CN108251519B - 轴前多指病的致病基因及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了突变的LMBR1基因及其用途，包含突变的LMBR1基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断轴前多指病的诊断剂和试剂盒。本发明为PPD的诊断和治疗提供了新的方法和工具。特别地，本发明所提供的诊断方法以及用于该方法的引物和/或探针和/或抗体可用于快速、有效地确定受试者是否患有PPD或处于发展PPD的风险中。

Description

轴前多指病的致病基因及其用途
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域以及疾病诊断和治疗领域；特别地，本发明提供了一种突变的轴前多指病相关的致病基因LMBR1及其用途，包含突变的LMBR1基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断轴前多指病的诊断剂和试剂盒。
背景技术
1996至2000年的研究报告显示，我国多指(趾)畸形平均发生率约为0.1％，多指(趾)发生率在所有出生缺陷中排名第二，然而其多个亚型的致病基因及致病机制仍未阐明，因此，其遗传成因与分子机制的研究具有重要的意义和价值，通过进一步明确其发病机制、定位病变靶点，能够推动临床PPD特异性诊疗技术的发展，并加深我们对于肢体发育机制的理解。
轴前多指/趾(Preaxial polydactyly，PPD)是常见先天性肢体畸形，分四种亚型，I型轴前多指(PPD-I)的致病基因及机制不明。先天性多指(趾)(polydactyly)是一种常见的肢体畸形，发生率居于各类肢体畸形之首，发病率约7～14‰[1]。轴前多指(趾)(preaxial polydactyly,PPD)作为先天性多指(趾)的主要亚型，以肢体桡(胫)侧超出正常数目的手指(脚趾)赘生为主要临床表现。
根据受累指(趾)发生的部位，目前轴前多指可划分为4个亚型(I-IV)：I型(OMIM174400)：二指节拇指多指；II型(OMIM 174500)：三指节拇指多指；III型(OMIM 174600)：食指多指；IV型(OMIM 174700)：多指3并指。多指(趾)畸形除了独立发生外，还可以作为一些综合征的部分症状而伴随出现，如交叉多指(趾)畸形(crossed polydactyly,OMIM175690)、三指节拇指多指综合征(triphalangeal thumb-polysyndaetyly，TPT-PS，OMIM190605)等。
轴前多指(趾)多为常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)疾病，从简单的三指节拇指单个指骨增加直至完整的额外指(趾)的产生，患病个体表型有明显差异。Zguricas等通过对12个家系的临床和遗传研究，认为PPD的关键致病基因区域位于微卫星标记D7S55与D7S2423之间1.9cM的区域内；Heus等采用构建染色体7q36的物理和转录图谱的方法，将候选区域进一步缩小至约450kb的区域，迄今报道的大部分PPD致病基因几乎都定位于此。报道较为广泛的多指相关基因有SHH、HLXB9、HOXD13、GLl3、LMBR1等，其中多数位于7号染色体尤其是7q36区域。对于PPD-II型，研究发现，所有报道的突变集中在位于7q36LMBR1(MIM*605522)基因五号内含子的ZRS(zone ofpolarizing activityregulatory sequence)区内，研究表明，在ZRS区，已有超过20个点突变，10个重复突变，1个三倍体与一个成对碱基的***被报道与PPD-II型的发病相关GLI3基因的突变被证明与PPD-IV型有关，而SHH在肢芽前部的表达又受到诸如GLI3等转录因子的主动抑制，构成一种负反馈的调节机制。除此之外，PPD-II/III，TPT-PS，IV型并指(syndactyly type IV，SD4，MIM186200)及Werner Mesomelic综合征(WMS，MIM 188770)等手指畸形都被报道与ZRS区的突变(mutation)或重复(duplication)相关。然而PPD-I型与PPD-III型的致病基因却尚未被证实。但ZRS区作为一个多指畸形的遗传热点区域，一直引起国内外学者的密切关注。
关于ZRS突变调控SHH异常表达导致PPD的致病机制，研究表明，位于LMBR1基因内，长约800bp的高度保守的ZRS区是下游约1Mb的SHH(Sonic hedgehog，MIM*600725)基因的顺式调控元件，这个ZRS顺式调控元件调控SHH的时空表达，对指(趾)的正常发育起着重要的作用。SHH蛋白在早期肢芽后缘一个称为ZPA(zone of polarizing activity)的部位表达和分泌，受ZRS的调控，ZRS突变可引起SHH蛋白的异位表达，以致异常指节的发生尽管大量研究已证明ZRS突变通过调控下游靶基因SHH异常表达导致PPD其它亚型的发生，然而，ZRS突变如何跨越1MB距离调控SHH异常表达的分子机制仍不清楚。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足之处，本发明通过遗传学相关研究方法(全基因组分型检测技术、连锁分析及候选区域sanger测序)定位出PPD-I型家系的致病基因及突变位点。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，当用具体的序列来描述基因或核酸时，其不仅包括该具体序列所代表的基因或核酸，而且包括该具体序列的互补序列所代表的基因或核酸。在本申请中，虽然为了方便起见，在多数情况下针对基因或核酸只给出了一条链的序列，然而本领域技术人员可以明确获知其互补链的序列。因此，本申请事实上也公开了所述互补链的序列。
