CN108315479A - 安卡拉病毒实时荧光定量pcr引物对及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对，包括FAdV‑4‑F和FAdV‑4‑R。所述引物对可用于制备安卡拉病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，从而对安卡拉病毒进行病毒含量的检测。该试剂盒包括阳性对照标准品、PCR反应液和阴性对照；所述阳性对照标准品为含有FAdV‑4序列的重组质粒pMD18‑FAdV‑4；所述PCR反应液包括提取的模板DNA，引物对，SYBR GreenⅠ荧光染料溶液，Taq酶，ddH2O，所述SYBR GreenⅠ荧光染料溶液包括SYBR Green I荧光染料、dNTP、反应缓冲液；双蒸水作为阴性对照。用本发明的引物对制备的安卡拉病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对安卡拉病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。

Description

安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对及试剂盒。
背景技术
安卡拉病是由禽腺病毒C种血清型4型(FAdV-4)引起的一种以心包积液，肝脏出血、肿大为特征的传染病。最早在1987年发现于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，因此称“安卡拉病”。根据其发病特征，也将其称为“鸡心包积液-肝炎综合征”。安卡拉病在2015年夏天首先在山东聊城地区的莘县引起肉鸡群大量发病，随后迅速传播至其他地方的肉食鸡、三黄鸡、麻鸡等。死亡率高达10％～80％。且该病的发病区域正在不断扩大，给养鸡业造成了一定的经济损失。目前，已建立的
FAdV-4的现有检测方法还较为单一，主要还是利用传统聚合酶链式反应法(PCR)进行检测，快速、敏感等方面尚有不足。
发明内容
本发明旨在提供一种实时荧光定量PCR检测安卡拉病的引物对。
本发明所采取的技术方案是：
一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对，包括FAdV-4-F：5′-CTTCGCAAGTCTCAGTA-3′(SEQ ID№1)和FAdV-4-R：5′-GTGCCCGTGTTATCCA-3′(SEQ ID №2)。所述引物对是根据Gen Bank上已发表的FAdV-4的Hexon全基因组序列[登录号：EU931692.1]的保守序列而设计。
本发明的引物对可用于制备安卡拉病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，从而对安卡拉病毒(FAdV-4)进行病毒含量的检测。该试剂盒包括阳性对照标准品、PCR反应液和阴性对照；所述阳性对照标准品为含有FAdV-4序列的重组质粒pMD18-FAdV-4；所述PCR反应液包括提取的模板DNA，如前所述的引物对，SYBR GreenⅠ荧光染料溶液，Taq酶，ddH2O，所述SYBRGreenⅠ荧光染料溶液包括SYBR Green I荧光染料、dNTP、反应缓冲液；双蒸水作为阴性对照。
用本发明的引物对制备的安卡拉病毒(FAdV-4)实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对安卡拉病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。
附图说明
图1是荧光定量PCR标准曲线；
图2是荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线；
图3是荧光定量PCR特异性试验图，其中标号1为阴性对照，2为FAdV-4阳性DNA，3为减蛋综合征病毒(EDSV)，4为新城疫病毒(NDV)，5为H5亚型禽流感病毒，6为H9亚型禽流感病毒的核酸，7为H9亚型禽流感病毒的c DNA；
图4为10个稀释度标准样品的灵敏性试验扩增曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1，荧光定量PCR方法的建立
FAdV-4基因组目的片段PCR扩增：
取收集的鸡胚尿囊液，于3000r/min,4℃离心10min后，收集上清液提取病毒核酸。PCR反应体系为：Primix Ex TaqTM酶12.5μL，上、下游引物各1μL(10μmol/L)，DNA模板2μL，加灭菌三蒸水至总体积25μL。上述各组分混匀瞬时离心后，在温度梯度PCR仪上执行以下程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，47℃退火54.5s，72℃延伸60s；进行34个循环，最后72℃延伸10min。取5μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
FAdV-4阳性对照标准品的制备：
