CN104651509A - 骨肉瘤的药物新靶标 - Google Patents

Abstract

本发明公开了C8orf59基因在制备诊断和治疗骨肉瘤的药物中的应用。本发明的实验证明C8orf59基因在骨肉瘤组织中的表达明显高于正常组织，因此，C8orf59基因可作为诊断骨肉瘤的特异性标志物，使骨肉瘤诊断更加准确、快速。本发明通过干扰骨肉瘤细胞系中C8orf59基因的表达可以明显抑制细胞增殖、迁移、侵袭、成瘤能力，同时加速细胞凋亡。因此C8orf59基因对骨肉瘤的基因治疗具有潜在的应用价值，有望将其应用于骨肉瘤的治疗，并在此基础上，开发抗骨肉瘤的新药，为临床骨肉瘤的防治做出贡献。

Description

骨肉瘤的药物新靶标

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种骨肉瘤的药物新靶标，具体涉及C8orf59基因在制备诊断骨肉瘤产品和制备治疗骨肉瘤药物中的应用。

背景技术

骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。是一种人类骨骼***最常见的原发性恶性肿瘤。典型的骨肉瘤是一种罕见的(占全部恶性肿瘤的0.2％)高致癌恶性肿瘤，其发病率约每年每一百万人里有三例。骨肉瘤主要出现在较长的骨骼以及少部分的软组织。其主要发病人群集中在10～20岁青少年，具有发病率高，早期转移率高，治愈生存率低等特点。X-射线，断层摄影技术，核磁共振，血管造影技术以及动态骨闪烁摄影技术等广泛应用于该病的诊断、肿瘤发生的程度及手术类型判断等等。但是利用上述临床手段进行骨肉瘤的诊断，常常导致患者的病情延误，错过最佳治疗时期。因此寻找一种骨肉瘤早期诊断标志物是亟待解决的问题。

高通量转录组测序(RNA-sep)是在转录组水平上进行深度测序的一项技术，测序技术在转录组分析中的应用主要集中在基因表达谱的构建，新基因的发现、小分子非编码RNA表达谱的构建和新小分子RNA基因的发现、蛋白质编码基因注释、以及如fusion transcript等转录组研究上。数据在最初的处理上是大体是相似的，接下来针对不同的研究目的可以选用不同的生物信息学软件进行计算。

利用大规模测序技术直接对由mRNA反转录成的cDNA序列进行测序，产生数以千万计的reads数量，从而使得一段特殊的基因组区域的转录水平可以直接通过比对到该基因组区域的reads数来衡量。该技术常用来构建某一特定组织或细胞的基因表达谱，通过对正常组织和病变组织进行基因表达谱的分析，得到在两种组织中差异表达的基因，一方面为研究疾病的发生和发展的分子机制提供新的思路，另一方面为疾病的诊断和治疗提供新的诊断标志物或药物靶点。

利用高通量转录组测序筛选与骨肉瘤密切相关的基因，不仅有利于研究骨肉瘤的发生和发展的病理机制，而且能为诊断和治疗骨肉瘤提供新的诊断标志物或新的药物靶点。

发明内容

本发明利用高通量测序技术发现C8orf59基因在骨肉瘤组织中的表达与在正常骨组织中的表达存在差异，与正常骨组织相比，C8orf59基因在骨肉瘤组织中表达上调，通过检测C8orf59基因的表达情况，就可以判断受试者是否患有骨肉瘤。

本发明的目的之一在于提供C8orf59基因在制备诊断骨肉瘤的产品中的应用。

本发明的目的之二在于提供C8orf59基因在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种诊断骨肉瘤的产品，所述诊断骨肉瘤的产品通过检测受试者成骨细胞中C8orf59基因的表达来判断受试者是否患有骨肉瘤。

进一步，所述诊断骨肉瘤的产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断骨肉瘤的产品。所述用RT-PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异扩增C8orf59基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异扩增C8orf59基因的引物；所述用免疫检测诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针；所述用基因芯片诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针。

