或细胞，如选择用来表达本发明抗体的杂交瘤细胞，例如以PTA-4572、PTA-4573、PTA-4574、PTA-4380、PTA-4381保藏于ATCC的克隆)获得编码免疫球蛋白的核酸，所述PCR扩增采用能与该序列3’和5’端杂交的合成引物，而所述克隆采用要鉴定的特定基因序列的特异性寡核苷酸探针，例如编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆。然后可采用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆入可复制克隆载体中。
[0347]一旦测定了抗体的核苷酸序列，可采用本领域熟知的核苷酸序列操作方法来操作抗体的核苷酸序列以产生氨基酸序列不同的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或***，所述方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见，例如，以下文献所述的技术：Sambrook等，1990，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约和Ausubel等编，1989，《最新分子生物学方法》，约翰威利父子出版公司，纽约，这些文献全文纳入本文作为参考)。
[0348]在具体的实施方式中，可采用常规的重组DNA技术将一个或多个CDR***框架区。所述框架区可以是天然产生的或共有序列框架区，优选人框架区(人框架区列表可参见，例如，Chothia等，1998，J.Mol.Biol.278：457-479)。通过组合框架区和CDR产生的多核苷酸优选编码能特异性结合于EphA2或EphA4的抗体。优选地，如上所述，可在框架区内产生一个或多个氨基酸取代，且优选地，所述氨基酸取代能提高抗体与其抗原的结合。此外，可采用这些方法对参与链内二硫键形成的一个或多个可变区半胱氨酸残基作出氨基酸取代或缺失从而产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体。本发明包括本领域技术人员知道的多核苷酸的其它改变。
抗体的重组表达
[0349]本发明抗体、其衍生物、类似物或片段(例如，本发明抗体的重链或轻链或其一部分或本发明的单链抗体)的重组表达需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码本发明某抗体分子或某抗体的重链或轻链或其一部分(优选含有重链或轻链可变结构域，但不一定)的多核苷酸，可采用本领域熟知的技术通过重组DNA技术制备产生抗体所用的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可采用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码抗体的序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
[0350]因此，本发明提供含有编码本发明的抗体、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变结构域或其一部分、或者重链或轻链CDR，并与启动子操作性相连的核苷酸序列的可复制载体。这种载体可包括编码该抗体恒定区的核苷酸序列(参见，例如PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO89/01036；和美国专利号5,122,464)，可将该抗体的可变区克隆入这种载体来表达完整的重链、完整的轻链、或这两者。
[0351]可通过常规技术将表达载体转运入宿主细胞中，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体或其片段、或其重链或轻链、或其一部分、或本发明的单链抗体，并与异源启动子操作性相连的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的某些实施方式中，可在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体从而表达完整的免疫球蛋白分子，如下所详述。
[0352]可利用各种宿主表达载体***来表达本发明抗体(参见，例如，美国专利号5,807,715)。这种宿主表达***提供了产生感兴趣编码序列后将其纯化的运载体，而且也提供了用合适的核苷酸编码序列转化或转染时能原位表达本发明抗体的细胞。这些***包括但不限于：微生物，例如用含有抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌(E.coli)，枯草芽胞杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母菌表达载体转化的酵母菌(如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞***；用含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞***；或包含含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建物的哺乳动物细胞***(如COS、CHO、BHK、293、NS0、3T3、PerC6细胞)。优选利用诸如大肠杆菌的细菌细胞，更优选用真核细胞(特别是对于表达完整的重组抗体)表达重组抗体。
[0353]例如，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))连同载体(如人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件)是抗体的有效表达***(Foecking等，Gene，1986，45：101；Cockett等，BioTechnology，1990，8：2)。在具体的实施方式中，编码某抗体或其片段的核苷酸序列的表达受组成型启动子、诱导型启动子或组织特异型启动子调节，所述抗体能特异性结合于EphA2或EphA4并激动EphA2或EphA4，抑制癌细胞表型，优先结合在癌细胞上但不在非癌细胞上有选择地暴露或增加的EphA2或EphA4上的表位和/或Koff小于3×10-3s-1。
[0354]在细菌***中，根据所表达抗体的应用选择许多表达载体是有利的。例如，为产生某抗体的药物组合物，当要产生大量这种蛋白质时，所需载体应能指导表达易于纯化的高水平融合蛋白产物。这种载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983，EMBO 12：1791)，该载体中的抗体编码序列可单独连接入载体与lacZ编码区同框从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13：3101-3109；Van Heeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等等。也可利用pGEX载体来表达外来多肽，例如含谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。这种融合蛋白一般是可溶性的，通过与基质谷胱甘肽-琼脂珠吸附和结合然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱不难从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为含有凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而能从GST部分释放克隆的靶基因产物。
[0355]在昆虫(细胞)***中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒可在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆入该病毒的非必需区域(例如□luorourac基因)并置于AcNPV启动子(例如□luorourac启动子)的控制下。
[0356]在哺乳动物宿主细胞中可利用许多病毒表达***。在利用腺病毒作为表达载体的情况中，可将感兴趣的抗体编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三分前导序列相连。然后可通过体外或体内重组将该嵌合型基因***腺病毒基因组。***病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)可获得能存活并能在感染的宿主中表达感兴趣抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk，1984，PNAS 81：6355-6359)。也需要特异性起始信号来有效翻译所***的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和毗邻序列。此外，起始密码子必须位于所需编码序列的读框相中以确保翻译整个***(序列)。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源，天然和合成的。可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等提高表达的效率。(参见Bittner等，1987，Methods in Enzymol.153：516-544)。
[0357]此外，可选择能以所需特定方式调节***序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可能对该蛋白质的功能至关重要。不同宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主***以确保所表达外来蛋白质的正确修饰和加工。为此目的，可利用具有初级转录物适当加工，基因产物糖基化和磷酸化细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于：CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、NS1和T47D、NS0(不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。
[0358]为长期高产量地产生重组蛋白，最好稳定表达。例如，可工程改造能稳定表达抗体的细胞系。除了利用含有病毒复制起点的表达载体外，可用受合适表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸位点等)和可选择标记控制的DNA转化宿主细胞。引入外来DNA后，在富集培养基中培养工程改造的细胞1-2天。然后转入选择性培养基。重组质粒中的可选择标记能赋予对选择(压力)的抗性，使细胞能将质粒稳定地整合入它们的染色体并生长形成细胞灶，进而克隆和扩增为细胞系。优选采用该方法来工程改造表达抗体的细胞系。这种工程改造的细胞系特别可用于筛选和评估能与抗体直接或间接相互作用的化合物。
[0359]可采用许多选择***，包括但不限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11：223)，谷氨酰胺合成酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：202)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，1980，Cell，22：817)基因可分别用于tk-、gs-、hgprt-或aprt-细胞中。也可利用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler等，1980，PNAS，77：357；O′Hare等，1981，PNAS，78：1527)；赋予对霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg，1981，PNAS，78：2072)；赋予对氨基糖苷类G-418抗性的neo(Wu和Wu，1991，Biotherapy，3：87；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：573；Mulligan，1993，Science，260：926；Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.，62：191；May，1993，TIB TECH，11：155)；和赋予对潮霉素抗性的hygro(Santerre等，1984，Gene，30：147)。可常规应用重组DNA技术领域已知的常规方法来选择所需的重组克隆，这种方法描述于Ausubel等编，《最新分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，纽约(1993)；Kriegler，《基因转移和表达，实验室手册》(Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual)，斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约，(1990)；Dracopoli等编，《人类基因组学最新方法》(Current Protocols in Human Genetics)，第12和13章，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，纽约，(1994)；Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.，150：1，通过引用将它们全文纳入本文。
[0360]通过载体扩增可提高抗体的表达水平(综述见Bebbington和Hentschel，《为在哺乳动物中表达克隆的基因而在DNA克隆中根据基因扩增利用载体》(The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)，第三卷，(学术出版社(Academic Press)，纽约，1987))。当某标记在表达抗体的载体***中可扩增时，提高宿主细胞培养液中存在的抑制剂水平将增加该标记基因的拷贝数。由于所扩增的区域与抗体基因相连，抗体产量也得以增加(Crouse等，1983，Mol.Cell.Biol.，3：257)。
[0361]可用本发明的两种表达载体共同转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可含有相同的可选择标记，从而能等同地表达重链多肽和轻链多肽。或者，可利用能编码(和能表达)重链多肽和轻链多肽二者的一种载体。在这种情况中，应将轻链置于重链之前以免有毒的游离重链过量(Proudfoot，1986，Nature，322：562；Kohler，1980，PNAS，77：2197)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
[0362]一旦通过重组表达产生了本发明抗体，可通过免疫球蛋白分子纯化领域已知的任何方法来纯化，例如层析(如，离子交换、亲和力，特别是在A蛋白和分子大小柱层析后利用对该特定抗原的亲和力)、离心、差别溶解性或蛋白质纯化的任何其它标准技术。此外，可将本发明抗体或其片段与本文所述或本领域已知的其它异源多肽序列融合以促进纯化。
预防/治疗方法
[0363]本发明包括方法治疗、预防或控制对象中与EphA2或EphA4的过表达相关的疾病或病症和/或细胞超增生性疾病，尤其是癌症，的方法，所述方法包括给予有效量的能靶向表达EphA2或EphA4的细胞并抑制EphA2或EphA4的表达或功能，和/或对超增生性细胞疾病有治疗或预防功效的组合物。一实施方式中，本发明的方法包括给对象施用一种组合物，该组合物包含与抗超增生性细胞疾病的治疗或预防药相连的EphA2或EphA4靶向部分。在其他实施方式中，本发明的方法包括给对象施用一种含有核酸的组合物，所述核酸包含编码EphA2或EphA4靶向部分的核苷酸序列和编码抗超增生性疾病的治疗或预防药的核苷酸序列。在其他实施方式中，本发明的方法包括给对象施用一种组合物，该组合物包含EphA2或EphA4靶向部分和含有编码抗超增生性疾病的治疗或预防药的核苷酸序列的核酸，其中所述靶向部分与所述核酸直接相连或通过递送至表达EphA2或EphA4的细胞中的递送载体相连。在具体的实施方式中，所述EphA2或EphA4靶向部分还能抑制EphA2或EphA4的表达或活性。
[0364]本发明包括治疗、预防或控制对象中与EphA2或EphA4的过表达相关的疾病或病症和/或细胞超增生性疾病，优选癌症，的方法，所述方法包括施用能靶向EphA2或EphA4和/或抑制EphA2或EphA4的表达或活性的一种或多种ADC，其中所述ADC包含EphA2或EphA4激动抗体、EphA2或EphA4胞内抗体、或EphA2或EphA4癌细胞表型抑制抗体或暴露的EphA2或EphA4表位抗体或以小于3×10-1s-1的Koff结合EphA2或EphA4的EphA2或EphA4抗体，优选一种或多种单克隆的EphA2或EphA4激动抗体、EphA2或EphA4胞内抗体、BiTE分子、或EphA2或EphA4癌细胞表型抑制抗体或暴露的EphA2或EphA4表位抗体或以小于3×10-1s-1的Koff结合EphA2或EphA4的EphA2或EphA4抗体。在具体的实施方式中，要治疗、预防或控制的疾病是恶性癌症。在其他具体实施方式中，要治疗、预防或控制的疾病是与过表达EphA2或EphA4的细胞相关的癌前状态。在更加具体的实施方式中，所述癌前状态是高级别的***上皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性囊肿病或复合性痣。
[0365]一实施方式中，本发明的组合物可与用于治疗、预防或控制与EphA2或EphA4的过表达相关的疾病或病症、超增生性疾病、和/或癌症的一种或多种其他治疗药组合施用。在某些实施方式中，一种或多种本发明的组合物与一种或多种用于治疗癌症的其他治疗药同时施用于哺乳动物，优选人。术语“同时”不限于在完全相同的时间施用预防药或治疗药，而是指以一定的顺序并在一定的时间间隔内将本发明组合物和其他药剂施用给对象，从而使得本发明组合物可与其他药剂一起发挥作用以提供优于以其他方式施用的益处。例如，可在相同时刻或者在不同时间点以任何顺序依次施用各种预防药或治疗药；然而，如果不是同时施药，则应该在非常接近的时间施用它们以便提供所需的治疗或预防效果。可采用任何合适的形式并通过任何合适的途径分别施用各种治疗药。在其他实施方式中，本发明的组合物是在外科手术之前、同时或之后施用的。优选地，所述外科手术能完全除去局部肿瘤或减小较大肿瘤的大小。外科手术也可用作预防性手段或用于减轻疼痛。
[0366]在进一步的实施方式中，本发明组合物包含一种或多种由以下抗体构成的EphA2抗体：EA2、EA5、12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8、或者表2或3或图1-59中所列的任何抗体，其中所述抗体用作EphA2-靶向部分或抗超增生性细胞疾病的药剂。一实施方式中，本发明的组合物包含由以下抗体构成的抗体：EA2、EA5、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、或者表2或3或图1-59中所列的任何已被人源化的抗体。在其他实施方式中，提供了EA2、EA5、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、或者表1或2所列任何抗体的变体，例如，尤其是在可变结构域内具有一个或多个氨基酸取代的变体，与EA2、EA5、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、或者表2或3或图1-59中所列的任何抗体相比，所述变体具有提高的活性、结合能力等等。
[0367]再在进一步的实施方式中，本发明的组合物包含一种或多种EphA2抗体(例如以下文献中所述：美国非临时申请序列号10/994,129(2004年11月19日提交)、10/436,782(2003年5月12日提交)和美国临时申请序列号60/583,184(2004年6月25日提交)、60/624,153(2004年11月2日提交)、60/601,634(2004年8月16日提交)、60/608,852(2004年9月13日提交)，所有文献通过引用全文纳入本文)，其中所述抗体用作EphA2靶向部分或抗超增生性细胞疾病的药剂。
[0368]再在其他实施方式中，本发明的组合物包含由EA44构成的一种或多种EphA4抗体(描述于，例如，2004年6月7日提交的美国非临时申请序列号10/863,729)，其中所述抗体用作EphA4靶向部分或抗超增生性细胞疾病的药剂。在进一步的实施方式中，本发明的组合物包含由人源化EA44构成的抗体。在其他实施方式中，提供了EA44的变体，例如，尤其是在可变结构域内具有一个或多个氨基酸取代的变体，与EA44相比，所述变体具有提高的活性、结合能力等等。
患者群
[0369]本发明提供了治疗、预防和控制与EphA2或EphA4的过表达相关的疾病或病症和/或超增生性细胞疾病，尤其是癌症，的方法，该方法是通过给予有此需要的对象治疗或预防有效量一种或多种本发明的组合物。在其他实施方式中，本发明的组合物可与一种或多种其他治疗药组合施用。所述对象优选是哺乳动物，如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如，猴，如食蟹猴(cynomolgous monkey)和人)。在其他实施方式中，所述对象是人。
