CN116426690A - 一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用 - Google Patents
一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116426690A CN116426690A CN202310191247.5A CN202310191247A CN116426690A CN 116426690 A CN116426690 A CN 116426690A CN 202310191247 A CN202310191247 A CN 202310191247A CN 116426690 A CN116426690 A CN 116426690A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer composition
- detecting
- disease virus
- border disease
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 241001118702 Border disease virus Species 0.000 claims description 17
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCSHACFHMFHFKK-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,3,5-trinitrobenzene;2,4,6-trinitro-1,3,5-triazinane Chemical compound [O-][N+](=O)C1NC([N+]([O-])=O)NC([N+]([O-])=O)N1.CC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O ZCSHACFHMFHFKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001222053 Akabane virus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701922 Bovine parvovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用,属于生物技术领域。能鉴别边界病病毒。每种病毒的引物包括:外引物F3和B3,内引物FIP和BIP,环引物LB。本发明可用于鉴别诊断边界病病毒检测方法毒。本发明提供的引物组合物检测引起边界病病毒检测方法有灵敏度好、特异性高、用时短、稳定性高等特点。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域,具体涉及一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用。
背景技术
边界病病毒(Border Disease Virus,BDV)感染引起边界病,主要感染山羊、绵羊、牛和部分野生反刍动物。该病在全球均有分布,包括英国、美国、日本、瑞典、新西兰、澳大利亚、加拿大、西班牙等许多养羊业发达国家,我国从安徽、江苏两省的腹泻山羊中检测到BDV。BDV属于黄病毒科。根据BDV基因组,将BDV分为8个基因亚型,BDV感染动物羔羊生长不良、神经异常、腹泻、流产、胎儿发育不良和畸形等为特征,部分感染动物出现水样腹泻并死亡,母羊则出现流产、死胎等症状。妊娠母羊感染该病毒后,还可导致胎儿持续感染成为病毒携带者和传染源,经垂直传播或水平传播给健康羊群。BDV是羊的重要传染病,很多地区的基层兽医及养殖户不了解该疾病,而且该病无特效药治疗及有效的疫苗预防,防治困难,对养羊业健康发展造成威胁。建立可鉴别诊断BDV的检测方法,快速、准确地测病原,可及时采取有效的防控措施,隔离感染及发病动物,清除传染源,降低本病发病率,减少畜牧业经济损失,促进养羊业健康发展
目前,用于检测BDV病原的方法主要包括病毒分离鉴定、免疫法、RT-PCR等。这些方法耗费时间久、操作复杂,不适用于突发传染病现场的应急检测,本文建立一种能够快速、敏感并且特异的检测方法。
发明内容
本发明提供一种用于鉴别诊断边界病病毒的引物组合物及其应用。具体通过以下技术方案实现:
所述用于检测边界病病毒S基因的引物组合物包括以下2组引物:
表1用于检测边界病病毒5'UTR基因的引物组合物
所述的引物还包括将上述各F3、B3、FIP、BIP和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。
本发明提供了上述引物组合物在环介导等温扩增方法中用以检测赤羽病毒和牛细小病毒基因的应用。
所述的引物组合物在环介导等温扩增(LAMP)方法中,引物组合物F3、B3、FIP、BIP和LB的摩尔浓度比为1:1:4-16:4-16:2-8范围。
所述的环介导等温扩增反应条件为60-65℃范围。
本发明还提供了上述组合物在用于引起边界病毒基因检测的试剂盒或芯片中的应用,具体为:
在制备检测边界病病毒基因试剂盒和微流控芯片中的应用。包括将各条引物单独包装的步骤。
所述的试剂盒或芯片的检测步骤包括:
1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组cDNA
2)以步骤1)提取的基因为模版,采用上述引物组合物进行边界病病毒基因的环介导等温扩增。
本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有边界病病毒。
应用上述引物组合物可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增,则待测样品中含有或疑似含有边界病病毒;如果不可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增,则待测样品中不含有边界病病毒。
本发明提供的用于检测边界病病毒的引物组合物,可便捷、快速、准确的检测出结果。对于实际应用而言,能够在1小时内获得检测结果。
附图说明
图1、是BDV引物扩增典型荧光曲线(BDV扩增S形曲线,羊基因组扩增曲线近乎直线,第一组引物扩增效率优于第二组引物);
图2、BDV荧光曲线为特异S型曲线,猪瘟病毒cDNA,羊结节皮肤病病毒基因组荧光曲线为近乎基线。表明BDV引物组合可以特异检测BDV病毒;
图3、2000、200和20拷贝BDV质粒扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下列实施中所用的试验方法,如无特殊说明,均为本领域常用的实验方法;
实施例1
人工合成边界病病毒5'UTR基因质粒。
使用RNA fast 200总RNA抽提试剂盒分别提取BDV,和猪瘟病毒基因组,然后分别加入反转录体系,42℃水浴1h。随后70℃水浴10min,冰浴5min,得到BDV,的cDNA和猪瘟病毒cDNA。
使用EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒提取羊基因组和结节皮肤病病毒基因组。作为为后续LAMP反应的模板。
实施例2
将BDV的cDNA和羊基因组用作模板,反应体系如下表;
表2BDV荧光定量PCR反应管25ul反应体系
BDV各引物的核苷酸序列如下表所示:
表1
结果如图1所示,BDV荧光曲线为特异S型曲线,第一组引物出峰时间早,做增效率优于第二组引物。羊基因组荧光曲线为近乎基线。两组BDV引物组合均可以特异检测BDV病毒。
实施例3
用第一组引物,扩增BDV、猪瘟病毒的cDNA,羊结节皮肤病病毒基因组,反应体系同实施例2。
结果如图2所示,BDV荧光曲线为特异S型曲线,猪瘟病毒cDNA和羊结节皮肤病病毒基因组荧光曲线为近乎基线。表明BDV引物组合可以特异检测BDV病毒。
实施例4
利用第一组引物,分别扩增系列浓度的人工合成BDV 5'UTR基因质粒,获得检测限。
结果如图3所示,2000、200和20拷贝BDV质粒扩增曲线(BDV检测限为20拷贝)。
BDV 5'UTR基因序列(SEQ ID NO.11):
gtatacgggagtagctcatgcccgtatacaaaattggatattccaaaactcgattgggttagggagccctcctagcgacggccgaaccgt
gttaaccatacacgtagtaggactagcagacgggaggactagccatcgtggtgagatccctgagcagtctaaatcctgagtacaggatag