使用RT-PCR诊断骨肉瘤产品中包含的特异扩增C8orf59基因的引物是利用Primer5.0引物设计软件或者其他常用的引物在线软件设计而成。对于本领域技术人员来说，根据已知基因序列设计出能够用于RT-PCR实验的扩增引物是不需要付出创造性劳动即可实现的。因此本发明的RT-PCR用的特异扩增C8orf59基因的引物是指所有能够在RT-PCR实验中成功扩增C8orf59基因的引物序列。在本发明的具体实施方案中，用于RT-PCR实验的C8orf59基因扩增引物序列如下：正向引物：5’-TACGGCTCGTGAGCGGAAT-3’(SEQ ID NO：1)；反向引物：5’-GGGATAAGTGATTTAATATCC-3’(SEQ ID NO：2)。

所述用实时定量PCR诊断骨肉瘤的产品包含的特异扩增C8orf59基因的引物是根据常用的QPCR引物在线软件设计而成。对于本领域技术人员来说，根据已知基因序列设计出能够用于QPCR实验的扩增引物是不需要付出创造性劳动即可实现的。因此本发明的实时定量PCR用的特异扩增C8orf59基因的引物是指所有能够在QPCR实验中成功扩增C8orf59基因的引物序列。在本发明的具体实施方案中，用于QPCR实验的C8orf59基因扩增引物序列如下：正向引物：5’-ATTCCTCAGCAGCGTCAT-3’(SEQ ID NO：3)；反向引物：5’-GCATCACCAGTATATTACAACAGA-3’(SEQ ID NO：4)。

与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

与C8orf59蛋白特异性结合的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。上述抗体可以从商业途径获取，也可以使用一系列本领域已知的方法来制备。例如，将纯化的人C8orf59蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人C8orf59蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。C8orf59蛋白的抗体包括可以阻抑C8orf59蛋白功能的抗体，也可以是不影响人C8orf59蛋白功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人C8orf59蛋白的片断或功能域致免疫而产生，而人C8orf59蛋白产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的C8orf59蛋白结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化C8orf59蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。

本发明提供了C8orf59基因在制备诊断骨肉瘤的产品中的应用。

所述诊断骨肉瘤的产品通过检测受试者成骨细胞中C8orf59基因的表达来判断受试者是否患有骨肉瘤。所述诊断骨肉瘤的产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断骨肉瘤的产品。所述用RT-PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异扩增C8orf59基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异扩增C8orf59基因的引物；所述用免疫检测诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针；所述用基因芯片诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针。

使用RT-PCR诊断骨肉瘤产品中包含的特异扩增C8orf59基因的引物是利用Primer5.0引物设计软件或者其他常用的引物在线软件设计而成。对于本领域技术人员来说，根据已知基因序列设计出能够用于RT-PCR实验的扩增引物是不需要付出创造性劳动即可实现的。因此本发明的RT-PCR用的特异扩增C8orf59基因的引物是指所有能够在RT-PCR实验中成功扩增C8orf59基因的引物序列。在本发明的具体实施方案中，用于RT-PCR实验的C8orf59基因扩增引物序列如下：正向引物：5’-TACGGCTCGTGAGCGGAAT-3’(SEQ ID NO：1)；反向引物：5’-GGGATAAGTGATTTAATATCC-3’(SEQ ID NO：2)。

所述用实时定量PCR诊断骨肉瘤的产品包含的特异扩增C8orf59基因的引物是根据常用的QPCR引物在线软件设计而成。对于本领域技术人员来说，根据已知基因序列设计出能够用于QPCR实验的扩增引物是不需要付出创造性劳动即可实现的。因此本发明的实时定量PCR用的特异扩增C8orf59基因的引物是指所有能够在QPCR实验中成功扩增C8orf59基因的引物序列。在本发明的具体实施方案中，用于QPCR实验的C8orf59基因扩增引物序列如下：正向引物：5’-ATTCCTCAGCAGCGTCAT-3’(SEQ ID NO：3)；反向引物：5’-GCATCACCAGTATATTACAACAGA-3’(SEQ ID NO：4)。

