CN105524140A - 人食道癌细胞特异性结合的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人食道癌细胞特异性结合的多肽及其应用，所涉及多肽的氨基酸序列为：LDPGPTWHRIPT。所涉及的应用为本发明的人食道癌细胞特异性结合的多肽特异结合人食道癌细胞的应用。该Eca-109细胞特异性结合多肽为食道癌的早期分子影像学诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发奠定了基础，可作为这方面研发的重要导向元件。

Description

人食道癌细胞特异性结合的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种人食道鳞癌细胞(Eca-109细胞)和组织特异性结合的多肽(序列)及其对人食道癌细胞、组织具有良好的结合特异性和敏感性的应用。

背景技术

食道癌(esophagealcancer)是一种常见的、多发的恶性肿瘤，通常包括由食管上部三分之一处和中间处发展而来的鳞状细胞癌和由食道下部三分之一处的黏液细胞发展而来的腺癌。在西方国家的食道癌组织学类型中，食道腺癌和鳞癌几乎各占50％；在中国的食道癌组织学类型中，鳞癌几乎占90％，而食道腺癌的发生率很低。据国际癌症研究署发布的《WorldCancerReport2014》显示，食道癌的死亡率以中国为最高，其中，男性食道癌死亡位居癌症死因的第二位，女性食道癌则为第三位。食道癌的发展一般经过上皮不典型增生、原位癌、***、转移癌等阶段。食道癌的治愈生存率与早期发现率密切相关，越晚发现治愈的可能性越小，一般只能控制病情。因此，早期诊断是获得食道癌治疗效果的关键。

传统的食道癌影像学技术包括：X线钡餐造影、食道脱落细胞学、纤维内窥镜、胸部CT扫描等，均是依靠其物理学和组织生理学的变化来发现和诊断疾病。然而，癌症的发生是从细胞、分子开始的，待发展到可见的器官改变时已进入中晚期。于是，以对癌细胞、癌组织为靶标的分子影像学诊断应运而生，而其中的关键元件是对癌细胞、癌组织具有特异靶向结合活性的分子片段的获得！而且，更重要的是一旦获得这种靶向分子片段，对于研发癌症后续的靶向治疗药物意义重大，对于大大改善目前临床抗癌药物因靶向性不足而导致的巨大药物毒性具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种食道癌细胞组织特异性结合的多肽序列。

本发明所提供的人食道癌细胞特异性结合的多肽，该多肽的氨基酸序列为：LDPGPTWHRIPT。

本发明还提供了上述人食道癌细胞特异性结合的多肽特异结合人食道癌细胞的应用。

本发明的多肽片段能够特异性结合Eca-109细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞(即正常细胞)，并对其他消化道肿瘤细胞表现出极低亲和力或者无亲和力；能够特异性结合人食道癌临床组织样品，而不识别癌旁非癌组织。

本发明的多肽的筛选方法为利用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的Eca-109细胞系为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取60个噬菌体克隆扩增并滴定，利用酶联免疫吸附实验(ELISA)鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与Eca-109细胞的亲和力，对阳性噬菌体克隆进行DNA测序，将测序结果比对后获得拥有“共有序列”的阳性克隆组4个，对这4条公有序列组以细胞免疫荧光法鉴定它们的特异性和敏感性，获得了本发明所提供的肽序为最佳肽序。最后，以该肽序列为模板合成荧光标记的食道癌特异性多肽探针，进一步以食道癌临床组织样品、食道癌组织芯片检测实验确证了该多肽对食道癌组织的特异性和敏感性，从而提示了该多肽序列巨大的应用价值。

各种噬菌体克隆水平、合成肽探针水平的实验结果均提示该多肽能够特异性结合人食道癌细胞和组织，这为该多肽序列未来用于食道癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向纳米药物的研发提供了实验依据。

本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选到Eca-109细胞特异结合的表面展示12肽的噬菌体克隆，并利用ELISA鉴定噬菌体克隆与食道癌细胞的亲和力，获得46个阳性噬菌体克隆，经测序获得4条共有多肽序列(Consensussequence)。以细胞免疫荧光法进一步鉴定这4条肽序代表性克隆的靶向性，提示含序列LDPGPTWHRIPT的噬菌体克隆(E37)与Eca-109细胞的特异结合力最强，为最佳阳性克隆。最后，以该序列为准合成荧光标记的多肽探针FITC-EsoProbe，在临床食道癌组织样品、食道癌组织芯片等层面证实多肽序列LDPGPTWHRIPT对食道癌组织和细胞均有强大的特异性结合活性。

