一种检测BRCA1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测BRCA1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒,属于基因测序技术领域。
背景技术
BRCAl和BRCA2基因同为抑癌基因,参与DNA修复,维护基因组的完整。它们已经被证实是乳腺癌遗传易感基因,与家族性乳腺癌密切相关,其基因突变可以常染色体显性遗传方式传递给子代。携带着BRCA1/BRCA2基因突变的人其一生中患乳腺癌,卵巢癌危险显著增加,到70岁时发生乳腺癌的预测累积风险可达到大约80%;同时容易早年发病。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,其中家族聚集性病例约占5~10%。对BRCA基因进行检测,寻找其致病突变位点,可帮助筛选出高危人群,有助于风险评估和早期诊断;同时也可为未来的高危人群基因筛查和基因诊断提供基本突变谱资料和检测策略。
由于BRCA1和BRCA2基因的突变对家族性乳腺癌、卵巢癌的发生有一定的联系,所以检测BRCA1和BRCA2的突变基因对相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的临床意义。另外,由于BRCA1和BRCA2的突变众多,检测这些突变对于相关基因的研究十分有意义,例如对于基因多态性分析和家族进化史研究。
目前,Sanger测序技术作为主要的基因测序工具,对生命科学做出了巨大贡献。目前它仍在PCR产物、质粒、细菌人工染色体的末端检测、基因分型方面发挥重要作用。随着对人类基因组测序的需求越来越高,面对大量的DNA信息需要更为高效、高通量、低成本的DNA测序技术,而Sanger测序仪,如目前应用广泛的3730xlDNA测序仪,由于对电泳分离技术的依赖,很难进一步提升分离速度,难以实现微型化反应,因此已经无法大幅度降低测序费用和提高检测通量。
也有已公开专利使用PCR方法来检测乳腺癌易感基因突变,例如专利“检测乳腺癌易感基因突变的多重PCR试剂盒及其制备方法”(CN101200766A)。但是,该专利所用的多重PCR仅限定在BRCA1和BRCA2基因部分外显子上的部分突变位点上,而这明显不能覆盖BRCA1和BRCA2基因遍布在多个外显子上的上百种突变,因此该专利在使用上有较大局限。
发明内容
本发明的目的是:提供一种用于检测BRCA1/2基因序列的探针库,利用本发明的探针库可以较好地与BRCA1/2基因进行杂交捕获,应用于二代测序过程中,能够具有高覆盖率、测序深度均一性好的优点。
本发明的第一个方面:
一种检测BRCA1/2基因突变的探针库,其中包括有核苷酸序列如SEQ ID NO. 1~162所示的任意一条探针,或者与其具有相同功能的探针。
优选的:探针库中包括上述的全部探针。
优选的:所述的具有相同功能的探针,是指将SEQ ID NO. 1~162任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。
优选的:所述的具有相同功能的探针与原探针具有80%以上相同的碱基,更优选是90%以上相同碱基,再优选是95%以上相同碱基。
本发明的第二个方面:
本发明提供一种富集BRCA1/2基因片段的方法,所述方法包括以下步骤:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)获得所述的检测BRCA1/2基因突变的探针;
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交;和
4)分离步骤3)的杂交产物,然后释放经杂交富集的BRCA1/2基因DNA片段。
其中,所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成,并且,所述步骤1)包括:
1-1)提取全基因组DNA,然后将其片段化;或者
1-2)提取mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA;
其中,所述受试者为哺乳动物,优选人,且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA;
优选地,所述DNA片段的长度为150~600bp;
进一步优选地,所述DNA片段的长度为150~200bp。
所述步骤2)中的DNA探针库为如上所述的DNA探针库。具体而言,所述DNA探针库包括一个或多个能够与BRCA1/2基因片段杂交的DNA探针,所述DNA探针如以下序列所示:SEQID NO. 1~162。
此外,所述步骤3)包括:
3-1)采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针;和
3-2)使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交;
优选地,所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素;进一步优选地,所述步骤3-2)包括在PCR扩增仪中,在65℃下将所述DNA探针库与DNA样本库孵育24小时。
因此,所述方法的步骤4)中,优选利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物。进一步优选地,所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素,所述步骤4)中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。
本发明的第三个方面:
本发明还提供一种检测BRCA1/2基因突变的方法,所述方法包括以下步骤:
1)根据上述方法富集BRCA1/2基因的DNA片段;和
2)检测所述BRCA1/2基因的突变。
优选地,所述步骤2)中采用下一代测序技术,通过对富集到的BRCA1/2基因片段进行测序而检测所述BRCA1/2基因片段的突变。
本发明的第四个方面:
本发明提供一种用于检测BRCA1/2基因突变的试剂盒,所述试剂盒包含上述的DNA探针库。
本发明的第五个方面:
上述的试剂盒在用于非治疗与诊断目的的BRCA1/2基因突变测序中的应用。
有益效果
本发明开发了基于杂交选择而捕获特定BRCA1/2基因序列的方法,采用该方法可以获得成几千倍富集的BRCA1/2基因DNA片段,该经富集的BRCA1/2基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术,特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测,以取得高效且准确的结果,对相关症状的后续治疗提供有意义的理论及临床指导。
并且,对于将通过本发明的方法富集得到的BRCA1/2基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言,还具有以下有益效果:
使用本发明的基因富集方法及筛选得到的特定DNA探针库,能够成数千倍地富集BRCA1/2基因片段,从而可以应用下一代测序技术、利用该BRCA1/2基因片段的测序,而准确地获得BRCA1/2基因的各种突变。并且,由于采用下一代测序技术,因此能够一次性检测多个基因的多种类型基因突变;准确性高,传统技术例如基因芯片技术,通常需要重复两次以上才能确定检测结果,而本发明在一次反应中,对单个碱基进行反复测序,保证了数据的精准度,并且缩短了检测周期;敏感性高,本发明提供的方法和试剂盒能够有效地使对于低突变丰度样本的检测灵敏性得到提高,和传统检测技术相比,本发明产生的数据能够达到碱基级的分辨率。
附图说明
图1为本发明技术方案的示例性工艺流程图,其中富集得到目标基因群,并用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测。
图2为本发明的重复区域探针设计示意图。
图3为本发明的外显子临近内含子探针设计示意图。
图4是重复区域探针设计与传统探针设计测序结果对比图。
图5是外显子临近内含子设计与传统探针设计测序结果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
在本文中所使用的术语”DNA”为脱氧核糖核酸(英文:Deoxyribonucleicacid,缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令,引导生物发育与生命机能运行,其碱基排列顺序构成了遗传信息,所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展,本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例,可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。高通量测序技术,例如Miseq测序技术具有以下优势:(1)高灵敏度:高通量测序,例如Miseq的测序通量大,目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据,高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下,使得每条序列获得高的测序深度,所以可以检测到含量更低的突变,同时因其测序深度高,其测序结果也更为可靠。(2)高通量,低成本:利用根据本发明实施例的标签序列,通过一次测序可以检测上万份样本,从而大大降低了成本。
本发明中的“突变”、“核酸变异”、“基因变异”可通用,本发明中的“SNP”(SNV)、“CNV”、“***缺失”(indel)和“结构变异”(SV)同通常定义,但本发明中对各种变异的大小不作特别限定,这样这几种变异之间有的有交叉,比如当***/缺失的为大片段甚至整条染色体时,也属于发生拷贝数变异(CNV)或是染色体非整倍性,也属于SV。这些类型变异的大小交叉并不妨碍本领域人员通过上述描述执行实现本发明的方法和/或装置并且达到所描述的结果。
本发明提供一种富集BRCA1/2基因片段的方法。具体而言,本发明的方法包括:从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA,经处理或合成cDNA,从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库;此外,针对要富集的BRCA1/2基因片段,设计与该BRCA1/2基因杂交的DNA探针,从中筛选出多个探针作为DNA探针库;然后,将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交,从而从DNA样本库中富集得到BRCA1/2基因DNA片段。根据本发明的具体实施方式,可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化,然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物,再从磁珠上释放出富集的BRCA1/2基因片段。经适应性处理,可以采用下一代测序基因对BRCA1/2基因片段进行基因结构突变的检测,以确认BRCA1/2基因的各类突变。
下面以富集得到的BRCA1/2基因片段用于基于下一代测序技术的基因突变检测为例,示例性地说明本发明。
一、准备mRNA/DNA样本库
1. 准备基因组DNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1 DNA提取
DNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2 DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书,将DNA片段化,片段长度为150~200碱基。
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
1.3 DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
2. 准备cDNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1 mRNA提取
mRNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测mRNA质量和浓度,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2 mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation***或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
2.3 用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
3. cDNA/DNA末端修补
将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行,其中,所述Klenow片段具有5’-3’’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性,但缺少5’-3’外切酶活性。由此,能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例,还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤,由此能够方便地进行后续处理。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
4. 在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A
在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A,以便获得具有粘性末端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例,可以利用Klenow(3’-5’exo-),即具有3’-5’外切酶活性的Klenow,在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此,能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。根据本发明的实施例,还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤,由此能够方便地进行后续处理。
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
5. 在cDNA/DNA两端加上接头
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
如使用mRNA→cDNA,进行6和7;
如果是用基因组DNA,直接跳到8。
6. 分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶,对照DNA梯度标准,在凝胶上剪切出150-250碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
7. cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
8. 扩增DNA模板
在本发明的一个实施例中,样本为含微量游离DNA片段的血浆样本,包含极其微量的目标游离DNA片段,第一扩增使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
9. 扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA/DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。
对于得到的cDNA/DNA样本库,如果cDNA小于30纳克/微升,DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、探针的设计
针对BRCA1/2基因准备DNA探针库。
本领域技术人员知晓:捕获的特异性受各种因素影响,如捕获探针的设计不佳,捕获条件不理想,基因组DNA中重复序列的封闭不充分及基因组DNA与捕获探针的比例不合适等因素都会影响捕获的特异性、敏感性、测序覆盖率等诸多结果。为了实现目标基因的高度富集和低脱靶率,本领域技术人员需要对探针的类型、长度、序列、杂交条件等进行大量实验摸索,需要通过创造性的探索工作才能够获得最佳的参数组合,没有在相应的证据证明下,其是否能够达到相同的效果,是本领域技术人员无法预期的。同时,对于产生突变的样本进行检测时,由于突变样本在组织样本中所占的比例会因个体而不同,因此,如果突变样本的丰度较低时,较容易导致的问题是探针往往无法准确地与突变的片断杂交,而导致检测的灵敏度低,这也需要对探针序列进行试验进行摸索。
另外,探针捕获测序中探针的特异性和均一性与捕获后的测序质量密切相关:探针特异性过低可导致捕获大量无效区域,大量非目标区域的DNA序列被捕获测序,产生大量无效测序数据,浪费测序成本,而探针特异性过高可导致杂交错配容忍度低,在捕获测序中我们需要研究目标DNA片段中发生的突变、***/缺失、融合等突变类型,对探针的杂交错配容忍度有一定要求,杂交错配容忍度低可能导致突变后的DNA序列无法捕获,导致突变漏检,导致假阴性结果;探针均一性差可导致不同区域DNA序列捕获效果差异显著,部分目标区域捕获效果较好,具有合格甚至过度的测序覆盖,部分目标区域捕获效果较差,测序覆盖较浅甚至不覆盖,引起部分区域漏检,导致假阴性结果。因此在探针设计过程中需要开展大量摸索试验,设计出特异性适中以及高度均一性的探针库。
探针特异性和均一性受多种因素影响,其中有些因素是所有基因探针设计中涉及的共同问题,包括探针长度、探针GC含量、探针overlap区域、杂交条件等因素。探针长度与探针特异性相关,在一定范围内探针长度越长探针特异性越高,探针长度太短可能导致无法将DNA片段捕获;探针GC含量与探针覆盖均一性相关,探针GC含量过高或差异过于显著,可能导致不同探针结合效率存在显著差异,导致捕获序列不均一;相邻探针间的overlap与探针覆盖均一性相关,探针与探针间不存在overlap的情况,探针间的Gap区域仅依靠探针的连带捕获效应覆盖,可能导致Gap区域覆盖度偏低,影响探针覆盖均一性;杂交条件与探针GC含量高度相关,不同的杂交条件可能导致探针结合效率存在差异,从而影响探针覆盖均一性。BRCA1/2探针设计综合参考了多次摸索试验结果以及本单位前期研究成果,采用了120 bp长度的DNA探针,绝大部分探针与探针间存在5 bp以上的overlap,所有探针GC含量控制在40-55%范围内,在一定程度上保证了探针合适的特异性和高度的均一性。
除了所有基因探针设计涉及共性因素外,BRCA1/2基因自身的特征同样可能对探针的特异性和均一性。BRCA/2基因属于人类基因组中编码区较长的基因,其中BRCA1基因编码区超过5KB编码1884个氨基酸,BRCA2基因编码区超过10KB编码3418个氨基酸;此外BRCA1/2基因均属于抑癌基因,在基因全长中任一位点发生突变均可能导致BRCA1/2基因失活,影响基因功能,甚至在临近外显子的内含子区域发生突变,同样可能通过影响外显子剪切影响BRCA1/2基因功能。上述BRCA1/2基因自身特征造成了长编码区和内含子区中富含大量重复区域,以及外显子临近内含子区域探针覆盖问题,影响探针捕获的效率。
BRCA1/2基因长编码区以及内含子区域内涉及的大量重复区域可能导致重复区域探针结合较差,同时重复区域在基因组中特异性较差,影响探针捕获效率。针对这个问题,本专利设计了专门的探针覆盖策略,具体形式见图2,重复区域内部不设计覆盖探针,在重复区域边缘设计多重探针,通过多重探针连带效应,捕获重复区域DNA序列,保证重复区域的覆盖深度,同时保证探针的捕获特异性。
BRCA1/2基因外显子临近内含子区域突变可能具有重要临床意义,传统探针覆盖方法通过外显子边缘探针的连带效应覆盖少量内含子区域,可能由于覆盖深度较低而造成大量剪切突变漏检。本专利中探针设计策略见图3,探针直接覆盖50-100 bp的外显子临近内含子区域,进一步通过连带效应覆盖更多内含子区域,确保外显子临近内含子区域的有效覆盖。
使用每个探针分别对全基因组进行了富集和扩增并根据结果进行筛选。通过IDTDNA Technologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,在5’端有生物素(Biotin)。
三、DNA捕获探针杂交
1. 将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合,反应条件为95℃ 5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合,反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的BRCA1/2基因片段
1. 准备链霉亲和素(Streptavidin-Coated)磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀,每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液,在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2. 分离杂交产物
混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液,在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3. cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的BRCA1/2基因片段cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
五、PCR扩增与纯化
因杂交捕获会损耗一定量的核酸,第二扩增能使捕获下的目标片段获得再次扩增以满足上机测序和质控检测的要求。本发明的这一文库构建方法特别适用于总游离核酸不低于10ng或者常规组织基因组DNA不低于1μg的样本的测序文库构建。
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
六、采用下一代测序技术检测BRCA1/2基因的突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序,如Roche 454、Illumina Hiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
示例性地,使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序***。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后,对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射,利用Bioconductor软件,成功映射片段进行突变分析。
实施例1 富集并检测BRCA1/2基因
一、构建样本库
1. DNA的提取
按照常规的组织样本的DNA提取方法提取样本DNA。
2. DNA片段化
按照DNA破碎仪使用说明书,将DNA样本片段化,使片段长度为150-200碱基。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将DNA过柱纯化。
3. DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
4. DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
5. 在DNA样本3'末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
6. 在DNA两端加上接头
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
7. 扩增6获得的DNA片段样本库
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4~6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
8. 扩增后DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪,进行DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。
对于得到的DNA样本库,如果DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、针对BRCA1/2基因准备DNA探针库
根据上述的探针设计方法和思路,设计并合成探针进行试验,在5’端有生物素(Biotin)。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液(10mM Tris-HCl, 2%牛血清白蛋白, pH8.0)混合(混合后,DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul),反应条件为95℃ 5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库:探针库为1:100的摩尔比,将探针库加入上述混合物,反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的BRCA1/2基因片段
1. 准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads(Life technologies, 货号:11206D)链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液(10mM Tris-HCl, 2%牛血清白蛋白, pH8.0),在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2. 分离杂交产物
混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液(磷酸缓冲液,0.1% Tween-20, 0.1% SDS,pH7.4),在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3. DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液(10mM氢氧化钠溶液)混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的BRCA1/2基因片段DNA样本库。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将样本库过柱纯化。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测BRCA1/2基因的基因结构突变
使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序***,其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
根据以上方法,采用不同探针进行测试结果如下:
一、不同探针长度检测数据对比
探针长度与探针特异性密切相关,因此我们设计了5种长度的探针,长度分别为80bp、100bp、120bp、140bp、160bp,使用上述探针捕获后进行NGS测序,测序后对数据进行质控,评估捕获序列ontarget率以及目标区域的覆盖率,ontarget率是指位于目标区域的序列在总测序序列中的占比,覆盖率是指目标区域的覆盖情况,具体质控结果见下表:
长度为120bp的探针相比80 bp和100 bp长度探针ontarget率以及目标区域覆盖率均显著提高,进一步加长至140bp以及160bp并未显著提升ontarget率以及目标区域覆盖率,但长探针合成效率显著降低,合成成本较高,因此选用120 bp长度探针。
二、不同GC含量探针对比
探针中GC含量与探针的结合能力高度相关,GC含量过高可能导致大量非特异性结合,因此我们对比分析了未经GC含量优化的探针、优化后GC含量控制在30-65%的探针和优化后GC含量控制在40-55%的探针,捕获后进行NGS检测,质控结果见下表:
GC含量控制在40-55%的探针显著优于GC含量未优化或GC含量30-65%的探针。
三、不同探针overlap长度对比
相邻探针间的相连方式可能与探针覆盖均一性相关,因此我们设计了三种相连形式,分别为10bp gap、5bp overlap和20bp overlap,捕获后进行NGS测序,质控结果如下:
相邻探针间存在5bp overlap相比于10bp gap时50%覆盖率显著升高,与20bpoverlap无显著差异。
四、重复区域常规覆盖与优化覆盖方式对比
重复区域在人类基因组中特异性较差,因此我们设计了特殊的覆盖形式,与传统覆盖形式(在重复区域上也均匀地设计了覆盖的探针)相比,重复区域(位置约在BRCA2基因全长329123000-32912400bp左右)捕获后测序结果见图4,上图为采用本专利优化技术设计的探针捕获后的测序结果,下图为采用传统探针捕获后的测序结果,优化后的探针设计对于重复区域覆盖显著优于传统探针设计。在重复区域内存在一个点突变,采用优化后的探针覆盖该位点测序深度为1532X,突变丰度为36%,采用传统探针覆盖该位点测序深度仅为131X,突变丰度为89%,存在较大偏差。
五、外显子临近内含子传统覆盖和优化覆盖方式对比
剪切相关内含子突变在BRCA1/2基因检测中至关重要,因此我们针对外显子临近内含子区域(约在BRCA1基因全长41243000-41243400bp区域范围)进行了特定探针设计,与传统探针设计(不在外显子临近内含子的区域内设计探针)相比,内含子区域捕获结果见图5,上图是传统探针覆盖内含子区域捕获结果,下图为优化后覆盖外显子临近内含子后内含子区域的捕获结果。优化后的探针内含子区域捕获效果显著优于传统探针。
六、检测灵敏度的验证
针对BRCA1的c.4065_4068del突变构建了突变型和野生型的质粒,按照突变型在野生型中拷贝数比例混合而不同丰度的样品,采用上述的探针库进行捕获、测序考察灵敏性,将采用将SEQ ID NO.163-164的探针作为SEQ ID NO.162探针的对照,考察检测灵敏度,每个样本重复测试3次,结果如下:
从表中可以看出,本发明提供的检测探针库和检测方法能够对低丰度的样本也具有较好的检测灵敏度,能够达到0.5%左右的检测灵敏度水平。
采用优化后的探针库对101例乳腺癌和卵巢癌患者白细胞样本和肿瘤组织样本进行BRCA1/2基因突变检测,其中乳腺癌患者76例,卵巢癌患者25例,肿瘤组织与白细胞样本均检出检测结果见下表:其中乳腺癌患者检出突变17例(22%),卵巢癌患者检出突变6例(24%); 外显子区域突变20例,内含子区域突变3例;点突变9例,缺失***突变13例,融合突变1例。
从上表中可以看出,本发明提供的检测探针库和检测方法能够较好地对BRCA1/2的全外显子区域进行检测。另外,经过DNA提取、PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
序列表
<110> 南京世和基因生物技术有限公司
<120> 一种检测BRCA1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒
<130> none
<160> 164
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaatttcaa gtaaccttgt ctttctttac ctaaatagac gagaagcgca acttcttcat 60
gttttacagt aattacgata cgtcttttag aatctcacag ggtagaccat tcagtcgtgt 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaagaaaaag agggggggat gggacgatca gacctcaact agttccttgg acagaggtgt 60
ttcacactgg tgtataaaac gttcattcaa acttacacaa tacaccgagg taataatcga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctaaaacgt acgactttga agagttggtc ttctttcccg gaagtgtcac aggaaataca 60
ttcttactat attggttttc catatattaa accattacta cgatccaacc ttcgttggtg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaaattaaa gtcctcggat gttctttcat gctctaaatc agttgaacaa cttctcgata 60
acttttagta aacacgaaaa gtcgaactgt gtccaaacct cacattcaca acttataggg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacgtttgta ttacaaaagg gaacataaaa tgtctacgtt tgtcgatatt aaaacgtttt 60
ttccttttat tgagaggact tgtagatttt ctacttcaaa gatagtaggt ttcatacccg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gattttctac ttcaaagata gtaggtttca tacccgatgt ctttggcacg gttttctgaa 60
gatgtctcac ttgggctttt aggaaggaac cattttggta aacaaaagaa gaagaagaag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgacaaatcg tcctttggtc agagtcacag gttgagagat tggaaccttg acactcttga 60
gactcctgtt tcgtcgccta tgttggagtt ttctgcagac agatgtaact taacccattc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aataaaaaac ccccctttaa aaaatcctag actaagaaga cttctatggc aattattccg 60
ttgaataacg tccactcagt ttctcttgga aacagatact tcgaccataa aaggataaat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagggatat cacaccctct agttcttaac aatgtttagt ggggagttcc ttggtcccta 60
ctttagtcaa acctaagacg ttttttccca ttaccgtttc aaacggttga attgtccgtg 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaaacatat aaaagtcgac gaacacttaa aagactctgc ctacattgtt tatgacttgt 60
agtagttggg tcattattac taaacttgtg gtgactcttc gcacgtcgac tctccgtagg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taggtctttt catagtccca tcaagacaaa gtttgaacgt acacctcggt acaccgtgtt 60
tatgagtacg gtcgagtaat gtcgtactct tgtcgtcaaa taatgagtga tttctgtctt 120
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtcttactt acatcttttc cgacttaaga cattattttc gtttgtcgga ccgaatcgtt 60
cctcggttgt attgtctacc cgaccttcat tcctttgtac attactatcc gcctgagggt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtcgtgtct ttttttccat ctagacttac gactagggga cacactctct tttcttacct 60
tattcgtctt tgacggtacg agtctcttag gatctctatg acttctacaa ggaacctatt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acctattgtg atttatcgtc gtaagtcttt caattactca ccaaaaggtc ttcactactt 60
gacaatccaa gactactgag tgtactaccc ctcagactta gtttacggtt tcatcgacta 120
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
actacataac ctgcaagatt tactccatct acttataaga ccaagaagtc tcttttatct 60
gaatgaccgg tcactaggag tactccgaaa ttatacattt tcactttctc aagtgaggtt 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtttagtca tctctcatta taacttctgt tttataaacc cttttggata gccttcttcc 60
gttcggaggg gttgaattcg gtacattgac ttttagatta atatcctcgt aaacaatgac 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgactcggtg tctattatgt tctcgcaggg gagtgtttat ttaatttcgc attttcctct 60
ggatgtagtc cggaagtagg actcctaaaa tagttctttc gtctaaaccg tcaagttttc 120
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tttctgagga ctttactatt tagtcccttg attggtttgc ctcgtcttac cagttcacta 60
cttataatga ttatcaccag tactcttatt ttgttttcca ctaagataag tcttactctt 120
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tctttttagg attgggttat cttagtgagc tttttcttag acgaaagttt tgctttcgac 60
ttggatattc gtcgtcatat tcgttatacc ttgagcttaa tttataggtg ttaagttttc 120
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tttcgtggat ttttcttatc cgactcctcc ttcagaagat ggtccgtata agtacgcgaa 60
cttgatcatc agtcatcttt agattcgggt ggattaacat gacttaacgt ttaactatca 120
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atcaacaaga tcgtcacttc tctatttctt ttttttcatg ttggtttacg gtcagtccgt 60
gtcgtctttg gatgttgagt accttccatt tcttggacgt tgacctcggt tcttctcatt 120
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cattgttcgg tttacttgtc tgttcatttt ctgtactgtc gctatgaaag ggtctcgact 60
tcaattgttt acgtggacca agaaaatgat tcacaagttt atggtcactt gaatttctta 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cttaaacagt taggatcgga aggttctctt ctttttcttc tctttgatct ttgtcaattt 60
cacagattat tacgacttct ggggtttcta gagtacaatt cacctctttc ccaaaacgtt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtttgactt tctagacatc tctcatcgtc ataaagtaac catggaccat gactaatacc 60
gtgagtcctt tcatagagca atgaccttca atcgtgagat cccttccgtt tttgtcttgg 120
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttggtttat ttacacactc agtcacacgt cgtaaacttt tggggttccc tgattaagta 60
ccaacaaggt ttctattatc tttactgtgt cttccgaaat tcataggtaa ccctgtactt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acttcaattg gtgtcagccc tttgttcgta tctttacctt ctttcacttg aactacgagt 60
cataaacgtc ttatgtaagt tccaaagttt cgcggtcagt aaacgaggca aaagtttagg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
taggtccttt acgtcttctc cttacacgtt gtaagagacg ggtgagaccc aggaatttct 60
ttgtttcagg ttttcagtga aaacttacac ttgttttcct tcttttagtt cctttcttac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tactcagatt atagttcgga catgtctgtc aattatagtg acgtccgaaa ggacaccaac 60
cagtctttct attcggtcaa ctattacggt ttacatcata gtttcctccg agatccaaaa 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccaaaacaga tagtagagtc aagtctccgt tgctttgacc tgagtaatga ggtttatttg 60
tacctgaaaa tgttttgggt atagcatatg gtggtgaaaa agggtagttc agtaaacaat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caattttgat ttacattctt tttagacgat ctccttttga aactccttgt aagttacagt 60
ggactttctc tttacccttt actcttgtaa ggttcatgtc actcgtgtta atcggcatta 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cggcattatt gtaatctctt ttacaaaaat ttcttcggtc gagttcgtta taattacttc 60
atccaaggtc atgattactt cacccgaggt cataattact ttatccaagg tcactacttt 120
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttttgtaag ttcgtcttga tccatctttg tctcccggtt ttaacttacg atacgaatct 60
aatccccaaa acgttggact ccagatattt gtttcagaag gaccttcatt aacattcgta 120
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgtaggactt tattttttcg ttcttatact tcttcatcaa gtctgacaat tatgtctaaa 60
gagaggtata gactaaagtc tattgaatct tgtcggatac ccttcatcag tacgtagagt 120
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gagtccaaac aagactctgt ggactactgg acaatctact accactttat ttccttctat 60
gatcaaaacg acttttactg taattccttt caagacgaca aaaatcgttt tcgcaggtct 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtctttcctc tcgaatcgtc ctcaggatcg ggaaagtggg tatgtgtaaa ccgagtccca 60
atggcttctc cccggttctt taatctcagg agtcttctct tgaatagatc actcctactt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acttctcgaa gggacgaagg ttgtgaacaa taaaccattt catttgttat atggaagagt 60
cagatgatcc gtatcgtggc aacgatggct cacagacaga ttcttgtgtc tcctcttaaa 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
taaataatag taacttctta tcgaatttac tgacgtcatt ggtccattat aaccgtttcc 60
gtagagtcct tgtagtggaa tcactccttt gttttacaag acgatcgaac aaaagaagtg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaagaagtg tcacgtcact taaccttctg aactgacgtt tatgtttgtg ggtcctagga 60
aagaactaac caagaaggtt tgtttactcc gtagtcagac tttcggtccc tcaaccagaa 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cagactcact gttccttaac caaagtctac tacttctttc tccttgcccg aaccttcttt 60
tattagttct tctcgtttcg tacctaagtt tgaatccata accttggtcc aaaaacacaa 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaaacaata aattccactt cgtcgtagac ccacactctc actttgttcg cagagacttc 60
tgacgagtcc cgataggaga gtctcactgt aaaattggtg agtccatttt tcgcacacac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taaaagaacc acggtaaata gcaaaaactt cgtctcccta tggtacgttg tattggacta 60
tttcgaggtc gtcctttacc gacttgatct tcgacacaat cttgtcgtac cctcggtcgg 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcggaagat tgtcgatggg aaggtagtat tcactgagaa gacgggaact cctggacgct 60
ttaggtcttg tttcgtgtag tctttttcca cacataacaa ccggtttgtg actatagaat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
caagggaact acagatgtta aagtggaaag aatgtctaag cgtatatgta ccggtttcct 60
tgttgaggta caaaagattt tccggatctc ttgtatatag tccacggaga ggagaaaggg 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
atttcatcta aacaaaagag taaggtaaat ttcgtcataa ttgaagtgtc ttttcatcac 60
ttatgggata ttcggtctta ggtcttccgg aaagacgact gttcaaactc cacagacgtc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccggaaagac gactgttcaa actccacaga cgtctatcaa gatggtcatt tttatttctt 60
ggtcctcacc tttccattct ttgtagttac atttctacga caccatagac tgtagaaata 120
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<212> DNA
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<400> 46
gtaaatagaa agatccagta ggggaagatt tacgggtagt aatctactat ccaccatgta 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtaattcc aacaactaca cctcctcgtt gtcgaccttc tcagacccgg tgtgctaaac 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atttaatttg aagagggtaa ggaaagtctc ccttggggaa tggaccttag accttagtcg 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcacaaccgt tgtatggtag aagttggaga cgtaactttc aaggggttaa ctttcaacgt 60
cttagacggg tctcaggtcg acgacgagta tgatgactat gacgacccat attacgttac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
taccttcttt cacactcgtc cctcttcggt cttaactgtc gaagttgtct ttcccagttg 60
ttttcttaca ggtaccacca cagaccggac tggggtcttc ttaaacactc acataggtat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacgagcac atgttcaaac ggtcttttgt ggtgtagtga aattgattag attaatgact 60
tctctgatga gtacaacaat acttttgtcc atatggttct tggaaatgtc ttatggaacg 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtaagacgtc tacgactcaa acacacactt gcctgtgact ttataaaaga tccttaacgc 60
cctcctttta cccatcaatc gataaagaca ttcatattat gataaagagg ggaggaggga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatacattg gacagaaaag atactagaga aatccccact gggtcagata atttctttct 60
ttttacgact tactccattc atgaactaca atgtttgatt ggtctctata agtaagtcag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aaagaaagtc gtactaaaac ttcagtctcc tctacaccag ttaccttctt tggtggttcc 60
aggtttcgct cgttctctta gggtcctgtc tttccatttc gagggaggga gttcaactgt 120
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gtaaggggac agggagagag aaggagagaa gaaggtctag aagtcccccg atctttagac 60
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<400> 56
taaaatctag ttgaccttac ctaccatgtc gacacaccac gaagacacca cttcctcgaa 60
agtagtaagt gggaaccgtg tcattcataa cccacgggac agtctctccc tcctgtgtta 120
<210> 57
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aaacttacga gaaaggaagg acccctaggt cccacaggtg ggttaacacc aacacgtcgg 60
tctacggacc tgtctcctgt taccgaaggt accattccac ggacgtacat ggacacgata 120
<210> 58
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttaacccgtc tacacactcc gtggacacca ctgggctctc acccacaacc tgtcacatcg 60
tgagatggtc acggtcctcg acctgtggat ggactatggg gtctaggggg tgtcggtgat 120
<210> 59
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tatcgtaggt aaaaatgcct gcattggatc caaagagagg ccaacatttt ttgaaatttt 60
taagacacgc tgcaacaaag caggtattga caaattttat ataactttat aaattacacc 120
<210> 60
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
taggaccaat aagtcttaat tggtttgaag aactttcttc agaagctcca ccctataatt 60
ctgaacctgc agaagaatct gaacataaaa acaacaatta cgaaccaaac ctatttaaaa 120
<210> 61
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ccacaaagga aaccatctta taatcagctg gcttcaactc caataatatt caaagagcaa 60
gggctgactc tgccgctgta ccaatctcct gtaaaagaat tagataaatt caaattagac 120
<210> 62
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tttaggaagg aatgttccca atagtagaca taaaagtctt cgcacagtga aaactaaaat 60
ggatcaagca gatgatgttt cctgtccact tctaaattct tgtcttagtg aaaggtatga 120
<210> 63
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acctaaggga tttgctttgt tttattttag tcctgttgtt ctacaatgta cacatgtaac 60
accacaaaga gataagtcag gtatgattaa aaacaatgct ttttattctt agaatactag 120
<210> 64
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
aacaattttc cccttttttt acccccagtg gtatgtggga gtttgtttca tacaccaaag 60
tttgtgaagg taaatattct acctggttta tttttatgac ttagtaattg agaatttgac 120
<210> 65
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ggtcgtcaga caccaaaaca tatttctgaa agtctaggag ctgaggtgga tcctgatatg 60
tcttggtcaa gttctttagc tacaccaccc acccttagtt ctactgtgct cataggtaat 120
<210> 66
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
acaatacaca taaattttta tcttacagtc agaaatgaag aagcatctga aactgtattt 60
cctcatgata ctactgctgt aagtaaatat gacattgatt agactgttga aattgctaac 120
<210> 67
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gcagaatgtg aaaagctatt tttccaatca tgatgaaagt ctgaagaaaa atgatagatt 60
tatcgcttct gtgacagaca gtgaaaacac aaatcaaaga gaagctgcaa gtcatggtaa 120
<210> 68
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
caggatttgg aaaaacatca gggaattcat ttaaagtaaa tagctgcaaa gaccacattg 60
gaaagtcaat gccaaatgtc ctagaagatg aagtatatga aacagttgta gatacctctg 120
<210> 69
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cctctgaaga agatagtttt tcattatgtt tttctaaatg tagaacaaaa aatctacaaa 60
aagtaagaac tagcaagact aggaaaaaaa ttttccatga agcaaacgct gatgaatgtg 120
<210> 70
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gtgaaaaatc taaaaaccaa gtgaaagaaa aatactcatt tgtatctgaa gtggaaccaa 60
atgatactga tccattagat tcaaatgtag caaatcagaa gccctttgag agtggaagtg 120
<210> 71
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
agtgacaaaa tctccaagga agttgtaccg tctttggcct gtgaatggtc tcaactaacc 60
ctttcaggtc taaatggagc ccagatggag aaaatacccc tattgcatat ttcttcatgt 120
<210> 72
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atgtgaccaa aatatttcag aaaaagacct attagacaca gagaacaaaa gaaagaaaga 60
ttttcttact tcagagaatt ctttgccacg tatttctagc ctaccaaaat cagagaagcc 120
<210> 73
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
agccattaaa tgaggaaaca gtggtaaata agagagatga agagcagcat cttgaatctc 60
atacagactg cattcttgca gtaaagcagg caatatctgg aacttctcca gtggcttctt 120
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tcttcatttc agggtatcaa aaagtctata ttcagaataa gagaatcacc taaagagact 60
ttcaatgcaa gtttttcagg tcatatgact gatccaaact ttaaaaaaga aactgaagcc 120
<210> 75
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
agcctctgaa agtggactgg aaatacatac tgtttgctca cagaaggagg actccttatg 60
tccaaattta attgataatg gaagctggcc agccaccacc acacagaatt ctgtagcttt 120
<210> 76
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
cagaatctgt agctttgaag aatgcaggtt taatatccac tttgaaaaag aaaacaaata 60
agtttattta tgctatacat gatgaaacat cttataaagg aaaaaaaata ccgaaagacc 120
<210> 77
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gaccaaaaat cagaactaat taactgttca gcccagtttg aagcaaatgc ttttgaagca 60
ccacttacat ttgcaaatgc tgattcaggt acctctgtct tttttttttt gtaaatagta 120
<210> 78
