CN112725533A - 用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量pcr鉴别的引物组 - Google Patents

用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量pcr鉴别的引物组 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的引物组，所述引物的序列如SEQ ID NO.1‑4所示，本发明建立能够同时对鸭1型腺病毒(DAdV‑1)和鸭4型腺病毒(DAdV‑4)进行检测和精准定量的实时荧光定量PCR方法具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的引物组研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的引 物组
技术领域
本发明提供一种用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的引物组及其试剂盒，属于动物传染病学领域。
背景技术
实时荧光定量PCR方法(Real time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。双重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测两种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。
根据国际病毒分类委员会(ICTV)分类，腺病毒科Adenoviridae下设5个属，分别为富AT腺病毒属Atadenovirus、禽腺病毒属Aviadenovirus、鱼腺病毒属Ichtadenovirus、哺乳动物腺病毒属Mastadenovirus和唾液酸酶病毒属Siadenovirus。其中富AT腺病毒属有5个种，分别为牛腺病毒D型Bovine adenovirus D、绵羊腺病毒D型Ovine adenovirus D、袋鼠腺病毒A型Possum adenovirus A、蛇腺病毒A型Snake adenovirus A和鸭腺病毒A型Duckadenovirus A(也称鸭1型腺病毒，Duck adenovirus 1，DAdV-1)(该属的代表种)。
鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)是2019年在我国南方地区发现一种鸭新型腺病毒病。对该病毒基因组进行分析发现，其主要基因编码蛋白均和鸭群中前期发现的鸭1型腺病毒、鸭2型腺病毒和鸭3型腺病毒相关基因的核苷酸和氨基酸同源性均低于80％。遗传进化分析表明，DAdV-4属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)，但处于一个独立的遗传进化分支，将其命名为鸭4型腺病毒(duckadenovirus 4，DAdV-4)。2020年，本研究团队在福建地区鸭群中也证实存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染(命名为DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)，测定的DBP基因和鸭4型腺病毒参考株GD-2019株(GenBank登录号MN733730)核苷酸同源性为100％。流行病学研究证实，当前鸭群中存在对鸭群健康养殖危害极大的腺病毒科禽腺病毒属的两种腺病毒(DAdV-1和DAdV-4)流行，这就给疫病的鉴别诊断带来现实需求。
本发明基于鸭群中存在对鸭群健康养殖危害极大的腺病毒科禽腺病毒属的两种腺病毒(DAdV-1和DAdV-4)基因序列特征，巧妙设计用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物组，可简化操作程序、节约成本，又可快速用于开展鸭群中DAdV-1和DAdV-4相关病原学致病机理(尤其是协同致病机理)研究。当前，国内外尚未见用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒(DAdV-1和DAdV-4)实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物组研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)实时荧光定量PCR鉴别的引物组及其试剂盒，建立能够同时对鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒进行鉴别的实时荧光定量PCR方法，该方法简化操作程序、节约成本。当前，国内外尚未见用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒(DAdV-1和DAdV-4)实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物组研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的引物组，所述引物包括如下：
鸭1SYF1：GCAGCTAGGAAGCAAGGTATT；
鸭1SYR101：ACCTCTGGTTTGAAGTGATGG；
鸭4SYF1：GGAAACCTGCGGTCCTTTAT；
鸭4SYR88：GGACGAAGAAGAAGAGCAAGAA。
所述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
所述实时荧光定量PCR鉴别的引物组在制备鉴别鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒的试剂盒上的应用。
一种用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
本发明建立的实时荧光定量PCR反应体系如表1所示：
表1实时荧光定量PCR反应体系
试剂 使用量/μL
EvaGreen Supermix(2×) 10
鸭1SYF1(10μmol/L) 0.3
鸭1SYR101(10μmol/L) 0.3
鸭4SYF1(10μmol/L) 0.3
鸭4SYR88(10μmol/L) 0.3
待检测样品的核酸DNA 2
灭菌去离子水 6.8
总体积 20
优化后的实时荧光定量PCR条件为：95℃120s，循环1次；95℃10s、58℃30s，循环40次；循环结束后，做出对应的熔解曲线。
结果判定：
实时荧光定量PCR反应结束后，观察熔解曲线峰值(Tm值)分析试验结果：
若在Tm＝(83.20±0.09)℃出现单一的特异性峰判为鸭1型腺病毒阳性；
若在Tm＝(79.22±0.10)℃出现单一的特异性峰判为鸭4型腺病毒阳性；
若Tm＝(83.20±0.09)℃和Tm＝(79.22±0.10)℃均出现峰值，表明鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒混合感染。
本发明提供用于鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)实时荧光定量PCR鉴别的引物组及其试剂盒，并建立能够同时对鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)进行检测和精准定量的实时荧光定量PCR方法具有以下优点和效果：
1.同时检测：本发明利用所述引物组建立的实时荧光定量PCR检测方法能够同时对鸭群中的DAdV-1和DAdV-4进行检测、区分和精准定量，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其Tm值即可直接对结果进行判断。
2.检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。
3.定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据检测待检样品中鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)的Ct值，可直接对其感染程度进行准确定量。
4.灵敏度高：鸭1型腺病毒(DAdV-1)的最低检测限为74.28拷贝/μL；鸭4型腺病毒(DAdV-4)的最低检测限为89.06拷贝/μL。
5.特异性强：对鸭群中的常见病原(如E coli.、R.A.、P.M.、DuCV、GHPyV、GPV、MDPV)均未见阳性扩增信号，仅对鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)检测出现荧光信号，且两者存在特异性熔解曲线峰值(Tm值)差异。
6.对83份临床送检鸭源病料进行鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染的实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的DNA，按照建立的实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm＝(83.20±0.09)℃出现单一的特异性峰的样品有7份(Tm值分别为83.19℃、83.17℃、83.23℃、83.21℃、83.19℃、83.22℃、83.21℃)，即存在鸭1型腺病毒(DAdV-1)感染阳性样品7份，阳性率为8.43％(7/83)；在Tm＝(79.22±0.10)℃出现单一的特异性峰的样品有4份(Tm值分别为79.18℃、79.22℃、79.21℃和79.21℃)，即存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染阳性样品4份，阳性率为4.82％(4/83)；且还有一份样品出现双峰值(Tm值分别为79.21℃和83.20℃)，即存在鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)混合感染阳性样品1份，阳性率为1.20％(1/83)。
附图说明
图1是DAdV-1和DAdV-4的DBP基因核苷酸同源性分析图。
图2是DAdV-1特异性引物设计原理示意图。
图3是DAdV-4特异性引物设计原理示意图。
图4是鸭1型腺病毒实时荧光定量PCR标准曲线。
图5是鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR标准曲线。
图6是实时荧光定量PCR方法检测鸭1型腺病毒敏感性试验结果图，其中，1：7.428×103拷贝/μL；2：7.428×102拷贝/μL；3：7.428×101拷贝/μL；7.428×100拷贝/μL。
图7是实时荧光定量PCR方法检测鸭4型腺病毒敏感性试验结果图，其中，1：8.906×104拷贝/μL；2：8.906×103拷贝/μL；3：8.906×102拷贝/μL；4：8.906×101拷贝/μL 5：8.906×100拷贝/μL。
图8是实时荧光定量PCR方法鸭1型腺病毒特异性测定结果图，其中，1：DAdV-1；Controls:试验使用的对照(E coli.、R.A.、P.M.、DuCV、GHPyV、GPV、MDPV)，由于均无阳性扩增信号，肉眼无法有效区分。
图9是实时荧光定量PCR方法鸭4型腺病毒特异性测定结果图，其中，1：DAdV-4；Controls:试验使用的对照((E coli.、R.A.、P.M.、DuCV、GHPyV、GPV、MDPV))，由于均无阳性扩增信号，肉眼无法有效区分。
图10是实时荧光定量PCR方法的熔解曲线图，其中，1：DAdV-4阳性；2：DAdV-1阳性；3：DAdV-1和DAdV-4阳性；4:试验使用的对照(E coli.、R.A.、P.M.、DuCV、GHPyV、GPV、MDPV)，由于均无阳性扩增信号，肉眼无法有效区分。
具体实施方式
下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
实施例1
1、相关试验病原
试验用病原(菌)鸭1型腺病毒(DAdV-1)、鸭4型腺病毒(DAdV-4)、鸭大肠杆菌(Ecoli.)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭源鹅多瘤病毒(GHPyV)、鸭源鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2、实时荧光定量PCR的引物设计与分析
2.1基因分析与比较
在GenBank数据库中检索不同宿主源禽腺病毒科腺病毒属病毒基因序列，经Lasergene软件分析比对发现，本研究选取DBP基因编码区序列作为引物候选基因靶区。
2.2引物设计
设计引物是参考基因序列为：鸭1型腺病毒(DAdV-1)(FJ12025株，KF286430)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)(DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)。
由于鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)的DBP基因是反向编码的，在引物设计时需要考虑这一问题(设计引物时DAdV-1参考株为FJ12025株、DAdV-4参考株为DAdV-4-FJ001株，设计引物时选择其反向编码序列进行实时荧光定量PCR的引物设计)，核苷酸同源性分析发现，DAdV-1参考株为FJ12025株和DAdV-4参考株为DAdV-4-FJ001株核苷酸同源性仅为48.9％(见图1)(说明：DAdV-1和DAdV-4型内基因较为保守，仅存在个别核苷酸位点变异，故图1仅选用两株来代表)。
2.2.1 DAdV-1特异性实时荧光定量PCR引物设计
经核苷酸同源性分析比较，设计针对DAdV-1特异性实时荧光定量PCR引物，引物序列为：
鸭1SYF1：GCAGCTAGGAAGCAAGGTATT；
鸭1SYR101：ACCTCTGGTTTGAAGTGATGG；
预期目的片段大小为101bp。从图2可见，本研究设计的DAdV-1特异性引物在DAdV-1和DAdV-4见差异较大，符合试验预期。
2.2.2 DAdV-4特异性实时荧光定量PCR引物设计
经核苷酸同源性分析比较，设计针对DAdV-4特异性实时荧光定量PCR引物，引物序列为：
鸭4SYF1：GGAAACCTGCGGTCCTTTAT；
鸭4SYR88：GGACGAAGAAGAAGAGCAAGAA；
预期目的片段大小为88bp。从图3可见，本研究设计的针对DAdV-4特异性实时荧光定量PCR引物在DAdV-1和DAdV-4见差异较大，符合试验预期。
3、实时荧光定量PCR检测方法的建立
3.1 DAdV-1阳性标准品的构建
根据DAdV-1(FJ12025株)DBP基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DAdV-1-F0：5′-TCGTCTTCTTCCTCGTCTTCAT-3′和DAdV-1-R0：5′-TCCTACCAGCGAAGCAGCAAT-3′，PCR产物大小为729bp。
用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取DAdV-1(FJ12025株)核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix(+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物(DAdV-1-F0，10μM和DAdV-1-R0，10μM)各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃50s，54℃30s，72℃60s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。
用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(DAdV-1-F0和DAdV-1-R0)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品(T-DAdV-1)，分装后置于-20℃保存备用。
3.2 DAdV-4阳性标准品的构建
根据DAdV-4(DAdV-4-FJ001株)DBP基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DAdV-4-F0：5′-CAATTCCACCACGCGAGGCTT-3′和DAdV-4-R0：5′-ACCTTGTAAAATAAGTGCCAG-3′，PCR产物大小为547bp。
用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取DAdV-4(DAdV-4-FJ001株)核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix(+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物(DAdV-4-F0，10μM和DAdV-4-R0，10μM)各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃50s，55℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。
用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(DAdV-4-F0和DAdV-4-R0)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品(T-DAdV-4)，分装后置于-20℃保存备用。
3.3实时荧光定量PCR方法的建立
分别以鸭1型腺病毒阳性标准品(T-DAdV-1)(质粒浓度为7.428×104至7.428×101拷贝/μL)和鸭4型腺病毒阳性标准品(T-DAdV-4)(质粒浓度为8.906×104至8.906×101拷贝/μL)为模板，在不同退火温度(54-62℃)、引物浓度(2.5-20μmol/L)下进行实时荧光定量PCR反应，筛选出最优条件[循环数阈值(cycle threshold，Ct值)较小且荧光值ΔRn较大时]。
优化后的实时荧光定量PCR体系见表1，优化后的实时荧光定量PCR条件为：95℃120s，循环1次；95℃10s、58℃30s，循环40次；循环结束后，做出对应的熔解曲线。
表1实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002910314020000081
Figure BDA0002910314020000091
以各鸭1型腺病毒标准品中质粒含量(C)的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，获得鸭1型腺病毒实时荧光定量PCR标准曲线(图4)，所获得标准曲线斜率为-3.35，Y轴截距为39.65，相关系数为0.999，符合实验预期。
以各鸭4型腺病毒标准品中质粒含量(C)的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，获得鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR标准曲线(图5)，所获得标准曲线斜率为-3.54，Y轴截距为39.33，相关系数为0.990，符合实验预期。
3.4实时荧光定量PCR方法的敏感性
分别以鸭1型腺病毒阳性标准品(T-DAdV-1)(质粒浓度为7.428×103至7.428×100拷贝/μL)和鸭4型腺病毒阳性标准品(T-DAdV-4)(质粒浓度为8.906×104至8.906×100拷贝/μL)为模板，以优化后的实时荧光定量PCR方法进行扩增。结果可见，鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒最低检测限分别为74.28拷贝/μL(图6)和89.06拷贝/μL(图7)。
3.5实时荧光定量PCR方法的特异性性
3.5.1实时荧光定量PCR检测鸭1型腺病毒特异性
以鸭1型腺病毒阳性样品核酸DNA为模板，以优化后的实时荧光定量PCR方法进行扩增。结果可见(图8)，仅DAdV-1出现阳性扩增信号，对其他病原(如E coli.、R.A.、P.M.、DuCV、GHPyV、GPV、MDPV)均未见阳性扩增信号。3.5.2实时荧光定量PCR检测鸭4型腺病毒特异性
以鸭4型腺病毒阳性样品核酸DNA为模板，以优化后的实时荧光定量PCR方法进行扩增。结果可见(图9)，仅DAdV-4出现阳性扩增信号，对其他病原(如E coli.、R.A.、P.M.、DuCV、GHPyV、GPV、MDPV)均未见阳性扩增信号。
4、实时荧光定量PCR方法结果判断及特异性分析
实时荧光定量PCR反应结束后，观察熔解曲线峰值(Tm值)分析试验结果：若在Tm＝(83.20±0.09)℃出现单一的特异性峰判为鸭1型腺病毒阳性(见图10)；若在Tm＝(79.22±0.10)℃出现单一的特异性峰判为鸭4型腺病毒阳性(见图10)；若Tm＝(83.20±0.09)℃和Tm＝(79.22±0.10)℃均出现峰值，表明鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒混合感染(见图10)。对其他病原(如E coli.、R.A.、P.M.、DuCV、GHPyV、GPV、MDPV)均未见特异性溶解曲线峰值(见图10)。
5、临床样品的检测
对83份临床送检鸭源病料进行鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染的实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的DNA，按照建立的实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm＝(83.20±0.09)℃出现单一的特异性峰的样品有7份(Tm值分别为83.19℃、83.17℃、83.23℃、83.21℃、83.19℃、83.22℃、83.21℃)，即存在鸭1型腺病毒(DAdV-1)感染阳性样品7份，阳性率为8.43％(7/83)；在Tm＝(79.22±0.10)℃出现单一的特异性峰的样品有4份(Tm值分别为79.18℃、79.22℃、79.21℃和79.21℃)，即存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染阳性样品4份，阳性率为4.82％(4/83)；且还有一份样品出现双峰值(Tm值分别为79.21℃和83.20℃)，即存在鸭1型腺病毒(DAdV-1)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)混合感染阳性样品1份，阳性率为1.20％(1/83)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的引物组
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gcagctagga agcaaggtat t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acctctggtt tgaagtgatg g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggaaacctgc ggtcctttat 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggacgaagaa gaagagcaag aa 22

Claims (2)

1.一种用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的引物组，其特征在于：所述引物包括如下：
鸭1SYF1：GCAGCTAGGAAGCAAGGTATT；
鸭1SYR101：ACCTCTGGTTTGAAGTGATGG；
鸭4SYF1：GGAAACCTGCGGTCCTTTAT；
鸭4SYR88：GGACGAAGAAGAAGAGCAAGAA。
2.一种用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR鉴别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
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