与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

与C8orf59蛋白特异性结合的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。上述抗体可以从商业途径获取，也可以使用一系列本领域已知的方法来制备。例如，将纯化的人C8orf59蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人C8orf59蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。C8orf59蛋白的抗体包括可以阻抑C8orf59蛋白功能的抗体，也可以是不影响人C8orf59蛋白功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人C8orf59蛋白的片断或功能域致免疫而产生，而人C8orf59蛋白产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的C8orf59蛋白结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化C8orf59蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。

本发明的所述诊断骨肉瘤的产品选自以下组：试剂盒、芯片、滤纸。上述试剂盒可以是检测基因转录水平的试剂盒，如RT-PCR试剂盒、QPCR试剂盒，也可以是检测基因表达水平的试剂盒，如ELISA试剂盒。上述芯片可以是基因芯片或是蛋白芯片，其能够检测目的基因的表达水平。

所述RT-PCR试剂盒除包含特异扩增C8orf59基因的引物之外，还可包含PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、Tap DNA聚合酶。所述RT-PCR试剂盒还可包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

所述QPCR试剂盒除包含特异扩增C8orf59基因的引物之外，还可包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

优选地，PCR缓冲液包含：25mM KCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH₄)₂SO₄。

所述QPCR试剂盒还可包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。

优选地，逆转录反应液包含：250mM pH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。

RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。

所述QPCR试剂盒还可包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

所述ELISA试剂盒除包含与C8orf59蛋白特异性结合的抗体之外，还包含包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、反应终止液、目的蛋白标准品。

优选地，包被缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，其成分为140mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4。

优选地，洗涤液为含1％Tween-20的PBS，称为PBST，其成分为PBS，1％Tween-20。

优选地，封闭液为含1％BSA的PBS，其成分为PBS，1％BSA。

优选地，加样缓冲液的成分为50mM Tris-HCl，0.5M KCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH值为8.4。

优选地，反应终止液成分为2M H₂SO₄。

本发明还提供了C8orf59基因在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

进一步，所述治疗骨肉瘤的药物可以是抑制骨肉瘤细胞增殖的药物，可以是促进骨肉瘤细胞凋亡的药物，可以是抑制骨肉瘤细胞迁移的药物，可以是抑制骨肉瘤细胞侵袭的药物、还可以是抑制骨肉瘤细胞成瘤的药物。

进一步，本发明所述的治疗骨肉瘤的药物包括：通过干扰RNA抑制C8orf59基因表达的双链核糖核酸，或基于C8orf59抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制C8orf59蛋白活性的蛋白质。

在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。

为了确保C8orf59基因能够被高效剔除或沉默，根据C8orf59基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http：//jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi DesignerofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https：//rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。siRNA寡核苷酸由上海吉玛制药技术有限公司化学合成。在本发明的具体实施方式中，针对C8orf59的siRNA序列(siRNA-C8orf59)的具体信息如下：正义链5’-UGUUCUUGGCCAUUGUCAGAA-3’，反义链5’-CUGACAAUGGCCAAGAACAAA-3’。同时设计阴性对照siRNA(siRNA-NC)：正义链：5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’(SEQ ID NO：5)；反义链：5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3’(SEQ ID NO：6)。

所述肿瘤疫苗是指用肿瘤组织中的特殊物质来激发患者体内的免疫功能，使患者的免疫功能能够杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗主要指治疗性疫苗，是在病人得病后再用疫苗的方法进行治疗，以控制肿瘤的复发和转移。肿瘤疫苗具有个体性，因为每一个病人所得的肿瘤类型、分期都不一样，肿瘤细胞所表达的物质也不同，而肿瘤疫苗又是由病人本身的肿瘤制成，因此针对患者具体的肿瘤制备的肿瘤疫苗具有个体化特征，其副作用小，针对性强。

