JP6974874B2 - ヒトpd−l1タンパク質に高親和性を有するペプチド及びその使用 - Google Patents
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Description
96ウエルELISAプレートを4℃で一晩、2μg/mlのPD−L1タンパク質でコートし、異なる濃度のFITCでラベルしたPPLCペプチドを加え、1時間インキュベーションした後、HRP結合抗FITCモノクローナル抗体を加え、1時間インキュベーションし、次に、ABTS着色溶液を加え、M5マイクロプレートリーダーでOD410数値を読み取り、GraphPad Prism 6でプロットして分析した。この結果は、PPLCがPD−L1タンパク質と極めて強い親和性を有することを立証し、解離定数が0.75μMであった(図1)。
2μg/mlのPD−L1タンパク質を4℃で96ウエルELISAプレートに一晩コートし、異なる濃度のPPLCと1μg/mlのPD−1タンパク質を混合し、インキュベーションした後、ウサギ抗ヒトPD−1のモノクローナル抗体を一次抗体とし、HRP標識のヤギ抗ウサギIGgのモノクローナル抗体を二次抗体として加え、ABTS発色した後にM5マイクロプレートリーダーでOD410を読み取り、GraphPad Prism 6でプロットして分析した。結果は、PPLCがPD−1/PD−L1の結合を効果的に阻害できることを示した(図2)。
組換えヒトPD−L1タンパク質組換えプラスミドをCHO細胞株にトランスフェクションし、36時間培養後、PD−L1タンパク質モノクローナル抗体又はFITCでラベルしたPPLCペプチドを加え、4℃で、30分間インキュベーションし、フローサイトメーターで検出を行った(図3)。プラスミドをトランスフェクションした後、36時間培養を続け、FITCでラベルしたPPLCペプチドを加え、37℃で30分間インキュベーションし、蛍光共焦点検出を行った(図4)。結果は、PPLCペプチドが細胞表面で発現されたPD−L1タンパク質と効果的に結合できることを示した(図3/図4)。
実験動物をPBS群とPPLC群に分け、6週齢の雌Balb/cに腫瘍を皮下注射し、2週間後に腫瘍が100mm3になると、PPLC薬の治療を行った。マウス腫瘍の大きさを毎日秤量し、差異を記録した。その結果は、当該ペプチドが、マウス腫瘍の成長速度を顕著に低下させ(図5)、マウスの生存時間を延長できる(図6)ことを見出した。
96ウエルELISAプレートを4℃で一晩、2μg/mlのPD−L1タンパク質でコートし、異なる濃度のFITCでラベルしたPPLCペプチドを加え、1時間インキュベーションした後、HRP結合抗FITCモノクローナル抗体を加え、1時間インキュベーションし、次に、ABTS着色溶液を加え、M5マイクロプレートリーダーでOD410数値を読み取り、GraphPad Prism 6でプロットして分析した。この結果は、PPLCがPD−L1タンパク質と極めて強い親和性を有することを立証し、解離定数が0.75μMであった。
2μg/mlのPD−L1タンパク質を4℃で96ウエルELISAプレートに一晩コートし、異なる濃度のPPLCと1μg/mlのPD−1タンパク質を混合し、インキュベーションした後、ウサギ抗ヒトPD−1のモノクローナル抗体を一次抗体とし、HRP標識のヤギ抗ウサギIGgのモノクローナル抗体を二次抗体として加え、ABTS発色した後にM5マイクロプレートリーダーでOD410を読み取り、GraphPad Prism 6でプロットして分析した。結果は、PPLCがPD−1/PD−L1の結合を効果的に阻害できることを示した。
組換えヒトPD−L1タンパク質組換えプラスミドをCHO細胞株にトランスフェクションし、36時間培養後、PD−L1タンパク質モノクローナル抗体又はFITCでラベルしたPPLCペプチドを加え、4℃で、30分間インキュベーションし、フローサイトメーターで検出を行った。プラスミドをトランスフェクションした後、36時間培養を続け、FITCでラベルしたPPLCペプチドを加え、37℃で30分間インキュベーションし、蛍光共焦点検出を行った。結果は、PPLCペプチドが細胞表面で発現されたPD−L1タンパク質と効果的に結合できることを示した。
実験動物をPBS群とPPLC群に分け、6週齢の雌Balb/cに腫瘍を皮下注射し、2週間後に腫瘍が100mm3になると、PPLC薬の治療を行った。マウス腫瘍の大きさを毎日秤量し、差異を記録した。その結果は、当該ペプチドが、マウス腫瘍の成長速度を顕著に低下させ、マウスの生存時間を延長できることを見出した。
Claims (8)
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるヒトPD−L1タンパク質に高親和性を有するペプチド。
- 請求項1に記載のPD−L1タンパク質に高親和性を有するペプチドをコードするコード遺伝子であって、
配列番号2に示されるヌクレオチド配列からなるコード遺伝子。 - コア配列として請求項1に記載のPD−L1タンパク質に高親和性を有するペプチドを含み、そのC末端、N末端又は側鎖基においてPEGによって修飾されていることを特徴とする修飾されたペプチド。
- 請求項1に記載のPD−L1タンパク質に高親和性を有するペプチドが蛍光性基で修飾され、またはアイソトープでラベル化され、或いは化学発光基又は酵素標識試薬で修飾された分子であり、PD−L1タンパク質の検出に適用可能であることを特徴とする修飾されたポリペプチド。
- 蛍光性基がFITCである、請求項4に記載の修飾されたポリペプチド。
- 請求項1に記載のヒトPD−L1タンパク質に高親和性を有するペプチドの、PD−L1タンパク質アンタゴニストを製造するための使用。
- 請求項1に記載のヒトPD−L1タンパク質に高親和性を有するペプチドの、PD−L1タンパク質発現の検出薬剤及び臨床検出試薬を製造するための使用。
- 請求項2に記載のPD−L1タンパク質に高親和性を有するペプチドのコード遺伝子の、PD−L1タンパク質のアンタゴニスト及びトレーシング・検出薬剤を製造するための使用。
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