CN107299155A - 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，属于动物传染病学领域。本发明包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化，样本DNA提取及结果检测判定。本发明建立的检测鹅星状病毒的实时荧光定量PCR的引物和探针的方法，在检测鹅星状病毒上灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测15.7个拷贝，可用于检测临床样本中鹅星状病毒的感染检测。

Description

一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针

技术领域

本发明涉及一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，属于动物传染病学领域。

背景技术

星状病毒属于星状病毒科(astroviridae)星状病毒属(astrovirus)，根据宿主不同分为两个属：哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽类星状病毒属(Avastrovirus)。禽星状病毒属现有3个属（Avastrovirus 1-3），包括鸭星状病毒(Duck astrovirus)、鸟肾炎病毒(Avian nephritisa strovirus)、火鸡星状病毒(Turkey astrovirus)等，火鸡星状病毒其代表种。星状病毒是单股正链、无囊膜的小RNA病毒，其基因组长度大约6.8kb，，从5′端至3′端共包含4部分：1个85个核苷酸的5′端非编码区、3个开放阅读框(Open readingframes, ORFs)（ORF1a、ORF1b、ORF2）、1个80个核苷酸的3′端非编码区、1个30个核苷酸的多聚腺苷酸尾巴。

鸭星状病毒是鸭病毒性肝炎（DHV）的主要致病原之一，DHV是危害养鸭业的重要传染病因其可导致雏鸭出现高死亡率，其发生常给养鸭业造成重大经济损失。DHV分为鸭甲肝病毒（DHAV）、鸭星状病毒1 型（DAst V-1）、鸭星状病毒 2 型（DAst V-2）三个血清型，三个血清型之间均没有明显的抗原交叉保护。1965年，在英国的Norfolk 首次报道发现 DHV-II（即现在所说的 DAst V-1）以来，DAst V-1在各国均未被报道，因此DAst V-1被认为仅限于在英国流行。2008 年，Fu等报道在我国发现DAstV-1，并完成了第一株DAstV-1中国分离株（C-NGB）的全基因组测序。2014 年刘宁等中国南部发现了DAst V-2。

近年来，随着检测技术的不断优化和检测领域的扩展，从人和动物中获得的新的星状病毒毒株序列与已知的星状病毒毒株序列的进化距离较远，可能还会有更多新亚型和基因型。2017年，本团队在福建某鹅养殖场送检的病料中，检测到鹅群中存在星状病毒感染（命名为鹅星状病毒GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430），该片段和禽星状病毒代表株（火鸡星状病毒2型）的核苷酸同源性为69.1%，和赤颈鸭（Anas penelope）星状病毒的核苷酸同源性仅为60.6%。

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标molecular Beacon。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如Eclipse、TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。当前国内外尚未见实时荧光定量PCR检测鹅星状病毒的引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是填补现有尚未见实时荧光定量PCR检测鹅星状病毒的引物和探针的方法相关研究报道空白，提供一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测15.7个拷贝，可用于对临床样本中鹅星状病毒的分子流行病学调查，为明确鹅星状病毒的分子流行病学特点提供检测方法和手段。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

上游引物GoAst-F：5’- GGCCAATATTCAACAACA -3’，

下游引物GoAst-R：5’- CCTTCCTTATTGACACAAG -3’；

所述探针序列GoAst-P为： 5’- TGTGTAATGTCTGGCTCACCCA -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

所述引物和探针用于鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测方法为：

（1）定量标准质粒的构建与制备

以提取的鹅星状病毒核酸DNA为模板，用上游引物GoAst-F3（引物序列为：5’-AGACACCACAGCTTAAGAAA-3’）和下游引物GoAst-R3（引物序列为：5’-ATATTTTTATACATATCTAT-3’）进行PCR扩增含有靶序列的基因片段（目的片段大小为331bp）。上述引物均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液 25 μL、上下游引物(GoAst-F3和GoAst-R3)（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸模板DNA 2 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃预变性5 min后进入循环，94 ℃变性50 s 、51 ℃退火30s、72 ℃延伸35s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用Universal DNA 纯化回收试剂盒将符合实验扩增预期的目的条带割胶回收，利用克隆载体（pEASY-T1 Simple CloningKit）将胶回收片段进行克隆。转化DH5a克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取12份单菌落，摇菌14h后，提取相应的质粒，进行双酶切鉴定符合预期后，送由上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，将序列测定结果经BLAST分析明确其为鹅星状病毒序列，将该阳性重组质粒作为标准质粒（T- GoAst）。

(2)实时荧光定量PCR反应体系和程序：

以鹅星状病毒阳性标准品（T- GoAst）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为1.57×10⁶、1.57×10⁵、1.57×10⁴、1.57×10³、1.57×10²和1.57×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64 ℃）、引物（GoAst-F、GoAst-R）浓度（2.5，5.0，10和20 μmol/L）和探针（GoAst-P）浓度（1.25、2.5、5和10 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。结果判定，观察FAM信号有关阳性荧光信号扩增，有阳性荧光信号即可判定待检样品为鹅星状病毒感染阳性。

