CN114195862A

CN114195862A - 一种多肽及其应用

Info

Publication number: CN114195862A
Application number: CN202111150093.2A
Authority: CN
Inventors: 叶招明; 林鹏; 薛钰铖; 滕王锶源
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN114195862B

Abstract

本发明公开了一种多肽及其应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示。本发明多肽利用噬菌体展示技术，利用噬菌体体外细胞细胞筛选以及体内肿瘤筛选，得到靶向骨肉瘤HOS细胞的亲和肽，通过体外荧光显微镜观察以及体内活体实验证明了该多肽对骨肉瘤HOS的靶向性及特异性结合。该多肽对骨肉瘤的靶向***有潜在的应用前景。

Description

一种多肽及其应用

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种多肽及其应用，特别涉及一种靶向骨肉瘤HOS细胞系的多肽及其应用。

(二)背景技术

骨肉瘤是人类最常见骨原发性恶性肿瘤，未发生转移的患者五年生存率低于70％，发生转移的患者五年生存率低于30％。近三十年来，骨肉瘤的治疗方式没有取得明显进展，临床上现有的主要治疗方式只有手术切除以及化疗，因此近三十年来骨肉瘤患者的长期存活率没有明显改变。

骨肉瘤的靶向治疗仍处于探索阶段，当前研究大多集中在骨肉瘤的种系和体细胞遗传学上，试图通过比较骨肉瘤的基因改变来寻找治疗靶点。但是基于基因组检查的骨肉瘤靶向治疗耗资大，且仍处于探索阶段。此外，骨肉瘤具有高水平的体细胞结构变异和拷贝数改变，导致骨肉瘤具有高度异质性，重复的靶标突变很少。因此，迫切需要开发一种新的骨肉瘤靶向治疗策略。

噬菌体展示技术可用于寻找靶向细胞的多肽，在识别肿瘤细胞的亲和性多肽方面有很强的应用价值。当前多个研究表明，将来源于噬菌体展示的短寡肽与药物，荧光染料，甚至纳米颗粒结合，可以用于癌症的靶向治疗以及精准诊断。

鉴于靶向多肽用于靶向治疗的优势，筛选一种能够靶向骨肉瘤细胞的多肽应用于骨肉瘤的靶向治疗具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种多肽及其应用，利用噬菌体展示技术，通过体外细胞筛选以及体内肿瘤筛选获得靶向人骨肉瘤HOS细胞系的亲和肽，所述多肽在靶向治疗骨肉瘤中具有广阔的应用前景。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种多肽，特别是靶向骨肉瘤HOS细胞系的多肽，所述多肽的氨基酸序列自N端至C端为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中的任意一种或至少两种的组合，优选为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO.1：TPPRVPLLTFGS；

SEQ ID NO.2：YPAAYHTLTREP；

SEQ ID NO.3：DSPTSLVLRARS；

SEQ ID NO.4：STLLADVRIPGS。

本发明通过噬菌体库的构建，从随机的噬菌体多肽库中筛选可以与人骨肉瘤HOS细胞系特异结合的多肽序列。再将这些序列与HOS细胞进行结合，筛选出与HOS细胞特异性结合的四个氨基酸序列，且SEQ ID NO.1所示氨基酸序列与HOS细胞结合的效果最好。

本发明还提供一种含所述多肽核苷酸序列的DNA片段，包含至少一个拷贝DNA片段的重组载体，以及包含重组载体的重组细胞，重组细胞转化宿主菌制备的重组基因工程菌；所述重组载体以M13KE噬菌体为基础载体，所述重组基因工程菌宿主菌优选为大肠杆菌ER2738。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含所述DNA片段、所述的重组载体或所述的重组细胞，以及药学上可接受的载体。

本发明提供一种所述多肽在制备肿瘤定位诊断试剂、抗肿瘤药物或肿瘤细胞靶向制剂中的应用。

所述多肽与药物连接时通常需要进行修饰，优选所述的修饰是在多肽氨基酸序列C端添加Gly-Gly-Ser-Cys连接物。

所述肿瘤为人骨肉瘤，或者肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌等可能表达与该多肽结合受体的肿瘤。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)本发明通过从随机的噬菌体多肽库中筛选可以与人骨肉瘤HOS细胞特异结合的多肽序列，确定了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与HOS细胞的结合效果最好；

(2)本发明多肽结合药物，荧光染料，载体等发挥肿瘤诊断、抗肿瘤等作用。

(3)本发明的多肽在骨肉瘤以及肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌等潜在高表达与该多肽结合受体的肿瘤治疗方面具有广泛的应用前景。

(四)附图说明

图1、活体成像观察多肽在肿瘤的聚集情况；A为活体成像照片，其中Saline注射生理盐水，CY5.5 Only注射200μM Cy5.5-马来酰亚胺的生理盐水溶液，CY5.5-Peptide C注射序列2的多肽结合物生理盐水溶液，CY5.5-Peptide S注射随机序列的多肽结合物生理盐水溶液，CY5.5-OTP注射序列1的多肽结合物生理盐水溶液；B为各组小鼠的荧光强度柱形图。

图2、体外荧光显微镜验证SEQ ID NO.1所示多肽对骨肉瘤HOS细胞的亲和性；A为荧光显微图，其中Cy5.5-OTP代表序列1的多肽结合物，Cy5.5-peptide C代表序列2的多肽结合物，Cy5.5-peptide S代表随机序列Peptide S的多肽结合物，Cy5.5Only代表Cy5.5-马来酰亚胺；DAPI代表DAPI染色，FITC-phalloidin代表FITC-phalloidin染色，Cy5.5-peptide dyes代表不同Cy5.5-多肽结合物，MERGE代表上述3个染色通道的合并图像；B为各组荧光强度柱形图。

图3、体外荧光显微镜验证SEQ ID NO.1所示多肽与骨肉瘤HOS细胞结合的特异性；A为荧光显微图，其中HOS代表HOS细胞，HUVECs代表对照细胞HUVECs，DAPI代表DAPI染色，Cy5.5-OTP代表序列1的Cy5.5-多肽结合物，MERGE代表上述2个染色通道的合并图像；B为各组荧光强度柱形图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所用试剂组成：

LB液体培养基：10gNaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，溶于1L ddH₂O。121℃蒸汽灭菌20min。

LB琼脂培养基：10gNaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，12g琼脂(Agar)，溶于1LddH₂O。121℃蒸汽灭菌20min。

细菌培养板：首先将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以及半乳糖苷(X-gal)分别用二甲基甲酰胺(DMF)配制成20mg/ml的溶液，-20℃避光保存；然后在100ml的LB琼脂培养基中分别加入100μL上述IPTG溶液以及X-gal溶液，制备成细菌培养板。

洗涤缓冲液：0.5mg/ml牛血清白蛋白和0.1％(v/v)Tween20的无血清DMEM细胞培养基。

洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，1mg/mL牛血清白蛋白，溶于ddH₂O，用质量浓度36％浓盐酸调节至pH2.2。

细胞裂解液：0.02mg/ml脱氧胆酸钠，10mM Tris-HCl，2mM EDTA，溶于ddH₂O。

Tris–HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)：121.1g Tris，1L ddH₂O，质量浓度36％浓盐酸调节pH 9.1，4℃储存。

PEG/NaCl溶液：100g聚乙二醇(PEG)，116.9g NaCl和475mL ddH₂O。

NAP缓冲液：80mM NaCl，50mM NH₄ H₂PO₄，溶剂为ddH₂O，质量浓度36％浓盐酸调节至pH 7.0。

Tris缓冲盐(TBS)：2.42g/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)，29.22g/L NaCl，1LddH₂O，质量浓度36％浓盐酸调节至pH 7.5。

M13KE噬菌体库：购买自Bio-lab生物科技有限公司。

所述室温是指25-30℃。人骨肉瘤HOS细胞购自中科院上海细胞库。

下述实施例中涉及到的多肽均由江苏南京金斯瑞生物科技有限公司合成和纯化，涉及测序均由湖北武汉百齐生物技术有限公司进行。

实施例1：人骨肉瘤HOS细胞系靶向肽采用噬菌体展示技术通过体外细胞筛选以及体内肿瘤筛选获得。

1、人骨肉瘤HOS靶向噬菌体的体外细胞筛选

(1)准备大肠杆菌溶液

①室温解冻ER2738大肠杆菌细菌液(约10¹⁰个/ml)，将300μL细菌液加入20mL的LB培养基中，置于220rpm，37℃摇床培养4小时至OD值＝500。

②500g，4℃离心6min，沉淀大肠杆菌；沉淀用10mL的80mM NaCl水溶液轻柔地重悬细菌颗粒；

③将重悬后的溶液于摇床50rpm，37℃摇晃20min后转入50mL离心管内，500g，4℃离心6min；沉淀用1mL 4℃预冷NAP缓冲液重悬，获得大肠杆菌溶液(OD值＝500)。随后保存于4℃冰箱，等待使用。

(2)人骨肉瘤HOS细胞靶向肽的体外筛选

①人骨肉瘤HOS细胞(50×10⁶个)接种至加有10mL含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养液的10cm细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中37℃，5％CO₂培育至90％细胞密度后，向培养液中加入适量M13KE噬菌体库(约1×10¹⁰个)，37℃培育1h。

②弃培养液，向培养瓶中加入4mL 4℃预冷的洗涤缓冲液，洗涤1分钟。

③弃洗涤缓冲液，加入5ml的PBS，然后用细胞刮刮取细胞。将刮取的细胞转移至15mL离心管，200g、4℃离心10min，弃上清。加入200μL的细胞裂解液，混合均匀，获取人骨肉瘤HOS细胞亲和噬菌体液。

④在1mL人骨肉瘤细胞亲和噬菌体液中，加1mL步骤(1)制备的大肠杆菌菌液，混合均匀，室温培育15min，获得噬菌体感染的细菌。转入250mL锥形瓶，加入20mL的LB培养液，置于摇床，220rpm、37℃培养过夜，获得扩增噬菌体液。

(3)噬菌体纯化

①将20mL扩增的噬菌体液于4℃、3000g下离心10min；将透明上清液转移到另一个离心瓶中，添加6mL PEG/NaCl溶液，并在4℃下过夜，记为A液。

②A液在5000g下离心10min，沉淀噬菌体，弃上清液后，用1.5mL TBS溶液重悬，添加150μL PEG/NaCl溶液，并在4℃下放置过夜，记为B液。

③将B液于5000g、4℃离心10min；弃上清，随后加入1mL TBS溶液溶解噬菌体颗粒，获得纯化的噬菌体液。

2、人骨肉瘤HOS靶向肽的体内筛选

①裸鼠HOS细胞成瘤造模：将约10⁶个HOS细胞注射至裸鼠左侧腋窝皮下成瘤。

②至肿瘤大小约为300cm³时，尾静脉注射100μL上述步骤1-(3)-③纯化的噬菌体溶液。

③24小时后，分离肿瘤组织。

④剪碎研磨，加入10ml的PBS，用匀浆器彻底匀浆肿瘤组织。

⑤1000g，4℃，10min，离心匀浆液，取上清，弃组织沉淀物。

⑥在上清液中加入步骤1-(1)提前制备好的1mL大肠杆菌溶液，室温共培育15min，获得噬菌体感染的细菌溶液。

⑦在250mL锥形瓶中，将噬菌体感染的细菌溶液转入LB培养液中，于37℃，220rpm摇床上培养过夜，获得扩增噬菌体液。

⑧噬菌体纯化同步骤1-(3)。

3、多肽序列检测

以上体外筛选过程进行4轮后，再进行1轮体内筛选过程。将各轮纯化的噬菌体液接种至细菌培养板，37℃培养过夜后，挑选蓝色单克隆菌落测序。测序结果如表1所示，筛选获得4条亲和骨肉瘤细胞的多肽序列，其中多肽序列1：TPPRVPLLTFGS(SEQ ID NO.1)，多肽序列2：YPAAYHTLTREP(SEQ ID NO.2)，多肽序列3：DSPTSLVLRARS(SEQ ID NO.3)，多肽序列4：STLLADVRIPGS(SEQ ID NO.4)。

表1、多肽序列出现频率

实施例2、多肽序列的人骨肉瘤HOS细胞系靶向性以及特异性验证。

1、体内验证多肽对骨肉瘤组织的靶向性

①在实施例1筛选的多肽(序列1、序列2)合成过程中，每个多肽的C端添加Gly-Gly-Gly-Ser-Cys连接物。

②多肽合成后，将1mL的10mM Cy5.5-马来酰亚胺(溶于DMSO)加入到1mL的10mM多肽水溶液中，室温反应3h。使多肽的Cys与Cy5.5染料的马来酰亚胺偶联，形成Cy5.5-多肽结合物，其中序列1形成的多肽结合物记为Cy5.5-OTP，序列2形成的多肽结合物记为Cy5.5-PeptideC。同时我们合成了一条随机序列Peptide S(LTPSTRLPGFPV，SEQ ID NO.5)作为对照，与Cy5.5-马来酰亚胺结合后，记为Cy5.5-Peptide S。

③分别将200μM不同的Cy5.5-多肽结合物生理盐水溶液(Cy5.5-OTP、Cy5.5-PeptideC、Cy5.5-Peptide S)、200μM的Cy5.5-马来酰亚胺生理盐水溶液(记为Cy5.5Only)和生理盐水(Saline)各100μL，经尾静脉注射至HOS成瘤小鼠体内，24小时后在小鼠麻醉状态下通过小动物活体成像***(PerkinElmer IVIS Spectrum CT)观察多肽在肿瘤的聚集情况(图1中A)。其中肿瘤处荧光信号越强则说明多肽靶向能力越强(图1中B)。

实验结果如图1所示：多肽序列1(TPPRVPLLTFGS)以及多肽序列2(YPAAYHTLTREP)对骨肉瘤均有靶向作用，其中多肽序列1(TPPRVPLLTFGS)的靶向作用最佳，序列1在肿瘤的荧光信号强度明显大于其余多肽，表明序列1对肿瘤有很好的靶向能力。

2、验证多肽对骨肉瘤HOS细胞的亲和力特异性

由于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的效果最好，我们后续又在体外实验中验证了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列对HOS细胞的靶向性以及特异性。按步骤1方法制备序列1以及序列2的Cy5.5-多肽结合物(记为Cy5.5-OTP与Cy5.5-Peptide C)及随机序列PeptideS的多肽结合物(记为Cy5.5-Peptide S)作为对照，同时以1mM Cy5.5-马来酰亚胺的DMSO溶液为空白对照，记为Cy5.5 Only。

①将HOS细胞以每孔1.0×10⁶个细胞的量接种到24孔板(1ml含体积浓度10％胎牛血清的DMEM高糖培养基)中，37℃，5％CO₂培养至50％细胞密度。

②在37℃下用10％BSA封闭60分钟。弃封闭液，用PBS缓冲液清洗3遍。

③分别加入终浓度均为10μM的Cy5.5-OTP，Cy5.5-Peptide S，Cy5.5-Peptide C，Cy5.5 Only与HOS细胞共孵育30分钟。随后用PBS缓冲液洗涤3次后，FITC-phalloidin染1h，DAPI染5min，37℃荧光显微镜下观察，实验结果如图2所示：OTP在HOS细胞内的信号明显高于对照组多肽，表明OTP对HOS细胞有明显的亲和力。

3、验证OTP对骨肉瘤HOS细胞的结合特异性

将HOS细胞以及对照细胞HUVECs(购自中科院上海细胞库)分别接种到24孔板(每孔1.0×10⁶个细胞，1ml含体积浓度10％胎牛血清的DMEM高糖培养基)中，在37℃下用10％BSA封闭60分钟，然后分别加入步骤1制备的Cy5.5-OTP(10μM)染色30分钟。三次洗涤后，DAPI染5min，37℃荧光显微镜下观察。实验结果如图3所示：OTP在HOS细胞内聚集明显多于HUVECs细胞，表明OTP可以特异性结合HOS细胞。

综上所述，本发明多肽及其产品能够与人骨肉瘤HOS细胞靶向结合，则本发明的多肽在骨肉瘤的靶向治疗以及诊断方面具有广泛的应用前景，并可能肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌等潜在高表达与该多肽结合受体的肿瘤靶向治疗方面具有广泛的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种多肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Thr Pro Pro Arg Val Pro Leu Leu Thr Phe Gly Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Tyr Pro Ala Ala Tyr His Thr Leu Thr Arg Glu Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Asp Ser Pro Thr Ser Leu Val Leu Arg Ala Arg Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Ser Thr Leu Leu Ala Asp Val Arg Ile Pro Gly Ser

1 5 10

Claims

1.一种多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列自N端至C端为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任意一种或至少两种的组合；

SEQ ID NO.1：TPPRVPLLTFGS；

SEQ ID NO.2：YPAAYHTLTREP；

SEQ ID NO.3：DSPTSLVLRARS；

SEQ ID NO.4：STLLADVRIPGS。

2.一种DNA片段，其特征在于所述DNA片段包含权利要求1所述多肽的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于所述重组载体含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的DNA片段。

4.一种重组细胞，其特征在于所述重组细胞含有权利要求3所述重组载体。

5.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括如权利要求1所述的多肽，如权利要求2所述的DNA片段、如权利要求3所述的重组载体或如权利要求4所述的重组细胞。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

7.一种权利要求1所述多肽在制备肿瘤定位诊断试剂中的应用。

8.一种权利要求1所述多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.一种权利要求1所述多肽在制备肿瘤细胞靶向制剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞包括骨肉瘤、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌的细胞。