CN106084009A - 人骨肉瘤u2‑os细胞特异性结合多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人骨肉瘤U2‑OS细胞特异性结合多肽及其应用，人骨肉瘤U2‑OS细胞特异性结合多肽的核心序列为APWTEAYWWHLP。本发明的多肽，可以特异性结合人骨肉瘤U2‑OS细胞。将该多肽与对人骨肉瘤有治疗作用的活性分子、负载对人骨肉瘤有治疗作用的活性分子的载体或标记分子偶联后，同样可以特异性结合人骨肉瘤U2‑OS细胞，可以实现人骨肉瘤的靶向治疗，或人骨肉瘤的快速准确诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向多肽及其应用，特别涉及一种人骨肉瘤U2-OS细胞特异性结合多肽及其应用。
背景技术
骨肉瘤是一种好发于青少年的常见恶性骨肿瘤，目前主流的治疗手段是术前大剂量化疗+根治性切除+术后继续大剂量化疗。常规的化疗药物由于没有靶向性，在杀死肿瘤细胞的同时也导致大量的正常细胞受损，对患者具有较大的毒副作用。然而对于骨肉瘤现行治疗方案不敏感的患者，其诊断和治疗仍无靶向适体（“诱饵”或“化学抗体”）应用于临床。因此，筛选与骨肉瘤细胞特异性结合的先导物质，通过与药物偶联等方式，使药物在体内具备定向识别并结合骨肉瘤细胞的活性，从而减轻或避免肿瘤药物的非选择杀伤特性，降低药物的毒副作用，进而提高疗效并减轻患者病痛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人骨肉瘤U2-OS细胞特异性结合多肽及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种人骨肉瘤U2-OS细胞特异性结合多肽，其核心序列为APWTEAYWWHLP。
进一步的，多肽的C端或N端独立连接有不超过3个氨基酸。
一种治疗人骨肉瘤的靶向药物，由对人骨肉瘤具有治疗作用的活性分子和与其相偶联的靶向分子组成，靶向分子为上述的多肽。
一种治疗人骨肉瘤的负载型靶向药物，载体上负载有对人骨肉瘤具有治疗作用的活性分子，靶向分子为上述的多肽。
一种用于人骨肉瘤诊断的试剂，由标志物和与其偶联的靶向分子组成，靶向分子为上述的多肽。
本发明的有益效果是：
本发明的多肽，可以特异性结合人骨肉瘤U2-OS细胞。将该多肽与对人骨肉瘤有治疗作用的活性分子、负载对人骨肉瘤有治疗作用的活性分子的载体或标记分子偶联后，同样可以特异性结合人骨肉瘤U2-OS细胞，可以实现人骨肉瘤的靶向治疗，或人骨肉瘤的快速准确诊断。
附图说明
图1是四轮差减筛选噬菌体文库的富集率趋势图；
图2是为部分噬菌体单克隆涂板结果；
图3是各个噬菌体单克隆的富集率；
图4是酶联免疫吸附实验(ELISA)的鉴定结果；
图5是多肽亲和力实验的实验结果。
具体实施方式
与U2-OS细胞有特异结合活性多肽筛选
使用蓝白筛选方式筛选与U2-OS细胞有特异结合活性的多肽，方法如下：
培养靶细胞人骨肉瘤U2-OS细胞和吸附细胞人成骨细胞hFOB1.19至对数成长期，将噬菌体文库分别与空培养瓶、hFOB1.19共培养1h以除去非特异性结合靶细胞的部分噬菌体，将上清培养液即不与培养瓶、hFOB1.19结合的噬菌体加入至U2-OS细胞中孵育1h，0.1%TBST洗涤10次，酸性洗脱产物即为所得噬菌体。将第一轮所得噬菌体扩增后投入第二轮筛选，共重复四轮筛选过程，将每一轮得到的噬菌体进行涂板以计数和随机挑选蓝斑测序。随着筛选次数的增加，噬菌体可见明显的富集，初步说明筛选得到了与U2-OS细胞特异性结合的阳性噬菌体克隆。
图1为四轮差减筛选噬菌体文库的富集率趋势图。
与人骨肉瘤U2-OS细胞特异性结合的噬菌体文库测序