例如，当提及LMBR1基因时，其不仅包括正义链序列，而且包括所述正义链的互补序列。又如，当提及SEQ ID NO:1时，其不仅包括SEQ ID NO:1所示的序列，而且包括SEQ IDNO:1的互补序列。
本申请中的核酸序列包括DNA形式和RNA形式。除非上下文特别指明，否则本发明的核酸序列不仅包括DNA形式，而且包括RNA形式。例如，当提及SEQ ID NO:1时，其不仅包括DNA形式，而且包括RNA形式(例如，mRNA序列)。
如本文中所使用的，术语“突变”，当用于描述基因或DNA时，是指基因序列或DNA序列中一个或多个(例如，几个)碱基的添加、缺失和/或置换。
如本文中所使用的，术语“杂合突变”是指这样的突变，其仅存在于一对等位基因中的一个基因中。如本文中所使用的，术语“纯合突变”是指这样的突变，其在一对等位基因中的两个基因中同时存在。
如本文中所使用的，术语“c.446”是指ZRS序列的第446位碱基，其中“c.”表示ZRSDNA，数字“446”表示第446个碱基。本文中所使用的其他类似的术语具有类似的含义。
如本文中所使用的，术语“c.446T→A”是指ZRS DNA序列的第446位碱基由T突变为A。本文中所使用的其他类似的术语具有类似的含义。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。此类载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
载体中可包含与目的基因可操作地连接的表达控制序列。如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达的控制作用。如本文中所使用的，术语“表达控制序列”是实现基因表达所需要的控制序列，其是本领域熟知的。表达控制序列通常必须包括启动子，常常也包括转录终止序列，并且还可以包含其他序列，如增强子序列。基因表达对于siRNA、miRNA等而言是指转录，并且还可以包括转录后加工；对于蛋白质编码序列而言通常是指转录和翻译，产生蛋白质。
另外，载体中还可包含选择标记。此类选择标记是本领域技术人员熟知的，例如但不限于抗生素抗性基因，例如青霉素抗性基因、红霉素抗性基因等等。
如本文中所使用的，“PCR引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。
本领域技术人员公知，引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增LMBR1基因是指，在PCR反应中引物只扩增LMBR1基因，而不扩增其他基因。此类引物的设计是本领域技术人员公知的。
通常，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有大体上的同一性，从而能够特异性扩增目的基因。例如，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
如本文中所使用的，术语“杂交”是指相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或
RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。一般而言，杂交的双方是待测核酸分子和已知核酸分子。在杂交体系中已知的核酸分子称作探针(probe)。核酸杂交包括固-液相杂交和液相杂交。液相杂交是在溶液中进行的杂交反应，其是指待测核酸分子与已知核酸分子(探针)在溶液中退火形成杂交复合物。
如本文中所使用的，术语“特异性检测LMBR1基因突变”是指探针能够区分出含有突变的LMBR1基因与不含有突变的LMBR1基因。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下，与LMBR1基因精确互补的探针可以与不含有突变的LMBR1基因杂交，而不与甚至只包含一个点突变的LMBR1基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的LMBR1基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的LMBR1基因杂交，而不与不含有突变的LMBR1基因杂交。
在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的。通常，探针是经标记的，从而在杂交反应结束后，通过利用探针上的标记物，可以分离和检测杂交后的双链。同样，也可以对引物进行标记，从而在PCR后，通过利用引物上的标记物，可以分离和检测扩增产物。可用于标记探针和引物的标记物在本领域内是已知的，包括但不限于，放射性同位素如125I、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。
如本文中所使用的，术语“siRNA”是指，siRNA能够通过RNA干扰特异性沉默或抑制特定基因的表达。