附图说明

图1：本发明的具体技术路线图；

图2：随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列；

图3：专用密码子表；

图4：60个阳性噬菌体克隆与Eca-109细胞亲和力两次ELISA鉴定结果；

图5：四条共有序列的代表性阳性噬菌体克隆与细胞亲和力的免疫荧光鉴定，其中：A、C、E、G分别为：噬菌体克隆E28、E13、E22、E37与细胞Eca-109的亲和力；B、D、F、H分别为：噬菌体克隆E28、E13、E22、E37与细胞HEK293的亲和力；I、K分别为：IRP、PBS与细胞Eca-109的亲和力；J、L分别为：IRP、PBS与细胞HEK293的亲和力；

图6：四条共有序列的代表性阳性噬菌体克隆亲和力的荧光强度分析，结果显示E37所代表的肽序列(LDPGPTWHRIPT)与Eca-109细胞的亲和力最佳；

图7：克隆E37(LDPGPTWHRIPT)与其它肿瘤细胞亲和力鉴定，其中：A：Eca-109；B：TE-1(食道癌另一细胞系)；C：SGC-7901(胃癌细胞)；D：Caco2(结直肠癌细胞)；E：SMMC-7721(肝癌细胞)；F：MCF7(乳腺癌细胞)；G：SiHa(***细胞)；

图8：克隆E37(LDPGPTWHRIPT)与食道癌及癌旁组织的结合特异性，其中，A：E37与食道癌组织；B：E37与癌旁组织；C：IRP与食道癌组织；D：IRP与癌旁组织；E：PBS与食道癌组织；F：PBS与癌旁组织；

图9：克隆E37(LDPGPTWHRIPT)与其它癌及癌旁组织的结合特异性，其中，A：与胃癌组织；B：与正常胃组织；C：与结直肠癌组织；D：与正常结直肠组织；

图10：多肽(LDPGPTWHRIPT)分子与Eca-109细胞特异性结合的剂量效应，其中：A、C、E、G、I、K的浓度分别为0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM；B、D、F、H、J、L为阴性对照多肽，浓度分别为0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM；

图11：多肽(LDPGPTWHRIPT)与Eca-109细胞特异性结合时间效应，其中：A、C、E、G、I、K：阳性多肽，孵育时间分别为5min、10min、15min、25min、40min、60min；B、D、F、H、J、L：对照多肽，孵育时间分别为5min、10min、15min、25min、40min、60min；

图12：多肽(LDPGPTWHRIPT)与食管鳞癌细胞的结合部位，其中：A、B、C：FITC-阳性多肽与Eca-109、TE-1、HEK293细胞；D、E、F：FITC-阴性多肽与Eca-109、TE-1、HEK293细胞；

图13：多肽(LDPGPTWHRIPT)与其它肿瘤细胞的结合特异性，其中：A：胃癌SGC-7901细胞；B：结直肠癌Caco2细胞；C：肝癌SMMC-7721细胞；D：乳腺癌MCF7细胞；E：***SiHa细胞；

图14：流式细胞仪检测多肽(LDPGPTWHRIPT)的结合特异性，其中：A：食道癌Eca-109细胞；B：食道癌TE-1细胞；C：HEK293细胞。绿色：FITC-阳性多肽；红色：FITC-阴性多肽；黑色：PBS；

图15：多肽(LDPGPTWHRIPT)竞争抑制：多肽(LDPGPTWHRIPT)孵育靶细胞后，再以噬菌体克隆E37孵育靶细胞，洗涤后根据噬菌体发出荧光的强弱分析多肽的特异性结合力；该竞争抑制力与多肽浓度正相关，说明多肽特异性良好；

图16：多肽(LDPGPTWHRIPT)与食道癌临床样品的结合特异性，其中：A：阳性肽与食道癌组织；B：阳性肽与癌旁组织；C：阴性肽与食道癌组织；D：阴性肽与癌旁组织；

