JPH06500114A

JPH06500114A - 組織再生促進及び癌治療用の生物活性ｅｇｆペプチド

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Publication number: JPH06500114A
Application number: JP3515629A
Authority: JP
Inventors: ガリック，ゲイリィ，イー．; リー，ジンズ，エス．; ブリック，マーク; アーリングハウス，ラルフ
Original assignee: ボードオブリージェンツ，ザユニバーシティオブテキサスシステム
Priority date: 1990-08-13
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 1994-01-06
Also published as: WO1992003476A1; CA2088972A1; EP0546068A1; US5183805A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組織再生促進及び癌治療用の生物活性ＥＧＦペプチド本発明は生物学的活性ペプタイドの分野、特に上皮成長因子として知られているペプチドに関するものである。

さらに詳しく述べれば本発明は上皮成長因子のアミノ酸残基３２〜４８間のフラグメントに配列が類似している驚くべき活性を有する環状ペプチドに関するものである。

この特定のフラグメントはＥＧＦペプチドの天然型の特性であるＢループの末端及びＣループの全部を含んでいる。本発明はまた、ＥＧＦ類似体の合成法が記載されているように、ペプチド合成の分野にも関するものである。

さらに本発明は上記合成ペプチドを創傷の治癒促進、消化性潰瘍の治療及び癌増殖抑制に使用する方法に関するものである。本発明はまた、腫瘍増殖を抑制するように、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−ｒ）を過生成する特殊腫瘍の治療方法に関するものである。上記新規ペプチドは生物学的系において、拮抗的及び作動的役割を果すことができ、したがって、各種の生物学的作用を促進するのに用いられる。本発明はまた上記ペプチドを創傷の治癒促進、特に火傷及び消化性潰瘍の治療に用いる方法に関するものである。新規ペプチドが腫瘍の増殖を抑制するという点において、本発明はまた癌の治療法に関するものである。

上皮成長因子は分子量６Ｋｄ（アミノ酸残基５３個）の一本鎖ポリベブチドで、３個の分子内ジスルフィド結合を有する。上皮成長因子のこれら３個のよく特徴づけられた分子内ジスルフィド結合か３個のループ、すなわちループＡ、Ｂ及びＣの境界を限定している。一般にループＡはアミノ酸残基１〜１９間に存在する特徴があり、ループＢは残基２０〜３１間に、ループＣは残基３４〜４３間に存在する特徴がある１゜ジスルフィド結合はＥＧＦペプチドフラグメント類似体の生物学的活性を完全に保持するために必要であることが判明している。ＨｅａｔｈとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９８６）　”は数個の合成ペプチドを試験して、単離したループ“Ｂ＃の活性は低く、（すなわちＥＧＦ活性の０．００１％）、また単離したループＡ及びＣでは活性はさらに低くい（上記バックグランドにより）ことを発見した。

Ｋｏｒｉｍａｙａらは単離したループＢペプチドの線状及び環状型はＥＧＦレセプター結合及び細胞培養における生物学的刺戟（有糸***誘発）において活性を示すが、その活性はきわめて低い（天然ＥＧＦのｏ、　ｏ　ｏ　ａ％）ことを発見しており、−万能のループは不活性であると記されている２゜残基４９〜５３はＥＧＦの生物学的活性にはほとんど寄与しないことがすでに知られているＥ０他のいくつかの報告により直接のアミノ末端アミノ酸及びカルボキシ末端アミノ酸はＥＧＦの活性に必要ないことが示されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ、　（１９７５）　’、　Ｃａｈｅｎ及びＣａｒｐｅｎｔｅｒ、　（１９７５）　’、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ及びＧｒｅｇｏｒｙ。

（１９８０）　’　；　Ｓｉｍｐｓｏｎら（１９８５）’）、最近、部位特異的変異誘発によりＥＧＦの生物学的活性に重要な鍵となる残基を同定し、ｔｙｒ２９と１ｅｕ４７が最も重要であるとしている（Ｅｎｇｅｒら（１９８８）　、　Ｇｒｅｇｏｒｙら（１９８８）ｌ）。

ＥＧＦペプチドは各種の培養細胞に対して強力な***促進因子であることがすでに知られている（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、　Ｊ、ら（１９８３）”）、ウロガストロンとしても知られているヒトＥＧＦ　（ｈＥＧＦ）は１ｎｖｉｖｏで胃酸分泌を抑制することも判明している（Ｇｒｅｇｏｒｙ、　Ｈ，、（１９７５）　’　）　、　ＥＧＦはまた細胞増殖の強力な刺激剤であることも知られている（同一文献）。特にＥＧＦは各種の製剤で上皮細胞組織の増殖を刺激することが示されている１゜ペプチド成長因子はいくつかの増殖調節過程において重要な役割を演じている。

最も特徴のある成長因子の２つは、ペプチドＥＧＦと形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）１１・１１である。形質転換成長因子αは生物学的に活性な物質であり、その構造と機能はＥＧＦと深く関係している。形質転換成長因子α（ＴＧＦ− α）はＥＧＦと類似のＥＧＦ−Ｒに対する結合親和力を持っている（ＤｅＬａｒｃｏ、　Ｊ、　Ｅ、ら、（１９７８）■）。これらの結果から、成長因子のどの部分が生物学的活性に必須であるかを明らかにしようとして、ＥＧＦならびにＴＧＦ−αの部分的ペプチド配列を合成する多くの研究か試みられている。

ＥＧＦはまた多くの種類の正常細胞及び形質転換細胞に対して育糸***促進性であることが知られており、創傷治癒に関与していると思われる。ＴＧＦ〜αは最初レトロウィルス形質転換細胞の上清に存在すると報告されたが、現在では脈管形成、上皮再生及びｉｎ　ｖｉｖｏにおける顆粒化組織形成の正常なメディエータ−であることが知られている。さらにＴＧＦ−αは多くのヒト腫瘍で生産され、そこで自己分泌して腫瘍細胞増殖の刺激を促進するように機能するものと思われる。

ペプチドＥＧＦ及びＴＧＦ−αは共に上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）と呼ばれる同じレセプターと結合することによってその作用を開始する。そのレセプターはグリコジル化された分子量１７０Ｋｄ”の経腸蛋白質である。ＥＧＦ− Ｒは固有のチロシンキナーゼ活性を有しており、これはＥＧＦ又はＴＧＦ−αの結合によって速やかに刺激されるが、これはこれらのペプチドによるシグナルトランスダクションにとって必要なことであるがあり、脳１４、膀胱１ｓ、***＋１を含む多くのヒトの腫瘍、及び頭部、頚部及び肺の扁平上皮細胞癌において過発現される。このようにＥＧＦ−Ｒの“活性化”は多くの正常細胞の***を刺激することにおいて、またある種の腫瘍細胞の異常増殖において重要な調節事象である。このためＥＧＦ及びＴＧＦ−αとＥＧＦ−Ｒとの相互作用に関しては最近ｌＯ年間でかなりの研究がなされている。

完全なＥＧＦペプチド、及びそれらの作用によく似ている抗体は殺腫瘍活性２！及び創傷治癒２３の促進に対するスクリーニングのような種々の過程で使用されている。しかしながらこれら天然のＥＧＦペプチドの使用はそれらの不安定性、標的特異性の欠除、及びそれらの三次構造についての理解の欠除のために限定されている。