tcgtcagtagttcaacgcaggcacggttctgccttgagatgctacgtggacgagggcatgcccaagacttgctttaatctcggcgggggtcgccgaggtgaaaacacctaacggtgttggggttacagcctgatagggtgctgcagaggcccacgaataggctagtataaaaatctctgc。
Claims (8)
2.根据权利要求1所述的一种用于检测引起边界病病毒5'UTR的引物组合物,其特征在于,所述的组合物包括将F3、B3、FIP、BIP和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的DNA分子。
3.据权利要求2所述一种用于检测引起边界病病毒5'UTR的引物组合物,其特征在于,在环介导等温扩增方法中用以检测边界病病毒5'UTR基因。
4.根据权利要求3所述一种用于检测引起边界病病毒5'UTR的引物组合物,其特征在于,所述的引物组合物在环介导等温扩增方法中,引物组合物F3、B3、FIP、BIP和LB的摩尔浓度比为1:1:4-16:4-16:2-8。
5.根据权利要求3所述的用于检测引起边界病病毒的引物组合物,其特征在于,所述的环介导等温扩增反应条件为60-65℃恒温60min。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物,其特征在于,在制备检测边界病病毒试剂盒和基因芯片中的应用。
7.一种权利要求1所述的引物组合物的应用,其特征在于,用于引起边界病病毒检测的试剂盒或芯片中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的试剂盒和芯片的检测步骤包括:
1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组RNA;
2)以步骤(1)提取的基因为模版,采用上述引物组合物对边界病病毒5'UTR环介导等温扩增。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310191247.5A CN116426690A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310191247.5A CN116426690A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116426690A true CN116426690A (zh) | 2023-07-14 |
Family
ID=87078645
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310191247.5A Pending CN116426690A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116426690A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117867175A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-04-12 | 中国兽医药品监察所 | 一种边界病病毒TaqMan荧光定量检测试剂和试剂盒及检测方法 |
-
2023
- 2023-03-02 CN CN202310191247.5A patent/CN116426690A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117867175A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-04-12 | 中国兽医药品监察所 | 一种边界病病毒TaqMan荧光定量检测试剂和试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107299155B (zh) | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 | |
CN106947838B (zh) | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
CN106811551A (zh) | 荧光定量PCR检测FAdV‑4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法 | |
CN107236825B (zh) | 用于real-time RPA快速检测和区分PRV野毒和疫苗毒的核酸及方法 | |
CN106636459B (zh) | 一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt-rpa特异性检测 | |
CN112176105B (zh) | 病毒bvdv、brv和bcv一管多重荧光pcr检测的专用引物及其应用 | |
CN114085929B (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的试剂盒 | |
CN106947834B (zh) | 一种检测六种鸭易感病毒的多重pcr方法 | |
CN116426690A (zh) | 一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用 | |
CN110438260A (zh) | 一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒 | |
CN101487064B (zh) | 检测五种***共患病病毒的方法及专用试剂盒 | |
CN110453010B (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒asfv的lamp引物组、试剂和试剂盒 | |
CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
US20230250497A1 (en) | One-step nested pcr primers set and kit modified with locked nucleic acid for detecting african swine fever virus | |
CN106191310A (zh) | 一种同时鉴别3种牛腹泻病病原体的引物组合及GeXP检测方法 | |
CN115612753A (zh) | 一种阿留申、肠炎、犬瘟热病检测的方法 | |
CN113151586B (zh) | 一种用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒ⅰ型和ⅱ型的引物组合、试剂盒及方法 | |
CN111500773B (zh) | 一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量rt-pcr引物、探针和试剂盒 | |
WO2013049822A2 (en) | Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv) | |
CN109536644B (zh) | 用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的as-pcr引物及其应用 | |
CN113337643A (zh) | 检测蓝舌病病毒、动物流行性出血病病毒和帕利亚姆病毒的rt-lamp引物组及试剂盒 | |
CN110157836B (zh) | 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法 | |
CN111500774A (zh) | 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒 | |
CN111500793A (zh) | 一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法 | |
RU2548799C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, днк-зонд и способ для идентификации вируса инфекционной анемии лошадей методом пцр или от-пцр в режиме реального времени |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |