CN106460060A

CN106460060A - Hnf4g‑rspo2融合基因及其在癌症治疗中的用途

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Publication number: CN106460060A
Application number: CN201580029656.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡杰; H·李
Original assignee: Crown Bioscience Inc Taicang
Current assignee: Crown Bioscience Inc Taicang
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-04-03
Also published as: ES2727374T3; EP3126528A4; US20170114414A1; WO2015149721A1; US20180282814A1; CN106536753A; PT3126528T; EP3126528A1; EP3126528B1; US10501805B2; CN106536753B; EP3126521A4; EP3126521A1; CN111808957A; WO2015149720A1; PT3126521T; US10683550B2; CN106460060B; EP4012049A3; EP3126521B1

Abstract

本公开提供了在含有核酸的样品中检测HNF4G和RSPO2融合基因的方法，也提供了用于检测所述融合基因的引物组、探针组和试剂盒。本文还提供了对所述融合基因呈阳性的人类疾病的动物模型。此外，本公开涉及用于评估和鉴定对HNF4G和RSPO2融合基因有效或者对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的人类疾病有效的试剂的方法，从而也提供了治疗所述疾病的方法。

Description

HNF4G-RSPO2融合基因及其在癌症治疗中的用途

相关申请

本申请涉及并要求2014年4月4日提交的名称为“癌症治疗的生物标记”的中国专利申请No.201410135569.9的优先权，其全部内容在此参考并入。

发明领域

本发明通常涉及在肿瘤细胞中发现的新的融合基因，以及靶向这种融合基因的治疗。

背景技术

R-spondin蛋白是典型Wnt/β-catenin信号转导通路的激动剂。最近发现R-spondin基因家族成员(RSPO)与一些结肠直肠癌中的其它基因伴侣融合(Seshagiri等人，Nature 2012488(7413):660-664)。据报道，由RSPO2基因和EIF3E基因融合形成的EIF3E(外显子1)-RSPO2(外显子2)融合基因在结肠癌患者的2％的癌症样品中出现，而由RSPO3基因和PTPRK基因融合形成的PTPRK(外显子1)-RSPO3(外显子2)融合基因在8％的样品中出现。基因融合事件通常激活R-spondin蛋白表达，从而激活Wnt信号转导。

因此，鉴定在癌细胞信号转导通路中RSPO2融合的基因伴侣将为癌症的治疗干预提供潜在机会。

发明概述

本发明提供了在含有核酸的样品中检测HNF4G和RSPO2融合基因的方法，其包括：使样品与检测试剂接触，所述检测试剂特异性地检测包含HNF4G的第一序列和RSPO2的第二序列的融合物的多核苷酸，以及检测所述多核苷酸的存在。

在某些实施方式中，所述第一序列是非编码序列，所述第二序列是编码序列。

在某些实施方式中，所述方法还包括检测所述多核苷酸的水平。

在某些实施方式中，所述HNF4G的第一序列位于RSPO2的第二序列的上游5'端。在某些实施方式中，所述HNF4G的第一序列包含(a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和(b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分。

在某些实施方式中，所述RSPO2的第二序列包含：(a)如ENST00000276659、ENST00000517781、ENST00000522333或ENST00000378439中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，或(b)如ENST00000521956中所示的RSPO2基因转录子的外显子1的至少一部分。

在某些实施方式中，所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000276659中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2。

在某些实施方式中，所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000517781中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2。

在某些实施方式中，所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000522333中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2。

在某些实施方式中，所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000378439中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2。

在某些实施方式中，所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000521956中所示的RSPO2基因转录子的外显子1的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子1。

在某些实施方式中，所述融合基因包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ ID NO:3)的融合连接处。在某些实施方式中，所述多核苷酸是cDNA或者mRNA。

在某些实施方式中，所述检测试剂包含针对所述HNF4G的第一序列的第一引物和针对所述RSPO2的第二序列的第二引物。在某些实施方式中，所述检测试剂包含针对含有所述融合连接处的片段的连接引物和针对所述第一或第二序列的非连接引物。

在某些实施方式中，所述检测试剂包含针对所述HNF4G的第一序列的第一探针和针对所述RSPO2的第二序列的第二探针。在某些实施方式中，所述检测试剂包含针对含有所述融合连接处的片段的连接探针。

在某些实施方式中，所述核酸样品来自患有胃癌的受试者。

本申请还提供了一组用于检测HNF4G和RSPO2融合基因的引物组，其包含：针对HNF4G的第一序列的第一引物和针对RSPO2的第二序列的第二引物；或针对含有HNF4G和RSPO2的融合连接处的片段的连接引物，以及针对HNF4G的第一序列或RSPO2的第二序列的非连接引物。

在某些实施方式中，所述第一引物或第二引物是针对所述融合基因的融合连接处的上游或下游至少80bp的区域，其中所述融合连接处包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ IDNO:3)。

在某些实施方式中，所述第一引物和第二引物可用于扩增长度为约200bp至400bp的扩增子。在某些实施方式中，所述第一引物是针对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6；所述第二引物是针对SEQ ID NO:2。

本申请还提供了一组用于检测HNF4G和RSPO2融合基因的探针组，其包含：针对HNF4G的第一序列的第一探针和针对RSPO2的第二序列的第二探针；或针对含有HNF4G和RSPO2的融合连接处的片段的连接探针。

本申请还提供了一种用于检测HNF4G和RSPO2融合基因的试剂盒，其包含前述引物组或探针组。

本申请还提供了一种用于对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的人类疾病的动物模型，其包括含有所述融合基因的人异种移植物。

本申请还提供了一种评估测试试剂对人类疾病的影响的方法，所述人类疾病对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性，所述方法包括：获得前述用于人类疾病的动物模型；将所述测试试剂施用至所述动物模型；测定所述测试试剂对人异种移植物的影响；以及评估所述测试试剂对所述人类疾病的影响。在某些实施方式中，所述测试试剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，所述治疗剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，所述测试试剂靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定实施方式中，所述治疗剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方式中，所述测试试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述疾病是癌症。

本申请还提供了一种评估测试试剂对HNF4G和RSPO2融合基因的影响的方法，所述方法包括：获得对所述融合基因呈阳性的细胞；将所述细胞暴露于所述测试试剂；以及测定所述测试试剂对所述融合基因或所述细胞的影响。在某些实施方式中，所述测试试剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，所述治疗剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，所述测试试剂靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定实施方式中，所述测试试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方式中，所述测试试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述疾病是癌症。

本申请还提供了一种鉴定用于治疗与HNF4G和RSPO2融合基因相关的疾病的试剂的方法，所述方法包括：提供对所述融合基因呈阳性的细胞，将所述细胞暴露于候选药剂，以及鉴定调节所述融合基因或其基因产物的生物活性的试剂。在某些实施方式中，所述试剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，所述试剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，所述试剂靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定实施方式中，所述试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方式中，所述试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述疾病是癌症。

本申请还提供了一种治疗与HNF4G和RSPO2融合基因相关的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的治疗剂，从而治疗所述疾病，所述治疗剂能够调节所述融合基因或其基因产物的生物活性。在某些实施方式中，所述治疗剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，所述治疗剂靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定实施方式中，所述治疗剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方式中，所述治疗剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述疾病是癌症。

附图说明

图1是GA3055中HNF4G-RSPO2基因融合物的示意图。HNF4G基因的外显子2融合至RSPO2基因的外显子2(或在RSPO2-005转录子的情况下为外显子1)。

图2是GA3055中的HNF4G-RSPO2基因融合物的连接序列(SEQ ID NO:4)。大写字母的序列来自HNF4G，小写字母的序列来自RSPO2。融合连接处用“|”表示。

图3显示GA3055中HNF4G-RSPO2基因融合物对RSPO2基因表达的激活。

图4显示HNF4G-RSPO2基因融合物连接序列和用于通过PCR验证融合的引物的位置。大写字母表示HNF4G的序列；小写字母表示RSPO2的序列；框内序列表示PCR引物的序列。

图5表明HNF4G-RSPO2基因融合物交界区的PCR扩增。箭头指向预期大小的特异性PCR产物。

图6显示HNF4G-RSPO2基因融合物交界区的RT-PCR产物的直接测序。

发明详述

本公开至少部分基于对作为RSPO2基因的新融合伴侣的HNF4G基因的发现。特别地，HNF4G和RSPO2的新融合基因在胃癌中发现。

本公开提供了检测HNF4G和RSPO2融合基因的方法、用于检测所述融合基因或其基因产物的引物组和探针组。还提供了体外和体内测试方法以评估或鉴定用于抑制或减少所述融合基因或其基因产物的活性剂。

融合基因

本公开提供了HNF4G和RSPO2的新融合基因。“融合基因”和“基因融合物”在本文中可互换使用，并且旨在涵盖DNA和RNA，包括但不限于在DNA水平(例如基因组DNA或cDNA)、RNA水平(例如mRNA)上两个或更多个独立基因的融合。在特定实施方式中，由于染色体重排(例如易位、中间缺失或染色体倒位)，两个基因在基因组DNA水平上融合。融合基因可以转录和/或翻译为其基因产物，所述基因产物可以是RNA或蛋白质。

本文提供的融合基因包含与RSPO2的第二序列共价连接的HNF4G的第一序列。本文所用的“HNF4G”可以指基因(例如DNA序列)或基因转录物(例如mRNA)。本文所用的“RSPO2”可以指基因(例如DNA序列)、基因转录物(例如mRNA)或蛋白质产物(即氨基酸序列)，本领域技术人员可以从上下文中理解其含义。本文所用的“编码序列”是指编码蛋白质产物的至少一个片段的多核苷酸序列。本文所用的“非编码序列”是指不编码蛋白质的多核苷酸序列，或转录成功能性非编码RNA的多核苷酸序列。序列可以是DNA序列，如基因组DNA或cDNA，也可以是RNA序列，如mRNA。两个编码序列的融合可以在框内，从而在被翻译成其蛋白质产物后，HNF4G的蛋白质片段融合至RSPO2的蛋白质片段。在融合基因中，HNF4G序列可以是RSPO2的编码序列的上游5’端或下游3’端。在特定实施方式中，HNF4G的第一序列位于RSPO2的第二序列的上游5'端。在特定实施方式中，所述第一序列是非编码序列，所述第二序列是编码序列。

所述序列包含一个或多个外显子。HNF4G和RSPO2的外显子的序列可以获自公开可用的数据库，例如Ensembl。简而言之，Ensembl数据库提供了给定基因(如HNF4G或RSPO2)的转录子，并且对于每个转录子，每个外显子序列从5’端至3’端方向按序编号，并提供了外显子序列，其中也鉴定了外显子序列在染色体上起始和结束的位置。在一些情况下，外显子序列在不同转录子中可具有不同的外显子编号。例如，外显子序列可以在转录子1中编号为外显子1，但在转录子2中编号为外显子2，尽管外显子序列可以本质上仍然是相同的。

在某些实施方式中，HNF4G的第一序列包含(a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，或(b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分。如本文所用，基因转录子通过其Ensembl编号来鉴定，其相应的序列可在万维网Ensemble组织网站(http://asia.ensembl.org/)获得。关于Ensemble数据库的更多细节，请参见Flicek等人，Nucleic Acids Research 2014，42Database issue：D749-D755，其通过引用整体并入本文。

在特定实施方式中，HNF4G的第一序列包括如下序列：所述序列包含如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述序列包含SEQ ID NO:1(5’-3’)：

AGCTCCGGGAGCGGCCCGCGCAGGAGCACCAGCGAAAGCAGCCAGTCTGAGATATTGACACTACAGAAAAAACTGACAGCTTACTCCTTGTATTGATTCTACTCTTCTCTACAAATATAGACTCCGTTCCCTACCACAGCCTT。

在特定实施方式中，HNF4G的第一序列包括如下序列：所述序列包含如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述序列包含SEQ ID NO:6(5’-3’)：

GCGGCCCGCGCAGTGATTGCTGCCTTGACCGTCCCTGCTCTTGAAGAGCACCAGCGAAAGCAGCCAGTCTGAGATATTGACACTACAGAAAAAACTGACAGCTTACTCCTTGTATTGATTCTACTCTTCTCTACAAATATAGACTCCGTTCCCTACCACAGCCTT。

在某些实施方式中，RSPO2的第二序列包含：(a)如ENST00000276659、ENST00000517781、ENST00000522333或ENST00000378439中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，或(b)如ENST00000521956中所示的RSPO2基因转录子的外显子1的至少一部分。在特定实施方式中，RSPO2基因的第二序列包含以下或由以下组成：i)如ENST00000276659所示的RSPO2基因转录子的外显子2、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6；ii)如ENST00000517781所示的RSPO2基因转录子的外显子2、外显子3、外显子4和外显子5；iii)如ENST00000522333所示的RSPO2基因转录子的外显子2和外显子3；iv)如ENST00000521956所示的RSPO2基因转录子的外显子1、外显子2和外显子3；或v)如ENST00000378439所示的RSPO2基因转录子的外显子2、外显子3、外显子4和外显子5。

在特定实施方式中，RSPO2的第二序列包含SEQ ID NO:2(5’-3’)：

GTTCGTGGCGGAGAGATGCTGATCGCGCTGAACTGACCGGTGCGGCCCGGGGGTGAGTGGCGAGTCTCCCTCTGAGTCCTCCCCAGCAGCGCGGCCGGCGCCGGCTCTTTGGGCGAACCCTCCAGTTCCTAGACTTTGAGAGGCGTCTCTCCCCCGCCCGACCGCC。

在特定实施方式中，HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000276659中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2。

在特定实施方式中，HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000517781中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2；

在特定实施方式中，HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000522333中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2。

在特定实施方式中，HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000378439中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2。

在特定实施方式中，HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000521956中所示的RSPO2基因转录子的外显子1的至少一部分，并且HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子1。

HNF4G序列融合至RSPO2序列的位点称为融合连接处。在某些实施方式中，本文提供的融合基因包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ ID NO:3)的融合连接处，其中HNF4G序列是大写字母，RSPO2序列是小写字母。在某些实施方式中，所述融合基因包含SEQ ID NO:4，其中HNF4G序列是大写字母，RSPO2序列是小写字母(参见图2)。在特定实施方式中，所述融合基因包含SEQ ID NO:5，其中HNF4G序列是大写字母，RSPO2序列是小写字母(参见图4)。

融合基因的某些具体实例在下表1和图1中示出。在融合基因中融合在一起的外显子以粗体标记。所有5个融合基因共享相同的融合连接处，其为SEQ ID NO:3。图1显示融合基因中外显子的示例性排列和融合。

表1

检测融合基因和/或其基因产物的方法

本文还提供在含有核酸的样品中检测本文提供的HNF4G和RSPO2融合基因的方法，其包括：使样品与检测试剂接触，所述检测试剂特异性地检测包含HNF4G的第一序列和RSPO2的第二序列的融合物的靶多核苷酸，以及检测所述靶多核苷酸的存在。

含有核酸的样品可以源自受试者的细胞或组织。本文使用的“核酸”可以是RNA的聚合物或DNA的聚合物。样品可以包含分离的核酸，例如分离的RNA或cDNA。或者，样品可以包含处于其天然或未纯化或未扩增状态的核酸，例如，样品可以是分离的细胞或组织，所述分离的细胞或组织被任选地预处理以释放其中包含的核酸。在另一实施方式中，样品中的核酸可以例如通过PCR反应或逆转录而被扩增。

在特定实施方式中，样品来源于疑似患有胃肿瘤或胃癌的受试者。样品可以是从受试者收集的任何合适的生物材料，例如体液(例如血液)和活检样品(例如来自疾病影响区域的细胞或组织)。在特定实施方式中，样品来源于胃肿瘤或癌细胞或组织。可以处理样品以提取核酸。

在检测方法中，使样品与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸特异性地检测包含融合基因的靶多核苷酸。靶多核苷酸可以是cDNA或mRNA，这取决于样品中包含的核酸的类型。靶多核苷酸可以包含本文提供的任何融合基因。在特定实施方式中，靶多核苷酸包含SEQ IDNOs:3-9或其RNA版本中的任一个。

靶多核苷酸可以基于本领域已知的任何合适的方法检测，例如但不限于基于杂交的方法和基于扩增的方法。基于杂交的方法通常涉及使用探针来杂交和检测靶序列。基于杂交的方法的例子包括：Northern blot、DNA微阵列、全基因组测序、RNA测序(RNA-seq)、定量实时PCR(qRT-PCR)、数字多重基因表达分析方法(参见例如Kulkarni MM,Curr ProtocMol Biol.2011年4月，第25章:Unit25B.10)、FISH方法(荧光原位杂交)、CISH(显色原位杂交)方法、SISH(银原位杂交)方法等。基于扩增的方法通常涉及使用引物、聚合酶和核苷酸单体的混合物，以基于靶模板多核苷酸的碱基序列合成新生多核苷酸链。基于扩增的方法的例子包括：PCR(聚合酶链式反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(链置换扩增)、等温和嵌合引物启动的核酸扩增、环介导等温扩增、转录介导的扩增等。