これら種々の問題を克服する方法は生物学的に活性な小さなペプチドをＥＧＦ及びＴＧＦ−αから合成し、それをさらに安定な分子になるように修飾することに重点を置くことである。前に報告したＥＧＦペプチドフラグメントの生物学的活性は極桧で低く、したがって生物活性がより高い型のものを合成する必要がある。すでに試験した人工のペプチド類似体はその活性が種々であり、その中には生物活性が高いものもある。しかしながら治療的に有効な臨床用製剤になるような十分な生物活性を有するペプチドはなお合成する必要がある。

ＥＧＦの限定された領域の生物学的に活性な類似体を調製することの将来性は新しい制癌剤を作り出す将来性を提供するものである。さらにこのようなペプチドは創傷の治癒促進特に火傷患者の特異的治療用として、また消化性潰瘍の治療用として潜在的に有用な治療薬を提供するものである。肺、頭部及び頚部の扁平上皮細胞癌を含むＥＧＦ−Ｒ過発現の腫瘍を治療する有効な方法の開発は、抗癌治療薬のような生物活性ペプチドの単離及び合成によって可能となるだろう。それからの第二世代のペプチドの開発は癌治療に利用できる選択肢に有意の進歩をもたらすだろう。このようなペプチドの使用によって現行の癌治療に伴なう多くの副作用を伴わない有効な制癌剤が作られるものと思われる。

本発明は上皮成長因子レセプターと相互作用する驚くべき能力を育する新規のペプチドについての発明である。

少なくともＥＧＦレセプターの１部と効果的に結合するＥＧＦペプチド類似体の能力は本発明の厳密に限定されたペプチド類似体の中に存在するものと信じられる。本出願人らは上皮成長因子ペプチドの配列を同定し、そして特に生物学的に活性なＥＧＦ環状ペプチド類似体を調製した。このペプチド類似体は天然の上皮成長因子（ＥＧＦ）の特徴であるループＢの末端部分及びループＣ全体を含んでいる。特にこのペプチド類似体は天然ＥＧＦペプチドの特徴であるアミノ酸３２〜４８間のアミノ酸を含んでいる。

ここに示した本発明者らの実験データは、ループＢの末端及びループＣから成る上述の環状ペプチドがこれまでに合成された他のすべてのＥＧＦペプチドよりも１００倍も大きい生物学的活性を有することを示している。

さらに上記ＥＧＦペプチド類似体は、これまでに報告された、あるいは合成された他のＥＧＦペプチド類似体の阻害活性の２倍以上の強さでオルニチン脱炭酸酵素活性を阻害することが示されている。

特に好ましい態様における本発明のペプチド類似体はアミノ末端とカルボキシル末端から成っている。さらにペプチドのアミノ末端はアセチル基を含んでいる。

ペプチドのカルボキシル末端はさらにアミド基を含んでいる。

本発明の他の好ましい態様においては、このペプチドの特徴は、チロシン（Ｙ）が典型的に存在する６位のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されていることである（アミノ酸の３２〜４８セグメントの６位のアミノ酸残基３７）。本発明のこの特定の態様は環状が線状型である。この置換ペプチドは試験したパラメーターにおいて、現存ＥＧＦ類似体以上に活性が上昇していることが判明した。フェニルアラニン置換ペプチドの活性度は他の既知のＥＧＦペプチド類似体に特有の活性より大きかった。環状ペプチド類似体の天然チロシン型は現在記述されている他のＥＧＦペプチド類似体と比較して１００倍以上の生物学的活性の上昇を示した。

チロシン及びフェニルアラニン置換ＥＧＦペプチド類似体の両者を調製し、環状及び線状型の両者で試験した。

これらの試験で各ペプチド類似体の線状型は試験したパラメータにおいて最小の活性を持つことが明らかになった。

１つの実施態様においては、本発明のＥＧＦペプチド類似体は天然ペプチドのアミノ酸３２〜３８セグメント間の３７位でチロシンがフェニルアラニンで置換されている環状ペプチドである。環状化はペプチド類似体の２つのシスティン間の少なくとも１つの分子内結合によって達成された。

本発明は天然ＥＧＦ及びそのアミノ酸残基３７がフェニルアラニンで置換された型のもののアミノ酸３２〜４８間のアミノ酸配列がＤ型から成っているもの及びＬ型から成っているもの、あるいはＤ−及びＬ−アミノ酸の混合型から成るＥＧＦペプチド類似体を含む。アミノ酸のＤ型は特に好ましく、Ｄ−アミノ酸からなるペプチドはｉｎ　ｖｉｖｏでかなり安定な治療薬であり、またより長い有効期間を有するものと期待される。Ｄ−アミノ酸は天然に存在する動物のプロテアーゼによって認識されないので、Ｄ−アミノ酸のペプチドは注射された場合ｉｎのと思われる。

本発明はまた上記の新規ペプチドの合成法、ならびに合成ペプチドを創傷の治癒を促進するために、及び腫瘍の増殖を阻害するために使用する方法を含む。上記ペプチドはＥＧＦ−ｒを過発現する腫瘍を治療する方法において治療薬として用いられる。このような治療薬としての使用に対しては、このペプチド類似体はデリバリ−システム（それにペプチドが結合されて）と共に用いられる。

例としてのみ述べるものであって限定するものではないが、本発明のデリバリ− システムには本ペプチド類似体のジフテリア毒素への結合又はモノクロナール抗体への結合が含まれる。

請求範囲のペプチドの長さか比較的短いことは細胞分解に対するペプチドの感受性を減すると信じられるので、カップリングシステムの使用は本発明の１つの実施態様においてペプチドの分解を一層妨げ、あるいは減じ、その結果ｉｎ　ｖｉｖｏでのペプチドの生物学的活性を長びかせるので好ましいことである。

このペプチドはＥＧＦ−ｒを過発現する腫瘍に対する抗癌剤として有効であることが期待される。開示のペプチドが最も有効であろうと期待される腫瘍には肺、頭部及び頚部の扁平上皮癌が含まれる。これらの癌ではＥＧＦ−Ｈの過発現が最も大きく頻度も高い。ＥＧＦ−Ｒが過発現されるその他の腫瘍には脳１６、膀胱１＠、及び***＋７の腫瘍がある。

本発明の１つの目的はＥＧＦレセプターと結合する能力を有する生物学的化合物をデザインすることである。

本発明の第２の目的は形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）に対するアンタゴニストとして作用する生物学的化合物をデザインすることである。形質転換成長因子 αは多くの腫瘍で異常に産生される分子でＥＧＦ−Ｒと結合することにより生物学的作用を現わす。

形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）はＥＧＦペプチドに構造が類似している。ＴＧＦ−αは多くのヒト腫瘍において産生され、そこで腫瘍増殖の自己分泌刺激を促進するように機能するものと思われる１７゜ＴＧＦ−αはレトロウィルス−形質転換細胞で最初に報告されたが、現在では脈管形成、上皮再生及びｉｎ　ｖｉｖｏにおける顆粒化組織形成の正常なメディエータ−であることが知られている。

創傷の治癒を促進する治療薬として、上記ペプチドは損傷した皮膚に塗布する局所治療型で用いられる。このような使用に対して、このペプチドはキャリヤーと結合した形で含まれることが予想される、１例として、損傷した皮膚とは火傷、発疹、擦過傷及びこれに類したものなど外的な皮膚の損傷である。このような使用では、約５ｎｇの合成ペプチドがペプチドの創傷治癒促進量であろうと予想される。より好ましくは、このペプチドは動物の創傷に局所的に塗布あるいは投与される。創傷治癒促進のための治療としての上記ペプチドの使用は実際には火傷の治療に適していると予想される。

本発明のＥＧＦペプチドは癌の治療あるいは悪性疾患患者の治療に治療薬として用いられるものと思われる。

このペプチド類似体は、静脈内（１，Ｖ、）あるいは動脈内投与によって全身的にあるいは局所的に投与される。

このペプチドは腫瘍のいかなる阻止量においても投与してよいが、このペプチドの好ましい投与用量は薬０．１　ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｍ”体表面面積／時間の範囲である。これらの投与量は経験的は概算であり、動物モデルでの改良が待たれる。

本発明はまた独特なＥＧＦペプチド類似体を合成し、環状化し、そして精製する新規な方法を含む。選択されたペプチドフラグメントのアミノ酸配列は最初この技術に熟練した者にはよく知られている標準的なペプチド合成技術、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９，６３）　（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

合成されたペプチドはペプチドのオリゴマー型から線状モノマー型ペプチドへ変換された。１例として、これは１モル過剰のジチオスレオトール（ＤＴＴ）で処理することによって達成された。ペプチドのモノマー線型はカラムクロマトグラフィーによって単離され、次にポリマー型を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって分別された。合成ペプチドの線状モノマー型は次にＣｈａｎｇら（１９８０）”及びＲｉｖｉｅｒら（１９７４）”によって報告されているようにＫｓＦｅＣＮｇを用いて環状化した。さらに詳述すると、ペプチド内の少なくとも２個のシスティンを連結することによってペプチドを環状化した。この連結によって分子内システィンを結合するジスルフィド橋が作られた。この樹脂がオリジナルなペプチドの原料である。さらにペプチドを生成させるためにこの樹脂を無水の條件下で室温に保存する。この樹脂はフッ化水素酸処理、酸抽出、環状化、そして最終的に精製によって処理がなされなければならない。

合成ペプチドの精製には有機物質を除くためにその後の精製段階として環状ペプチドの追加分別を実施した。

この精製段階に最もよく用いられたのはポリスチレンカラム（ＸＡＤ−１）であった。不完全なペプチドあるいは遊離のアミノ酸を除去するために最終の精製段階としてＨＰＬＣ精製（分別）を追加した。このようにしてさらに精製して得られたペプチドは９９％以上の純度となった。

環状ペプチド類似体生成物の生物学的活性の測定によって得られたペプチドの同一性を確認するために、それについてアミノ酸分析及びＨＰＬＣ分析を行った。

特にペプチド調製物について、天然ＥＧＦペプチドの特徴である生物学的活性の存在の有無について試験した。アミノ酸３２〜４８間の天然ＥＧＦペプチドに特徴的なアミノ酸配列を有する合成ペプチド又は天然ペプチドのアミノ酸３２〜４８間の配列の６位（アミノ酸残基３７）がフェニルアラニンで置換された型のアミノ酸配列を有する合成ペプチドについて試験した。

ペプチド類似体の環状化はアミノ酸配列中の２個のシスティン間で行われ、最終的にＳ−８結合が形成されて分子中の２個のシスティンが架橋する。アミノ酸配列を環状化する多くの方法が存在するか、現在の方法の最も好ましい方法はＫｓＦｅＣＮｉを使用する方法である。

上記上皮成長因子ペプチド類似体のアミノ酸配列の置換型（アミノ酸残基３７）の調製には最初のペプチド合成か含まれる。このペプチドは天然ＥＧＦの特徴であるアミノ酸３２〜４８間のアミノ酸配列から成るが、但しアミノ酸残基３７のチロシンが削除されてその代りにフェニルアラニンが置換されている。これは無置換ペプチドの調製について記載されたごとく、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの合成法を用いて達成される。

本出願の目的に対して、“生物学的に活性なペプチド”の用語にはＥＧＦレセプターに結合する能力を有するすべてのペプチドが含まれる。ペプチドの相対的生物学的活性は、また免疫複合体キナーゼアッセイにおけるペプチドの活性、オルニチン脱炭酸酵素活性を阻害する能力、マイトジェン刺激活性、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＥＧＦ−ｒの燐酸化を誘導する能力及びカルバクチンの燐酸化における作用を反映する。ペプチドの“腫瘍阻止量”なる用語は腫瘍の成長を減するに十分なＥＧＦペプチドの量の意味である。

腫瘍の成長を減退させ又は阻害するように上記ペプチドが機能するその作用機序は上皮成長因子に対する細胞のレセプターに合成ペプチドが結合することによるものと信じられる。その結果、リガンドなしでも、あるいは細胞表面に密集しているため少量のリガンドの存在においても“活性化”されるＥＧＦ−レセプターはインターナリゼーションされ、その結果増殖が阻害される。

完全には明らかになっていないが、上記ペプチドが創傷の治癒を促進する作用機序はＥＧＦやＴＧＦ−αが正常に機能する機序、すなわち上皮細胞の***に対する遺伝プログラムを刺激する機序と同じであると仮定されている。

本明細書においては全体を通じて次の略語が使用されている：Ａｌａ又はＡ＝アラニエンａ　＝アミノ酸Ａｒｇ又はＲ＝アルギニエンｓｎ又はＮ＝アスパラギンＡｓｐ又はＤエアスパラギン酸Ｃｙｓ又はＣ；システィンＥＧＦ　＝上皮成長因子ＥＧＦ−ｒ＝上皮成長因子レしプターＧｉｎ又はＱ＝グルタミンＧｌｕ又はＥ＝グルタミン酸Ｇｌｙ又はＧ＝ニブリシン１ｅ又はＩ＝イソロイシンＬｅｕ又はＬ；ロイシンＬｙｓ又はに＝リシンＭｅｔ又はＭ冨メチオエンＰｈｅ又はＦ＝フェニルアラニンＰｒｏ又はＰ＝ニブロリンｅｔ又はＳ＝セリンＴＧＦ　＝形質転換成長因子ＴＧＦ−α＝形質転換成長因子α Ｔｒｐ又はＷ＝）リブトファンＶａｌ又はＶ＝バリンＨｉｓ又はＨ＝ヒスチジンＴｙｒ又はＹ＝チロシンＴｈｒ又はＴ＝スレオニエン１６合成ペプチドによるＥＧＦ−Ｒ刺激の速度論。

半密集Ａ４３１細胞（０，１％ＦＣ３中で増殖）に、６位にチロシンを持つ環状（ペプチドＡ）又は線状型（ペプチドＤ）ペプチドの指示濃度が３７℃で１０分間２０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えられた。細胞を採集して溶菌し、ＥＦＧ−Ｒを免疫沈澱させ、免疫複合体キナーゼアッセイを実施し、図１に記載されているごとく蛋白質を分割した。図１のように、相対的強さが図の下に示されている。

この数字はＡ４３１へ活性環状ペプチド及び低活性線状ペプチドを添加後のキナーゼ刺激の予備的速度論を比較するものである。Ａ４３１細胞へ各種の生物学的反応モディファイア−を添加後のＥＧＦ−ｒの免疫複合体キナーゼが示されている。ペプチド“Ａ＃は６位（すなわち天然ＥＧＦの３７位）に天然のチロシンを含む環状ペプチドを示し、ペプチド”Ｄ”は６位（すなわち天然ＥＧＦの３７位）にチロシンを持つ線状ペプチド類似体を示す。刺激の速度論の極めて予備的な分析において、環状ペプチド（標識ペプチド“Ａ”）は１５分後にキナーゼ活性の最大の刺激を示した。

図２．生物学的反応モディファイア−添加後のＥＧＦ−Ｒの免疫複合体キナーゼ。

約７０〜８０％密集したＡ４３１細胞を界面活性剤含１！ｒ（ＲＩＰＡ）緩衝液中で溶菌し、１０，０００ｘｇで１０分間遠沈して清澄化した。溶菌液をモノクローナル抗体Ｒ１と４℃で２時間インキュベートしてＥＧＦ−Ｒを免疫沈澱させた。１５分間５０μｌのパンソルビンとインキュベートした後、免疫複合体を採集した。キナーゼアッセイのために複合体をＲＩＰＡ緩衝液で洗浄し、０゜１％トリトンｘ−１００含存２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７゜０）５０μｍにバナジン酸ナトリウム１００μｍ添加したものに再懸濁した。この複合体に生物学的反応モディファイア−を図に示した濃度で添加した。１０分間インキュベートシた後、１０μＣ１７−１”Ａ　Ｔ　Ｐ含有２０　ｍＭＨＥＰＥＳ５０μｌを添加して反応を開始した。２５℃、１０分間反応させ、ＲＩＰＡ緩衝液を添加して反応を停止した。放射性複合体を洗浄し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（８％ポリアクリルアミドゲル）でＥＧＦ−Ｒを分割後オートラジオグラフィーにかけた。ペプチドＡ−６位（すなわち天然ＥＧＦ配列の３７位）にｔｙｒを持つ環状ペプチド；ペプチドＢ−６位（すなわち天然ＥＧＦ配列の３７位）にｔＹｒを持つ線状ペプチド。無処理の対照に比較してのバンドの強さをデンシトメーターによるスキャニングで測定し、図の下部に示しである。無関係な配列を持つ数個の対照ペプチド（線状と環状の両者）はこの定量法でＥＧＦ−レセプターの生物学的活性を刺激しながった（データ示さず）。

図３０合成ペプチドによる”’ｒ−ＥＧＦ結合の阻害ｌＸ１０３個のＡ４３１細胞を２４穴の組織培養用プレートの各穴に入れ、４８時間増殖させた。ＢＳＡｏ、１％及びＨＥＰＥＳ５ｍＭを含む無血清澄ＤＭＥＭ　（ｐＨ７，４）で３回細胞を洗浄後、この培地で４°Ｃ１４５分間インキュベートした。その後各種濃度のペプチド（無標識ＥＧＦ）を添加し、続いて２０，０００ｃｐｍ　”’Ｉ−ＥＧＦを添加した。２時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いてＩ　Ｎ　ＮａＯＨｌ　ｍｌ中で２４℃、１８時間可溶化した。溶液の放射能はガンマ−カウンターで測定した。ペプチドＡ−６位にｔｙｒを持つ環状ペプチド；ペプチドＢ−６位にｔｙｒを持つ線状ペプチド；ペプチドＣ −６位にｐｈｅを持つ環状ペプチド。

ｔｙｒを持つ環状ペプチド（ペプチド“Ａ″）はＥＧＦ−レセプターとの結合に対して”！’Ｉ−ＥＦＧとかなりの競合を示し、無標識ＥＧＦの濃度よりも１０倍だけ高い濃度で５０％の阻害が起こった。これらの結果はＥＧＦ−レセプター結合に対して従来報告されているペプチドよりも１００倍高い競合を示すので意義あることである。

同じような長さを有する無関係のペプチドではＥＧＦ−ｒとの結合に対してＥＧＦと極めてわずかな競合力しか示さない（データ示さす）。ペプチドＣ（チロシンをフェニルアラニンで置換した環状ペプチド）とペプチドＢ（千ロジンを含む線状ペプチド）は”’　Ｉ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ結合に対して最低の競合を示したにすぎない。キナーゼアッセイで最も活性なペプチドはＥＧＦ結合阻害においても最も活性があった。

図４．ＭＥ−１８０細胞における合成ペプチド前処理のＥＧＦ刺激ＯＤＣ誘導に対する影響。

半密集ＭＥ　１８０細胞を１００　ｎｇ／ｍｌのペプチドで３０分間、続いてｆａｎｇ／ｍｌのＥＧＦで３時間処理した。

細胞をペレット状とし、２５ｍＭ　ＮａＰＯ４，１ｍＭ　ＤＴＴ。

４０ｕＭ　ＰＬＰ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液中で超音波処理し、４° Ｃ，１５，００Ｏｒｐｍで３０分間遠沈した。上清のオルニチン脱炭酸酵素活性は、全オルニチン濃度０．５　ｍＭ、全容０．２ｍｌ中のＩ　（”Ｃ）オルニチン０．５μＣｉから生ずる１４ＣＯｔを調べることによって測定した。

Ｐｌ−６位がｐｈｅの線状ペプチド、Ｐ２−６位がｐｈｅの環状ペプチド、Ｐ３ −６位がｔｙｒの線状ペプチド：Ｐ４−６位がｔｙｒの環状ペプチド。３７位に天然のチロシンを持つ環状ペプチド（図の標識ペプチド４（Ｐ４））は１００倍の過剰でＥＧＦのＯＤＣ誘導を５０％阻害した。

他のペプチドの活性は弱かった。実施した別のアッセイで、同じ合成ＥＧＦペプチド類似体が最も活性があり、このことは天然のＥＧＦと特異的に相互作用することを強く示唆するものである。

図５．ＥＧＦ又は環状ペプチドのＡ４３１細胞の増殖に及ぼす影響。Ａ４３１細胞の有糸***促進刺激この研究はペプチド類似体がＡ４３１細胞に対する天然ＥＧＦの影響を刺激することかできるかどうかを調べるために実施したものである。細胞を直径６０ｍｍの組織培養プレートに２Ｘ１０＠の濃度で播種し、３日間インキュベートした後ペプチド及び／又はＥＧＦを添加した無血清培地中で増殖させた。ペプチド類似体３８Ａは天然のチロシンを持つペプチドの環状型である。７２時間後細胞を採集し、ヘマシトメーターで計測した。天然のＥＧＦは低濃度（０，１ｎｇ／　ｍｌ）ではＡ４３１細胞の増殖を刺激したが、高濃度（ｌｏ　ｎｇ／ｍｌ）ではＥＧＦは細胞増殖を阻害した。出願人の最も生物学的に活性な環状のＥＧＦペプチド類似体は低濃度（０，１ｎｇ／ｍｌ）でも高濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）でも細胞増殖を刺激した。合成環状ＥＧＦペプチド類似体では、試験した濃度の全範囲に亘ってＡ４３１細胞の増殖阻害は認められなかった。