所述肿瘤疫苗制备时，用手术方法切取肿瘤患者的肿瘤组织并无菌冷冻保存，以提取肿瘤抗原。获得肿瘤抗原是第一步，接着要获得树突状细胞，即从病人血液的单个核细胞中获得。采出单个核细胞后再进行筛选和体外培养，然后用肿瘤抗原在体外刺激树突状细胞，使该树突状细胞能够传递免疫信息，最后将训练好的树突状细胞回输到体内，使体内产生针对肿瘤抗原的免疫应答。

本发明还提供了上述针对C8orf59的siRNA在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。所述治疗骨肉瘤的药物可以是抑制骨肉瘤细胞增殖的药物，可以是促进骨肉瘤细胞凋亡的药物，可以是抑制骨肉瘤细胞迁移的药物，可以是抑制骨肉瘤细胞侵袭的药物、还抑制骨肉瘤细胞成瘤的药物。

上述药物除包含siRNA外，还可以包含药学上常见的药物载体。

所述药物的施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。

所述药物可被制成多种剂型，如片剂、针剂、胶囊等。用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备药物针剂。片剂和胶囊之类的药物，也可通过本领域技术人员常规方法制备。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明首次公开了C8orf59基因与骨肉瘤相关，C8orf59基因有望成为诊断骨肉瘤的分子标志物，并为研究骨肉瘤的分子机理提供新的思路。

(2)利用检测基因表达的方式诊断骨肉瘤的存在与否的方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。

附图说明

图1显示利用RT-PCR检测C8orf59基因在骨肉瘤组织和正常骨组织中的表达差异；

图2显示利用实时定量PCR检测C8orf59基因在骨肉瘤组织和正常骨组织中的表达差异；

图3显示利用实时定量PCR在转录水平上检测针对C8orf59的干扰RNA对C8orf59基因表达的影响；

图4利用MTT法检测C8orf59基因表达对骨肉瘤细胞系U2OS增殖的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与骨肉瘤相关的基因

1.1 样品收集

各收集8例正常骨组织、骨肉瘤组织的样本。

1.2 RNA样品的制备及质量分析

1.2.1 RNA样品的制备

正常骨组织和骨肉瘤组织经过RNA抽提后经琼脂糖凝胶电泳判断RNA样品质量，合格者可以用于进一步的转录组分析。

1.2.2 RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

1.2.3 RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)

Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。

1.3 高通量转录组测序

1.3.1 RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的***默认参数。

1.3.2 转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

1.3.3 差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

1.4 结果

前期的RNA-seq测序结果共筛选出979个差异表达基因，其中表达水平上调的基因472个，表达水平下调的基因507个。

实施例2 大样本PCR验证候选基因与骨肉瘤的关系

考虑现有技术中还未见关于该基因与骨肉瘤相关性进行研究的基因作为候选基因，同时考虑前期高通量转录组深度测序的结果，根据P value的大小选择C8orf59基因(其表达在骨肉瘤组织中上调)进行验证。收集30个骨肉瘤组织，同时收集20个正常骨组织样本，采用PCR进行经典的分子生物学实验验证，具体操作步骤如下所示：

1、RNA提取

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5min；

②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；

③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。

2、逆转录

用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

3、RT-PCR扩增

C8orf59：正向引物为5’-TACGGCTCGTGAGCGGAAT-3’(SEQ ID NO：1)；

C8orf59：反向引物为5’-GGGATAAGTGATTTAATATCC-3’(SEQ ID NO：2)；

β-actin：正向引物为5’-CATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQ ID NO：7)；

β-actin：反向引物为5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’(SEQ ID NO：8)。

反应混合物中各成分：正向引物、反向引物、10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板的量为分别为0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μL，最后补充双蒸水使反应体系为10μL。PCR的反应条件如下：94℃，5min预变性；94℃，30s变性；55℃，30s退火；72℃，30s延伸；共35个循环，电泳检测PCR扩增产物。以DNA条带的亮度来衡量DNA量，条带越亮，代表DNA量越多。以β-actin作内参对照，将C8orf59基因扩增产物的条带的亮度进行均一化处理，比较正常骨组织和骨肉瘤组织中C8orf59基因扩增产物的亮度的比值。结果如图1所示，与正常骨组织相比，C8orf59基因在骨肉瘤组织的表达上调，同RNA-sep结果一致。

4、QPCR扩增

采用25μL反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μL，正向引物(5μmol/μl)1μL，反向引物(5μmol/μl)1μL，模板cDNA2.0μL，双蒸水8.5μL；扩增C8orf59基因的正向引物序列为5’-ATTCCTCAGCAGCGTCAT-3’(SEQ ID NO：3)，反向引物序列为5’-GCATCACCAGTATATTACAACAGA-3’(SEQ ID NO：4)；管家基因优选GAPDH，扩增管家基因的正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ IDNO：9)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO：10)。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。结果如图2所示，与正常骨组织相比，C8orf59基因在骨肉瘤组织中的表达上调，同RNA-sep结果一致。

实施例3 免疫检测样本中C8orf59蛋白的表达变化

1.抗原蛋白获得

利用基因工程表达：可从Genbank数据库中获得人C8orf59基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，***原核生物或真核生物表达载体中，表达C8orf59蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白质。

2.抗体制备

可采用以下几种方法制备抗体：

(1)细胞融合法：用上述制备的C8orf59蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。

(2)利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。

(3)利用纯化的蛋白质免疫动物，制备多抗血清。

3.检测

(1)用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行骨肉瘤的病理检测，阳性信号为骨肉瘤。

(2)取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为骨肉瘤可疑病人。

(3)将C8orf59抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于骨肉瘤诊断。

实施例4 C8orf59基因表达对骨肉瘤细胞生理活动的影响

1.siRNA干扰效率的检测

1.1 细胞培养

以人骨肉瘤U2OS细胞系为研究对象，人骨肉瘤U2OS细胞系购自上海细胞库，细胞培养用含10％胎牛血清的IMDM培养基，在不含青霉素、链霉素的环境下，于体积分数为5％的CO₂、37℃条件下常规培养。U2OS细胞置显微镜下观察到细胞贴壁生长，体积中等，大小均匀，细胞呈椭圆形或不规则形，胞质较少，细胞核较大，核仁清晰。

1.2 siRNA干扰C8orf59基因表达

针对C8orf59的siRNA序列(siRNA-C8orf59)：

正义链5’-UGUUCUUGGCCAUUGUCAGAA-3’(SEQ ID NO：5)；

反义链为5’-CUGACAAUGGCCAAGAACAAA-3’(SEQ ID NO：6)。

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’(SEQ ID NO：11)；

反义链为5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3’(SEQ ID NO：12)。

将细胞按1×10⁴/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的IMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组和实验组(20nM)，其中阴性对照组siRNA与C8orf59基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔。同时分别转染。

1.3 QPCR检测C8orf59基因的转录水平

1.3.1 细胞总RNA的提取

采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取U2OS细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次，加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以1mL/管分装至1.5mL Eppendorf管中。每管加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃、7500r/min离心10min。弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500r/min离心5min，室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。

1.3.2 逆转录步骤同实施例2。

1.3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

1.4 结果

结果如图3显示，siRNA-C8orf59能有效抑制C8orf59基因的表达。

2.C8orf59基因对骨肉瘤细胞增殖的影响

细胞体外增殖使用MTT法检测。

2.1 步骤：

将5×10³个细胞铺入96孔板并培养过夜，次日转染阴性对照RNA或siRNA-C8orf59，并于转染后0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h进行MTT检测。首先，弃去培养上清，换入100μL含MTT 0.5mg/ml(Sigma公司)的新鲜培养基；然后37℃孵育4h；最后换入100μL DMSO(Sigma公司)并振荡10min。最终吸光度使用490nm波长检测，绘制细胞生长曲线。