[0370]可用本发明所包含的方法治疗的癌症的具体例子包括但不限于过表达EphA2或EphA4的癌症。在进一步的实施方式中，所述癌症是上皮细胞来源的癌症。这种癌症的例子有肺癌、结肠癌、***癌、乳腺癌和皮肤癌。其他癌症包括膀胱癌、胰腺癌以及肾细胞癌和黑色素瘤。其他癌症以举例的方式列出而非仅限于下文所述的那些。在具体的实施方式中，本发明的方法可用于治疗和/或预防原发性肿瘤转移。
[0371]本发明的方法和组合物包括给患有或预计将患癌症的对象/患者(例如，具有特定类型癌症的遗传倾向、曾经接触过致癌物、或正处于特定癌症的缓解中)施用一种或多种本发明的组合物。文中，“癌症”指原发性或转移性癌症。这种患者之前可对癌症进行过治疗或未进行治疗。本发明的方法和组合物可用作一线或二线癌症治疗。本发明还包括治疗正在接受其他癌症疗法的患者，本发明的方法和组合物可用在这些其他癌症疗法出现任何副作用或不耐受之前。本发明还包括施用一种或多种本发明的组合物以治疗或缓解难治性患者的症状的方法。在某些实施方式中，某种疗法难治的癌症是指至少癌细胞的一些重要部分未被杀死或它们的细胞***未停止。可通过本领域已知的任何方法在体内或体外鉴定某癌细胞是否是难治的从而确定癌细胞治疗的有效性，鉴定时采用本领域接受的“难治”定义。在各种实施方式中，当癌细胞的数目未显著减少或有所增加时癌症是难治的。本发明还包括施用一种或多种EphA2或EphA4 ADC(用作EphA2或EphA4-靶向部分和/或抗癌药)以预防易患癌症的患者的癌症发生或复发的方法。优选地，ADC的抗体部分是以下一种或多种：EA2、EA5、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、或者表2或3或图1-59中所列的任何抗体。在其他实施方式中，用于本发明的ADC组合物和方法的EphA4激动抗体是EA44。
[0372]在具体的实施方式中，施用本发明的组合物以逆转癌细胞对某些激素、放疗和化疗药产生的耐药性或灵敏度降低，从而使癌细胞重新对这些试剂中的一种或多种敏感，然后就可以施用(或继续施用)这些试剂以治疗或控制癌症，包括预防转移。在具体的实施方式中，本发明组合物施用于细胞因子IL-6水平升高的患者，已知IL-6水平升高与癌细胞对诸如化疗和激素疗法等不同治疗方案产生抗性有关。在其他具体实施方式中，本发明的组合物施用于对他莫昔芬治疗的反应性降低或难治的乳腺癌患者。在其他具体实施方式中，本发明的组合物施用于细胞因子IL-6水平升高的患者，已知IL-6水平升高与癌细胞对诸如化疗和激素疗法等不同治疗方案产生抗性有关。
[0373]在其他实施方式中，本发明提供了治疗患者的癌症的方法，该方法将一种或多种本发明的组合物与任何其他疗法组合施用于已证实用其他疗法难治而不再采用这些疗法的患者。优选地，按照本发明，可将EA2、EA5、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8、表2或3中所列的任何抗体、或EA44中的一种或多种用作抗-EphA2或抗-EphA4ADC。在某些实施方式中，用本发明的方法治疗的患者是已用化疗、放疗、激素疗法或者生物疗法/免疫疗法治疗过的患者。这些患者中包括难治性患者和尽管采用现有癌症疗法治疗但仍患有癌症的患者。在其他实施方式中，所述患者已经过治疗且没有疾病活性，施用一种或多种本发明的组合物用于预防癌症复发。
[0374]在某些实施方式中，现有疗法是化疗。在具体的实施方式中，现有疗法包括施用化学疗(剂)，其中包括但不限于：氨甲喋呤，紫杉酚，巯基嘌呤，巯鸟嘌呤，羟基脲，阿糖胞苷，环磷酰胺，异环磷酰胺，亚硝基脲，顺铂，卡铂，丝裂霉素，达卡巴嗪，丙卡巴肼，依托泊甙，喜树碱(campathecin)，博来霉素，阿霉素，伊达比星，柔红霉素，放线菌素D，普卡霉素，米托蒽醌，天冬酰胺酶，长春花碱，长春新碱，长春瑞滨，紫杉醇，多西他赛，等等。这些患者中包括用放疗、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法治疗过的患者。这些患者中还包括接受过癌症外科手术治疗的患者。
[0375]或者，本发明还包括治疗正在接受或已经接受过放疗的患者的方法。这些患者中包括正在用或之前用化疗、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法治疗的患者。这些患者中还包括接受过癌症外科手术治疗的患者。
[0376]在其他实施方式中，本发明包括治疗正在接受或已经接受过激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法的患者的方法。这些患者中包括正在用或之前用化疗和/或放疗治疗的患者。这些患者中还包括接受过癌症外科手术治疗的患者。
[0377]此外，本发明还提供了作为化疗、放疗、激素疗法、和/或生物疗法/免疫疗法的替代疗法的癌症治疗方法，上述疗法已证实或可能证实对治疗对象的毒性过大，即所导致的副作用不可接受或不可忍受。任选地，用本发明方法治疗的对象可以用诸如外科手术、化疗、放疗、激素疗法或生物疗法等其他癌症疗法治疗，这取决于发现哪种疗法不可接受或不可忍受。
[0378]在其他实施方式中，本发明将一种或多种本发明组合物给予患者而不与任何其他癌症疗法组合以治疗癌症，已证明所述患者对这些疗法难治。在具体的实施方式中，给予用其他癌症疗法难治的患者一种或多种本发明组合物而不采取(其它)癌症疗法。
[0379]在其他实施方式中，可对具有与过表达EphA2或EphA4的细胞相关的癌前状态的患者施用本发明组合物以治疗该疾病并降低发展成恶性癌症的可能性。在具体的实施方式中，所述癌前状态是高级别的***上皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性囊肿病或复合性痣。
[0380]再在其他实施方式中，本发明提供了治疗、预防和控制非癌症的超增生性细胞疾病，尤其是与EphA2或EphA4的过表达有关的疾病的方法，所述疾病包括但不限于：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、再狭窄(平滑肌再狭窄和/或内皮再狭窄)、银屑病，等等。这些方法包括与上述治疗、预防和控制癌症的方法类似的方法，例如，可将本发明的组合物以及组合疗法施用于特定疗法难治的患者，等等。
癌症
[0381]可用本发明的方法和组合物治疗、预防或控制的癌症和相关疾病包括但不限于上皮细胞来源的癌症。这种癌症的例子包括以下这些：白血病，例如但不限于，急性白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病，如成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病，粒单核细胞白血病，单核细胞性白血病，和红白血病和骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病，毛细胞性白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于，霍奇金病，非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于，郁积型多发性骨髓瘤，非分泌型骨髓瘤，骨硬化性骨髓瘤，浆细胞性白血病，孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；意义未定的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆γ-球蛋白病；重链病；骨骼和***肉瘤，例如但不限于，骨骼肉瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，尤因肉瘤，恶性巨细胞瘤，骨纤维肉瘤，脊索瘤，骨膜肉瘤，软组织肉瘤，血管肉瘤，纤维肉瘤，卡波西肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，***肉瘤，神经鞘瘤，横纹肌肉瘤，滑膜肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于，胶质瘤，星形细胞瘤，脑干胶质瘤，室管膜瘤，少突神经胶质瘤，非神经胶质瘤，听神经鞘瘤，颅咽管瘤，髓母细胞瘤，脑脊膜瘤，松果体瘤，成松果体细胞瘤，原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于，导管癌，腺癌，小叶(小细胞)癌，导管内癌，髓样乳腺癌，粘液性乳癌，管状乳腺癌，***乳癌，佩吉特病，炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于，嗜铬细胞瘤及肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于，***状或滤泡甲状腺癌，甲状腺髓样癌和未分化型甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于，胰岛素瘤，胃泌素瘤，高血糖素瘤，舒血管肠肽瘤，生长抑素分泌肿瘤，和癌或胰岛细胞肿瘤；脑垂体癌，例如但不限于，库欣病，泌乳素分泌肿瘤，肢端肥大症，糖尿病；眼癌，例如但不限于，眼部黑色素瘤如虹膜黑色素瘤，脉络膜黑色素瘤，睫状体黑色素瘤，视网膜母细胞瘤；***癌，如鳞状细胞癌，腺癌，恶性黑色素瘤；外阴肿瘤，如鳞状细胞癌，黑色素瘤，腺癌，基底细胞癌，肉瘤，佩吉特病；***，例如但不限于，鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于，子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于，卵巢上皮癌，交界瘤，生殖细胞瘤，间质瘤；食管癌，例如但不限于，鳞状细胞癌，腺癌，腺样囊性癌，粘液表皮样癌，腺鳞癌，肉瘤，黑色素瘤，浆细胞瘤，疣状癌，和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于，腺癌，蕈状(息肉)，溃疡，浅表性扩散，弥漫性扩散，恶性淋巴瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤，癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于，肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌，如腺癌；胆管癌，例如但不限于，□luoroura，结节性胆管癌，和弥漫性胆管癌；肺癌，如非小细胞肺癌，鳞状细胞癌(表皮样癌)，腺癌，大细胞癌及小细胞肺癌；睾丸癌，例如但不限于，生殖细胞瘤，***瘤，未分化癌，经典(典型)癌，***细胞性***瘤，非***瘤，胚胎癌性细胞，胚胎性癌，畸胎瘤，绒毛膜癌(卵黄囊瘤)，***癌，例如但不限于，***上皮内肿瘤，腺癌，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤；penal cancers；口腔癌，例如但不限于，鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌症，例如但不限于，粘液表皮样腺癌，腺样癌；咽癌，例如但不限于，鳞状上皮细胞癌，疣；皮肤癌，例如但不限于，基底细胞癌，鳞状细胞癌和黑色素瘤，浅表扩散性黑色素瘤，结节性黑色素瘤，雀斑痣，恶性黑色素瘤，肢端黑色素瘤；肾癌，例如但不限于，肾细胞癌，腺癌，格拉维次氏瘤，纤维肉瘤，移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；维尔姆斯瘤；膀胱癌，例如但不限于，移行细胞癌，鳞状上皮细胞癌，腺癌，癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤，骨肉瘤，内皮肉瘤，***内皮肉瘤，间皮瘤，滑膜瘤，成血管细胞瘤，上皮癌，囊腺癌，支气管癌，汗腺癌，皮脂腺癌，***状癌和***状腺癌(为回顾这些疾病可参见Fishman等，1985，Medicine，第二版，费城JBL公司(J.B.Lippincott Co)，Philadelphia)和Murphy等，1997，《知情决策：癌症诊断、治疗和康复全书》(Informed Decisions：The Complete Book of Cancer Diagnosis，Treatment，and Recovery)，Viking Penguin，美国企鹅图书公司(Penguin Books U.S.A.，Inc.))。
[0382]因此，本发明的方法和组合物也可用于治疗或预防各种癌症或其他异常增生性疾病，所述异常增生性疾病包括(但不限于)以下这些：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴系造血肿瘤，包括白细胞、急性淋巴细胞性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤；骨髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病以及前髓细胞性白血病；间充质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤，***瘤，畸胎癌，成神经细胞瘤和胶质瘤；中枢和外周神经***的肿瘤，包括星形细胞瘤，成神经细胞瘤，胶质瘤，和神经鞘瘤；间充质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑色素瘤，着色性干皮病，角化棘皮瘤，***瘤，甲状腺滤泡癌和畸胎癌。还包括用本发明方法和组合物治疗细胞凋亡畸变所致的癌症。这种癌症可包括但不限于滤泡性淋巴瘤，具有p53突变的癌症，乳腺、***和卵巢的激素依存性肿瘤，以及癌前期病变如家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生异常综合征。在具体的实施方式中，治疗或预防的是皮肤、肺、结肠、乳腺、***、膀胱、肾、胰腺、卵巢或子宫中的恶性或异常增生性变化(如组织转化和发育异常)，或者超增生性疾病。在某些具体实施方式中，治疗或预防的是肉瘤、黑色素瘤或白细胞。
[0383]一些实施方式中，所述癌症是恶性的并过表达EphA2或EphA4。在其他实施方式中，要治疗的疾病是与过表达EphA2或EphA4的细胞相关的癌前状态。在具体的实施方式中，所述癌前状态是高级别的***上皮内瘤样病变(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维性囊肿病或复合性痣。
[0384]在其他实施方式中，本发明的方法和组合物用于治疗和/或预防乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌和***癌以及黑色素瘤，下面举例说明但不限于此。
乳腺癌的治疗
[0385]在具体的实施方式中，给乳腺癌患者施用有效量的一种或多种本发明的组合物。一实施方式中，本发明提供了一种预防、治疗或控制乳腺癌的方法，该方法包括给予患者：(a)本发明的抗-EphA2或抗-EphA4ADC，和(b)药学上可接受的载体。在其他实施方式中，本发明的组合物可与有效量的一种或多种用于乳腺癌疗法的其他试剂组合施用。用于乳腺癌疗法的药剂包括但不限于：阿霉素，表柔比星，阿霉素和环磷酰胺的组合(AC)，环磷酰胺、阿霉素和5-氟尿嘧啶的组合(CAF)，环磷酰胺、表柔比星和5-氟尿嘧啶的组合(CEF)，赫赛汀，他莫昔芬，他莫昔芬和细胞毒化学疗剂的组合物，紫杉烷(如多西他赛和紫杉醇)。在进一步的实施方式中，本发明的组合物可包含紫杉烷外加标准阿霉素和环磷酰胺，或与它们组合使用，以辅助治疗结节阳性、局部乳腺癌。
[0386]在具体的实施方式中，给患有乳腺癌前纤维腺瘤或纤维囊性疾病的患者施用本发明的组合物以治疗所述疾病并降低它们发展成恶性乳腺癌的可能性。在其他具体实施方式中，对治疗，尤其是激素疗法，更具体是他莫昔芬疗法没有反应的患者施用本发明的组合物以治疗癌症和/或使患者不再难治或产生反应。
结肠癌的治疗
[0387]在具体的实施方式中，给结肠癌患者施用有效量的一种或多种本发明的组合物。在其他实施方式中，本发明的组合物包含有效量的一种或多种用于结肠癌疗法的其他试剂或与其联用，所述其他试剂包括但不限于：5-FU和亚叶酸的组合，5-FU和左旋咪唑的组合，伊立替康(CPT-11)或伊立替康、5-FU和亚叶酸的组合(IFL)。
***癌的治疗
[0388]在具体的实施方式中，给***癌患者施用有效量的一种或多种本发明的组合物。在其他实施方式中，本发明的组合物包含有效量的一种或多种用于***癌疗法的其他试剂或与其联用，所述其他试剂包括但不限于：外线束放疗，间质植入放射性同位素(即，I125、钯、铱)，亮丙瑞林或其他LHRH激动剂，非甾类抗雄激素(氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺)，甾类抗雄激素(醋酸环丙孕酮)，亮丙瑞林和氟他胺的组合，***如DES，氯烯雌醚，乙炔***，偶联的***U.S.P.，DES-二磷酸，放射性同位素如锶-89，外线束放疗和锶-89的组合物，二线激素疗法如氨鲁米特、氢化可的松、停用氟他胺、孕酮和酮康唑，低剂量波尼松，或报道称可使症状产生主观改善并降低PSA水平的其他化疗方案，其中包括多西他赛、紫杉醇、雌氮芥/多西他赛、雌氮芥/依托泊甙、雌氮芥/长春花碱、和雌氮芥/紫杉醇。
[0389]在具体的实施方式中，给高级别***上皮内瘤样病变(PIN)患者施用本发明的组合物以治疗所述疾病和病症并降低它们发展成恶性***癌的可能性。
黑色素瘤的治疗
[0390]在具体的实施方式中，给黑色素瘤患者施用有效量的一种或多种本发明的组合物。在其他实施方式中，本发明的组合物包含有效量的一种或多种用于黑色素瘤癌症疗法的其他试剂或与其联用，所述其他试剂包括但不限于：达卡巴嗪(DTIC)，亚硝基脲如卡氮芥(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)，具有适度单一试剂活性的试剂包括长春花生物碱、铂化合物和紫杉烷，达特茅斯(Dartmouth)方案(顺铂、BCNU和DTIC)，干扰素α(IFN-A)，和白介素-2(IL-2)。在具体的实施方式中，有效量的一种或多种本发明的激动单克隆抗体可以和离体升温肢体灌注(isolated hyperthermic limbperfusion)(ILP)加美法仑(L-PAM)，加或不加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，一起施用于具有脑转移、骨转移和脊髓受压的患者以便和放疗一起实现症状的减轻和一定程度上的肿瘤缩小。
[0391]在具体的实施方式中，给癌前复合性痣患者施用本发明的组合物以治疗该病并降低它发展成恶性黑色素瘤的可能性。
卵巢癌的治疗
[0392]在具体的实施方式中，给卵巢癌患者施用有效量的一种或多种本发明的组合物。在其他实施方式中，本发明的组合物包含有效量的一种或多种用于卵巢癌疗法的其他试剂或与其联用，所述其他试剂包括但不限于：腹膜内放疗如P32疗法，腹部和盆骨全放疗，顺铂，紫杉醇(紫杉酚)或多西他赛(Taxotere)和顺铂或卡铂的组合物，环磷酰胺和顺铂的组合物，环磷酰胺和卡铂的组合物，5-FU和亚叶酸的组合物，依托泊甙，脂质体阿霉素，吉西他滨或托泊替康。还包括将有效量的一种或多种本发明组合物与紫杉酚组合施用于患有铂难治性疾病的患者。包括治疗患有难治性卵巢癌的患者，治疗包括施用以下药剂：给铂难治性疾病患者施用异环磷酰胺，在顺铂组合方案失败后施用六甲蜜胺(HMM)作为补救化疗，以及给肿瘤上的胞质***受体水平可检测的患者施用他莫昔芬。
肺癌的治疗
[0393]在具体的实施方式中，给小细胞肺癌患者施用有效量的一种或多种本发明的组合物。在其他实施方式中，本发明的组合物包含有效量的一种或多种用于肺癌疗法的其他试剂或与其联用，所述其他试剂包括但不限于：胸部放疗、顺铂、长春新碱、阿霉素和依托泊甙(单用或联用)，环磷酰胺、阿霉素、长春新碱/依托泊甙和顺铂的组合(CAV/EP)，采用支气管内激光疗法局部减轻症状，支气管内支架，和/或近程放射治疗。
[0394]在某些具体实施方式中，给非小细胞肺癌患者组合施用有效量的一种或多种用于肺癌疗法的其他试剂和有效量的一种或多种本发明组合物，所述其他试剂包括但不限于：姑息性放射治疗，顺铂、长春花碱和丝裂霉素的组合，顺铂和长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛或吉西他滨的组合，卡铂和紫杉醇、用于支气管内损伤的间质放疗或立体定向放射外科的组合。
其他预防药/治疗药
[0395]一些实施方式中，本发明提供了一种预防、治疗或控制超增生性细胞疾病的方法，该方法包括给患者施用：(a)本发明的的抗-EphA2或抗-EphA4ADC，和(b)药学上可接受的载体。一些实施方式中，本发明提供了一种预防、治疗或控制超增生性细胞疾病的方法，该方法包括组合施用一种或多种其他疗法和一种或多种本发明组合物，所述其他疗法例如，但不限于，化疗、放疗、激素疗法、生物疗法/免疫疗法和/或外科手术。
[0396]可用于本发明的预防药/治疗药包括但不限于：蛋白质性分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白质(包括翻译后修饰的蛋白质)、抗体等等；或小分子(小于1000道尔顿)无机或有机化合物；或核酸分子，包括但不限于双链或单链DNA、或双链或单链RNA，以及三螺旋核酸分子。预防/治疗药可衍生自任何已知生物(包括但不限于：动物、植物、细菌、真菌以及原生生物或病毒)或衍生自合成分子库。
[0397]在具体的实施方式中，可用于本发明的预防药/治疗药是激酶抑制剂，所述激酶例如但不限于：AB L，ACK，AFK，AKT(例如，AKT-1、AKT-2和AKT-3)，ALK，AMP-PK，ATM，Aurora1，Aurora2，bARK1，bArk2，BLK，BMX，BTK，CAK，CaM激酶，CDC2，CDK，CK，COT，CTD，DNA-PK，EGF-R，ErbB-1，ErbB-2，ErbB-3，ErbB-4，ERK(例如，ERK1，ERK2，ERK3，ERK4，ERK5，ERK6，ERK7)，ERT-PK，FAK，FGR(例如，FGF1R，FGF2R)，FLT(例如，FLT-1，FLT-2，FLT-3，FLT-4)，FRK，FYN，GSK(例如，GSK1，GSK2，GSK3-α，GSK3-β，GSK4，GSK5)，G-蛋白偶联受体激酶(GRK)，HCK，HER2，HKII，JAK(例如，JAK1，JAK2，JAK3，JAK4)，JNK(例如，JNK1，JNK2，JNK3)，KDR，KIT，IGF-1受体，IKK-1，IKK-2，INSR(胰岛素受体)，IRAK1，IRAK2，IRK，ITK，LCK，LOK，LYN，MAPK，MAPKAPK-1，MAPKAPK-2，MEK，MET，MFPK，MHCK，MLCK，MLK3，NEU，NIK，PDGF受体α，PDGF受体β，PHK，PI-3激酶，PKA，PKB，PKC，PKG，PRK1，PYK2，p38激酶，p135tyk2，p34cdc2，p42cdc2，p42mapk，p44mpk，RAF，RET，RIP，RIP-2，RK，RON，RS激酶，SRC，SYK，S6K，TAK1，TEC，TIE1，TIE2，TRKA，TXK，TYK2，UL13，VEGFR1，VEGFR2，YES，YRK，ZAP-70，以及这些激酶的所有亚型(见例如，Hardie和Hanks(1995)《蛋白激酶因子手册》(The Protein Kinase FactsBook)，I和II，加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社(Academic Press，SanDiego，Calif.))。在进一步的实施方式中，一种或多种可用于本发明的预防药/治疗药是Eph受体激酶抑制剂(例如，EphA2，EphA4)。在具体的实施方式中，一种或多种可用于本发明的预防药/治疗药是EphA2或EphA4的抑制剂。
[0398]在其他具体实施方式中，一种或多种可用于本发明的预防药/治疗药是血管发生抑制剂，例如但不限于：血管紧张素(纤溶酶原片段)；抗血管形成抗凝血酶III；血管酶(Angiozyme)；ABT-627；Bay 12-9566；Benefin；贝伐单抗；BMS-275291；软骨衍生的抑制剂(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col 3；考布他汀A-4；内皮生长抑制素(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-β；卤夫酮；肝素酶；肝素多聚己糖片段；HMV833；人绒膜***(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素可诱导的蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle 5(纤溶酶原片段)；马立马司他；金属蛋白酶抑制剂(TIMP)；2-甲氧***；MMI 270(CGS 27023A)；MoAbIMC-1C11；新伐司他；NM-3；Panzem；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原激活剂抑制剂；血小板因子-4(PF4)；普啉司他；促乳素16kD片段；增殖蛋白相关蛋白(PRP)；PTK 787/ZK 222594；类视黄醇；索利司他；鲨胺；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氢可的索-S；四硫钼酸盐；沙利度胺；血小板反应蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-β)；Vasculostatin；血管生成抑制素(钙网织蛋白片段)；ZD6126；ZD6474；法尼基转移酶抑制剂(FTI)；和二膦酸盐。
[0399]在其他具体实施方式中，一种或多种可用于本发明的预防药/治疗药是抗癌药，例如，但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；乙酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；吖扎胞苷；阿替哌；固氮霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠，溴匹立明；白消安；放线菌素C；二***；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡氮芥；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥，西罗里霉素；顺铂；克拉曲滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪，放线菌素D，盐酸柔红霉素；氨烯咪胺；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普美；环氧丙啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌氮芥磷酸钠；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊甙；磷酸依托泊甙；艾托卜宁；盐酸法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素2(包括重组白介素2，或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；伊普铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马丙考；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米特卡辛；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；亚硝基脲；诺可唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；天冬酰胺酶；培利霉素；溴新斯的明；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌酰硫烷；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；顺螺铂；链黑菌素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；曲托龙；磷酸曲西立滨；曲美沙特；三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸环氧长春碱；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药包括但不限于：20-表-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯(acylfulvene)；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；白介素-2；ALL-TK拮抗剂；六甲密胺；氨莫司汀；磺胺异噁唑；氨磷汀；氨基-γ-酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗-背侧化形态发生蛋白-1；抗雄激素；抗雄激素；***癌(药物)；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿苏拉任(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀；阿西纳他汀1(axinastatin 1)；阿西纳他汀2(axinastatin 2)；阿西纳他汀3(axinastatin 3)；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰基星形孢菌素；β内酰胺衍生物；β-阿里星(β-alethine)；β环霉素B(betaclamycin B)；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙定基精胺(bisaziridinylspermine)；双奈法德；比斯他汀A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸亚矾胺；卡泊三醇；抑激酶素C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；羧酰胺-氨基-***；羧基酰氨基***；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；氯喹噁啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克里斯霉素A(collismycin A)；克里斯霉素B(collismycin B)；考布他汀A4；考布他汀类似物；科纳吉宁(conagenin)；克莱姆白斯定816(crambescidin 816)；克立那托；缩酚酸肽8；缩酚酸肽A衍生物；库莱新A(curacin A)；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone)；环普来它姆(cycloplatam)；塞普霉素(cypemycin)；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱氢代代宁B；地洛瑞林；***；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；戴多克斯(didox)；二乙基正精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮胞苷；二氢紫杉醇；二噁霉素；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈***酚；杜卡霉素SA(duocarmycin SA)；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；磷雌氮芥类似物；***激动剂；***拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊甙；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；黄酮吡醇；氟噻司汀；氟甾酮；氟达拉滨；氟代盐酸柔红霉素(fluorodaunorunicinhydrochloride)；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；莫特沙芬钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；海普苏凡(hepsulfam)；调蛋白；六甲撑二乙酰胺；金丝桃蒽酮；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；***受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；异苯格唑(isobengazole)；异高软海绵素B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼；加斯普来克内酯(jasplakinolide)；卡哈拉来德F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N；兰瑞肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸磨茹多糖；莱普托他汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制性因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+***+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线形聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；利索克林酰胺7(lissoclinamide 7)；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；罗唑利宾；勒托替康；莱索弗林(lysofylline)；溶细胞肽；美坦新；曼诺他汀A(mannostatinA)；马立马司他；马丙考；麦斯平(maspin)；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆(merbarone)；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；丝裂霉素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体；人绒毛膜促性腺素；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重抗药性基因抑制剂；多重肿瘤阻遏物1-疗法；芥子抗癌症药物；印度洋海绵(mycaperoxide)B；分枝杆菌细胞壁提取物；麦瑞普容(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛；纳帕弗英(napavin)；奈弗特平(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼沙霉素；氧化氮调节剂；一氧化二氮抗氧化剂；耐出林(nitrullyn)；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；欧凯斯酮(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥卡星(oracin)；细胞因子口服诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；奥考诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；派劳胺；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；菌铁素(parabactin)；帕折普汀；天冬酰胺酶；培得星；戊聚硫钠；喷司他丁；盼特罗唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏乙醇；吩嗪霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶血链球菌素；盐酸匹罗卡品；吡柔比星；吡曲克辛；普莱斯汀A(placetinA)；普莱斯汀B(placetin B)；血纤溶酶原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；泊非霉素；强的松；丙基双吖啶酮；***素J2；蛋白酶体抑制剂；A蛋白免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻(microalgal)；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡啶氧基化血红蛋白聚氧乙烯偶联物(pyridoxylated hemoglobinpolyoxyethylene conjugate)；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；洛太米特；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽；罗喹美克；莱比金酮B1(rubiginone B1)；莱布克斯(ruboxyl)；沙芬戈；塞头平(saintopin)；SarCNU；萨克福托A(sarcophytol A)；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；老化衍生的抑制剂1(senescence derivedinhibitor 1)；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；首弗罗(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；斯派卡霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；斯奈潘定；海绵素1(spongistatin 1)；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞***抑制剂；斯迪派酰胺(stipiamide)；间质溶解素抑制剂；硫诺星(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂(superactive vasoactive intestinalpeptide antagonist)；苏来迪斯塔(suradista)；苏拉灭；苦马豆碱；合成的葡胺聚糖；他莫司汀；甲碘化他莫昔芬；牛磺莫司汀；紫杉酚；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；特流比流(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)；四佐明(tetrazomine)；塞利布来斯汀(thaliblastine)；沙利度胺；噻可拉林；巯鸟嘌呤；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；甲状腺刺激激素；乙基锡初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；托普森汀(topsentin)；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；曲美沙特；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；赖氨酸激酶阻断剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；尿殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；凡若林B(variolin B)；载体***；红细胞基因疗法；沙利度胺；维拉雷琐；藜芦明；弗丁斯(verdins)；维替泊芬；长春瑞滨；弗克斯林(vinxaltine)；弗它星(vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C和净司他丁斯酯。优选的其他抗癌药是5-氟尿嘧啶和亚叶酸。
[0400]在更加具体的实施方式中，本发明还包括施用一种或多种本发明的组合物以便优选治疗上述乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、***癌、结肠癌和肺癌，所述组合物包含一种或多种治疗剂或与其联用，所述治疗剂例如但不限于如表5所示的抗癌药。
表5
[0401]本发明还包括组合施用本发明组合物与放疗，包括使用x射线、γ射线和其他放射源以破坏癌细胞。在某些实施方式中，放疗作为外线束放射或远程放射治疗给予，其中放射来自远端放射源。在其他实施方式中，放疗作为内部疗法或近程放射治疗给予，其中放射源置于体内靠近癌细胞或肿块的地方。
[0402]本领域已知癌症治疗药和它们的剂量、给药途径以及建议用法，已经描述在诸如《药师案头参考》(Physician’s Desk Reference)(第58版，2004)等文献中。
制剂
[0403]可利用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制本发明所用的药物组合物。因此，可将本发明组合物和它们生理上可接受的盐和溶剂合物配制成经吸入或吹入(通过口腔或鼻)或口服、胃肠外或粘膜(例如，含服、***、直肠、舌下)给药。在其他实施方式中，采用局部或全身性胃肠外给药。