图17：多肽(LDPGPTWHRIPT)与其它消化道癌组织的结合特异性，其中：A、阳性肽与胃癌组织；B、阳性肽与胃癌旁组织；(C)阴性肽与结直肠癌组织；(D)阴性肽与结直肠癌旁组织；其中，食道与胃的组织源很接近，所以会出现弱的结合，这也反映了该多肽良好的靶向性；

图18：多肽(LDPGPTWHRIPT)与5例食道癌切片的结合特异性，其中：A、C、E、G：阳性肽与食道鳞癌组织；I：阳性肽与食道腺癌组织；B、D、F、H：阴性肽与食道鳞癌组织；(J)阴性肽与食道腺癌组织；

图19：多肽(LDPGPTWHRIPT)与食道癌组织芯片的结合特异性，其中：A：阳性肽；B：阴性肽。A-C7、A-C8为癌旁组织。结果显示了多肽(LDPGPTWHRIPT)与食道癌鳞癌类型最佳的结合特异性。

具体实施方式

噬菌体肽库(PhageDisplayedPeptidesLibrary)是将随机编码的多肽以外壳融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使海量随机多肽与其配体(如抗体、细胞膜表面某特殊微结构、受体、分子或分子片段，等)通过体外亲和淘选程序(Bio-panning)得以快速筛选。这一技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤药物靶向运输等方面的研究。本发明就是提供利用上述肽库筛选的、可以特异敏感的结合于人食道癌细胞和组织的一条多肽序列，并以相关实验结果证明了该序列对人食道癌细胞和组织结合的高度特异性和敏感性。该多肽由于其分子量小、亲和力高、免疫原性低、组织穿透性强、易合成等特点，将其连接其它效应分子(如荧光素、同位素、毒素、化学药物等)，在未来可以用于：(1)食道癌的早期分子影像学诊断，可以形成肿瘤三维成像，大大提高食道癌的早期诊断率，并可对治疗疗效评价；(2)作为食道癌化疗药物的导向元件而用于食道癌的靶向化疗，可大大降低药物毒性而提高疗效，使化疗成为对病人确实有益的治疗方法之一；(3)用于寻找肿瘤细胞表面相关配体的研究，为肿瘤治疗提供新的靶点；(4)将多肽与纳米脂质体或纳米药物偶联，可达到更好的靶向治疗效果。

一、技术路线

本发明采用噬菌体多肽展示技术，以人食道鳞癌Eca-109细胞系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞进行4轮消减筛选，从噬菌体12肽库中筛选能特异性结合Eca-109细胞的多肽序列，为食道癌早期诊断和靶向治疗的进一步研究提供良好的基础，具体技术路线如图1所示。

二、材料与方法

2.1主要实验材料

2.1.1细胞、噬菌体肽库、宿主菌

(1)细胞株：人食道癌细胞株Eca-109，人胚肾细胞株HEK293，购于美国ATCC(Rockville，美国)。

(2)噬菌体肽库：随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12^TMPhageDisplayPeptideLibraryKit)购自NewEnglandBiolabs，USA。

(3)宿主菌：大肠杆菌E.coliER2738：购自NewEnglandBiolabs，USA。

(4)细胞培养基：RPMI1640完全培养基，购自美国Invitrogen公司。

2.2实验方法

2.2.1细胞培养

用RPMI1640完全培养基、37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱。

2.2.2宿主菌E.coliER2738的培养

E.coliER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌体肽库的专用菌株。用LB-Tet培养基、37℃恒温摇床、300rpm振荡过夜。

2.2.3噬菌体展示十二肽库的消减筛选

以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞，食道癌Eca-109细胞为靶细胞，参照随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12TMPhageDisplayPeptideLibraryKit)使用说明书，优化改良筛选方法，进行4轮消减筛选，保持每一轮筛选投入噬菌体量不少于1.5×10¹⁰pfu。

2.2.4噬菌体阳性克隆的鉴定(ELISA法)

按照常规细胞ELISA实验流程进行，取与阴性对照吸光度比值大于2.0者初步定为“阳性克隆”。

2.2.5阳性噬菌体克隆多肽序列的测定：

按照噬菌体测序常规准备和送送南京金丝瑞生物工程公司全自动测序。根据肽库试剂盒说明书读序图，利用DNAStar软件找到EgalⅠ酶切位点和KpnⅠ酶切位点，确定12肽基因区段，按照试剂盒说明书提供的三联密码子表及克隆方案(参见图2、图3)翻译成多肽序列。