在特定实施方式中，检测步骤涉及扩增步骤。在这种情况下，检测试剂包含至少一对引物，所述引物可以与靶多核苷酸杂交，并在聚合酶存在下扩增包含融合连接处的靶区域。在一种实施方式中，检测试剂包含针对HNF4G的第一序列的第一引物和针对RSPO2的第二序列的第二引物。本文所用的“针对”序列的引物或探针是指引物或探针与序列的至少一部分具有足够的同一性或互补性，使得引物或探针可以与序列或其互补链特异性地杂交。本文所用的“特异性地杂交”是指引物或探针可在严格条件下与预期序列杂交。本文所用的“严格条件”是指在42℃下在由5×SSPE、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和100ug/mL变性鲑精DNA组成的溶液中杂交，然后在42℃下用包含0.5×SSC和0.1％SDS的溶液洗涤。

在另一实施方式中，检测试剂包含针对含有融合连接处的片段的连接引物和针对第一或第二序列的非连接引物。连接引物将特异性地与融合连接处杂交，从而在靶多核苷酸存在时特异性地实现扩增。否则，如果样品中的核酸不含靶多核苷酸，则连接引物不会与其靶序列特异性杂交，并且不能实现有意义的扩增。

在通过合适的核酸扩增方法(例如PCR)扩增后，检测扩增产物。在特定实施方式中，扩增产物具有100bp-1500bp(例如100bp-1000bp、100bp-900bp、100bp-800bp、100bp-700bp、100bp-600bp、100bp-500bp、100bp-400bp、100bp-350bp、100bp-300bp、200bp-1000bp、200bp-900bp、200bp-800bp、200bp-700bp、200bp-600bp、200bp-500bp、200bp-400bp、200bp-350bp、200bp-300bp等)的长度。在特定实施方式中，扩增产物的存在将指示靶多核苷酸的存在。在特定实施方式中，进一步检测扩增产物的分子量或大小或序列，并且扩增产物的期望大小或序列表明靶多核苷酸的存在。

当靶多核苷酸是RNA时，扩增步骤可任选地进一步包括逆转录步骤以产生样品中的RNA的cDNA。然后使用引物扩增cDNA，以允许检测融合连接处的存在。

本文提供的引物具有约10-100bp(例如10-50bp、10-40bp、10-30bp、10-25bp等)的长度。在特定实施方式中，第一引物包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的等长部分互补的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)个连续核苷酸，并且第二引物包含SEQ ID NO:2的等长部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)个连续核苷酸。在特定实施方式中，第一引物包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的等长部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)个连续核苷酸，并且第二引物包含与SEQ IDNO:2的等长部分互补的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)个连续核苷酸。

在特定实施方式中，第一引物或第二引物针对融合基因的融合连接处上游或下游至少80bp的区域。在特定实施方式中，融合基因包含SEQ ID NO:3的融合连接处。在特定实施方式中，第一引物和第二引物可用于扩增长度为约200bp至400bp的扩增子。在特定实施方式中，第一引物是针对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6，并且第二引物是针对SEQ ID NO:2。在特定实施方式中，第一引物和第二引物选自如下组成的组：

5’CAGGAGCACCAGCGAAAG 3’(SEQ ID NO:7)和5’TGAGGGCAAAGGAGAAAAGG 3’(SEQID NO:8)。

连接引物包含SEQ ID NO:3的至少6(例如6、7、8、9或10)个连续核苷酸，或包含与SEQ ID NO:3的等长部分互补的至少6个连续核苷酸。在特定实施方式中，连接引物包含SEQID NO:3或与SEQ ID NO:3互补。一旦确定了连接引物，可以基于扩增产物的期望长度设计非连接引物。例如，当期望有300bp的扩增产物时，非连接引物可以设计为与融合连接处上游5’端或融合连接处下游3’端约300bp处的靶多核苷酸互补。

在特定实施方式中，检测步骤包括杂交步骤。可以将探针设计成与靶多核苷酸特异性地杂交，从而达到其检测作用。本文提供的探针可具有合适的长度，例如约20-200bp(例如20-190bp、20-150bp、20-120bp、20-100bp、20-90bp、20-80bp、20-70bp、20-60bp、20-50bp、20-40bp等)。