[0404]对于口服给药，所述药物组合物可采取，例如利用药学上可接受的赋形剂通过常规方式制备的片剂或胶囊形式，所述赋形剂例如有：黏合剂(如，预先明胶化(pregelatinised)的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(如，马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(如，月桂基硫酸钠)。可通过本领域熟知的方法包衣片剂。口服给予的液体制剂可采取以下形式，例如溶液、糖浆或混悬液，或者它们可以干产品的形式存在，用水或其它合适的运载体构建后再使用。可利用药学上可接受的添加剂通过常规方式制备这种液体制剂，所述添加剂例如有：悬浮剂(如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)；乳化剂(如，卵磷脂或***胶)；非水性运载体(如，杏仁油、油酯、乙醇或分级的植物油)；防腐剂(如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。这些制剂也可适当含有缓冲盐、调味剂、色素和甜味剂。
[0405]可适当地配制口服给药的制剂而控释活性化合物。
[0406]对于含服给药，所述组合物可采取常规方式配制的片剂或糖锭形式。
[0407]对于吸入给药，可以装在加压包中或喷雾器中的气溶胶喷剂形式，利用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体来常规递送本发明所用的预防药或治疗药。在加压气溶胶的情况中，可通过提供能递送计量用量的阀门来确定剂量单位。可将用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊和药盒配制为含有化合物与合适粉基，例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0408]可将预防药或治疗药配制为通过注射，例如通过推注或连续输液而用于胃肠外给药。用于注射的制剂可以是单位剂型，例如装在含有添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器中。所述组合物可采取诸如油性或水性运载体配制的混悬液、溶液或乳液形式，并可含有配制制剂(formulatoryagent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用合适的运载体，例如无菌无热原水配制后使用。
[0409]预防药或治疗药也可配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂(retention enemas)，例如可含有，如可可油或其它甘油酯等常规栓剂基。
[0410]除了上述的其它制剂，也可将预防药或治疗药配制为长效制剂。可通过植入(例如，皮下或肌肉内)或肌肉内注射给予这种长效制剂。因此，例如可用合适的聚合或疏水性材料(如，可接受的油配制的乳液)或离子交换树脂配制预防药或治疗药，或配制为不易溶的衍生物，如配制为不易溶的盐。
[0411]本发明也提供包装在密封容器，例如标明含量的安瓿或小袋中的预防药或治疗药。在一个实施方式中，预防药或治疗药以装在密封容器中的无菌冻干粉末或无水浓缩物提供，可用，例如水或盐水重建成合适浓度后给予对象。
[0412]在本发明的其他实施方式中，本领域已知各种化疗、生物/免疫疗法和激素疗法药物的配制和给药，在《医师案头参考》(Physicians’DeskReference)，第56版，(2002)中常有描述。例如，在本发明的某些具体实施方式中，本发明的治疗药可按表5所述形式配制和提供。
[0413]在本发明的其他实施方式中，可将放疗药物，例如放射性同位素以装在胶囊中的液体或饮料口服给予。也可将放射性同位素制剂配置成静脉内注射剂。熟练的肿瘤学家能确定优选的制剂和给药途径。
[0414]在某些实施方式中，对于静脉内注射剂，本发明的组合物可配制成1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml和25mg/ml，对于反复皮下给药和肌内注射，可配制成5mg/ml、10mg/ml和80mg/ml。
[0415]如果需要，可将这些组合物装在包含一种或多种含活性成分的单位剂型包装或分装装置中。例如，所述包装可包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分装装置中可装有给药使用说明书。
给药剂量和频率
[0416]可通过标准临床方法测定预防、治疗、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状的本发明疗剂(例如，预防药或治疗药)或组合物的有效用量。给药频率和剂量也将随各患者的具体情况而改变，这取决于所给予的具体疗剂(例如，具体的一种或多种治疗或预防药)、病症、疾病或状况的严重程度、给药途径以及患者的年龄、体重、反应和以往用药史。例如，可将所述组合物给予动物模型，例如本文所述或本领域技术人员已知的动物模型来测定能有效预防、治疗、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状的本发明预防或治疗药或者组合物的剂量。此外，可任选采用体外试验来帮助鉴定最佳剂量范围。本领域技术人员可通过考虑这些因素和以下，例如参考文献报道和《医师案头参考》(Physicians’DeskReference)(第58版，2004)推荐的剂量来选择合适的方案。
[0417]在各种实施方式中，疗剂(例如，预防药或治疗药)的给药频率如下：间隔小于1小时，间隔约1小时，间隔约1小时至约2小时，间隔约2小时至约3小时，间隔约3小时至约4小时，间隔约4小时至约5小时，间隔约5小时至约6小时，间隔约6小时至约7小时，间隔约7小时至约8小时，间隔约8小时至约9小时，间隔约9小时至约10小时，间隔约10小时至约11小时，间隔约11小时至约12小时，间隔不超过24小时，或者间隔不超过48小时。在某些实施方式中，在同次患者就诊时施用两种或多种组分。
[0418]术语治疗有效的和预防有效的包括本文提供的给药剂量和频率。所述剂量和频率通常还将随各患者的具体情况而改变，这取决于所给予的具体治疗或预防药、癌症的严重性和类型、给药途径、以及患者的年龄、体重、反应和以往用药史。合适的方案可由精通本领域的技术人员通过考虑这种因素和以下(例如)文献中报道的剂量和《医师案头参考》(Physicians’Desk Reference)(第58版，2004)中推荐的剂量做出选择。
[0419]小分子的示范性剂量包括每千克对象或样品重量为微克或毫克级用量的小分子(例如，约1毫克/千克-约500毫克/千克、约100毫克/千克-约5毫克/千克，或约1微克/千克-约50微克/千克)。
[0420]对于本发明包括的抗体、蛋白质、多肽、肽和融合蛋白，给予患者的剂量通常是以患者体重计为0.0001-100mg/kg。优选地，以患者体重计，给予患者的剂量为0.0001-20mg/kg、0.0001-10mg/kg、0.0001-5mg/kg、0.0001-2mg/kg、0.0001-1mg/kg、0.0001-0.75mg/kg、0.0001-0.5mg/kg、0.0001-0.25mg/kg、0.0001-0.15mg/kg、0.0001-0.10mg/kg、0.001-0.5mg/kg、0.01-0.25mg/kg或0.01-0.10mg/kg。由于对外来多肽可产生免疫应答，人抗体在人体内的半衰期通常比其它物种的抗体长。因此，人抗体常可采取较低剂量和较低的给药频率。此外，可通过例如脂质化修饰来提高抗体的摄取和组织渗透从而降低本发明抗体或其片段的给药剂量和频率。
[0421]在具体的实施方式中，以患者体重计，为预防、治疗、控制和/或缓解患者的超增生性疾病或其一种或多种症状而给予的本发明ADC的剂量为150μg/kg或以下、125μg/kg或以下、100μg/kg或以下、95μg/kg或以下、90μg/kg或以下、85μg/kg或以下、80μg/kg或以下、75μg/kg或以下、70μg/kg或以下、65μg/kg或以下、60μg/kg或以下、55μg/kg或以下、50μg/kg或以下、45μg/kg或以下、40μg/kg或以下、35μg/kg或以下、30μg/kg或以下、25μg/kg或以下、20μg/kg或以下、15μg/kg或以下、10μg/kg或以下、5μg/kg或以下、2.5μg/kg或以下、2μg/kg或以下、1.5μg/kg或以下、1μg/kg或以下、0.5μg/kg或以下或0.5μg/kg或以下。在其他实施方式中，为预防、治疗、控制和/或缓解患者的超增生性疾病或其一种或多种症状而给予的本发明ADC的剂量是以下单位剂量：0.1-20mg、0.1-15mg、0.1-12mg、0.1-10mg、0.1-8mg、0.1-7mg、0.1-5mg、0.1-2.5mg、0.25-20mg、0.25-15mg、0.25-12mg、0.25-10mg、0.25-8mg、0.25-7m g、0.25-5mg、0.5-2.5mg、1-20mg、1-15mg、1-12mg、1-10mg、1-8mg、1-7mg、1-5mg或1-2.5mg。
[0422]在其他实施方式中，给予对象一份或多份有效量的一种或多种本发明疗剂法(例如，治疗或预防药)，此有效量能使本发明疗剂(例如，治疗或预防药)的血清滴度达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml。再在其他实施方式中，给予对象有效量的一种或多种本发明的ADC，从而使本发明ADC的血清滴度达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml，随后给予有效量的一种或多种本发明的ADC能使血清滴度维持在至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml。根据这些实施方式，可给予对象1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多次后续剂量。
[0423]在具体的实施方式中，本发明提供预防、治疗、控制和/或缓解患者的超增生性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予有此需要的对象以下剂量的一种或多种本发明疗剂(例如，治疗或预防药)、组合疗剂或组合物：至少10μg、优选至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg、至少100μg、至少105μg、至少110μg、至少115μg或至少120μg。在其他实施方式中，本发明提供预防、治疗、控制和/或缓解患者的超增生性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括每3天1次、优选每4天1次、每5天1次、每6天1次、每7天1次、每8天1次、每10天1次、每2周1次、每3周1次或每月1次给予有此需要的对象以下剂量的一种或多种本发明ADC、组合疗剂或组合物：至少10μg、优选至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg、至少100μg、至少105μg、至少110μg、至少115μg或至少120μg。
[0424]本发明提供预防、治疗、控制和/或缓解患者的超增生性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括：(a)给予需要的对象一份或多份剂量的预防或治疗有效量的一种或多种本发明ADC、组合疗剂或组合物；和(b)监测给予一定剂量数的所述疗剂(例如，治疗或预防药)后，所述对象中所述给予的ADC的血浆水平/浓度。此外，所述一定剂量数优选是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12份剂量的预防或治疗有效量的一种或多种本发明ADC、组合物或组合疗剂。
[0425]在具体的实施方式中，本发明提供预防、治疗、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括：(a)给予有此需要的对象至少10μg剂量(优选至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg)的一种或多种本发明疗剂(例如，治疗或预防药)；和(b)当所述对象中所给予的ADC的血浆水平低于0.1μg/ml、优选低于0.25μg/ml、低于0.5μg/ml、低于0.75μg/ml或低于1μg/ml时，给予所述对象一份或多份后续剂量。在其他实施方式中，本发明提供预防、治疗、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括：(a)给予有此需要的对象一份或多份至少10μg剂量(优选至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg)的一种或多种本发明ADC；和(b)监测给予一定剂量数后，所述对象中所给予ADC的血浆水平；和(c)当所述对象中所给予ADC的血浆水平低于0.1μg/ml、优选低于0.25μg/ml、低于0.5μg/ml、低于0.75μg/ml或低于1μg/ml时，给予所述对象后续剂量的本发明ADC。优选地，所述一定剂量数是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12份剂量的有效量的一种或多种本发明ADC。
[0426]按照本发明方法，可联合施用除本发明ADC之外的已用于或目前正用于预防、治疗、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状的疗剂(例如，预防药或治疗药)和一种或多种ADC来治疗、预防、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状。优选地，本发明联合治疗所用的预防药或治疗药的剂量低于已用于或目前正用于预防、治疗、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状的那些剂量。目前正用于预防、治疗、控制和/或缓解超增生性疾病或其一种或多种症状的药物的推荐剂量可从本领域任何文献获得，所述文献包括但不限于：Hardman等编，2001，Goodman和Gilman的《治疗学的药理学基础》(Pharmacological Basis OfBasis Of Therapeutics)，第10版，纽约麦基山(McGraw-Hill，New York)；《医师案头参考》(Physician’s Desk Reference)(PDR)，第58版，2004，新泽西州蒙特维尔医疗经济有限公司(Medical Economics Co.，Inc.，Montvale，NJ)；这两份文献全文纳入本文作为参考。
[0427]在各种实施方式中，这些疗剂(例如，预防药或治疗药)间隔不到5分钟、间隔不到30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1-约2小时、间隔约2小时-约3小时、间隔约3小时-约4小时、间隔约4小时-约5小时、间隔约5小时-约6小时、间隔约6小时-约7小时、间隔约7小时-约8小时、间隔约8小时-约9小时、间隔约9小时-约10小时、间隔约10小时-约11小时、间隔约11小时-约12小时、间隔约12小时-18小时、间隔18小时-24小时、间隔24小时-36小时、间隔36小时-48小时、间隔48小时-52小时、间隔52小时-60小时、间隔60小时-72小时、间隔72小时-84小时、间隔84小时-96小时或间隔96小时-120小时给予。在其他实施方式中，在同一次患者就诊时施用两种或多种疗剂。
[0428]在某些实施方式中，可循环给予一种或多种本发明ADC和一种或多种其他疗剂(例如，预防药或治疗药)。循环疗法包括在某时期给予第一疗剂(例如，第一预防药或治疗药)，然后在某时期给予第二疗剂(例如，第二预防药或治疗药)，任选地，然后在某时期给予第三疗剂(例如，预防药或治疗药)等等，重复该顺次给予，即进行此循环来降低对疗剂之一产生耐受、避免或降低疗剂之一的副作用和/或提高疗剂的效力。
[0395]在某些实施方式中，可反复给予相同的本发明ADC，给药可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其它实施方式中，可反复给予除本发明ADC外的同一疗剂(例如，预防药或治疗药)，给药可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
实施例
[0429]现参考以下实施例描述本发明。给予这些实施例仅是为说明的目的，本发明不应理解为以任何方式局限于这些实施例，而应理解为包括因本文的说明而显而易见的任何及所有改变形式。
实施例1
各种抗体构建物的产生和表达
[0431]产生抗共同抗原EphA2的六种人源化单克隆抗体(G5、10D3、12G3、1E11、4C10、4B11)和一种人/小鼠嵌合抗体(EA5)。所有这些抗体在哺乳动物细胞中表达不佳。在这些抗体各自的第40、60和/或61位产生一个或多个重链取代以确定在这些位置上存在一个或多个优选的氨基酸残基对产量的影响。六种人源化抗体在H40位上含有丙氨酸，这些抗体的H60和H61位分别被丙氨酸和天冬氨酸取代。抗相同抗原的嵌合抗体EA5在H40、H60或H61位不含任何优选氨基酸。产生EA5的两条独立重链，一条在60和61位含有取代，另一条在H40、H60和H61位含有取代。经修饰的重链的具体氨基酸残基(见图1B)如下所述。在所有情况中，导致40、60和61位具有一个或多个优选重链残基的取代能显著提高产量(见表6)。有趣的是，当EA5不含任何优选的氨基酸时，重链A60/D61组合本身能显著提高产率。
材料和方法
[0432]抗原特异性抗体的产生、表征和克隆：产生、筛选、克隆和表达抗体的通用方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，《最新分子生物学方法》，F.M.Ausubel等编，约翰威利父子出版公司(奇切斯特，英格兰，1998)；《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，第三版，J.Sambrook等编，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)(冷泉港，纽约，2001)；《抗体实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，E.Harlow和D.Lane编，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约，1988)；和《抗体使用实验室手册》(Using Antibodies：A Laboratory Manual)，E.Harlow和D.Lane编，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约，1999)，通过引用将它们全文纳入本文。
[0433]重链取代的产生：将抗体克隆G5、10D3、12G3、1E11、4C10、4B11和EA5的轻链可变区以及抗体克隆G5、10D3、12G3、1E11、4C10、4B11和EA5的重链可变区分别克隆入编码人巨细胞病毒主要立即早期(hCMVie)增强子、启动子和5′-非翻译区的哺乳动物表达载体(Boshart等，1985，Cell 41：521-30)。在该***中，人γ1链随人κ链一起分泌(Johnson等，1997，J.Infect.Dis.176：1215-24)。采用加州斯加特基因公司的快速改变多点诱变试剂盒(Quick Change Multi Mutagenesis Kit，Stratagene，CA)按照制造商的说明通过定点诱变引入所有重链取代。具体地说，采用以下引物在克隆G5、10D3、12G3、1E11、4C10和4B11中引入S60A/A61D：
5’-ACACAACAGAGTACGCTGACTCTGTGAAGGGTAGAGTCACCATT-3’；如此产生了重链抗体克隆G5/M、10D3/M、12G3/M、1E11/M、4C10/M和4B11/M；采用以下引物将N60A/Q61D引入EA5：
5’-GTTACAATGGTGTTACTAGCTACGCCGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCAC-3’和
5’-GTGGCCTTGCCCTTGAACTTGTCGGCGTAGCTAGTAACACCATTGTAAC-3’，由此产生了EA5/M’；并采用以下引物将S40A/N60A/Q61D引入EA5：
5’-CTACATGCACTGGGTCAAGCAGGCCCATGGAAAGAGCCTTGAG-3’、
5’-CTCAAGGCTCTTTCCATGGGCCTGCTTGACCCAGTGCATGTAG-3’、
5’-GTTACAATGGTGTTACTAGCTACGCCGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCAC-3’和
5’-GTGGCCTTGCCCTTGAACTTGTCGGCGTAGCTAGTAACACCATTGTAAC-3’，由此产生了EA5/M。注意，轻链保持未改变(图1A)。采用ABI 3100测序仪验证序列。然后采用脂转染胺和标准方法在35mm的6孔平皿中用各种抗体构建物瞬时转染人胎肾(HEK)293细胞。在转染后72和144小时时分两次收获上清液(分别称为第1次和第2次收获物)。然后根据产量和与原始抗原的结合来检测分泌的可溶性人IgG1(见下文)。
[0434]表达产量的测量：通过ELISA测量抗体克隆G5、G5/M、10D3、10D3/M、12G3、12G3/M、1E11、1E11/M、4C10、4C10/M、4B11和4B11/Mut的表达产量。采用抗-人IgG ELISA检测以3天为间隔分两次收集的转染上清液(见上文)的抗体产量。简言之，将涂布有山羊抗人IgG的96孔Biocoat平板(加州圣何塞BD生物科技公司(BD Biosciences，San Jose，CA))的各孔与样品(上清液)或标准品(人IgG，0.5-100ng/ml)一起培育，然后和山羊抗人IgG抗体的辣根过氧化物酶偶联物一起培育。用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺检测过氧化物酶活性并用0.2M H2SO4终止反应。在450nm阅读平板。结果总结于表6。
表6：重链修饰抗体的产量提高a
aHEK 293细胞用各种抗体构建物瞬时转染。
bH1＝第一次收获物(转染后72小时)。
cH2＝第二次收获物(转染后144小时)。
d增加倍数＝各种收获物(H1，H2)中重链修饰的“Mut”抗体的平均产量与各种收获物中未修饰抗体的平均产量相除的结果。
实施例2
固相淘选以鉴定克隆1C1
[0435]用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6，西格玛公司(Sigma))配制的20μg/ml的EphA2-Fc涂布免疫试管，4℃培育过夜。噬菌体文库(Fab310，戴克斯公司(Dyax))用1/5体积的20％PEG(氟鲁卡公司(Fluka))沉淀并重悬于PBS(pH 7.4)。然后用2％牛奶封闭噬菌体文库，用非-EphA2结合的单克隆抗体取消选定(以除去Fc结合物)。封闭和取消选定之后，将噬菌体文库转移至涂有EphaA2的免疫试管，该免疫试管用2％牛奶封闭。2小时后用PBST(PBS+0.1％吐温)洗涤免疫试管10-20次，然后用PBS洗涤10-20次以除去未结合的噬菌体。用1ml 100mM三乙胺(西格玛公司)从免疫试管上洗脱下结合的噬菌体并加入0.5ml 1M Tris-HCl(pH 7.5，英杰公司(Invitrogen))进行中和。然后将1体积洗脱并中和的噬菌体与5体积对数期TG1细胞(诺佛根公司(Novagen))和4体积2YT(塔克诺华公司(Teknova))混合。将样品于37℃培育30分钟(水浴)。然后以4000g离心样品并将沉淀物重悬于2YT。将细胞涂布在含有羧苄青霉素和2％葡萄糖的2YT琼脂平板(塔克诺华公司)上。平板于30℃培育过夜。第二天收集集落并用辅助噬菌体(英杰公司)感染。感染的细胞在含有羧苄青霉素(英杰公司)和卡那霉素(西格玛公司)的2YT中于30℃培养过夜以产生高效价噬菌体。从过夜培养液中沉淀噬菌体，然后按照上述过程进行第二轮淘选。第二轮淘选得到抗-EphA2抗体克隆1C1。
抗-EphA2抗体：1F12、1H3、1D3、2B12和5A8的产生
[0436]采用噬菌体展示技术来鉴定结合于EphA2的Fab。戴克斯公司的噬菌体文库fab310用于可溶性噬菌体淘选。噬菌体文库用2％牛奶封闭并用非-EphA2结合单克隆抗体取消选定(以除去Fc结合物)。链霉抗生物素蛋白涂布的戴纳尔珠(dynabead)(戴纳尔生物科技公司(Dynal Biotech))用1％牛奶封闭。使封闭并取消选定的噬菌体接触2.9μg生物素化的EphA2并使EphA2-噬菌体复合物被封闭的戴纳尔珠(英杰公司)捕获。用1ml100mM三乙胺(西格玛公司)洗脱结合的噬菌体并加入0.5ml 1M Tris-HCl中和洗脱液。为进行感染，将1体积的噬菌体洗脱液与5体积处于对数期的TG1(诺佛根公司)和4体积2YT(塔克诺华公司)混合。将此混合物在37℃的水浴中培育30分钟。感染后以4000g离心5分钟并将沉淀物重悬于2YT。将TG-1细胞涂布在含有50ug/ml羧苄青霉素和2％葡萄糖的2YT平板(塔克诺华公司)上并将平板于30℃培育过夜。第二天收集细菌菌落并用辅助噬菌体(英杰公司)感染。使感染的细胞在含有羧苄青霉素(英杰公司)和卡那霉素(西格玛公司)的2YT培养基中生长过夜以产生高效价噬菌体。通过PEG沉淀从过夜培养液中浓缩噬菌体。PEG沉淀采用培养液1/5体积的PEG/NaCl溶液(氟鲁卡公司的PEG)进行。沉淀后，将噬菌体沉淀物重悬于1ml PBS(pH 7.4，英杰公司)并用于下一轮淘选。再进行两轮淘选，此时生物素化的EphA2的浓度降至2.0μg。抗-EphA2抗体1F12、1D3、1H3和2B12来自第二轮淘选，抗-EphA2抗体5A8来自第三轮淘选。
抗-EphA2抗体的瞬时表达
[0437]为表达完整的抗体IgG，采用标准分子生物学技术将抗体重链和轻链的可变区克隆入含有IgG1/□或IgG1/□抗体恒定区的哺乳动物细胞IgG表达载体pABOE。重链和轻链表达盒都在它们各自的CMVie启动子控制之下。用293fectin转染试剂按照制造商的方法(英杰公司)将抗体基因瞬时转染入HEK 293F。9天内收集3次，之后使培养上清液通过A蛋白柱(GE健康护理公司(GE health care))来纯化蛋白质。用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3.2)洗脱结合的抗体，然后用PBS透析。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所有蛋白质，采用BCA试剂盒(皮尔斯公司(PIERCE))进行定量ELISA以确定抗体浓度。
实施例3
α-EphA2抗体的细胞表面结合
[0438]4℃在96孔v底平板中，用1μg第一Ab(1C1、1F12、1H3和3F2a-EphA2Ab以及R347同种型对照)将150μl FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清+L-谷氨酰胺)中的2×105细胞染色30分钟。然后用2×冷PBS洗涤细胞并在4℃用第二Ab(藻红蛋白(Phycoerythin)偶联的山羊抗人IgG，生物源公司(Biosource))染色30分钟。用BD生物科技公司的FACS流式细胞计(FACS Calibur flow cytometer)进行荧光分析。该实验的结果总结于图14A和14B，这些结果证实这些抗体各自有结合肿瘤细胞上表达的人、小鼠和大鼠EphA2的能力。
实施例4
α-EphA2抗体的内在化
[0439]将抗-EphA2抗体(B233、B208和EA5)和识别抗-EphA2抗体的第二皂草素(毒素)标记的单克隆抗体(mAb)共培育并引入基于肿瘤细胞的单层细胞(MCF-10A)，培育72-96小时。目的是测量细胞死亡，细胞死亡表明mAb复合物(抗-EphA2 mAb和第二mAb-皂草素的偶联物)被内在化。该试验用作初步筛选以选择内在化的mAb。参见Kohls等，Biotechniques，2000-1；28(1)：162-5。该实验的结果总结于本文的图15和16。
实施例5
α-EphA2抗体内在化的荧光显像
[0440]使细胞(PC3、HUVEC或CT26)于37℃/5％CO2在Nunc Tek II8-室载玻片上生长24-48小时，其浓度是每个室每400μl适当生长培养基2.5-5.0×104个细胞。4℃，用浓度为50μg/ml的第一Ab(G5、1C1、1F12或3F2抗-EphA2Ab和R347同种型对照)标记贴壁细胞30-45分钟。然后用2×PBS洗涤细胞，然后用生长培养基覆盖细胞并在37℃/5％CO2培育0分钟、20分钟(图18A-C和19)或60分钟(图17)以使细胞表面结合的第一Ab内在化。
[0441]内在化之后，将细胞固定(4％低聚甲醛)、通化处理(0.5％Triton X-100)、并用第二AlexaFluor 488山羊抗人IgGAb(生物源公司)标记，各步骤之间用2×冷PBS洗涤。最后用含DAPI的VECTASHIELD封固培养基(载体实验室公司(Vector Labs))以及盖玻片覆盖细胞，然后用荧光共焦显微镜检测并拍照。抗体内在化实验的结果示于本文图16、17、18A、18B、18C和19的荧光显微图片中。EphA2与激动EphA2抗体结合而被这些细胞系迅速内在化。
实施例6
EphA2受体活化
[0442]使细胞于37℃/5％CO2在6孔组织培养平板中生长过夜，其浓度是每个孔每3ml适当生长培养基0.5×106个细胞。第二天除去用过的培养基并更换成含有10μg1C1或1F12α-EphA2Ab或者R347同种型对照的新鲜培养基。将细胞在37℃/5％CO2下培育以激活EphA2受体。活化之后用1×冷PBS洗涤细胞并在冰上用含磷酸酶抑制剂混合物1和2(西格玛公司)和完全蛋白酶抑制剂混合物片剂(罗氏公司(Roche))的1％TritonX-100裂解缓冲液裂解，添加物按照制造商的推荐加入。将预偶联于兔抗小鼠IgG的D7α-EphA2mAb和50μl A蛋白琼脂糖珠与溶胞产物在4℃混合过夜以使蛋白质免疫沉淀。
[0443]按照制造商的方法用10％Bis-Tris NuPAGE Western凝胶分辨蛋白质裂解产物并通过电泳转移至硝酸纤维素膜(英杰公司)。将印迹与1μg/ml第一(小鼠α磷酸酪氨酸IgG2bk，克隆4-G10，阿普斯特公司(Upstate))和第二(过氧化物酶-偶联的山羊抗小鼠IgG，杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research))Ab一起培育以便用Super Signal ECL试剂盒(皮尔斯公司(Pierce))鉴定活化的(磷酸化的)蛋白质条带，并用爱美沙生物技术公司(Amersham Biosciences)的Hyperfilm培育(develop)。也可参见Coffman等，Cancer Res.63：7907-7912，2003。EphA2受体活化试验的结果总结于本文的图20和21，结果证实了这些抗体各自具有活化各种人、小鼠和大鼠肿瘤细胞系上EphA2的能力。
实施例7
Eph受体交叉反应性ELISA试验
[0444]为证实抗-EphA2抗体1C 1和1F12是否显示与受体Eph家族的任何鼠科成员有任何结合，进行了以下试验。用PBS(pH 7.2)将抗-EphA抗体从5μl/ml的浓度开始以1∶2稀释到8个孔中。用50μl稀释抗体涂布EIA/RIA ELISA平板(Costar编号3690)，4℃培育过夜。第二天用Elx405自动平板洗涤器洗涤平板，洗涤程序为用1X PBST(1X PSB，0.1％吐温20)进行5次分配/抽吸洗涤步骤，其间以振荡3秒为间隔。在一叠纸巾上将平板拍干，室温下用240μl封闭缓冲液(2％BSA w/v，用1X PBST配制)封闭1小时。用酶连接的硫-NHS-生物素试剂(EZ-link sulfo-NHS-BiotinReagent)(Pierce编号21335)将Eph受体生物素化，生物素/Eph受体分子的比例为8。生物素化的Eph受体用50mM Tris-HCl(Invitrogen编号15506-017)淬灭并用封闭缓冲液稀释至1μg/ml。平板再用Elx405自动平板洗涤器洗涤并拍干。在各孔中加入50μl稀释的生物素化的Eph受体并37℃培育1小时。如上所述将平板洗涤并干燥，然后加入50μl中性亲和素(neutravidin)-HRP 1：12500(Pierce编号31002)。37℃培育1小时后将平板洗涤、旋转180°并再次洗涤。将平板拍干并在各孔中加入50μl SureBlueTMB过氧化物酶(KPL编号52-00-03)，然后培育(develop)5-10分钟。用50μl 0.2M H2SO4终止反应xx并在450nm读取ELISA信号。该实验的结果总结于图23，结果证实1C1可结合鼠EphA2和鼠EphA4，而1F12可结合鼠EphA2、3、4、5、6、7、8以及鼠EphB1和2。
实施例8
体外生长抑制试验
[0445]抗体的偶联
用缬氨酸-瓜氨酸(vc)或马来酰亚胺己酰基-瓜氨酸(mc)接头将EphA2偶联于单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)或单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)。按照之前描述的方案(Doronina等，BioConjug Chem.2006；Doronina等，NatBiotech 2003)在西雅图遗传有限公司(Seattle Genetics，Inc.)进行抗体偶联。
体外生长抑制试验
[0446]使细胞于37℃/5％CO2在组织培养物处理的96孔平板(FalconBD)中生长过夜，培养浓度为每孔150μl生长培养基(RPMI 1640+10％胎牛血清)中含2.0-3.0×103个细胞。第二天除去用过的培养基并将每孔更换成120μl新鲜培养基。准备不同的药物稀释液平板并将30μl各种稀释液转移至细胞中。
[0447]将平板在37℃/5％CO2再培育3-4天并用细胞效价-总发光细胞生存力测定试剂盒(CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay kit)(帕玛咖公司(Promega))收获。用Wallac Victor II平板阅读器读取发光来检测细胞生存力。
[0448]在不同体外生长抑制试验中检测以下细胞：PC3、SKMEL-28、A549、MDA-MB-231、231KC、A375、HCT-116、SW620、MDA-MB-468、MDA-MB-435、T231、HUVEC、H460、M21、SKOV-3、HeyA8、Panc.02.03、DU145、ACHN、OVCAR-3、HT29、MCF10-A、F98和CYNO-MK。在不同体外生长抑制试验中检测以下抗体：G5vcMMAF、3F2vcMMAE、3F2vcMMAF、3F2mcMMAF、EA5vcMMAF、1A7MMAF、R347vcMMAF、R347mcMMAF、1C1mcMMAF、1F12mcMMAF、1C1vcMMAE和1F12vcMMAE。所进行的众多不同体外生长抑制试验的结果总结于本文的图30-47，该结果证实了各种EphA2偶联物具有特异性抑制表达EphA2的肿瘤细胞系生长的能力。
实施例9
用各种癌症模型检测抗-EphA2 ADC G5的体内功效
[0449]给4-6周龄的无胸腺nu/nu(新泽西州萨默维尔哈伦(Harlan，Somerville，NJ))雌性小鼠皮下注射5×106个肿瘤细胞。如附图图例所示，肿瘤的平均尺寸达到100-150mm3后每4天给腹膜内空腔注射PBS或抗体药物偶联物，总共注射5剂。各治疗组由10-12只小鼠构成。
[0450]从药物治疗开始时用卡尺定期(每周1-2次)测量肿瘤体积。这些研究的结果总结于本文的图49-51。这些结果证实，偶联于带有vc接头的MMAF的G5以剂量依赖性方式特异性抑制PC3和MDA-MB231肿瘤的体内生长。
实施例10
在***癌模型中检测抗-EphA2ADC 3F2的体内功效
[0450]给4-6周龄的无胸腺nu/nu(新泽西州萨默维尔哈伦)雌性小鼠皮下注射5×106个肿瘤细胞。如附图图例所示，肿瘤的平均尺寸达到100-150mm3后每4天给腹膜内空腔注射PBS或抗体药物偶联物，总共注射5剂。各治疗组由10-12只小鼠构成。
[0451]从药物治疗开始时用卡尺定期(每周1-2次)测量肿瘤体积。该研究的结果总结于本文的图52。这些结果证实，偶联于带有vc接头的MMAE或带有mc接头的MMAF的3F2可特异性抑制PC3肿瘤的体内生长。
实施例11
在各种癌症模型中检测抗-EphA2ADC 1C1和1F12的体内功效
[0452]给4-6周龄的无胸腺nu/nu(新泽西州萨默维尔哈伦)雌性小鼠皮下注射5×106个肿瘤细胞。如附图所示，肿瘤的平均尺寸达到100-150mm3后每4天给腹膜内空腔注射PBS或抗体药物偶联物，总共注射5剂。剂量范围为1mg/kg(20μg)到10mg/kg(200μg)，如本文各图所述(见本文图53-56C的描述)。各治疗组由10-12只小鼠构成。
[0453]从药物治疗开始时用卡尺定期(每周1-2次)测量肿瘤体积。这些研究的结果总结于本文的图53-56C。这些结果证实，偶联于带有mc接头的MMAF的1C1和1F12以剂量依赖性方式特异性抑制PC3和MDA-MB231肿瘤的体内生长，并且耐受良好。
实施例12
体内毒性研究
[0454]给4-6周龄的雌性Balb/c小鼠(新泽西州萨默维尔哈伦)经尾静脉注射(单次推注)PBS或抗体药物偶联物(偶联于带有vc接头的MMAF或偶联于带有mc接头的MMAF的1C1和1F12)，剂量水平如下：vcMMAE抗体为40mg/kg、50mg/kg和60mg/kg；1C1-mcMMAF抗体为120mg/kg、180mg/kg和240mg/kg；而1F12-mcMMAF抗体为90mg/kg、120mg/kg、180mg/kg、210mg/kg和240mg/kg。记录施用药物后14天的日常观察值和体重测量值。各治疗组由3-4只小鼠构成。任何证实有病征(驼背、呼吸受损、活力降低、体重减轻大于20％，等等)的动物通过CO2窒息实施人性化安乐死。这些体内毒性研究的结果总结于本文的图58，显示了各种抗体药物偶联物的相对耐受性，因为与体重减轻有关。
[0455]虽然出于说明的目的描述了本发明的具体实施方式，但本领域技术人员应知道可对诸细节作出许多改变而不脱离随附权利要求书所述的本发明。
[0456]本说明书提及的所有发表物、专利或专利申请均全文纳入本说明书作为参考，就好像每份发表物、专利或专利申请各自专门并单独表明全文纳入本文作为参考那样。
序列表
<110>米迪缪尼股份有限公司(MedImmune and Seattle Genetics)
M.S.金奇(Kinch，Michael S)
C.巴赫(Bachy，Christine)
D.泰斯(Tice，David)
H.吴(Wu，Herren)
高长寿(Gao，Changsou)
P.D.森特(Senter，Peter)
<120>毒素偶联的Eph受体抗体
<130>EP120PCT
<150>60/735,966
<151>2005-11-14
<160>166
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>383
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人源化抗体可变区
<400>1
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacatga tggcttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atcggtcctt ctggtggccc tactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tcagagacaa ctctaagaat actctctact 240
tgcagatgaa cagcttaagg gctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg ggatacgata 300
gtggctacga ttacgttgca gtggctgggc ccgctgaata cttccagcac tggggccagg 360
gcaccctggt caccgtctca agc 383
<210>2
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人源化抗体可变区
<400>2
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt acttggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcatctaatt tacatacggg ggtcccatct 180
aggttcagcg gcagtggatc tggaacagaa ttcagtctca ccatcagcgg cctgcagcct 240
gatgattttg caacctatta ttgccaacaa tataatagtt attctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210>3
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化抗体可变区
<400>3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Met Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Gly Pro Ser Gly Gly Pro Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asp Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Val Ala Gly Pro Ala
100 105 110
Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化抗体VL区
<400>4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>5
His Tyr Met Met Ala
1 5
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>6
Arg Ile Gly Pro Ser Gly Gly Pro Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>7
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>7
Tyr Asp Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Glu Tyr
1 5 10 15
Phe Gln His
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>8
