CN105483292A - 禽腺病毒4型pcr检测试剂盒及其检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禽腺病毒4型PCR检测试剂盒及其检验方法。所述试剂盒包括蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚：氯仿：异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水，其特征在于所述试剂盒还包括2×TaqPCR？Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ？ID？No.1所示，下游引物的序列为SEQ？ID？No.2所示，该试剂盒可用于检测禽腺病毒4型。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行禽腺病毒4型检测的方法，能够快速、特异的检测禽腺病毒4型。
Description
技术领域
本发明涉及禽腺病毒4型的检测技术领域。
背景技术
2015年6月以来，我国河南、山东、河北、辽宁、安徽、吉林等部分地区，鸡群发生了不明原因的以心包积液、肝脏肿大为特征的疾病，根据病变，该病被称为“鸡心包积液-肝炎综合征”。该病主要发生于20-30日龄的肉鸡，包括817、肉杂等，发病后4-8天为死亡高峰，病程8-15天，死亡率达20～30％。同时蛋鸡20-70日龄以及200-300日龄也有发生，但死亡率低于肉鸡。目前，该病的发病区域不断扩大，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。现已证实，该病的病原为禽腺病毒4型(fowladenovirus4,FAdV-4)。
聚合酶链式反应(PCR)由于特异性好、灵敏性高、重复性好等优点在动物疫病检测领域被广泛应用。目前国内尚无检测禽腺病毒4型的PCR检测试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明针对新发禽腺病毒4型，提供了一种用于禽腺病毒4型检测的PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测禽腺病毒4型。
本发明所采取的技术方案是：一种用于禽腺病毒4型检测的PCR试剂盒，包括蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚∶氯仿∶异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水，其特征在于所述试剂盒还包括2×TaqPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo.2所示。
引物是根据GenBank公布的禽腺病毒4型病毒序列，在其Hexon基因保守序列区域设计的一对特异性引物。
优选的，2×TaqPCRMix由DNA聚合酶、2×TaqPCRbuffer和dNTPMixture组成。
优选的，所述试剂盒还包括DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚∶氯仿∶异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。
其中，阳性对照可为将禽腺病毒4型接种9-11日龄鸡胚后，收集96～144小时感染鸡胚的尿囊液。
本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有禽腺病毒4型的产品中的应用。
应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有禽腺病毒4型的方法，包括如下步骤：
1、病毒DNA的提取
取300μL经过预处理的待测样品置于1.5mL离心管中，加入10mg/ml蛋白酶K10μL，裂解液300μL，50℃孵育2h后加入610μLtris饱和酚，充分震荡5min，12000rpm离心10min；将上清转移至新1.5mL离心管中加等体积酚：氯仿：异戊醇(1：24：25)，充分混匀12000rpm离心10min；取上清，加酚：氯仿：异戊醇重复抽提一次；抽提后将上清转移至新1.5mL离心管中，加入2倍体积冰浴后无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠，-20℃沉淀45min后12000rpm离心10min，弃上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL无菌蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。
待测样品可为鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10min后取上清，之后再进行DNA的提取。
2、PCR反应
在反应管中加入10μL2×TaqPCRMix、1μL上述DNA溶液、0.5μL10μM的上游引物(SEQIDNo.1)、0.5μL10μM的下游引物(SEQIDNo.2)，最后加入无核酸酶水至总体积为20μL。
混匀后按如下反应程序进行：94℃3min，1个循环；94℃10s,56℃30s，72℃57s，共30个循环；72℃5min1个循环。反应结束后，经1％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，若出现954bp大小的条带则待测样品含有禽腺病毒4型病毒。
本发明提供了一对检测禽腺病毒4型的特异性引物，利用其制成的PCR试剂盒，能够快速、特异的检测禽腺病毒4型。
附图说明
图1为禽腺病毒4型PCR检测结果；
M：DL2000Marker；1：阳性对照；2:阴性对照；
图2为禽腺病毒4型PCR敏感性检测结果；
M:DL2000Marker；1～6依次为100～10-5倍比稀释病毒核酸的扩增产物；7:阴性对照；
图3为禽腺病毒4型PCR特异性检测结果。
M:DL2000Marker；1:禽腺病毒4型；2:禽腺病毒11型；3:传染性支气管炎病毒；4：新城疫病毒；5：禽流感病毒；6：阴性对照。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种检测禽腺病毒4型的PCR试剂盒最佳实施例
本实施例试剂盒包括：(1)禽腺病毒4型DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚∶氯仿∶异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
(2)PCR反应试剂：2×TaqPCRMix、上游引物、下游引物；(4)其他：阳性对照和无核酸酶水。其中，2×TaqPCRMix由DNA聚合酶、2×TaqPCRbuffer和dNTPMixture组成，阳性对照为将禽腺病毒4型接种9-11日龄鸡胚后，收集96～144小时感染鸡胚的尿囊液，引物为冻干粉，HPLC纯。本实施例试剂盒包含的引物序列见表1。
表1引物序列
实施例2非诊断目的以PCR法检测禽腺病毒4型的方法
本实施例检测方法采用实施例1中的试剂盒。取发病鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织为待测样品。
本实施例检测方法包括以下步骤：
1、病毒DNA提取具体步骤如下：(1)将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟后取上清，取上清。(2)分别取300μL上述处理后待测样品以及阳性对照，加入蛋白酶K10μL，细胞裂解液300μL，50℃孵育2h后加入610μLtris-平衡酚，充分震荡5min，12000rpm离心10min。(3)将上清转移至新1.5mL离心管中加等体积酚：氯仿：异戊醇(1：24：25)，充分混匀12000rpm离心10min。(4)取上清，加酚：氯仿：异戊醇重复抽提一次。(5)抽提后将上清转移至新1.5mL离心管中，加入2倍体积冰浴后无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠，-20℃沉淀45min后12000rpm离心10min，弃上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL无菌蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。
2、PCR反应：分别在反应管中加入10μL2×TaqPCRMix、1μL上述DNA溶液、0.5μL上游引物(10μM)、0.5μL下游引物(10μM)，最后加无核酸酶水至体积为20μL，混匀。
反应程序如下：94℃3min，1个循环；94℃10s,56℃30s，72℃57s，共30个循环；72℃5min1个循环。
3、电泳检测：反应结束后，经1％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，禽腺病毒4型的阳性对照样本扩增产物的条带大小为954bp，结果见图1。若待测样品电泳检测后出现954bp大小的条带则含有禽腺病毒4型，反之则不含有禽腺病毒4型。
实施例3禽腺病毒4型PCR检测方法的敏感性试验
通过超微量分光光度计测量，计算禽腺病毒4型DNA浓度为129.3ng/μL的核酸模板进行敏感性试验。
禽腺病毒4型PCR检测操作过程按照实施例2进行。
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图2所示。可见，PCR最低能检测到0.0129ng/μL禽腺病毒4型核酸模板。
实施例4禽腺病毒4型PCR检测方法的特异性试验
按照实施例2的方法，分别对禽腺病毒4型(fowladenovirus4,FAdV-4),禽腺病毒11型(fowladenovirus11,FAdV-11),传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus,IBV),禽流感病毒(avaininfluenzavirus,AIV)和新城疫病毒(newcastlediseasevirus,NDV)的标准参考毒株，以及灭菌超纯水的阴性对照进行PCR反应，检测PCR方法的特异性。以上扩增产物均用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。
结果如图3所示，禽腺病毒4型核酸扩增出了与预期大小相符的954bp的条带，而阴性对照以及其他4种病毒核酸均未扩增出任何条带。上述结果表明本发明PCR检测方法能特异性扩增禽腺病毒4型核酸，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，本发明PCR检测方法具有很好的特异性。
Claims (5)
1.一种用于禽腺病毒4型检测的PCR试剂盒，包括蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚：氯仿：异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水，其特征在于所述试剂盒还包括2×TaqPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的用于禽腺病毒4型检测的PCR试剂盒，其特征在于所述2×TaqPCRMix由DNA聚合酶、2×TaqPCRbuffer和dNTPMixture组成。
3.根据权利要求1所述的用于禽腺病毒4型检测的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚：氯仿：异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的用于禽腺病毒4型检测的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照。
5.如权利要求1～4任一项所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有禽腺病毒4型的产品中的应用。
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