2.2 结果

结果如图4所示，抑制C8orf59表达后，骨肉瘤细胞U2OS的生长明显受到抑制，表明C8orf59基因参与了骨肉瘤细胞的增殖过程。

3.C8orf59基因对细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测C8orf59基因对细胞凋亡的影响。

3.1步骤

按照前面描述的方法进行细胞转染，转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×10⁶个/ml，取200μL上述细胞悬液放置到Appendorf管中，加入10μL Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μL。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。

3.2 统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P＜0.05时具有统计学意义。

3.3 结果

C8orf59基因干扰组的细胞凋亡率为(45.23+2.53)％，阴性对照组的细胞凋亡率为(7.33+0.26)％，上述差异具有统计学意义(P＜0.05)，上述结果表明抑制C8orf59基因的表达能明显促进骨肉瘤细胞U2OS的凋亡。

4.C8orf59基因对骨肉瘤细胞迁移能力的影响

采用划痕愈合实验检测C8orf59基因对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。

4.1 具体步骤

(1)选用含有15μg/ml纤维蛋白原的PBS涂盖5cm大小的培养皿过夜。

(2)第二天加入含有10％FBS的IMDM，在紫外线下灭菌数小时后使用。

(3)将U2OS细胞按照前面描述的方法进行细胞转染，转染72h后，按照1×10⁶个细胞的标准对细胞进行接种培养，24h后，观察细胞是否生长均匀。

(4)用细胞刮在培养皿的细胞中间划开一条痕迹，将其放置在培养箱中培养24h后观察细胞在划痕中的迁移能力，每次观察的时候选择3个样本，观察3次。

4.2统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P＜0.05时具有统计学意义。

4.3结果

侵袭实验开始24h后，C8orf59基因干扰组和阴性对照组的划痕愈合率的平均值分别为28％、75％，上述差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明抑制C8orf59基因的表达，骨肉瘤细胞U2OS的迁移能力下降。

5.C8orf59基因对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响

使用Transwell侵袭小室测定法检测C8orf59基因对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。

5.1 具体操作步骤为：

(1)预先把Matrigel(Beeton-Diekinson，FranklnLakes，NJ)用4℃的IMDM稀释至200μg/ml，取200μL稀释的IMDM放置在孔径为8μm的Transwell上。

(2)使聚碳脂膜膜上全部的微孔都要被Matrigel覆盖，然后把其放在37℃的条件下过夜。

(3)对其进行干燥处理。

(4)用紫外线对备好的Transwell照射2h来灭菌，照射前加入少量的灭菌处理过的无血清的IMDM对其进行水化。

(5)按照前面描述的方法进行细胞转染，转染72h后，取U2OS细胞然后按细胞数3×10⁴加入到每个小室中，培养基选用IMDM。

(6)将其放置到46孔板中培养。

(7)5％CO₂、37℃培养箱中孵育24h。

(8)将小室取出后用纸巾或棉签擦干净上室那面的Matrigel和细胞，下室的那面用甲醇固定10min后，进行常规HE染色，用显微镜观察。

(9)按照随机选择3个高倍镜视野来进行观察，并仔细计数小室下室面的细胞个数作为穿透Matrigel的细胞数目，这个过程进行3次，计算其平均数来作为计算的参考依据。

5.2统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P＜0.05时具有统计学意义。

5.3结果

24h后，C8orf59基因干扰组，通过Transwell膜的细胞数在显微镜下每个视野细胞数的平均值为47个，而阴性对照组通过Transwell膜的细胞数在显微镜下每个视野细胞数的平均值为324个，上述差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明抑制C8orf59基因的表达，骨肉瘤细胞U2OS的侵袭能力下降。

6.C8orf59基因对骨肉瘤细胞成瘤能力的影响

6.1步骤：

(1)按照前面描述的方法进行细胞转染，转染72h后将U2OS细胞胰酶消化后，制备成细胞悬液；

(2)细胞计数后接种于6孔板中(200个细胞/孔)，将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途隔3天进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；