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>9
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>10
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg Thr
1 5
<210>11
<211>387
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>11
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttaccaga tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggcgt tactctttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccgtgt attactgtac gagagaactt 300
ttgggtactg tagtagtacc agttgcatgg aaaatgcgtg gctactttga ctactggggc 360
cagctcaccc tggtcaccgt ctcaagc 387
<210>12
<211>324
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>12
gacatccaga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag catgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcccccgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210>13
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gln Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Val Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Leu Leu Gly Thr Val Val Val Pro Val Ala Trp Lys Met
100 105 110
Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Leu Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210>14
<211>108
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>15
Arg Tyr Gln Met Met
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<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>16
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Val Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>17
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>17
Glu Leu Leu Gly Thr Val Val Val Pro Val Ala Trp Lys Met Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Phe Asp Tyr
20
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>18
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>19
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Thr
1 5
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<211>10
<212>PRT
<213>人工的
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<223>抗体CDR
<400>20
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1 5 10
<210>21
<211>354
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>21
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtacgcta tgcgttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atcggtcctt ctggtggctg gactccttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300
ggcatttacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc aagc 354
<210>22
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>22
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atcacttgcc gggccagtca gggcattagt agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
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aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctagaa cttaataatt accctttcac tttcggcctt 300
gggaccaaag tgcatatcaa a 321
<210>23
<211>118
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Ala Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Gly Pro Ser Gly Gly Trp Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
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Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>24
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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Met Tyr Ala Met Arg
1 5
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<400>26
Val Ile Gly Pro Ser Gly Gly Trp Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210>27
<211>9
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<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>27
Asp Arg Gly Ile Tyr Gly Met Asp Val
1 5
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<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>28
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>29
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>30
Leu Glu Leu Asn Asn Tyr Pro Phe Thr
1 5
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<211>366
<212>DNA
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<220>
<223>合成构建物
<400>31
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacgata tgctttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atcggttctt ctggtggcta tactaagtat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagcccgc 300
agcgtagtgg ttagctctga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360
tcaagc 366
<210>32
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>32
gacatccaga tgacccagtc tccatcttct gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagt aagtggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctttggt gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aagttcagcg gcagtaaatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattctg caacttatta ctgccaacaa tataatgatt acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagattaa a 321
<210>33
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Asp Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Gly Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Ser Val Val Val Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>34
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Lys Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Lys Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>35
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>35
Pro Tyr Asp Met Leu
1 5
<210>36
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>36
Arg Ile Gly Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>37
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>37
Ala Arg Ser Val Val Val Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>38
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Lys Trp Leu Ala
1 5 10
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>39
Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>40
Gln Gln Tyr Asn Asp Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210>41
<211>351
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>41
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aattacaata tgtattgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atcgttcctt ctggtggcaa gacttcttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatcgtac 300
ggagggggat ttgactactg gggccagggc accctggtca ccgtctcaag c 351
<210>42
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>42
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgttggaga caaagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca ggatattctc acctggttag cctggtatca gtggaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca tcatcgacac cctgcagcct 240
gaggattttg caacttacta ctgtcaacag gctatccgtt tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa g 321
<210>43
<211>117
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>43
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Val Pro Ser Gly Gly Lys Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Gly Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>44
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Leu Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Trp Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp Thr Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ile Arg Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>45
Asn Tyr Asn Met Tyr
1 5
<210>46
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>46
Val Ile Val Pro Ser Gly Lys Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>47
Ser Tyr Gly Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>48
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Leu Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>49
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>50
Gln Gln Ala Ile Arg Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>51
<211>375
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>51
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tattaccgta tgtattgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctattctt ctggtggccc tacttattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatatg 300
ggtaccggtt tttggagtgg ttggggccta ggctctgact actggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct caagc 375
<210>52
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>52
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210>53
<211>125
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>53
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Arg Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Met Gly Thr Gly Phe Trp Ser Gly Trp Gly Leu Gly Ser
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>54
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>55
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>55
Tyr Tyr Arg Met Tyr
1 5
<210>56
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>56
Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>57
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>57
Asp Met Gly Thr Gly Phe Trp Ser Gly Trp Gly Leu Gly Ser Asp Tyr
1 5 10 15
<210>58
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>58
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210>59
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>59
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>60
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>61
<211>361
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>61
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt gattactcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggagtg gattgggttt attagaaaca aagctaatgc ctacacaaca 180
gagtacagtg catctgtgaa gggtagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300