ペプチドとＥＧＦとを表示濃度で混合した実験においては、低濃度で細胞増殖の刺激が認められた。しかしながら、天然ＥＧＦの高濃度でもｔｏｎｇ／ｍｌの合成環状ＥＧＦペプチド類似体存在下ではもはやＡ４３１細胞の増殖を阻害しなかった。これらの結果は、合成環状ペプチド類似体は低濃度でも天然ＥＧＦに特徴的な生物学的活性を有することを強く示唆している。出願人の予備データは本発明の合成ＥＧＦ環状ペプチド類似体がＥＧＦレセプターと相互作用することを示している。この合成類似体は試験したＡ４３１細胞系に加えて他の特定の細胞系の増殖に対しても重要な影響を存するものと思われる。

ＥＧＦペプチド類似体と天然ＥＧＦの相互作用は複雑であると思われるので今後の研究が必要である。

本発明は天然上皮成長因子ＥＧＦペプチドの単離された領域に類似のアミノ酸配列から成る新規の、驚くべきほどの生物活性を有するペプチドの発見とその合成を示すものである。天然ＥＧＦペプチドのレセプター結合領域は抗体を認識するアミノ酸残基２０〜３７間に存在すると以前に報告されている（Ｋｏｎｏｒｉｙａら、（１９８４）８１：１３５１−１３５５）。発明者らはＥＧＦのレセプター結合領域は天然ＥＧＦペプチドのアミノ酸残基３２〜４８間の配列に類似した配列を有するアミノ酸領域に存在することを明らかにしている。上述のペプチドのＥＧＦレセプター結合活性は細胞を活性化すること無しに結合する利点を持っており、したがってこのペプチドは、腫瘍成長因子−α（ＴＧＦ−α）の結合によってＥＧＦ−レセプターを過発現する腫瘍に対して潜在的に価値ある制癌剤となる。

天然ＥＧＦペプチドの特定の切片に類似したペプチドセグメントあるいはフラグメントは実験室で通常使用されている装置及び手法を用い、標準Ｆｍｏｃ合成プロトコールに従って本研究用に選択され合成された！４゜（合成法の詳細は下に示す）。

以下は上皮成長因子（ＥＧＦ）のペプチド類似体を調製するために用いられた手法を記述したものである。

ＥＧＦペプチドの選択されたフラグメント又はペプチド（表１参照）を改良Ｖｅｇａ２５０　盟自動ペプチド合成機を用い、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、、　８５：２１４９−５４　（１９６３））を用いて調製した。

ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）アミノ酸ブロック基の除去及び樹脂からのペプチドの分離は０°Ｃで約１時間フッ化水素酸処理することによって達成された非ペプチドの有機化合物を除去するためにペプチド含有混合物をジメチルエーテルで抽出し、合成されたペプチドを樹脂粉末から酢酸（約２５％Ｗ／Ｖ）で抽出した。

次のペプチドの線状及び環状モノマー型を含む４個のペプチドを調製した；Ｉ　−Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ−ＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫ−Ａｍｉｄｅ（ｔｅｒｍｅｄ＃３７）Ｉｆ　−Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ−ＮＣＶＶＧＦ［ＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫ−Ａｍｉｄｅ（＃３８）Ｕは合成ＥＧＦペプチド類似体のフェニルアラニン置換型を示す。

環状型はペプチド内で２個の分子内システィンを連結することによって作成した。ペプチド類似体のアミノ末端及びカルボキシ末端はプロテアーゼに対するペプチドの抵抗を高めるためにアセチル基及びアミド基でそれぞれブロックした。

線状モノマー型の精製合成及び抽出後、ペプチドのモノマー型を単離するため、Ｇ−２５カラムによるカラムクロマトグラフィーにより各ペプチドを分別しｌこ。Ｇ−２５カラムにかける前にオリゴマー及び環状型を線状モノマー型に変換するためペプチドを初めに１モル過剰のジチオスレオトール（ＤＴＴ）で処理した。

ペプチドの環状化ペプチドの線状型を除去するため０２５カラムによるクロマトグラフィーでペプチドを分別した。有機物質を除去するためペプチドをさらにポリスチレンカラム（ＸＡＤ−１）で分別した。次にペプチドをＫｓＦｅＣＮｓを用い、Ｃｈａｎｇら（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、±５：４８５−９４　（１９８０））及びＲｉｖｉｅｒら（Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、９６：２９８６−９２　（１９７４））によって報告されている化学反応によって、ペプチド内で分子内システィンを連結することによって環状化した。Ｆｅ−を除くためにこのペプチドをさらに処理した。調製物が緑青色を呈するのでＦｅ−の存在は明らかであった。

精製の最終段階としてさらにＨＰＬＣによる分別を行い、合成ＥＧＦペプチド類似体を単一ピークとして溶離した。

アミノ酸分析及びＨＰＬＣ分析出願者らは表１に示されている生物学的に活性なペプチドとして得られたペプチドの配列を確定するため、及びフェニルアラニンによるそのＧ置換体の配列を確定するため、十分に精製した環状モノマー型ペプチドの調製物を分析した。これら生成物のアミノ酸分析及び分析用ＨＰＬＣ分析は予期したペプチド配列と一致した。ペプチドの純度は環状モノマー型ペプチドについては約５３％〜５７％の間であった。

ペプチド活性アッセイ用のモデル細胞系同一の株化細胞系に対してＥＧＦは濃度が異なることによって***を促進したり、増殖を抑制したりする。したかって、細胞表面のレセプターの発現が変化する細胞系でペプチドの試験を実施した。多くの研究室からの研究がＡ４３１細胞からのＥＧＦ−ｒの特性研究に重点を置いているので、Ａ４３！細胞が最初のモデル細胞系であった。出願人らはまた新鮮ヒト腫瘍及び／又は脳１−***１１からの細胞系、及び頭部、頚部の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）”°−１″のＥＧＦ−ｒ発現及び活性について研究した。

追加のモデルとして、出願人は上記ペプチドの、２つの追加モデルＨＮＳＣＣ細胞系（Ｍ、　Ｄ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ病院のＤｒ、　ｐ、　５ａｃｋｓによって株化された）に及ぼす影響を研究することを提案する、その理由はこれらの細胞系においては、ＥＧＦ−ｒレベルとＥＧＦに対する反応において異なっていることを出願人は観察しているからである！０−１３゜これらの細胞は重要な生物学的モデル、すなわち薬理学的薬剤としての効果を決定するのに最も重要な最初の段階においてこのペプチドの生化学的活性を測定するのに適しているに違いない。

生化学ペプチドは最初、出願人及びその他の研究者ＣＭａｘｗｅ　ｌ　ｌら、１９８８）”によって以前に報告されているように、Ａ４３１細胞のＥＧＦ−ｒからの免疫複合体キナーゼアッセイで、ペプチドのチロシンキナーゼ活性を変える能力についてスクリーニングされた。このアッセイは極めて敏感であり、またキナーゼの活性化は育糸***誘発における最初の事象の１つである。

これらの細胞からのＥＧＦ−ｒへのＥＧＦの結合に対する競合を調べるために活性ペプチドがアッセイで用いられた。次に有望なペプチドについてはｊｎ　ｖｉｖｏでのＥＧＦ−ｒの燐酸化、カルバクチンの燐酸化、ＯＤＣの誘導、及びモデルｃ−ｍｙｃ細胞系における合成などに対してスクリーニングした。腫瘍の生物学的治療に対するペプチドの終局的開発のために、出願人はこれらペプチドの腫瘍細胞系、特にＥＧＦレセプターを過発現する腫瘍細胞系に対してアンタゴニストとして作用する能力を確認することを試みた。

前述の研究から得られた結果のいくつかを総合すると、試験したペプチドの生物学的活性は無置換環状ＥＧＦペプチド類似体の特性である生物学的活性を有することが判明した。ある特定のペプチドはこれまでに合成された他の類似体よりも１０〜１００倍高い生物学的活性を示すことか判明した。アミノ酸３２〜４８間の無置換ＥＧＦペプチド類似体の線状型はこれまでに得られたベブチどよりも１０倍高い生物学的活性を存することが判明した。この無置換ペプチドの環状型はこれまでに記述した他のペプチドよりも１００倍高い活性を示した。

次の実施例は好ましい実施態様及び本発明の育用性を記述するために示すもので、これに添付した特許請求範囲に別途の方法で特に記載されていなければ本発明を限定するものではない。

実施例１ＥＧＦペプチド類似体の合成４個のペプチド類似体、すなわち天然ＥＧＦのアミノ酸３２〜４８の間の配列から成る２個のペプチド類似体と、６位（アミノ酸残基３７）のチロシンがフェニルアラニンで置換されている以外は同じ配列のペプチドフラグメント（アミノ酸３２〜４８）からなる２個のペプチド類似体を合成した。この領域の天然ＥＧＦペプチドは表１に示す配列を持つ。

天然ＥＧＦのアミノ酸残基３２〜４８間のアミノ酸配列ａＭｎ−ｃｔｓ　、　− ｖａｌ−ｖａｌ　、−ｇｌｙ　、−Ｑｒ　、　−１１ａ　、−ｇｌｙ、−ｇｌｕ　、−ａｒｇ−ｃｔｓ、−ｇＬｎ、−ｔｙｒ、−ａｒｇ、−ａｓｐ、−１＊ｕ、 −１７ｇ、−一山謙。

各２個のこれら異なったペプチド配列は線状型と環状型（２個の分子内システィンのジスルフィド架橋によって調製）で合成された。２個のペプチドはペプチドのアミノ酸残基＃３７のチロシンをフェニルアラニンで置換したもので、１個は線状型、他の１個は環状型である。

ペプチドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄらによって報告され、上に概説されている方法に従がって合成し、部分的に精製した。ペプチドのそれ以上の精製はＨＰＬＣによって成しとげられた。

特許請求範囲の特に好ましい態様は、ペプチドの無置換（ｔｙｒ　”　）型及びアミノ酸残基＃３７の置換（フェニルアラニン）型の両者のカルボキシル末端にアミド基を、アミノ末端（＊で示す）にアセチル基を含む。

実施例２類上皮癌腫細胞系Ａ４３１　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）のレセプターはＥＧＦレセプターの特性について最も完全に研究されたモデルである。この細胞系はレセプター遺伝子が増強されており、そのためこの細胞モデルはＥＧＦの構造、活性及び生化学の研究に最もよく適している。

この細胞系からのＥＧＦレセプターをモノクローナル抗体Ｒ＋　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で免疫沈澱させた。免疫複合体はホルマリン固定スタフィロコッカス・アウレウス　コーワン株（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて採集した。これらの複合体を免疫複合体キナーゼアッセイでキナーゼ活性を測定した。

実施例３試験したＥＧＦペプチド合成ＥＧＦペプチド類似体の各種の線状型及び環状型の生物活性が出願人によって試験された。これらのペプチドには次のものがある：線状ＥＧＦ−アミノ酸３２〜４８環状ＥＧＦ−アミノ酸３２〜４８アミノ酸残基＃３７ｔｌｌ換線状ＥＧＦ−アミノ酸３２〜４８．８３７位＝フェニルアラニンアミノ酸残基＃３７置換環状ＥＧＦ −アミノ酸３２〜４８．８３７位＝フェニルアラニンレセプター試験で測定した生物学的活性を持っていないことが判明した線状ペプチドは次のペプチドである；アミノ酸３２〜４８の線状ペプチドで＃４４位がｔｙｒのもの、線状ペプチド（アミノ酸３２〜４８）−４４位ｐｈｅ　ｏ他の腫瘍からの数種の他のペプチドも、試験したパラメーターでは生物学的活性を示さなかつた。

ペプチドの潜在的生物学的活性を測定するため、複合体に各種濃度の合成ペプチド類似体又はＥＧＦを加え、自己燐酸化を測定した後に免疫複合体キナーゼアッセイを実施した（Ｍａｘｗｅｌｌら、１９８８）。

実施例４免疫複合体キナーゼアッセイにおけるＥＧＦレセプターの構造、活性及び生化学はレセプター遺伝子が増強されている類上皮癌腫細胞系Ａ４３１のレセプターについて最も完全に研究されている。この細胞系からのＥＧＦレセプターを実施例２に示したようにモノクローナル抗体Ｒ１を用いて免疫沈澱させた。このペプチドの潜在的生物学的活性を測定するため、各種濃度のペプチド又はＥＧＦを複合体に加え、そして実施例３に示したように自己燐酸化を測定した後に免疫複合体キナーゼアッセイを実施した（図１及び図２参照）。実施例３から選択されたペプチドが試験に使用された。

６位（アミノ酸残基＃３７）にチロシンを持つ環状及び線状ペプチドをＥＧＦと比較した結果を図１に示す。

ペプチド“Ａ”、（天然の千ロジンを含むＥＧＦペプチド類似体の環状型に相当する）が２０　ｎｇ／　ｍｌの濃度でキナーゼ活性を３〜６倍増加させて、強い生物学的活性をこのアッセイで示した。この刺激度は濃度５ｎｇ／ｍｌの天然ＥＧＦにほぼ等しい。わずかな刺激（略２倍）がアミノ酸残基６位（アミノ酸残基３７）で置換されたフェニルアラニンを持つ環状ペプチド類似体の３０ｎ／ｍｌ濃度で観察されが、比較の線状ペプチド（ｐｈｅで置換）では活性を示さなかった（図には示されていない）。

刺激の速度論の極めて予備的な分析においては、環状ペプチド（ペプチド“Ａ“ と標識）は１５分後にキナーゼ活性の最大の刺激を示した（図２）。興味あることに、アミノ酸残基３７位にフェニルアラニンを持つ線状ペプチドであるペプチド“Ｄ”はキナーゼ活性を阻害した（図２）。

実施例５ＥＧＦレセプター競合アッセイ本実験は調製したペプチドＥＧＦ類似体のＥＧＦレセプターへの結合位置を決定するために計画されたものである。

ペプチドがＥＧＦレセプターに直接結合するかどうかを決定することはむずかしい。それはペプチドの法度化が立体配座を妨げるからである。したがって予備試験においては、出願人はＥＧＦレセプター結合位置に対してＥＧＦペプチド類似体の、天然”５Ｉ−ＥＧＦと競合する能力を評価する方法を選んだ。このアッセイのために、マイクロ滴定ウェル中で、無血清培地で細胞を１晩増殖させ、ＰＢＳで数回洗浄し、その後種々の濃度のペプチドと２時間インキュベートした。次に”’Ｉ−ＥＧＦを３０分間加え、細胞を完全に洗浄した後放射能をガンマ−カウンターで測定した。