在特定实施方式中，检测试剂包含针对HNF4G的第一序列的第一探针和针对RSPO2的第二序列的第二探针。在特定实施方式中，第一探针包含针对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的等长部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)个连续核苷酸，并且第二探针包含针对SEQ ID NO:2的等长部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)个连续核苷酸。在说明性实例中，第一和第二探针之一可以是捕获探针，其还包含能够通过共价键或非共价键与底物结合的固定部分，另一探针可以是还包含可检测标记的检测探针。捕获探针可以首先与样品接触以允许与核酸杂交，然后通过捕获探针上的固定部分将复合物固定在底物上，并除去未结合的分子。然后将检测探针加入到固定的复合物中以允许发生杂交。在洗去多余的探针后，检测固定在底物上的可检测标记。固定部分的说明性实例包括但不限于生物素、链霉亲和素、抗原、抗体、蛋白A、蛋白G、寡核苷酸等。检测探针上的可检测标记可以是例如荧光染料、放射性同位素、抗体、酶和寡核苷酸(例如寡核苷酸条形码)。在另一个说明性实例中，第一和第二探针之一还包含荧光染料，另一探针包含淬灭剂。在两个探针与靶多核苷酸结合后，两个探针彼此接近，使得一个探针上的淬灭剂淬灭另一探针上的染料的荧光信号。荧光染料的说明性实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、6-joe、EDANS；罗丹明6G(P6G)及其衍生物(四甲基罗丹明(TMR)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC)、x-罗丹明、德克萨斯红、“BODJPY FL”(商品名，Molecular Probes公司(Eugene，Oregon，USA)产品、“BODIPY FL/C3”(商品名，Molecular Probes公司产品)，“BODIPY EL/C6”(商品名，Molecular Probes公司产品)、“BODIPY 5-FAM”(商品名，Molecular Probes公司产品)、“BODIPY TMR”(商品名，MolecularProbes公司产品)及其衍生物(例如，“BODIPY TR”(商品名，Molecular Probes公司产品)、“BODIPY R6G”(商品名，Molecular Probes公司产品)、“BODIPY 564”(商品名，MolecularProbes公司产品)和“BODIPY 581”(商品名，Molecular Probes公司产品))。淬灭剂的说明性实例包括但不限Dabcyl、“QSY7”(Molecular Probes)、“QSY33”(Molecular Probes)、二茂铁及其衍生物、甲基紫精和N,N'-二甲基-2,9-二氮杂芘等。

在特定实施方式中，检测试剂包含针对含有融合连接处的片段的连接探针。连接探针包含与SEQ ID NO:3等长的至少6(例如，6、7、8、9或10)个连续核苷酸，或包含与SEQ IDNO:3的等长互补的至少6个连续核苷酸。连接探针还可包含可检测标记。在说明性实例中，样品中的核酸可以固定在底物上，然后与识别融合连接处的探针接触。在洗去未反应的探针后，可以检测底物以确定是否存在探针，这可以表明融合基因的融合连接处的存在。在另一个说明性实例中，连接探针可以包含荧光染料和淬灭剂两者，从而当探针是完整的时，淬灭剂淬灭染料的荧光。该探针可用于一种扩增方法，在这种扩增方法中，使用具有5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶(例如Taq聚合酶)来扩增包含融合连接处的靶区域。在扩增期间，与融合连接处杂交的探针在其沿着靶多核苷酸前进时被聚合酶降解，从而分离探针上的荧光染料和淬灭剂，并允许荧光染料发射其待检测的信号。

另一方面，本公开还提供了在含蛋白质的样品中检测本文提供的融合基因的方法，所述方法包括使样品与检测试剂接触，所述检测试剂特异性地检测由融合基因编码的融合蛋白，并检测融合蛋白的存在。

可以检测由融合基因编码的融合蛋白的存在和水平。例如，样品可以与融合蛋白的特异性抗体接触，并且可以使用本领域已知的方法检测抗体和融合蛋白之间的复合物的形成，所述方法例如，免疫组织化学测定、蛋白质印迹法、ELISA、ELIFA、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、酶免疫测定法、双抗体夹心法等。

试剂盒

本文提供的引物组或探针组或连接探针可用于检测HNF4G和RSPO2融合基因。因此，本公开的另一方面涉及包含本文所述的引物组或探针组或连接探针的试剂盒。

在特定实施方式中，试剂盒包含针对HNF4G的第一序列的第一引物和针对RSPO2的第二序列的第二引物。在特定实施方式中，试剂盒包含针对含有HNF4G和RSPO2的融合连接处的片段的连接引物，以及针对HNF4G的第一序列或针对RSPO2的第二序列的非连接引物。

在特定实施方式中，试剂盒包含针对HNF4G的第一序列的第一探针和针对RSPO2的第二序列的第二探针。在特定实施方案中，试剂盒包含针对含有融合连接处的片段的连接探针。

本文提供的试剂盒可以进一步包含一种或多种用于检测的组分，例如聚合酶、用于扩增的缓冲液和/或用于探针杂交的缓冲液。

使用方法

本公开还提供了使用融合基因的方法。

HNF4G-RSPO2的基因融合是人第8条染色体上的染色体内重排。本发明人已经发现，这种HNF4G和RSPO2融合基因存在于胃癌组织中，而先前的R-SPONDIN蛋白基因融合物仅在结肠直肠肿瘤样品中有过描述。因此，HNF4G和RSPO2的融合基因可以是对融合基因呈阳性的疾病(特别是对于与wnt信号转导相关的疾病)的药物靶标。

一方面，本公开提供了鉴定可用于治疗受试者中对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的疾病的候选试剂的方法，所述方法包括：提供对所述融合基因呈阳性的细胞，将所述细胞暴露于候选试剂，以及鉴定调节所述融合基因或其基因产物的生物活性的候选试剂。

本文使用的术语“调节”是指融合基因或其基因产物的表达水平和/或生物活性的上调或下调。在特定实施方式中，细胞源自对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的受试者的组织或样品。在特定实施方式中，细胞源自具有胃肿瘤或胃癌的受试者的组织或样品，这些受试者被检测为对融合基因呈阳性。在特定实施方式中，细胞可以被基因工程化以包含融合基因。在特定实施方式中，候选试剂可以包括但不限于核酸、小的有机或无机分子和抗体或其抗原结合片段。在特定实施方式中，候选试剂是wnt通路拮抗剂。在特定实施方式中，候选试剂靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定实施方式中，候选试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在特定实施方式中，候选试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。

在特定实施方式中，本公开还提供了评估测试试剂对HNF4G和RSPO2融合基因的影响的方法，所述方法包括：获得对所述融合基因呈阳性的细胞；将所述细胞暴露于所述测试试剂；以及测定所述测试试剂对所述融合基因或所述细胞的影响。测试试剂对融合基因的影响可以是，例如降低或提高融合基因或其基因产物的表达水平和/或生物活性。