(3)实验终止时用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤细胞后，Giemsa染色，拍照。

6.2结果

平板克隆实验结果显示，与阴性对照组相比，C8orf59基因表达干扰组的骨肉瘤细胞U2OS形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小，上述结果表明C8orf59沉默导致骨肉瘤细胞形成克隆的能力下降。

实施例5 C8orf59抗原蛋白作为骨肉瘤疫苗的应用

1.抗原蛋白获得

利用基因工程表达：可从Genbank数据库中获得人C8orf59基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，根据上述序列使用多肽合成仪合成C8orf59抗原多肽。

2.DC(树突状细胞)的体外分离和培养

患者外周静脉血经淋巴细胞分层液Ficoll梯度离心后分离界面单个核细胞。细胞经洗涤2次后，用无血清培养基AIM-V培养液(Gibco BRL公司)悬浮，调整细胞浓度到3×10⁶个/ml，接种入6孔培养板。在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜后，轻轻吹打悬浮细胞并回收冻存，用以制备效应细胞。在贴壁细胞培养液中加入含1000U/ml粒单集落刺激因子和500U/ml白细胞介素的AIM-V。培养至第7天时，收获悬浮的DC。

3.T2细胞或HLA-A2的EBV(Epstein Barr Virus，非洲淋巴细胞瘤病毒)转染的人B淋巴细胞与终浓度为20μg/ml的C8orf59抗原多肽共孵育4h，洗涤后作为靶细胞。

4.通过以下方式鉴定本发明治疗骨肉瘤的C8orf59抗原疫苗，通过DC递呈C8orf59抗原肽活化效应T细胞，产生特异性针对C8orf59抗原表位的免疫应答：

(1)DC细胞的处理：DC经离心后重悬浮在2ml AIM-V中，并加入C8orf59抗原肽至该多肽终浓度为40ug/ml。37℃、5％CO₂培养18h，经3000rad放射线照射后，洗涤待用。

(2)效应细胞的制备：将步骤3制备的靶细胞与照射后的DC细胞以20∶1混合共孵育6-7天，再按照相同比例加入DC，6-7天后，再次重复刺激一次，作为效应T细胞。于0、7、10、14、19天，分别留取培养上清，用于细胞因子检测。

(3)细胞因子检测：采用细胞因子检测试剂盒(购自美国Endogen公司)检测培养上清中分泌的细胞因子。

5.实验结果表明，经本发明C8orf59抗原肽刺激的DC所活化的效应T细胞，能产生特异性针对C8orf59抗原表位的免疫应答，从而特异性杀伤结合有该相同C8orf59抗原肽的靶细胞，说明本发明C8orf59抗原蛋白可以作为潜在的骨肉瘤治疗性疫苗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种诊断骨肉瘤的产品，其特征在于，所述产品通过检测受试者成骨细胞中C8orf59基因的表达来判断受试者是否患有骨肉瘤。

2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断骨肉瘤的产品。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述用RT-PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异扩增C8orf59基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨肉瘤的产品至少包括一对特异扩增C8orf59基因的引物；所述用免疫检测诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针；所述用基因芯片诊断骨肉瘤的产品包括：与C8orf59基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的产品，其特征在于，所述产品选自以下组：试剂盒、芯片、滤纸。

5.C8orf59基因在制备权利要求1-3中任一项所述的诊断骨肉瘤的产品中的应用。

6.C8orf59基因在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物选自以下组：抑制骨肉瘤细胞增殖的药物、抑制骨肉瘤细胞凋亡的药物、抑制骨肉瘤细胞迁移的药物、抑制骨肉瘤侵袭的药物、抑制骨肉瘤细胞成瘤的药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物包括通过干扰RNA抑制C8orf59基因表达的双链核糖核酸，或基于C8orf59抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制C8orf59蛋白活性的蛋白质。

9.一种抑制C8orf59基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA序列为：正义链如SEQ ID NO：5所示，反义链如SEQ ID NO：6所示。

10.权利要求9所述的siRNA在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。