CN116426690A - 一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用，属于生物技术领域。能鉴别边界病病毒。每种病毒的引物包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LB。本发明可用于鉴别诊断边界病病毒检测方法毒。本发明提供的引物组合物检测引起边界病病毒检测方法有灵敏度好、特异性高、用时短、稳定性高等特点。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物及应用。
背景技术
边界病病毒(Border Disease Virus，BDV)感染引起边界病，主要感染山羊、绵羊、牛和部分野生反刍动物。该病在全球均有分布，包括英国、美国、日本、瑞典、新西兰、澳大利亚、加拿大、西班牙等许多养羊业发达国家，我国从安徽、江苏两省的腹泻山羊中检测到BDV。BDV属于黄病毒科。根据BDV基因组，将BDV分为8个基因亚型，BDV感染动物羔羊生长不良、神经异常、腹泻、流产、胎儿发育不良和畸形等为特征，部分感染动物出现水样腹泻并死亡，母羊则出现流产、死胎等症状。妊娠母羊感染该病毒后，还可导致胎儿持续感染成为病毒携带者和传染源，经垂直传播或水平传播给健康羊群。BDV是羊的重要传染病，很多地区的基层兽医及养殖户不了解该疾病，而且该病无特效药治疗及有效的疫苗预防，防治困难，对养羊业健康发展造成威胁。建立可鉴别诊断BDV的检测方法，快速、准确地测病原，可及时采取有效的防控措施，隔离感染及发病动物，清除传染源，降低本病发病率，减少畜牧业经济损失，促进养羊业健康发展
目前，用于检测BDV病原的方法主要包括病毒分离鉴定、免疫法、RT-PCR等。这些方法耗费时间久、操作复杂，不适用于突发传染病现场的应急检测，本文建立一种能够快速、敏感并且特异的检测方法。
发明内容
本发明提供一种用于鉴别诊断边界病病毒的引物组合物及其应用。具体通过以下技术方案实现：
所述用于检测边界病病毒S基因的引物组合物包括以下2组引物：
表1用于检测边界病病毒5'UTR基因的引物组合物
所述的引物还包括将上述各F3、B3、FIP、BIP和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。
本发明提供了上述引物组合物在环介导等温扩增方法中用以检测赤羽病毒和牛细小病毒基因的应用。
所述的引物组合物在环介导等温扩增(LAMP)方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP和LB的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8范围。
所述的环介导等温扩增反应条件为60-65℃范围。
本发明还提供了上述组合物在用于引起边界病毒基因检测的试剂盒或芯片中的应用，具体为：
在制备检测边界病病毒基因试剂盒和微流控芯片中的应用。包括将各条引物单独包装的步骤。
所述的试剂盒或芯片的检测步骤包括：
1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组cDNA
2)以步骤1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物进行边界病病毒基因的环介导等温扩增。
本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有边界病病毒。
应用上述引物组合物可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有边界病病毒；如果不可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增，则待测样品中不含有边界病病毒。
本发明提供的用于检测边界病病毒的引物组合物，可便捷、快速、准确的检测出结果。对于实际应用而言，能够在1小时内获得检测结果。
附图说明
图1、是BDV引物扩增典型荧光曲线(BDV扩增S形曲线，羊基因组扩增曲线近乎直线，第一组引物扩增效率优于第二组引物)；
图2、BDV荧光曲线为特异S型曲线,猪瘟病毒cDNA，羊结节皮肤病病毒基因组荧光曲线为近乎基线。表明BDV引物组合可以特异检测BDV病毒；
图3、2000、200和20拷贝BDV质粒扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法；
实施例1
人工合成边界病病毒5'UTR基因质粒。
使用RNA fast 200总RNA抽提试剂盒分别提取BDV,和猪瘟病毒基因组，然后分别加入反转录体系，42℃水浴1h。随后70℃水浴10min，冰浴5min，得到BDV,的cDNA和猪瘟病毒cDNA。
使用EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒提取羊基因组和结节皮肤病病毒基因组。作为为后续LAMP反应的模板。
实施例2
将BDV的cDNA和羊基因组用作模板，反应体系如下表；
表2BDV荧光定量PCR反应管25ul反应体系
BDV各引物的核苷酸序列如下表所示：
表1
结果如图1所示，BDV荧光曲线为特异S型曲线,第一组引物出峰时间早，做增效率优于第二组引物。羊基因组荧光曲线为近乎基线。两组BDV引物组合均可以特异检测BDV病毒。
实施例3
用第一组引物，扩增BDV、猪瘟病毒的cDNA，羊结节皮肤病病毒基因组，反应体系同实施例2。
结果如图2所示，BDV荧光曲线为特异S型曲线,猪瘟病毒cDNA和羊结节皮肤病病毒基因组荧光曲线为近乎基线。表明BDV引物组合可以特异检测BDV病毒。
实施例4
利用第一组引物，分别扩增系列浓度的人工合成BDV 5'UTR基因质粒，获得检测限。
结果如图3所示，2000、200和20拷贝BDV质粒扩增曲线(BDV检测限为20拷贝)。
BDV 5'UTR基因序列(SEQ ID NO.11)：
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gttaaccatacacgtagtaggactagcagacgggaggactagccatcgtggtgagatccctgagcagtctaaatcctgagtacaggatag
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Claims (8)
1.一种用于检测边界病病毒基因的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物用于检测边界病病毒5'UTR基因；
所述用于检测边界病病毒5'UTR基因的引物组合物包括以下引物：
2.根据权利要求1所述的一种用于检测引起边界病病毒5'UTR的引物组合物，其特征在于，所述的组合物包括将F3、B3、FIP、BIP和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的DNA分子。
3.据权利要求2所述一种用于检测引起边界病病毒5'UTR的引物组合物，其特征在于，在环介导等温扩增方法中用以检测边界病病毒5'UTR基因。
4.根据权利要求3所述一种用于检测引起边界病病毒5'UTR的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物在环介导等温扩增方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP和LB的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8。
5.根据权利要求3所述的用于检测引起边界病病毒的引物组合物，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应条件为60-65℃恒温60min。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测引起边界病病毒基因的引物组合物，其特征在于，在制备检测边界病病毒试剂盒和基因芯片中的应用。
7.一种权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，用于引起边界病病毒检测的试剂盒或芯片中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒和芯片的检测步骤包括：
1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组RNA；
2)以步骤(1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物对边界病病毒5'UTR环介导等温扩增。
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