另一方面，本公开提供了治疗与HNF4G和RSPO2融合基因相关的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的治疗剂，从而治疗所述疾病，所述治疗剂能够调节所述融合基因或其基因产物的生物活性。

在特定实施方式中，所述疾病是涉及不受控制的细胞生长的增殖性疾病。在特定实施方式中，所述疾病是肿瘤或癌症。在特定实施方式中，所述疾病是胃肿瘤或胃癌。

如本文所用，术语“处理”或“治疗”是指一种或多种治疗行为，其为了具有一种或多种期望的或有益的结果而进行，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间进行。在本发明中，期望的或有益的治疗包括但不限于以下的一种或多种：预防疾病的发作或复发、减轻由疾病导致的一种或多种症状、减轻疾病的病理后果、预防转移、改善疾病、提高患病人群的生活质量、减少治疗疾病所需的其它药物的剂量、延迟疾病进展和/或延长患病人群的生存期。在特定实施方式中，治疗剂可以是如下中的任一种：抗体或其抗原结合片段、结合蛋白、小的有机或无机分子、核酸及其任意组合。

在特定实施方式中，治疗剂包括但不限于核酸、小的有机或无机分子和抗体或其抗原结合片段。在特定实施方式中，治疗剂是wnt通路拮抗剂。在特定实施方式中，治疗剂靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定实施方式中，治疗剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方式中，治疗剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了评估测试试剂对HNF4G和RSPO2融合基因的影响的方法，所述方法包括：获得对所述融合基因呈阳性的细胞；将所述细胞暴露于所述测试试剂；以及测定所述测试试剂对所述融合基因或所述细胞的影响。

如本文所用，表述“测试试剂的影响”可包括对融合基因的表达水平或生物学活性，和/或对融合基因的蛋白质产物的表达水平或生物学活性的影响。

在某些实施方式中，测试试剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，治疗剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，测试试剂靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因或融合基因的基因产物。在特定实施方式中，测试试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方式中，测试试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。在特定实施方式中，所述疾病是肿瘤或癌症。在特定实施方式中，所述疾病是胃肿瘤或胃癌。

动物模型和动物模型的用途

另一方面，本公开提供了用于对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的人类疾病的动物模型，其包括含有本文提供的融合基因的人异种移植物。

人异种移植物包含对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的细胞或组织，其在被移植到动物之后可以模拟或模仿与融合基因相关的人类疾病或疾病病变。可以使用本领域已知的任何合适的方法将异种移植物移植到动物模型上，例如通过皮下、腹膜内或静脉注射移植细胞；或者通过手术植入一部分组织。在某些实施方式中，异种移植物是癌细胞，并且通过皮下注射移植到动物模型。在特定实施方式中，异种移植物是源自人胃肿瘤或胃癌的细胞或组织。融合基因的存在可导致疾病的不同，例如，疾病的不同严重性、疾病的不同亚型、疾病的不同阶段、对特定治疗剂的不同响应性等。因此，本文提供的动物模型可特别用于研究与融合基因相关的人类疾病，以及评估疾病对特定治疗剂的反应性。在特定实施方式中，所述疾病是肿瘤或癌症。在特定实施方式中，所述疾病是胃肿瘤或胃癌。

本文所用的术语“动物”是指除人以外的所有脊椎动物，优选哺乳动物，例如狗、猪、兔或啮齿目动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)。在特定实施方式中，动物模型是哺乳动物。在特定实施方式中，动物模型是啮齿目动物。在特定实施方式中，啮齿目动物是小鼠、大鼠、豚鼠或仓鼠。在特定实施方式中，动物模型是免疫缺陷的。免疫缺陷动物缺乏活化内源性T细胞、活化内源性B细胞和活化内源性自然杀伤细胞。免疫缺陷动物的实例包括，例如：T淋巴细胞缺陷动物(例如，BALB/c裸鼠、C57BL裸鼠、NIH裸鼠、裸大鼠等)；B淋巴细胞缺陷动物(例如CBA/N小鼠)；NK细胞缺陷动物(例如Beige小鼠)；联合免疫缺陷动物(例如重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(T、B淋巴细胞联合免疫缺陷型)，Beige/Nude(T淋巴细胞和NK细胞联合免疫缺陷型)，SCID Beige/SCID NOD小鼠(T、B淋巴细胞和NK细胞联合免疫缺陷型))，以及经处理或操作以具有类似于任何上述免疫缺陷动物的免疫***的动物。

另一方面，本公开提供了评估测试试剂对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的人类疾病的影响的方法，所述方法包括：获得用于本文提供的人类疾病的动物模型；将所述测试试剂施用至所述动物模型；测定所述测试试剂对人异种移植物的影响；以及评价所述测试试剂对所述人类疾病的影响。

在特定实施方式中，测试试剂可以包括但不限于核酸、小的有机或无机分子和抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，测试试剂是wnt通路拮抗剂。在某些实施方式中，治疗剂靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定实施方式中，测试试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方式中，测试试剂是结合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的单克隆抗体或其抗原结合片段。在特定实施方式中，所述疾病是肿瘤或癌症。在特定实施方式中，所述疾病是胃肿瘤或胃癌。可以以一个或多个合适剂量将测试试剂施用至动物模型，并且可以评估对动物模型的影响。可以以本领域已知的任何合适的方式将测试试剂施用至动物模型。在某些实施方式中，测试试剂可以通过口服、胃肠、局部、直肠内、静脉内、经皮、经粘膜等施用。在特定实施方式中，术语“合适剂量”或“剂量”是指包含预定量的测试试剂的物理上分立的单位，其被计算以产生期望的效果。在特定实施方式中，以单剂量或多剂量施用至动物。在特定实施方式中，所述评价通过单次或多次进行。在特定实施方式中，在施用测试试剂之前和之后，在来自动物的样品或标本(例如，血液、活组织检查)中进行评估。在某些实施方式中，通过观察施用测试试剂前后动物的物理变化(例如体重减轻/增加、精神状态)来进行测试。在特定实施方式中，通过比较施用测试试剂前后动物模型中异种移植物的大小/重量和/或比较某些生物标志物的存在和/或水平来进行评估。