建立的鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法优化出的25 μL 最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（GoAst-F、GoAst-R）（10 μmol/L）各0.5 μL、探针（GoAst-P）（5 μmol/L）1 μL、模板2 μL、水补足至25μL。优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95 ℃预变性60 s；95 ℃ 10s，58℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。

用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

从图1可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为15.7拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鹅星状病毒实时荧光定量PCR标准曲线（图2），所获得标准曲线斜率为-3.241，Y轴截距为36.49，相关系数为0.998，扩增效率为99.9%，符合实验预期。

有益效果

本发明采用鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针进行鹅星状病毒检测，具有以下优点和效果：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需2h，且一次可以同时进行96个样品检测。对临床收集的75份鸭病料进行检测后发现，检测到4份鹅星状病毒感染阳性。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鹅星状病毒的Ct值，直接对其感染鹅星状病毒进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测15.7个拷贝，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。

4、特异性强：和鹅群中的常见传染病（如鹅大肠杆菌病、鹅细小病毒病、鹅呼肠孤病毒病和鹅多瘤病毒病）均无反应信号，仅对鹅星状病毒检测出现荧光信号。

5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行鹅星状病毒检测的组内变异系数为0.43-1.89%，组间变异系数0.49-2.31%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

附图说明

图1 实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的扩增曲线。1：1.57×10⁶ 拷贝/μL；2：1. 57×10⁵ 拷贝/μL；3：1. 57×10⁴ 拷贝/μL；4：1. 57×10³ 拷贝/μL；5：1. 57×10²拷贝/μL；6：1. 57×10¹ 拷贝/μL。

图2实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的标准曲线。

图3实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的特异性。1：鹅星状病毒；2：鹅大肠杆菌；3：鹅细小病毒；4：鹅呼肠孤病毒；5：鹅多瘤病毒。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、引物和探针的设计与合成

参考鹅星状病毒（鹅星状病毒GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430）的聚合酶1b蛋白（polymerase 1b protein）基因序列特征，设计实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的特异性引物（GoAst-F和GoAst-R）和探针（GoAst-P），其中GoAst-F和GoAst-R引物序列为：

上游引物GoAst-F：5’- GGCCAATATTCAACAACA -3’，

下游引物GoAst-R：5’- CCTTCCTTATTGACACAAG -3’；

所述探针序列GoAst-P为： 5’- TGTGTAATGTCTGGCTCACCCA -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。引物和探针由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

1、标准品的构建

根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒（鹅星状病毒GsFJ2017株）聚合酶1b蛋白编码的基因序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：GoAst-F3：5′- AGACACCACAGCTTAAGAAA -3′和GoAst-R3：5′- ATATTTTTATACATATCTAT -3′，用于扩增约331 bp的聚合酶1b蛋白基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鹅星状病毒（GsFJ2017株）核酸RNA，按照PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)推荐的50μL体系进行RT-PCR反应，其中PrimeScript 1 Step Enzyme Mix反应液2μL、2×1 Step Buffer（Dye Plus）反应液25μL、上下游引物（GoAst-F3和GoAst-R3，10μM）各2μL、提取的核酸RNA 2μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：50 ℃ 反转录30 min后进行PCR扩增程序；94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；循环结束后72℃延伸 10 min。

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将RT-PCR扩增的特异性聚合酶1b蛋白基因片段克隆到pEASY-T1克隆载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用RT-PCR扩增时的引物（GoAst-F3和GoAst-R3）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- GoAst），分装后置于-20 ℃保存备用。

3、实时荧光定量PCR反应条件

建立的鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法优化出的25 μL 最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（GoAst-F和GoAst-R）（10 μmol/L） 各0.5 μL、探针（GoAst-P）（5 μmol/L）1 μL、模板2 μL、水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，1 min预变性；95℃ 10 s、56℃ 10s、72℃ 15 s，共40个循环。

4、特异性检测

和鹅群中的常见传染病（如鹅大肠杆菌、鹅细小病毒、鹅呼肠孤病毒和鹅多瘤病毒）均无反应信号，仅对鹅星状病毒检测出现荧光信号。

5、重复性试验

实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.43-1.89%，组间变异系数0.49-2.31%，结果见表1，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR变异系数

6、临床应用

使用建立的鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法对临床收集的75份鸭病料进行检测后发现，检测到4份鹅星状病毒感染阳性，阳性率为5.33%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggccaatatt caacaaca 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccttccttat tgacacaag 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgtaatgt ctggctcacc ca 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agacaccaca gcttaagaaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atatttttat acatatctat 20

Claims (2)

1.一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：

上游引物GoAst-F：5’- GGCCAATATTCAACAACA -3’，

下游引物GoAst-R：5’- CCTTCCTTATTGACACAAG -3’；

所述探针序列GoAst-P为： 5’- TGTGTAATGTCTGGCTCACCCA -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

2.一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。