目的PCR产物电泳后，用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒回收，按照目的片段与pMD-18T载体分子比5∶1的比例进行连接、转化、菌落PCR鉴定、序列分析，并对阳性对照标准品进行少量提取和纯化后，于-20℃保存备用。
实时定量PCR反应及标准曲线和回归方程的建立：
少量提取阳性对照标准品经纯化后，测定其在260nm和280nm处的吸光值，计算出质粒浓度和纯度依据推算分子量计算目的基因拷贝数，对阳性重组质粒进行10倍梯度稀释，作为实时定量PCR的标准品。反应条件和PCR体系如表1所示：
表1 反应条件和PCR体系
实施例2，FAdV-4目的片段PCR扩增与重组质粒的鉴定
将FAdV-4的Hexon保守序列中长度为114bp的目标片段纯化与pMD-18T载体连接后，将连接产物转化入DH5α感受态细胞，同时对转化成功的菌落进行纯化培养，并进行PCR及测序鉴定，与预期结果一致。序列测定结果表明，与Du CV基因组的对应区域的同源性为100％，将构建成功的含有目的基因重组质粒命名为pMD18-FAdV-4。
实施例3，实时定量PCR反应及标准曲线的绘制
将少量提取并纯化后的pMD18-FAdV-4质粒测得OD260nm和OD280nm分别为0.165和0.089，相应浓度的重组质粒拷贝数为2.40×108拷贝/μL，将重组质粒进行10倍梯度稀释，取100～106拷贝数的重组质粒建立标准曲线，横坐标代表质粒拷贝数的对数(X)，纵坐标为Ct值(Y)；在此基础上推导出相应的回归方程为y＝-3.1245x+34.197，回归方程与标准曲线的相关系数(R2)为0.997，扩增效率为1.090，结果如图1所示。荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线见图2。标准品各个稀释度的溶解温度Tm值在86.0～86.5℃之间，无引物二聚体和非特异性扩增产物出现，所建立PCR方法的引物特异性好。
实施例4，特异性试验
特异性、灵敏性及重复性试验：
采用建立的荧光定量PCR方法对FAdV-4阳性DNA、减蛋综合征病毒(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒的核酸或c DNA进行扩增，同时设立阴性对照，结果如图3所示，其溶解曲线单一，表明该方法具有良好的特异性。
实施例5，灵敏性试验
将已计算出拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释，作10次稀释，每个梯度浓度的重组质粒分别作为模板，在最佳反应条件下进行荧光定量PCR扩增，结果见图4。由图4可知，能检测出来的最低拷贝数为6.72×10-1拷贝/μL。
实施例6，重复性试验
以6.72×103、6.72×104、6.72×105拷贝/μL 3个稀释度的FAdV-4重组质粒样品作为模板，以最佳反应条件进行荧光定量PCR的批内和批间重复性试验，结果见表2。由表2可知，3次批内和批间重复性试验的变异系数均小于2％。表明建立的荧光定量PCR的方法具有较好的重复性。
表2 荧光定量PCR的批内与批间重复性试验结果
荧光定量PCR是在PCR反应过程中通过连续监测荧光信号的强弱来实时测定特异性产物的量，并据此推断检测病料的初始含毒量，不仅有常规PCR技术的扩增高效率的特点，还具有高度的特异性、光谱技术的高敏感性和精确性等特点，同时避免了后续电泳等步骤，减少了污染和人为操作带来的误差。采用该方法检测减蛋综合征病毒(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒的核酸或c DNA结果均为阴性，说明该方法具有良好的特异性；在重复性试验中，批内、批间重复性试验结果的变异系数均小于2％，表明重复性良好。本试验最小检出浓度为6.72×10-1拷贝/μL，在灵敏性上有一定提高。该荧光定量PCR方法可利用其标准曲线准确定量，即检测样品中所含有的初始病毒量。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对及试剂盒
<130> 2018
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttcgcaagt ctcagta 17
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgcccgtgt tatcca 16

Claims (2)

1.一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对，其特征在于，包括SEQ ID № 1所示的FAdV-4-F和SEQ ID № 2所示的FAdV-4-R。
2.一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括阳性对照标准品和PCR反应液；所述阳性对照标准品为含有FAdV-4序列的重组质粒pMD18-FAdV-4；所述PCR反应液包括提取的模板DNA，如权利要求1所述的引物对，SYBR Green Ⅰ荧光染料溶液，Taq酶，ddH2O。
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