随机挑选实施例中第二轮、第三轮及第四轮筛选中的大量蓝斑，接种于过夜培养的ER2738菌液中，37℃恒温摇床过夜后进行DNA测序。测序结果如表1所示。
表1、噬菌体文库测序结果
测序结果显示，***了多肽序列APWTEAYWWHLP的噬菌体单克隆重复率较高，说明该序列与U2-OS特异性结合活性较高。
噬菌体单克隆富集率实验
将***了多肽序列APWTEAYWWHLP的噬菌体单克隆接种至ER2738菌液中进行扩增，用每一个扩增后的噬菌体单克隆代替噬菌体文库，重复实施例1中的噬菌体筛选流程，蓝白斑计数法计算每个噬菌体单克隆的富集率，验证其结合U2-OS细胞的特异性。结果显示，***了多肽序列APWTEAYWWHLP的单克隆噬菌体得到了高度富集，说明***了本序列的噬菌体单克隆与U2-OS细胞特异性结合活性较高。
图2为部分噬菌体单克隆涂板结果，图3为各个噬菌体单克隆的富集率。
酶联免疫吸附实验(ELISA)
测序结果显示，四轮筛选中共有9个噬菌体单克隆有重复，扩增其中6个重复率较高的噬菌体，按照常规操作进行ELISA鉴定。酶联免疫吸附实验(ELISA)的鉴定结果如图4所示。实验结果显示其中有3个噬菌体单克隆与U2-OS结合活性较高，序列APWTEAYWWHLP与U2-OS的结合活性最强。
多肽亲和力实验
合成异硫氰酸荧光素（FITC）标记的多肽APWTEAYWWHLP（FITC）（本发明多肽）和随机多肽HGVAELVKSSTAK(FITC) ，在12孔板上培养U2-OS细胞至对数生长期后分别与本发明多肽和随机多肽4℃共培养4小时，PBS冲洗三次后胰酶消化，收集细胞后流式细胞仪检测荧光值。实验结果如图5所示。结果显示本发明多肽荧光值较高，说明本序列多肽具有U2-OS细胞特异性结合活性。
根据现有技术，可以预见，多肽的C端或N端独立连接有不超过3个氨基酸时，并不会显著改变多肽的特异结合性，因此，本发明的多肽APWTEAYWWHLP的C端或N端独立连接有不超过3个氨基酸时，并不会影响其功能。
当本发明多肽与对人骨肉瘤具有治疗作用的活性分子偶联后，可以赋予活性分子靶向性，得到用于治疗人骨肉瘤的靶向药物。
类似的，将本发明多肽与药物载体偶联后，可赋予载体靶向性，可得到治疗人骨肉瘤的负载型靶向药物。
或将本发明多肽与标志物，如荧光试剂、放射性标记等偶联后，可以得到用于人骨肉瘤诊断的试剂。
<110> ***广州总医院
<120> 人骨肉瘤U2-OS细胞特异性结合多肽及其应用
<130> U2-OS
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工多肽
<400> 1
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<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 12
His Asn Pro Trp Trp Glu Ile Ser Xaa Leu Arg Met
1 5 10
Claims (5)
1.一种多肽，其核心序列为APWTEAYWWHLP。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：多肽的C端或N端独立连接有不超过3个氨基酸。
3.一种治疗人骨肉瘤的靶向药物，由对人骨肉瘤具有治疗作用的活性分子和与其相偶联的靶向分子组成，其特征在于：靶向分子为权利要求1或2所述的多肽。
4.一种治疗人骨肉瘤的负载型靶向药物，载体上负载有对人骨肉瘤具有治疗作用的活性分子，其特征在于：载体上偶联有权利要求1或2所述的多肽。
5.一种用于人骨肉瘤诊断的试剂，由标志物和与其偶联的靶向分子组成，其特征在于：靶向分子为权利要求1或2所述的多肽。
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