2.2.6阳性噬菌体克隆的特异性和敏感性的鉴定

测序后根据每个共有序列(Consensussequences)所包含克隆结合初步ELISA结果确定各对应共有序列的代表性克隆，对这些代表性克隆再以常规细胞免疫荧光法进行结合特异性和敏感性的最终鉴定。

2.2.8统计学方法

采用SPSS16.0-GLM中的Univariate分析数据，数据均以±SD表示，组间多重比较采用Duncan检验处理。P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著，P>0.05为无统计学意义。

三、实验结果

3.1细胞ELISA初步鉴定噬菌体阳性克隆

第4轮消减筛选后不进行扩增，直接滴定，从约有100个蓝斑的LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取60个噬菌体单克隆，扩增后做ELISA鉴定，结果如图4所示。

3.2噬菌体阳性克隆的测序结果及分析

测序获得阳性噬菌体克隆含有4个共有序列：LDPGPTWHRIPT(E37)，LWDSTSTRPPLT(E28)，LPDARRHSSPTT(E13)，和HDSDSSHHGPPT(E22)。

3.3阳性噬菌体克隆的特异性和敏感性鉴定

采用细胞、组织免疫荧光技术，以FITC标记的兔抗羊IgG为二抗，羊抗M13多克隆抗体为一抗，荧光显微镜下拍照分析。设无关克隆对照(URPs)、PBS对照、人胚肾HEK293细胞对照、癌旁组织对照及其他癌组织对照。结果如图5-图9所示，显示阳性噬菌体克隆均结合到Eca-109细胞或者人食道癌组织上，但以E37克隆(LDPGPTWHRIPT)最佳。阳性噬菌体克隆均不与HEK293细胞、癌旁组织、其他癌组织结合，但与胃癌组织有低度结合，这是因为胃与食道在解剖和组织源上非常接近之故，也从另一角度说明阳性多肽的极好的组织靶向性。

3.4根据E37序列(LDPGPTWHRIPT)合成多肽的特异性和敏感性鉴定

方法同上，结果如图10-图17所示。多肽LDPGPTWHRIPT特异结合到Eca-109细胞或者人食道癌组织上，但不与HEK293细胞、癌旁组织、其他癌组织结合。

为了进一步确定多肽LDPGPTWHRIPT的特异性结合力，以人食道癌组织切片和芯片做了免疫荧光(方法同上)检测。结果如图18、19所示，该多肽与食道癌组织具有良好的结合特异性，而且与早期的食道鳞癌组织结合特异性更好！提示了其用于食道癌早期诊断方面的价值。

四、本发明获得的研究成果及其意义

本发明以食道癌Eca-109细胞为靶细胞，以人胚肾HEK293为吸附细胞，采用全细胞筛选策略，经过4轮消减筛选，经过酶联免疫吸附试验鉴定，随机挑取的60个噬菌体克隆中有46个阳性克隆，测序获得4条共同多肽序列，分别为LDPGPTWHRIPT、LWDSTSTRPPLT、LPDARRHSSPTT、HDSDSSHHGPPT，它们的代表性克隆分别为E37、E28、E13、E22。通过一系列不同层次的鉴定分析实验后发现其中的LDPGPTWHRIPT(E37)对于食道癌细胞、组织的靶向性最强，而不识别正常细胞(人胚肾HEK293细胞)、癌旁组织以及消化道其他组织来源的癌细胞，其中对早期食道鳞癌组织的特异性结合力更好，提示了其用于食道癌早期诊断方面的价值。

本发明多肽在食道癌早期检测和靶向治疗方面具有潜在的应用价值，在治疗方面，有望利用其特异性高、分子量小、穿透力强、亲和力高的特性来与传统化疗药物(如顺铂、阿霉素等)偶联，达到靶向递送给药的目的，大大减小化疗药物的非特异性和毒副作用；在食道癌早期检测方面，利用同位素或者荧光标记的多肽可以特异性结合食道癌细胞，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，对于食道癌早期检测、癌病灶定位和疗效评价都具有重要意义。

Claims (2)

1.人食道癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为：LDPGPTWHRIPT。

2.权利要求1所述人食道癌细胞特异性结合的多肽特异结合人食道癌细胞的应用。