その実験結果を図３に示す。ｔｙｒを持つ環状ペプチドは図３で”Ａ″と標識されており、ＥＧＦレセプターとの結合に対して”Ｉ−ＥＧＦとかなりの競合を示した。

無標識ＥＧＦの濃度より１０倍だけ高い濃度でも５０％の阻害が起こった。これらの結果は有意である。何故ならこれらの結果はＥＧＦレセプターとの結合に対して合成ＥＧＦペプチド類似体はこれまでに報告された他のべブチドよりも１００倍高い競合を示すからである。

アミノ酸残基＃３７が置換された環状ペプチド（フェニルアラニン）（図３で“ Ｃ″と標識）及び無置換（チロシン）線状ペプチド（図３で”Ｂ”と標識）はｌ！Ｓ　Ｉ−ＥＧＦ結合に対して最低の競合を示す。同様な長さの無関係環状ペプチドはＥＧＦと競合する能力は極めて小さい。このようにキナーゼアッセイで最も活性なペプチドはまたＥＧＦ結合の阻害においても最も活性である。

これら２つのアッセイにおけるペプチドの生物学的活性の差はこのように確かに存在する。

実施例６オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）活性の阻害オルニチン脱炭酸酵素はＥＧＦ　（及び他の多くの成長因子）の刺激によって有糸***が促進されると活性が急速に増加する酵素である。出願人による予備試験の結果を図４に示す。６位（天然ペプチドのアミノ酸残基＃３７）に天然のチロシンを持つ環状ペプチド（図４でペプチド４として記されている）は１００倍の過剰でＥＧＦのＯＤＣ誘導を５０％阻害した。その他のペプチドの活性は低かった。このように３種のアッセイすべてにおいて、天然ペプチドのアミノ酸３２〜４８間のＥＧＦペプチドの同じ環状チロシンモノマー型が最も活性があり、天然ＥＧＦのこの配列に相当する特定のＥＧＦセグメントがＥＧＦ−ｒと特異的に相互作用することを強く示唆している。

実施例７Ａ４３１細胞の有糸***促進性刺激出願人はペプチド類似体がＥＧＦのＡ４３１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５５５）への影響を刺激し得るかどうかを決定するための予備試験を開始した。

Ａ４３１細胞は悪性細胞系であり、ＥＧＦ−ｒの研究はこの細胞系で行うことに特徴がある。細胞を２×１０’の濃度で平板に接種し、図５に示すごとくペプチド類似体及び／又はＥＧＦを添加して３日間増殖させた。

予期したごとく、０．１　ｎｇ／ｍｌの濃度でＥＧＦはＡ４３１の増殖を刺激した。１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦでは、これらの細細胞の増殖は抑制された。興味あることに、生物学的に最も活性な環状ペプチド類似体は０．１　ｎｇ／ｍｌでも１０ｎｇ／ｍｌでもまたこれらの細胞を刺激した。ペプチド類似体の試験した全濃度範囲に亘って、Ａ４３１細胞の増殖阻害は認められなかった。

ペプチド類似体とＥＧＦとを表示の濃度で混合した実験においては、低濃度で細胞増殖の刺激が認められた。

しかしながら、Ｌｏｎｇ／ｍｌのペプチド類似体の存在下では高濃度のＥＧＦでもＡ４３１細胞の増殖を阻害しなかった。

これらの実験は環状ペプチドが生物学的活性を有することを強く示唆するものである。要約すると、研究中の環状ペプチドはＥＧＦレセプターと相互作用し、細胞系の増殖に対して重要な影響を及ぼすことをこれらのデータは示している。

実施例８ヒトでの腫瘍治療に対する合成ＥＧＦペプチドの使用についての提案現在開示されているＥＧＦの環状ペプチド類似体がＥＧＦレセプターに対して結合親和性を有することか示されている限りにおいて、出願人はＥＧＦレセプターを過発現する細胞から成る腫瘍細胞又は悪性細胞の抑制にこれらのペプチドを使用することを提案する。腫瘍増殖のこのクラスの代表的なものは、例えば肺、頭部及び頚部の扁平上皮細胞癌である。脳、膀胱、***などの他の腫瘍の増殖も、上述のペプチドで効果的に治療し得る條件の範囲内で同様に期待される。

最適の用量計画は標準の第１相及び第目相臨床試験様式に従がって決定されなければならないが、１つの考えられる用量計画は下に示すようなものであろう。初めに、最初の患者３名を入院させて、０．１ｍｇ／ｍ２のペプチド類似体を毎日１時間かけて７日間静脈内投与し、その間生命徴候及び臨床毒性の証拠を徹底的にモニターする。この治療後さらに２週間観察を続ける。もし３名の患者全員が何ら重大な副作用（修正ＷＨＯ毒性基準１によるＩＩＩ又はＩＶ段階）なしにこの治療に耐性を示すならば次の患者を治療する。これら次の患者には特定のペプチド類似体を次の計画に従がって段階的に用量を増やして各段階３名に投与する。

用量　用量　治療段階　ｍｇ／ｍ”／ｄａｙ　期間１　０．１　７　Ｄａｙｓ２　０．５　７　Ｄａｙｓ５　１０．０　７　Ｄａｙｓ６　２０．０　７　Ｄａｙｓ７　４０．０　７　Ｄａｙｓ８　８０．０　’　７　Ｄａｙｓ９　１６０．０　７　Ｄａｙｓ最大耐用量までより多くの経験が得られるように、ペプチド類似体の連続注入（すなわち、１〜１０ｍｇ／Ｉ１１″／ｈｒ３週間、その後１週間休止）又は毎日ポーラス注射（すなわち、１０ｍｇ／　ｔｎ２／　ｄａｙ　３週間、その後１週間休止、又はさらに長い期間投与）のような他の用量計画が探査のために計画さる。

効果評価のために、出願人はリンパ節肥大及び／又は肺又は肝臓の病変のような臨床的に価値のある及び／又は測定可能な腫瘍性病変を持つ患者群を試験に入れる計画である。これらの病変は身体検査及び／又はＣＡＴスキャンを含むラジオグラフィーによる評価で容易に追跡することができる。反応基準は完全に標準化されており、医科学に熟練した人にはよく知られている。完全な緩解は最低の４週間で進行性腫瘍のすべての臨床的証拠が完全に消失することと定義されている；部分的緩解とは測定した病変の直径の積の和の５０％以上の減少が最低４週間継続するもとの定義されている。いずれかの病変の大きさが同時に増加したり、新しい病変の出現があってはならない。

万一、この方法が、増殖抑制の代りに、腫瘍増殖の刺激によって妨害される場合には、ＥＧＦペプチドのこの性質は静止腫瘍細胞を細胞周期へ戻し、その後周期特異的化学療法剤で腫瘍を治療するために利用することができる。

これらの特殊な用途では、上述のペプチドは不安定な結合で化学療法剤に結合するものと思われる。−例としてこのような化学療法剤にはシスブラチナム、アドリアマイシン、シトキサン、メトトレキセート、５−フロロウラシル、あるいはプレオマイシン等がある。上述のペプチドはデリバリ−システムへ結びつけられる可能性かある。−例として、このようなデリバリ−システムとしてはモノクローナル抗体、ジフテリア毒素、あるいは他の同じような作用物質へのペクチドのカップリングがある。ペプチドの適当なキャリヤーへのカップリングは特定の腫瘍をより良く標的とすることができると思われる。