在一个方面，本发明提供了突变的LMBR1基因，其与野生型LMBR1基因的差异在于1个突变，并且所述突变的LMBR1基因导致轴前多指病(PPD)的发生；所述突变是：LMBR1基因第5个内含子的ZRS区(SEQ ID NO.1)中c.446T→A。
在另一个方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含上述的突变的LMBR1基因。
优选地，所述载体选自克隆载体和表达载体。
优选地，所述载体还包含与所述突变的LMBR1基因可操作地连接的表达控制序列。更优选地，所述表达控制序列选自启动子，增强子和终止子。
优选地，所述载体还包含选择标记。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的突变的LMBR1基因或上述的载体。
在另一个方面，本发明提供了上述突变的LMBR1基因或上述的载体或上述的宿主细胞的用途，其用于产生PPD动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生PPD动物模型。
在另一个方面，本发明提供了用于诊断PPD的诊断剂，所述诊断剂包含能够特异性检测LMBR1基因突变的探针，或能够特异性识别突变的LMBR1蛋白的抗体或其抗原结合片段；其中，所述LMBR1基因突变是第5个内含子的ZRS区(SEQ ID NO.1)中c.446T→A。
优选地，所述探针或抗体或其抗原结合片段是经标记的。
在另一个方面，本发明提供了能够特异性扩增LMBR1基因的第5个内含子的ZRS区的引物在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于诊断PPD。
优选地，所述引物的序列选自SEQ ID NO:2和3。
优选地，所述引物是如SEQ ID NO:2和3所示的引物对。
优选地，所述引物是经标记的。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述的诊断剂。
优选地，所述试剂盒还包含用于PCR的试剂，用于提取核酸的试剂，和/或用于检测所述抗体或其抗原结合片段的二抗。
优选地，所述用于PCR的试剂包括dNTP和聚合酶。
在另一个方面，本发明提供了上述诊断剂在制备用于检测LMBR1基因的突变和/或用于诊断PPD的试剂盒中的用途。
在另一个方面，本发明提供了能够特异性扩增LMBR1基因的第5个内含子的ZRS区的引物在制备用于诊断PPD的试剂盒中的用途。
优选地，所述试剂盒还包含用于PCR的试剂或用于提取核酸的试剂。
优选地，所述用于PCR的试剂包括dNTP和聚合酶。
优选地，所述引物的序列选自SEQ ID NO:2和3。
优选地，所述引物是如SEQ ID NO:2和3所示的引物对。
优选地，所述引物是经标记的。
综上所述，本发明的有益效果为：
(1)本发明为PPD的诊断和治疗提供了新的方法和工具。特别地，本发明所提供的诊断方法以及用于该方法的引物和/或探针和/或抗体可用于快速、有效地确定受试者是否患有PPD或处于发展PPD的风险中。
(2)本发明为PPD的发病机制研究奠定了重要基础，为PPD患者的治疗提供全新的理论依据。另外，PPD的致病基因的鉴定对将来的遗传咨询、产前诊断及基因治疗具有重要意义。此外，利用PPD致病基因所获得的疾病动物模型是研究PPD的发病机制和治疗方法的有力工具。
附图说明
图1为PDD-I型家系系谱图(I-IV代表家系中的代数)；其中，T\T和T\A为sanger测序的结果(针对c.446)；
图2为PPD-I型家系成员(患者、疑似病例及正常对照)手部X线及物理成像结果；其中，图2A,B:II-11(患者序号)，右侧拇指典型的两个远端指节，左侧拇指不完全远端指节复制；图2C:IV-1(患者)类似于II-11的表型；图2D,E:III-8(患者)，两侧拇指对称性远端指节不完全复制；图2F:III-12，右侧拇指远端指节不完全复制，左侧拇指正常；图2G:II-2,(疑似病例)，双侧拇指在远端指节与中指节间存在小的籽骨；图2H:III-5，正常对照；
图3是全基因组Linkage分析结果；
图4为Sanger测序鉴定患者ZRS区的结果；
图5EMSA实验(A)和Super-shift(B)实验检测突变型DNA片段与转录因子/核蛋白(K:蛋白)的相互作用；其中，B-MT-DNA为生物素标记突变型DNA探针；NE为核蛋白；Anti-HnRNPK为K蛋白抗体；Anti-HnRNPD为D蛋白抗体；Anti-HnRNPA/B为A/B蛋白抗体；Anti-HnRNPF为F蛋白抗体；Ig G为阴性对照抗体；
(C)在Caco-2细胞里过表达K蛋白和敲低K蛋白后的EMSA实验；其中，B-MT-DNA为生物素标记突变型DNA探针；B-WT-DNA为生物素标记野生DNA探针；HnRNPK O为过表达K蛋白；siHnRNPK s48为干扰RNA，可敲低K蛋白的表达；
(D)即染色质免疫共沉淀-qPCR实验的结果(ChIP-qPCR实验)，HnRNPK组为加入K蛋白抗体，IgG组为阴性对照抗体；
图6为DNApull-down实验结果图；
图7中A图是双荧光素酶报告基因检测结果；
7B图为三组的荧光素酶信号强度变化的观察结果，其中通过siHnRNPK s48敲低K蛋白基因表达；
7C图为在Caco-2细胞内转染siHnRNPK s48敲低K蛋白的表达,观察Shh的mRNA的变化结果；其中，scrambled为对照组，siHnRNPK s48为实验组；
7D图为Caco-2细胞内转染siHnRNPK s48，进行western blot半定量观察Shh的蛋白表达量的结果；
图8A和B为ZRS区域点突变的小鼠；
图9为质粒pEZX-GA03的图谱。
具体实施方式
本发明针对一个汉族四代31人的稀有PPD-I家系，利用全基因组基因分型和连锁分析及候选区域Sanger测序，定位出LMBR1基因中ZRS区(Sonic hedgehog，SHH远距离调控子)新发点突变，位于PPD致病热点区域——7q36的LMBR1基因ZRS区内T>A的杂合突变在该家系中呈共分离，是PPD-I的致病突变，且50例正常对照中皆不携带该基因的突变。我们的研究提示该突变是PPD-I型的新发致病突变，然而该突变导致PPD-I型表型的发生机制仍需进行深入研究。实验证明该点突变造成ZRS区与转录因子K蛋白亲和力显著增加，阐明K蛋白介导ZRS突变、调控SHH异常表达，导致PPD-I发生的分子机制。应当说明的是，转录因子K蛋白是核内不均一性核糖核蛋白K，hnRNP K，分子量65Kd，位于第九号染色体上，NCBI上GeneID:3190，其主要功能结构为3个引导DNA-RNA连接的KH域和一个独特的KI域，hnRNP K不仅能通过依赖CT元件的途径或不依赖CT元件的途径在转录水平上对基因表达进行调控，还能通过自身的磷酸化，改变mRNA的翻译效率，以及调控基因翻译及转导胞内信号，并且在细胞周期中有重要作用。
基于以上研究结果，我们提出PPD-I型家系ZRS新发点突变可能通过改变与转录因子/蛋白的结合能力，从而激活了SHH基因异常表达的科研假设。在前期的预实验中：发明人利用内源性表达SHH基因与相关转录因子的Caco-2细胞，提取其细胞核蛋白，与体外合成的野生型/突变型DNA探针进行凝胶电泳迁移实验(ElectrophoreticMobility Shift Assay，EMSA)，结果证明，野生型及突变型探针均检测到相同的特异性DNA/蛋白结合带，然而突变型探针明显提高了与转录因子/蛋白的结合能力。进一步对结合带进行蛋白质谱分析得到结合带中存在转录因子K蛋白，Super-shift实验证明K蛋白抗体的加入明显减弱了突变探针与蛋白的结合，染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)实验反向验证K蛋白能与ZRS区域的DNA序列结合(目前尚未有文献报道转录因子K蛋白与ZRS区域相互结合)，表明K蛋白可能介导了该ZRS新突变导致PPD-I型发生，而K蛋白是否参与介导ZRS突变调控SHH异常时空表达导致PPD-I型发生仍需进一步的体外及体内实验验证。
本申请以PPD-I型家系的新发致病突变为切入点，并在新发现K蛋白的基础上，进一步通过体外DNA-pull down、ChIP-sequence、双荧光素酶报告基因检测技术及小鼠动物模型，以阐明K蛋白如何介导ZRS突变调控SHH异常时空表达导致PPD-I型发生的机制，以期为基因治疗、疾病防治手段的提高提供理论依据。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如，分子生物学和核酸化学实验方法)。参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold SpringHarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,CurrentProtocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，其全部通过引用合并入本文。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1PPD家系的收集、表型鉴定及分类
本申请的发明人在广东省范围内组织开展PPD家系的病例收集，收集到一个稀有包括8名患者在内的31人的四代PPD-I型大家系。PPD的诊断依据家族史、物理及X线成像检查患者双手、双足的骨骼畸形。依据Temtamy S与WinterR M建立的方法分类。
结果分析：如图1所示，包括8名明显PPD表型患者，9个不确定疾病表型在内的31人的PPD-I型大家系，为常染色体显性遗传。X线成像检查显示患者存在不同程度的PPD-I型表型，肉眼可见明显的指骨畸形；部分成员拇指远端指节及中指节间存在小的籽骨，肉眼未出现明显指骨畸形。因正常人群中存在一定比例籽骨现象，因此，这部分成员暂定为疑似患者
实施例2致病基因的定位
使用QIAamp DNAblood Mini kits(Qiagen,Germany)提取PPD-I型家系所有成员及50名正常对照外周血基因组DNA样品。
a.全基因组基因(LMBR1基因)分型
选取11个家庭成员，包括图1中7个患者(II3、II7、II11、III4、III8、III11、IV1)，4个正常人(II4、II8、II12、III5)的DNA样品，进行变性、片段化及扩增后与IlluminaHumanOmni2.5-Quad Beadchip芯片进行杂交，标记的核酸加入后捕获DNA。HumanOmni2.5-Quad Beadchip芯片覆盖了推定的功能性变异，这些变异精选自12,000多个个体的外显子组和全基因组序列，综合了来自HapMap和千人基因组计划的250万个SNP标签(＞2.5％MAF)，以及＞240,000个外显子标志物。DNA样本变性、中和后，在37℃温育过夜。扩增后的DNA为悬浮片段，在48℃与Beadchip芯片杂交过夜，而未杂交以及非特异杂交的DNA样本被洗脱。加入标记的核苷酸来扩展所捕获的DNA片段。iScan system用于成像，GenomeStudio(v.2011.1)软件***用于数据分析。每个样品获得2.5millionSNPs(single-nucleotidepolymorphisms)。
b.连锁及拷贝数变异(copy number variation,CNV)分析
从2.5million SNPs中选择横跨常染色体的7,037个SNPs进行散点连锁分析。首先对PPD-I型家系进行基因组范围单一影响模式的自由连锁分析(A genome-wide affected-only model-free linkage analysis)，基于单基因常染色体显性遗传模式，上述得到的连锁区域进一步进行基于模型的多点连锁分析(multipointmodel-based linkageanalysis)。在所有区域的拷贝数变异(copy number variation,CNV)经cnvPartitionv.1.2.1软件分析，结果如图3所示。
c.Sanger测序
对连锁的区域使用Bigdye Terminator Cycle Sequence Kit 3.1(ABI AppliedBiosystems)进行Sanger测序，鉴定PPD-I型的致病基因及突变位点。
结果分析：如图3所示，为全基因组Linkage分析结果，其中5个区域被鉴定，包括1p13(～45cM),4q35(～10cM),7q36(～15cM),10p15(～10cM)和21q21(～15cM)，LOD>1.8。Chr7突变位点位于ZRS区，位于7号染色体的7q36区域。
如图4所示，通过Sanger测序鉴定患者ZRS区，其中，WT代表野生型；MT代表突变型；测序结果表明患者存在T/A点突变，而正常人为T/T，其中7位患者存在T/A点突变，4位正常人为T/T。LMBR1基因五号内含子ZRS区PCR扩增所需的引物如下表1所示。
表1LMBR1基因五号内显子ZRS区PCR扩增引物序列
Forward 5’-CTGATTTTGTAAGGAACTCTGG-3’(SEQ ID NO.2)
Reverse 5’-GCGTATGGGAACTCAGAAA-3’(SEQ ID NO.3)
结果分析：7位患者和4位正常人进行全基因组基因分型分析结果如图3所示，从2.5million SNPs中选择横跨常染色体的7,037个SNPs进行散点连锁分析，鉴定了5个连锁区域1p13,4q35,7q36,10p15和21q21(LOD>1.8)，由于ZRS恰好位于连锁到的7q36区域，我们首先对家系其他成员ZRS进行了Sanger测序，PCR扩增引物序列如表1所示，结果鉴定出所有患者及疑似患者(III-9)的ZRS区域存在一个T/A的点突变，而正常者及其他可疑者为T/T(图4)，该突变在患者和正常对照者中出现了共分离。在以上区域经cnvPartition v.1.2.1软件分析，未发现CNV异常的病例与对照共分离现象，排除拷贝数变异导致PPD-I型的可能。
由此，所获得的测序结果充分表明，本发明所鉴定到的杂合突变导致PPD疾病。即，LMBR1基因第5个内含子的ZRS区(SEQ ID NO.1)中c.446T→A的突变与PPD疾病的发生具有相关性。
实施例3ZRS突变调控下游SHH基因异常表达的分子机制
1)ZRS突变改变其与细胞核内转录因子/特定蛋白结合能力
EMSA实验：以人来源的Caco-2细胞(表达SHH蛋白，细胞核存在调控SHH表达的转录因子)为细胞模型，体外构建生物素标记的野生型及突变型ZRS探针，收集Caco-2细胞核蛋白，凝胶电泳迁移实验(Electrophoretical mobility shift assay，EMSA)检测核蛋白与野生型及突变型ZRS探针结合的差异性。
对EMSA中特异性结合带切胶进行蛋白质谱鉴定，得到转录因子K蛋白。在EMSA结合体系中加入K蛋白抗体进行Super-shift实验及ChIP实验验证K蛋白与ZRS之间的互作。
1、ChIP实验：
将K蛋白与染色质交联形成复合体，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过K蛋白特异性抗体沉淀此复合体，特异性地富集K蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与qPCR检测，从而反向证明K蛋白能与ZRS区域的DNA序列结合；其中，ZRS区的PCR的引物同表1提供的引物序列。反应体系为2ul的前后引物1：1混合液、5ul的MIX，3ul的DNA，扩增反应为普通qPCR的扩增反应。
结果分析：如图5所示，突变探针(SEQ ID NO.7)和野生型探针(SEQ ID NO.8)泳道均出现与特异性蛋白的结合带band S，但突变型探针明显提高了其与核蛋白结合能力(图5A)。将该泳道的蛋白进行质谱分析，发现该特异结合的蛋白可能为HnRNPK蛋白、HnRNPD、HnRNPA/B、HnRNPF，在EMSA反应体系中加入分别加入K蛋白抗体、D蛋白抗体、A/B蛋白抗体、F蛋白抗体进行Super-shift实验，结果如图(5B)发现，加入K蛋白抗体的泳道band S带明显减弱(未出现超迁移带可能因为DNA-蛋白复合物分子量过大，未入胶，此结果已反复验证)，表明与ZRS-DNA结合的蛋白可能为K蛋白。