提供以下实例以说明本发明。它们不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：来自患者的异种移植(PDX)模型的基因组分析

来自患者的异种移植物(PDX)反映患者的病理和遗传图谱，因此被评价为用于研究肿瘤发生和个性化治疗的预测性实验模型。为了更好地了解癌症发展的基本机制，以及鉴别生物标志物和分子靶标以进行有效的癌症诊断和治疗，在50个PDX胃癌模型的集合上进行基因组谱分析。

根据标准方案，使用试剂制备和纯化得到总RNA，所述总RNA源自50个PDX模型的快速冷冻的肿瘤组织。在Illumina HiSeq 2500平台上进行转录组测序，随后使用SOAPfuse和Defuse软件对融合基因进行RNAseq(如表2所示)数据分析。

表2.在PDX模型GA3055中检测到HNF4G-RSPO2基因融合

通过RNA-seq技术从50个PDX胃癌模型(参见图3)产生的基因表达数据使用log10(FPKM)表示。最低log10(FPKM)设置为-2。当将表达值绘图时，log10(FPKM)小于-2的基因显示在-2处。用于RNA-seq分析的基因和转录子基于ENSEMBL数据库版本66，可以很方便的在网站“http://feb2012.archive.embembl.org/index.html”上搜索相关的基因信息。

在胃癌PDX模型中通过转录组测序检测HNF4G-RSPO2基因融合。这是在人胃癌异种移植物样品中首次发现的这种基因融合构建体的报告。

在检查的超过50个胃PDX模型中，发现只有一个模型含有HNF4G-RSPO2基因融合，其可能代表胃癌患者的亚群。HNF4G-RSPO2融合事件似乎激活了RSPO2基因的表达，因为其余胃癌PDX模型不表达该基因。

实施例2：使用PCR验证癌组织模型中的HNF4G-RSPO2基因融合

为了验证HNF4G-RSPO2融合基因的存在，从癌症组织模型中提取RNA，并使用试剂根据标准方案进行纯化。然后按照标准方案使用逆转录制备cDNA，随后进行基因特异性PCR扩增和直接测序。从如图4所示的基因融合连接处位置设计如表3所示的引物。

表3.引物信息

聚合酶链式反应(PCR)在由以下组成的50μl反应体系中进行：1μl样品cDNA、5μl10X PCR缓冲液，1μl每种引物，4μl dNTP和1μl TaqE。循环条件如下：在94℃下初始变性10分钟，随后是在94℃下变性30秒、在55-65℃下退火30秒和在72℃下延伸30秒的40个循环，最后在72℃下延伸7分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显现(参见图5)。

通过使用正向(上部)和反向(底部)引物的Sanger测序方法对PCR产物进行测序，并且通过RNA测序检测显示了色谱图具有一致的序列接合(参见图6)。因此，通过RT-PCR和直接测序证实了HNF4G-RSPO2基因融合的存在。

在胃癌PDX模型中鉴定HNF4G-RSPO2基因融合为研究具有相似遗传背景的癌症患者中的肿瘤发生提供了一种有价值的工具。此外，基因融合模型还为评估靶向R-spondin蛋白或Wnt信号通路成员的新型抗癌药物提供了一种有价值的工具。

虽然已经参照特定实施例(其中一些是优选实施例)具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本文公开的本发明的精神和范围的情况下，可在形式和细节上进行各种改变。

序列表

<110> 中美冠科(太仓)生物技术有限公司

<120> HNF4G-RSPO2融合基因及其在癌症治疗中的用途

<130> 061557-8011WO01

<150> CN201410135569.9

<151> 2014-04-04

<160> 8

<170> PatentIn 3.3版本

<210> 1

<211> 143

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agctccggga gcggcccgcg caggagcacc agcgaaagca gccagtctga gatattgaca 60

ctacagaaaa aactgacagc ttactccttg tattgattct actcttctct acaaatatag 120

actccgttcc ctaccacagc ctt 143

<210> 2

<211> 166

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gttcgtggcg gagagatgct gatcgcgctg aactgaccgg tgcggcccgg gggtgagtgg 60

cgagtctccc tctgagtcct ccccagcagc gcggccggcg ccggctcttt gggcgaaccc 120

tccagttcct agactttgag aggcgtctct cccccgcccg accgcc 166

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

ccacagcctt gttcgtggcg 20

<210> 4

<211> 331

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gcggcccgcg cagtgattgc tgccttgacc gtccctgctc ttgaagagca ccagcgaaag 60