taccctaggt atcatgctat ggactcctgg ggccagggca ccatggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210>62
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>62
gccatccagt tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtacct gcagaagcca 120
gggcagtctc cacagctcct gatctattat ggcttccagt ccatctctgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag gccaacagct ggccgctcac gttcggcgga 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210>63
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变重链
<400>63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>64
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>64
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Gly Phe Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>65
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>65
Asp Tyr Ser Met Asn
1 5
<210>66
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>66
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>67
Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser
1 5
<210>68
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>68
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210>69
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>69
Tyr Gly Phe Gln Ser Ile Ser
1 5
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>70
Gln Gln Ala Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210>71
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>71
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210>72
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>72
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>73
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>73
Ser Tyr Thr Met Ser
1 5
<210>74
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>74
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>75
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>75
Glu Ala Ile Phe Thr Tyr
1 5
<210>76
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>76
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210>77
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>77
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>78
Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210>79
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>79
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>80
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>80
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>81
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>81
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210>82
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>82
Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>83
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>83
Ser His Ala Met Asp Tyr
1 5
<210>84
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>84
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210>85
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>85
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>86
Val Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Thr
1 5
<210>87
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>87
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>88
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>88
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Asn Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210>89
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>89
Asp Tyr Ser Met Asn
1 5
<210>90
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>90
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>91
Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser
1 5
<210>92
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>92
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210>93
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>93
Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser
1 5
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>94
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210>95
<211>118
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>95
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asn Met Val Gly Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>96
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>96
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210>97
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>97
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210>98
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>98
Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210>99
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>99
Gly Gly Asn Met Val Gly Gly Gly Tyr
1 5
<210>100
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>100
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210>101
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>101
Leu Thr Thr Asn Leu Ala Ser
1 5
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>102
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210>103
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>103
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>104
<211>108
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体可变区
<400>104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105
<210>105
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>105
Asp Tyr Ser Met Asn
1 5
<210>106
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>106
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210>107
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>107
Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser
1 5
<210>108
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>108
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210>109
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Antibcdy CDR
<400>109
Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser
1 5
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体CDR
<400>110
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210>111
<211>990
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>抗体恒定区重链
<400>111
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa 990
<210>112
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>抗体恒定区轻链
<400>112
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210>113
<211>330
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体恒定区重链
<400>113
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>114
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗体恒定区轻链
<400>114
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>115
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>115
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Sar Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Thr Thr Val Tyr Gly Asp Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>116
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>116
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>117
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>117
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Phe Thr Val Tyr Gly Asp Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>118
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>118
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Pro Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Pro Ser Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>119
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>119
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Phe Thr Val Tyr Gly Asp Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>120
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>120
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Pro Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Trp Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Pro Ser Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>121
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>121
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Thr Thr Val Tyr Gly Asp Asn Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>122
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>122
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Pro Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Pro Ser Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>123
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>123
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp lle Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Phe Thr Val Tyr Gly Asp Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>124
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Pro Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Pro Ser Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>125
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>125
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Phe Thr Val Tyr Gly Asp Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>126
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>126
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Pro Ser Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>127
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>127
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Phe Thr Val Tyr Gly Asp Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>128
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>128
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Gly Ala Ser Thr Trp Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Pro Ser Trp Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>129