詳しく述べれば、腫瘍細胞へ薬剤を運搬するための特異的なリガンドとしてペプチドを用いるという重要な見通しに近づくことである。出願人らは化学療法に用いられているアルキル化剤を、Ｄｉｌｌｍａｎら！４によって報告されているように酸不安定ｃｉｓアコニット酸結合で活性ペプチドのアミノ末端へ結合させることを提案する。レセプター・リガンド複合体の細胞内吸収の際にｃｉｓ−アコニット酸結合が切れて！４、薬剤を遊離して細胞毒性を生じることが考えられる。

上述のペプチドの生物学的特性はこのようにペプチドを潜在的に革命的なヒト用の抗癌治療薬とするものである。創傷、特に潰瘍発生性の損傷及び火傷の治癒促進に上述のペプチドを使用することが提示されているが、その基礎を予備的細胞研究が提供するものである。

文　献次の参考文献が参照番号によってここに特に引用されている：４、　Ｇｒａｇｏｒｙ、Ｊ−、（１９）５）ｔ　Ｈａ上鳳！塵ｚ　２５１＝３２５−２７゜９、　Ｍａｒｒｉｆｉ＊ｌｄ、（１９６コ）、、旦ｆｉ＝２１４４− ５４゜１−　Ｃｏｈ＊ｎ、ｓ−（１９６２）、　Ｌ」１広ＬｑＩｌｒ　２１Ｌ＝　１５５５−６２゜１９、　ｃａｒｐａｎｔａｒ　（１９１１７）、　Ｖ　５６：８８Ｌ−９１４゜２０、　Ｃ＆ｒｐ＠！’ｌｔｌ！ｒ　（１９）９）、　ｔｌ旦：　工９コー２１６゜２１　Ｋｌｔｌｊｌｔａ、Ｍ−Ｉ　！　（１９８６１，ｍ、４ｊｔ！　１６４ｇ−５３゜２５、　Ｍｉｌｌｅｒ、皇−一塁よＪＬ　（１９８１＞、　二１Ｊ■２１（ｔ　４２＋２０７−１４゜２６−　ｘａｘｖｓｌｌ　（ｉｓｓ！ｊ）、ニーは■；遡に＝１（１１１ｔ　４！（５）”コ０−７゜ＫｊＮＥＴＩＣＳ　ＯＦ　ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＥＧＦ　ＲＥＣＥＰＴＯＲＡＵＴＯＰＨＯ３ＰＨＯＲＹＬＡＴＩＯＮ　ＩＮ　ＩＣにＡＡＦＴＥＲＡロロ汀ＩＯＮ　０ＦＰＥＰＴＩ口ＥＳＴＯＡ４３１　ＣＥＬＬＳ”−ｔ”’　？’ ７Ｔ　Ｑ　＋＝　％　＋７’Ｑ、？ｐ　乙）Ａ　Ｋ　Ｉ（−”０　１１１　４．５３．３　１１１　０．３５　０．９ＩＭＭＵＮＥ　ＣＯＭＰＬＥＸにＩＮＡＳＥ　ＯＦ　ＥＧＦ−ＲＡＦＴＥＲ＾ＯＤ汀ＩＯＮ　ＯＦ　ＶＡＲｆＯＵＳ　８１０ＬＯＧＩＣＦＩＥＳＰＯＮＳＥ　ＭＯＤＩＦＩＥＲ３ＴＯＡ４３１　ＣＥＬＬＳ１４’ｒ１／　９貯へｊシ牙Ｑｄ１　往、すり字ル２贋Ａν　七テ°＋”７７Ｐ −テ１５広舌ｔ１７　εＱ丁ニーＰ−の　Ｌｔｐｊ？　令ノ？奔−半Ｔ−大：・ＢＲＭ／Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ　（１）　Ｏ，ｊ　３．９　０．Ｑ　Ｏ，９０，６３，６１２５１−ＥＧＦ　ＢＯＵＮＤ　（％　ＯＦ　Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ）ｏｏｃ　ＡＣＴＭＴＹ　（ｏｏｃ；シ陰）補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法組８４条の８）平成　５年　２月１２　日ＩＪ、。

Claims

【特許請求の範囲】

１．アミノ酸配列ＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＯＹＲＤＬＫから成り、カルボキシル末端にアミド基を、アミノ末端にアセチル基を持つＥＧＦペプチドの生物学的に活性なペプチドフラグメント。
２．腫瘍細胞増殖を抑制するペブチドから成り、創傷の治癒を促進し、そしてＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＯＹＲＤＬＫの配列から成るＥＧＦレセブターに結合し、カルボキシル末端にアミド基を、アミノ末端にアセチル基を持つ上皮成長因子の生物学的に活性なペブチドフラグメント。
３．アミノ酸配列ＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＯＹＲＤＬＫから成り、カルボキシル末端にアミド基を、アミノ末端にアセチル基を、そして上記配列のシステインが分子内ジスルフィド結合を形成しているＥＧＦの生物学的に活性な環状ペブチドフラグメント。
４．請求の範囲第１項又は第２項に記載されており、さらに環状ペブチドから成ると定義される上皮成長因子のペブチド類似体。
５．ＥＧＦレセブターに対して天然ＥＧＦの０．００１％以上の結合親和力を有すると定義される請求の範囲第１項、第２項又は第３項の生物学的に活性なペブチドフラグメント。
６．さらにプロテアーゼ抵抗性と定義される請求の範囲１、２、３又は４のペブチド。
７．さらに、天然上皮成長因子の特性であるループＢの末端フラグメント及びループＣから成ると定義される請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項。
８．さらに細胞系のオルニチン脱炭酸酵素活性を阻害する能力を持つと定義される請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項のペブチド。
９．請求の範囲第８項において細胞系がＡ４１８である請求の範囲第８項のペブチド。
１０．さらにＬ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸から成ると定義される請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項のペブチド類似体。
１１．さらにＤ−アミノ酸から成ると定義される請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項のペブチド類似体。
１２．さらにペブチド内の２個のシステイン間の分子内結合から成る請求の範囲第１項又は第２項のペブチド類似体。
１３．ＥＧＦレセブターに対して天然ＥＧＦの少なくとも４．５％の結合親和力を有すると定義される請求の範囲第３項の生物学的に活性なペブチドフラグメント。
１４．市質的に１７個のアミノ酸から成ると定義される請求の範囲第３項の生物学的に活性な環状ペブチドフラグメント。
１５．ＥＧＦレセブターに対して天然ＥＧＦの約１８％の結合親和力を持つと定義される請求の範囲第３項の生物学的に活性な環状ペブチド類似体。
１６．本質的にアミノ酸配列ＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＯＹＲＤＬＫから成り、カルボキシル末端にアミド基を、アミノ末端にアセチル基を持つと定義されるＥＧＦの生物学的に活性な環状ペブチドフラグメント。
１７．Ａ−４１３細胞のＥＧＦレセブターに対して天然ＥＧＦの４．５％以上の結合親和力を有すると定義される請求の範囲第４２項の生物学的に活性な環状ペブチドフラグメント。
１８．Ａ−４１３細胞ＥＧＦレセブターに対して天然ＥＧＦの１８％の結合親和力を有すると定義される請求の範囲第４２項の生物学的に活性な環状ペブチドフラグメント。
１９．上記配列のシステイン間に分子内ジスルフィド結合を有すると定義される請求の範囲第４２項の生物学的に活性な環状ペブチドフラグメント。