C图通过质粒过表达K蛋白，Band S条带增宽；通过siHnRNPK s48敲低K蛋白mRNA来降低K蛋白的表达，Band S条带减弱，证明了Band S条带里面存在K蛋白。D图染色质免疫共沉淀-qPCR实验，利用K蛋白抗体把K蛋白结合的DNA序列通过染色质免疫共沉淀分离出来，再进行qPCR(实时荧光定量PCR)。实验材料为病人(MT组)和正常人(WT组)血液细胞分离的淋巴细胞。发现MT组即突变组的qPCR的信号明显比WT组高，反向验证K蛋白能与ZRS区域的DNA序列结合。其中，siHnRNPK s48的序列如下表2所示。
表2siHnRNPK s48的正义链和反义链
2、ChIP-qPCR实验的步骤：将K蛋白与染色质交联形成复合体，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过K蛋白特异性抗体沉淀此复合体，特异性地富集K蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与qPCR检测，ZRS(％input)为0.024，GAPDH(％input)为0.012(目的基因区域相对表达量为阴性对照基因2倍)。
结果如图5D所示，从而反向证明K蛋白能与ZRS区域的DNA序列结合。进一步表明与ZRS区域DNA序列结合的蛋白为K蛋白。
2)K蛋白参与调控SHH表达
DNApull down MS-Shh promoter实验步骤：体外构建SHH启动子探针,收集Caco-2核蛋白，进行结合反应，结合产物进行蛋白质质谱分析，鉴定与SHH启动子结合的转录因子/蛋白，寻找可能与K蛋白互作的蛋白(或K蛋白本身)。Shh启动子探针序列如SEQ ID NO.6所示。
DNApull down MS-ZRS实验步骤:以ZRS点突变前后29个碱基序列体外构建探针，其它步骤与上述相同。
其中，ZRS点突变型探针：(SEQ ID NO.7)(粗体下划线A为检测到突变位点)；ZRS点野生型探针：CCCAGTGGCTAATTTGTATCAGGCCTCCA(SEQ ID NO.8)。
结果分析：如图6所示，DNApull down MS实验中证明蛋白K可以与ZRS及Shh的启动子结合，此实验证明K蛋白确实可以跟ZRS与Shh的启动子结合，但未能证明此结合能引起基因表达的变化，下一步利用双荧光素酶报告基因检测以证明。
3)双荧光素酶报告基因检测：以K蛋白(或与K蛋白互作蛋白)介导ZRS突变调控SHH基因表达，检测荧光素酶组间表达差异。
试验方法：
(1)pEZX-GA03质粒的图谱如图9所示，作为对照的空载体。在pEZX-GA03质粒的基础上构建了如下质粒：
质粒1：用minimal promoter SHH替换mini cmv，命名为S-NEG-GA03(即CS-NEG-GA03-02)；
质粒2：用ZRS野生型(SEQ ID NO.10)+minimal promoter SHH替换minicmv，命名为CS-ZRS01-GA03；
质粒3：用ZRS突变型(SEQ ID NO.9)+minimal promoter SHH替换minicmv，命名为CS-ZRS02-GA03；
质粒4：ZRS野生型(SEQ ID NO.10)+mini cmv，命名为CS-ZRS01-GA03-1；
质粒5：ZRS突变型(SEQ ID NO.9)+mini cmv，命名为CS-ZRS02-GA03-2；
质粒6：mini cmv去掉的空载体，命名为CS-pEZX-GA03(即CS-NEG-GA03-01)；
其中，minimal promoter SHH的序列如SEQ ID NO.6所示；ZRS突变点附近150碱基序列如下：
(SEQ ID NO.9)，其中斜体倾斜的A为突变碱基。SEQ ID NO.9对应的野生型序列如SEQ IDNO.10所示。
(2)将带有荧光素酶报告基因的质粒转染至Caco-2细胞，其中，涉及的质粒包括：
Shhprom组质粒为带有荧光素酶报告基因的质粒上添加Shh基因的启动子(即质粒1)；
WT-Shhprom组质粒为Shh基因启动子序列前方添加野生型ZRS(突变位点前后150个碱基序列)(即质粒2)；
MT-Shhprom组质粒为Shh基因启动子序列前方添加ZRS突变位点前后150个碱基序列(即质粒3)。
结果分析：如图7所示，通过构建上述的质粒1、2、3，转染进Caco-2细胞得到图7A的结果。因质粒中构建了Shh的启动子，所以一旦启动子开始表达了，后面的荧光素酶也会表达，而且荧光素酶是不需要进行修饰即有生物活性，通过加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应过程中会发出生物荧光，然后可以通过荧光测定仪测定反应过程中释放的生物荧光；A图证明，对比WT-Shhprom组与Shhprom组、MT-Shhprom组与Shhprom组得ZRS区增强Shh的表达，对比WT-Shhprom组与MT-Shhprom组可知突变型的ZRS增强Shh的表达能力更强；
B图利用siHnRNPK s48敲低K蛋白的表达，观察到三组的荧光素酶诱导的荧光信号下降，反向证明了k蛋白是造成A图里三组荧光信号差异的原因；
C图在Caco-2细胞内转染siHnRNPK s48敲低K蛋白的表达，观察到Shh的mRNA合成量的减少，证明了细胞内K蛋白可促进Shh的表达；
D图在蛋白层面利用Western blot证明K蛋白的表达下降可导致Shh的表达下降。
4)利用CRISP/Cas9技术构建ZRS区域点突变小鼠动物模型
试验方法：
构建CRISPR/Cas9载体，以及LMBR1基因ZRS区靶向gRNA(guide RNA)(gRNA位于在ZRS新发突变附近)，共同经显微注射于小鼠受精卵，通过常规测序，Western-blot与PCR验证ZRS突变形式，确定模型构建成功，获得ZRS突变的小鼠模型，如图8A、8B所示。