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<400>130
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<400>131
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<220>
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115
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<220>
<223>合成构建物
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aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
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<220>
<223>合成构建物
<400>140
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<220>
<223>合成构建物
<400>141
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<220>
<223>合成构建物
<400>142
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<220>
<223>合成构建物
<400>143
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<220>
<223>合成构建物
<400>144
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
<223>合成构建物
<400>145
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<212>PRT
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<220>
<223>合成构建物
<400>146
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<220>
<223>合成构建物
<400>147
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<212>PRT
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<220>
<223>合成构建物
<400>148
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<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>149
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>150
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>151
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<210>152
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>152
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>153
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>154
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<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>155
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<210>156
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>156
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>157
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100 105
Claims (108)
1.一种特异性结合于EphA2的内在化抗体药物偶联物(ADC)，其特征在于，所述药物是毒素。
2.如权利要求所述的ADC，其特征在于，所述ADC至少特异性结合人EphA2、小鼠EphA2和大鼠EphA2。
3.如权利要求1或2所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含间隔区和接头。
4.如权利要求3所述的ADC，其特征在于，所述接头是马来酰亚胺己酰基-瓜氨酸接头。
5.如权利要求3所述的ADC，其特征在于，所述接头是缬氨酸-瓜氨酸接头。
6.如权利要求1所述的ADC，其特征在于，所述毒素是抗-微管蛋白剂。
7.如权利要求6所述的ADC，其特征在于，所述抗-微管蛋白剂是奥瑞斯他汀。
8.如权利要求7所述的ADC，其特征在于，所述奥瑞斯他汀是奥瑞斯他汀E或奥瑞斯他汀F。
9.如权利要求8所述的ADC，其特征在于，所述奥瑞斯他汀是单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)。
10.如权利要求8所述的ADC，其特征在于，所述奥瑞斯他汀是单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)。
11.如权利要求1所述的ADC，其包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH结构域的氨基酸序列的可变重链(VH)结构域，其中，所述ADC特异性结合于EphA2多肽。
12.如权利要求1所述的ADC，其包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域的氨基酸序列的可变轻链(VL)结构域，其中，所述ADC特异性结合于EphA2多肽。
13.如权利要求11所述的ADC，其还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域。
14.如权利要求1所述的ADC，其包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的CDR的氨基酸序列的互补决定区(CDR)，其中，所述ADC特异性结合于EphA2多肽。
15.如权利要求14所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。
16.如权利要求14所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。
17.如权利要求15所述的ADC，其还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。
18.如权利要求15所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR1的氨基酸序列的VH CDR1。
19.如权利要求15所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
20.如权利要求15所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
21.如权利要求18所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
22.如权利要求18所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
23.如权利要求19所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
24.如权利要求21所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
25.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VH的氨基酸序列的VH CDR1。
26.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
27.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
28.如权利要求25所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR2的氨基酸序列的VH CDR2。
29.如权利要求25所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
30.如权利要求26所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
31.如权利要求28所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR3。
32.如权利要求16所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
33.如权利要求16所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
34.如权利要求16所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
35.如权利要求32所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
36.如权利要求32所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
37.如权利要求33所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
38.如权利要求35所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
39.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
40.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
41.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
42.如权利要求39所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
43.如权利要求39所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
44.如权利要求40所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
45.如权利要求42所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
46.如权利要求45所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
47.如权利要求25所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
48.如权利要求25所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
49.如权利要求46所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
50.如权利要求46所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VLCDR3。
51.如权利要求47所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
52.如权利要求49所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
53.如权利要求26所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
54.如权利要求26所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
55.如权利要求26所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
56.如权利要求53所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
57.如权利要求53所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
58.如权利要求54所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
59.如权利要求56所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
60.如权利要求27所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
61.如权利要求27所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
62.如权利要求27所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
63.如权利要求60所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
64.如权利要求60所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
65.如权利要求61所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
66.如权利要求63所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
67.如权利要求28所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
68.如权利要求28所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
69.如权利要求28所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
70.如权利要求67所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
71.如权利要求67所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
72.如权利要求68所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
73.如权利要求70所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
74.如权利要求29所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
75.如权利要求29所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
76.如权利要求29所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
77.如权利要求74所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
78.如权利要求74所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
79.如权利要求75所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
80.如权利要求77所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
81.如权利要求30所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
82.如权利要求30所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B 12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
83.如权利要求30所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
84.如权利要求81所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
85.如权利要求81所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
86.如权利要求82所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
87.如权利要求84所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
88.如权利要求31所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR1的氨基酸序列的VL CDR1。
89.如权利要求31所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
90.如权利要求31所述的ADC，其特征在于，所述ADC包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
91.如权利要求88所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR2的氨基酸序列的VL CDR2。
92.如权利要求88所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
93.如权利要求89所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
94.如权利要求91所述的ADC，其特征在于，所述ADC还包含具有12G3H11、B233、B208、B210、G5、10C12、4H5、10G9、3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12或5A8的VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR3。
95.一种分离的核酸，其包含编码如权利要求1-94中任一项所述ADC的人、人源化或嵌合形式的重链可变结构域或轻链可变结构域的核苷酸序列。
96.一种载体，其包含如权利要求95所述的核酸。
97.一种宿主细胞，其包含如权利要求96所述的载体。
98.一种治疗有此需要的患者的癌症的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的如权利要求1-94中任一项所述的ADC。
99.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述施药使癌细胞内的EphA2磷酸化水平相对于未治疗的癌细胞内的EphA2磷酸化水平有所提高。
100.如权利要求99所述的方法，其特征在于，所述癌症是上皮细胞来源的癌症。
101.如权利要求100所述的方法，其特征在于，所述癌症包含与具有所述癌细胞组织类型的非癌细胞相比过表达EphA2的细胞。
102.如权利要求100所述的方法，其特征在于，所述癌症是皮肤、肺、结肠、乳腺、***、膀胱、肾或胰腺的癌症或是肾细胞癌或黑色素瘤。
103.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述癌症是转移性癌症。
104.如权利要求98所述的方法，所述方法包括施用不是EphA2抗体的其他抗癌疗法。
105.如权利要求104所述的方法，其特征在于，所述其他癌症疗法选自化疗、生物疗法、免疫疗法、放疗、激素疗法或外科手术。
106.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1-94中任一项所述的ADC以及药学上可接受的载体。
107.如权利要求106所述的药物组合物，其包含不是EphA2抗体的抗癌药。
108.如权利要求107所述的药物组合物，其特征在于，所述抗癌药是化疗药、放疗药、激素疗法药物、生物疗法药物或免疫疗法药物。
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