cagccagtct gagatattga cactacagaa aaaactgaca gcttactcct tgtattgatt 120

ctactcttct ctacaaatat agactccgtt ccctaccaca gccttgttcg tggcggagag 180

atgctgatcg cgctgaactg accggtgcgg cccgggggtg agtggcgagt ctccctctga 240

gtcctcccca gcagcgcggc cggcgccggc tctttgggcg aaccctccag ttcctagact 300

ttgagaggcg tctctccccc gcccgaccgc c 331

<210> 5

<211> 343

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

agctccggga gcggcccgcg caggagcacc agcgaaagca gccagtctga gatattgaca 60

ctacagaaaa aactgacagc ttactccttg tattgattct actcttctct acaaatatag 120

actccgttcc ctaccacagc cttgttcgtg gcggagagat gctgatcgcg ctgaactgac 180

cggtgcggcc cgggggtgag tggcgagtct ccctctgagt cctccccagc agcgcggccg 240

gcgccggctc tttgggcgaa ccctccagtt cctagacttt gagaggcgtc tctcccccgc 300

ccgaccgccc agatgcagtt tcgccttttc tcctttgccc tca 343

<210> 6

<211> 165

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

gcggcccgcg cagtgattgc tgccttgacc gtccctgctc ttgaagagca ccagcgaaag 60

cagccagtct gagatattga cactacagaa aaaactgaca gcttactcct tgtattgatt 120

ctactcttct ctacaaatat agactccgtt ccctaccaca gcctt 165

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

caggagcacc agcgaaag 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

tgagggcaaa ggagaaaagg 20

Claims

1.一种在含有核酸的样品中检测HNF4G和RSPO2融合基因的方法，其包括：

a)使样品与检测试剂接触，所述检测试剂特异性地检测包含HNF4G的第一序列和RSPO2的第二序列的融合物的多核苷酸，以及

b)检测所述多核苷酸的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述HNF4G的第一序列位于RSPO2的第二序列的上游5'端。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一序列是非编码序列，所述第二序列是编码序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述HNF4G的第一序列包含(a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，或(b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RSPO2的第二序列包含(a)如ENST00000276659、ENST00000517781、ENST00000522333或ENST00000378439中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，或(b)如ENST00000521956中所示的RSPO2基因转录子的外显子1的至少一部分。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中：

i)所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，或b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000276659中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2；

ii)所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，或b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000517781中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2；

iii)所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，或b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000522333中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2；

iv)所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，或b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000378439中所示的RSPO2基因转录子的外显子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子2；或

v)所述HNF4G的第一序列包含选自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因转录子的外显子2的至少一部分，或b)如ENST00000494318中所示HNF4G基因转录子的外显子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000521956中所示的RSPO2基因转录子的外显子1的至少一部分，并且所述HNF4G基因转录子ENST00000396419的外显子2或所述HNF4G基因转录子ENST00000494318的外显子3融合至所述RSPO2基因转录子的外显子1。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述融合基因包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ ID NO:3)的融合连接处。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是cDNA或者mRNA。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述检测试剂包含针对所述HNF4G的第一序列的第一引物和针对所述RSPO2的第二序列的第二引物。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测试剂包含针对含有所述融合连接处的片段的连接引物和针对所述第一或第二序列的非连接引物。

11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述检测试剂包含针对所述HNF4G的第一序列的第一探针和针对所述RSPO2的第二序列的第二探针。

12.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测试剂包含针对含有所述融合连接处的片段的连接探针。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其还包括检测所述多核苷酸的水平。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述核酸样品来自疑似患有胃癌的受试者。

15.一组用于检测HNF4G和RSPO2融合基因的引物组，其包含：

a)针对HNF4G的第一序列的第一引物和针对RSPO2的第二序列的第二引物；或

b)针对含有HNF4G和RSPO2的融合连接处的片段的连接引物，以及针对HNF4G的第一序列或RSPO2的第二序列的非连接引物。

16.根据权利要求15所述的引物组，其中所述第一引物或第二引物是针对所述融合基因的融合连接处的上游或下游至少80bp的区域，其中所述融合连接处包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ ID NO:3)。

17.根据权利要求15所述的引物组，其中所述第一引物和第二引物可用于扩增长度为约200bp至400bp的扩增子。

18.根据权利要求16所述的引物组，其中所述第一引物是针对SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:6；所述第二引物是针对SEQ ID NO:2。

19.一组用于检测HNF4G和RSPO2融合基因的探针组，其包含：

a)针对HNF4G的第一序列的第一探针和针对RSPO2的第二序列的第二探针；或

b)针对含有HNF4G和RSPO2的融合连接处的片段的连接探针。

20.一种用于检测HNF4G和RSPO2融合基因的试剂盒，其包含如权利要求15所述的引物组或如权利要求19所述的探针组。

21.一种用于对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性的人类疾病的动物模型，其包括含有所述融合基因的人异种移植物。

22.一种评估测试试剂对人类疾病的影响的方法，其中所述人类疾病对HNF4G和RSPO2融合基因呈阳性，所述方法包括：

a)获得用于人类疾病的如权利要求21所述的动物模型；

b)将所述测试试剂施用至所述动物模型；

c)测定所述测试试剂对人异种移植物的影响；以及

d)评估所述测试试剂对所述人类疾病的影响。

23.一种评估测试试剂对HNF4G和RSPO2融合基因的影响的方法，所述方法包括：

a)获得对所述融合基因呈阳性的细胞；

b)将所述细胞暴露于所述测试试剂；以及

c)测定所述测试试剂对所述融合基因或所述细胞的影响。

24.一种鉴定用于治疗与HNF4G和RSPO2融合基因相关的疾病的试剂的方法，所述方法包括：

a)提供对所述融合基因呈阳性的细胞，

b)将所述细胞暴露于候选药剂，以及

c)鉴定调节所述融合基因或其基因产物的生物活性的试剂。

25.一种治疗与HNF4G和RSPO2融合基因相关的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的治疗剂，从而治疗所述疾病，所述治疗剂能够调节所述融合基因或其基因产物的生物活性。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗剂是wnt通路拮抗剂。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述wnt通路拮抗剂靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因或所述融合基因的基因产物。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病是癌症。