结果分析：如图8所示，ZAS杂合突变的小鼠表型为双下肢多指(图8A、B)表明ZRS区点突变可导致多指表型。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第一医院
<120> 轴前多指病的致病基因及其用途
<130> 2018
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 788
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
aactttaatg cctatgtttg atttgaagtc atagcataaa aggtaacata agcaacatcc 60
tgaccaatta tccaaaccat ccagacatcc ctgaatggcc agagcgtagc acacggtctg 120
taggattaag aggttaactc ctataacttc aaacaaagtg cctgataata aaagcaaaaa 180
gtacaaaatt ttaggtaact tcctttctta attaattgga ctgaccaggt ggaagcgaag 240
agttctgtgc tggtgcttgg aatgtctata aagctgagca acatgacagc acaatagagg 300
aggaacaaag atttttttaa tatgtttcta tcctgtgtca cagtttgaaa ttgtcctggt 360
ttatgtccct tttggcaaac ttacataaaa gtgacctgta ctgtatttta tgaccagatg 420
actttttccc cccagtggct aatttgtatc aggcctccat cttaaagaga cacagagtga 480
gtaggaagtc cagcctctgt ctccacgagc tttcattgca ttctttcatt atttttgctc 540
gttttttgcc actgatgatc cataaattgt tggaaatgag tgattaagga agtgctgctt 600
agtgttagtg gcacatgcgc atatttggcc tggttctggt gggtgagagg aaatcacaga 660
caaaagggaa gcccctgctg ggaaccctgc aaggaaattt aacttgggtc atgttttgat 720
cttagtgttt attacagaaa atgaagccat atctcactaa ctattgttac gtgttaattt 780
gattttcc 788
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgattttgt aaggaactct gg 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgtatggga actcagaaa 19
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
cuagugucuu guuaguugau u 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
ucaacuaaca agacacuagu u 21
<210> 6
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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gcatttcaaa taccagtgct ttaagttatg gtcactcata attatcctcg gtccacagag 180
gctgagtctt caggaggggc tcagtcctct ttcttcaaaa tgcagggaga gccagcctgc 240
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gtgtgagcga ctctgtgctt gatgactgaa gcttgcgggg gtttaaactg tcctttaaaa 360
acttaagttg gttttaactg aagcacctac cattccaggg aaagtcaggg ggaaacgcaa 420
ggatgtacac aaagccggga gtaactgctg ttaccacaag acatgcgctc ctccctcccg 480
cccaccttta tcttaggaaa gatttttttt tttttaactc gaatccttca ggtgaaaata 540
aagcaacagc agcaacagaa aaaaaaaacg tagtcttctt cagggttaac atcagaagac 600
aagcttgtgc ggctttggcc aatcagatgc gcccctggca gctataatat agtgctaaag 660
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tttgattgct gtctcgcgac ccaactccga tgtgttccgt tatcagcggc cggcagcctg 780
ccattccagc ccctgtctgg gtggggagcg gtggagagtc ccccgcagcc gcggcgggca 840
aggttatata ggaagagaaa gagcgaggca gccagcgagg gagagagcga gcgggcgagc 900
cggagcgagg aagggaaagc gcaagagaga g 931
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cccagtggct aatttgtatc aggcctcca 29
<210> 9
<211> 150
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
ttggcaaact tacataaaag tgaccttgta ctgtatttta tgaccagatg actttttccc 60
cccagtggct aattagtatc aggcctccat cttaaagaga cacagagtga gtaggaagtc 120
cagcctctgt ctccacgagc tttcattgca 150
<210> 10
<211> 150
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
ttggcaaact tacataaaag tgaccttgta ctgtatttta tgaccagatg actttttccc 60
cccagtggct aatttgtatc aggcctccat cttaaagaga cacagagtga gtaggaagtc 120
cagcctctgt ctccacgagc tttcattgca 150

Claims (9)

1.突变的LMBR1基因，其特征在于，其与野生型LMBR1基因的差异在于1个突变，并且所述突变的LMBR1基因导致轴前多指病(PPD)的发生；所述突变是：LMBR1基因第5个内含子的ZRS区中c.446T→A，所述ZRS区的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1的突变的LMBR1基因。
3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1的突变的LMBR1基因或权利要求2的载体。
4.权利要求1的突变的LMBR1基因，其用于产生PPD动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生PPD动物模型。
5.权利要求2的载体，其用于产生PPD动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生PPD动物模型。
6.权利要求3的宿主细胞的用途，其用于产生PPD动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生PPD动物模型。
7.用于诊断PPD的诊断剂，其特征在于，所述诊断剂包含能够特异性检测LMBR1基因突变的探针，其中，所述LMBR1基因突变是第5个内含子的ZRS区中c.446T→A，所述ZRS区的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求7的诊断剂。
9.权利要求7的诊断剂在制备用于检测LMBR1基因的突变和/或用于诊断PPD的试剂盒中的用途。
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CN106244713A (zh) * 2016-09-22 2016-12-21 北京市农林科学院 一种检测北京油鸡五趾性状的方法及应用

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CN106244713A (zh) * 2016-09-22 2016-12-21 北京市农林科学院 一种检测北京油鸡五趾性状的方法及应用

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A novel ZRS mutation in a Balochi tribal family with triphalangeal thumb, pre-axial polydactyly, post-axial polydactyly, and syndactyly;Julia E VanderMeer等;《AMERICAN JOURNAL OF MEDICAL GENETICS PART A》;20130801;第158A卷(第8期);2031-2035 *
Julia E VanderMeer等.A novel ZRS mutation in a Balochi tribal family with triphalangeal thumb, pre-axial polydactyly, post-axial polydactyly, and syndactyly.《AMERICAN JOURNAL OF MEDICAL GENETICS PART A》.2013,第158A卷(第8期),2031-2035. *

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