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggtttattgc attcttctgt gaaaagaagc tgttcacaga atgattctga agaaccaact 60
ttgtccttaa ctagctcttt tgggacaatt ctgaggaaat gttctagaaa tgaaacatgt 120
<210> 79
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
atgttctaat aatacagtaa tctctcagga tcttgattat aaagaagcaa aatgtaataa 60
ggaaaaacta cagttattta ttaccccaga agctgattct ctgtcatgcc tgcaggaagg 120
<210> 80
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
aaggacagtg tgaaaatgat ccaaaaagca aaaaagtttc agatataaaa gaagaggtct 60
tggctgcagc atgtcaccca gtacaacatt caaaagtgga atacagtgat actgactttc 120
<210> 81
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tttcaatccc agaaaagtct tttatatgat catgaaaatg ccagcactct tattttaact 60
cctacttcca aggatgttct gtcaaaccta gtcatgattt ctagaggcaa agaatcatac 120
<210> 82
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
atacaaaatg tcagacaagc tcaaaggtaa caattatgaa tctgatgttg aattaaccaa 60
aaatattccc atggaaaaga atcaagatgt atgtgcttta aatgaaaatt ataaaaacgt 120
<210> 83
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acgttgagct gttgccacct gaaaaataca tgagagtagc atcaccttca agaaaggtac 60
aattcaacca aaacacaaat ctaagagtaa tccaaaaaaa tcaagaagaa actacttcaa 120
<210> 84
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tcaatttcaa aaataactgt caatccagac tctgaagaac ttttctcaga caatgagaat 60
aattttgtct tccaagtagc taatgaaagg aataatcttg ctttaggaaa tactaaggaa 120
<210> 85
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ggaacttcat gaaacagact tgacttgtgt aaacgaaccc attttcaaga actctaccat 60
ggttttatat ggagacacag gtgataaaca agcaacccaa gtgtcaatta aaaaagattt 120
<210> 86
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
atttggttta tgttcttgca gaggagaaca aaaatagtgt aaagcagcat ataaaaatga 60
ctctaggtca agatttaaaa tcggacatct ccttgaatat agataaaata ccagaaaaaa 120
<210> 87
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
aaaaataatg attacatgaa caaatgggca ggactcttag gtccaatttc aaatcacagt 60
tttggaggta gcttcagaac agcttcaaat aaggaaatca agctctctga acataacatt 120
<210> 88
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cattaagaag agcaaaatgt tcttcaaaga tattgaagaa caatatccta ctagtttagc 60
ttgtgttgaa attgtaaata ccttggcatt agataatcaa aagaaactga gcaagcctca 120
<210> 89
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ctcagtcaat taatactgta tctgcacatt tacagagtag tgtagttgtt tctgattgta 60
aaaatagtca tataacccct cagatgttat tttccaagca ggattttaat tcaaaccata 120
<210> 90
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cataatttaa cacctagcca aaaggcagaa attacagaac tttctactat attagaagaa 60
tcaggaagtc agtttgaatt tactcagttt agaaaaccaa gctacatatt gcagaagagt 120
<210> 91
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gagtacattt gaagtgcctg aaaaccagat gactatctta aagaccactt ctgaggaatg 60
cagagatgct gatcttcatg tcataatgaa tgccccatcg attggtcagg tagacagcag 120
<210> 92
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gcagcaagca atttgaaggt acagttgaaa ttaaacggaa gtttgctggc ctgttgaaaa 60
atgactgtaa caaaagtgct tctggttatt taacagatga aaatgaagtg gggtttaggg 120
<210> 93
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
aggggctttt attctgctca tggcacaaaa ctgaatgttt ctactgaagc tctgcaaaaa 60
gctgtgaaac tgtttagtga tattgagaat attagtgagg aaacttctgc agaggtacat 120
<210> 94
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gcagaggtac atccaataag tttatcttca agtaaatgtc atgattctgt tgtttcaatg 60
tttaagatag aaaatcataa tgataaaact gtaagtgaaa aaaataataa atgccaactg 120
<210> 95
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
atattacaaa ataatattga aatgactact ggcacttttg ttgaagaaat tactgaaaat 60
tacaagagaa atactgaaaa tgaagataac aaatatactg ctgccagtag aaattctcat 120
<210> 96
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
aacttagaat ttgatggcag tgattcaagt aaaaatgata ctgtttgtat tcataaagat 60
gaaacggact tgctatttac tgatcagcac aacatatgtc ttaaattatc tggccagttt 120
<210> 97
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gtttatgaag gagggaaaca ctcagattaa agaagatttg tcagatttaa cttttttgga 60
agttgcgaaa gctcaagaag catgtcatgg taatacttca aataaagaac agttaactgc 120
<210> 98
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ctgctactaa aacggagcaa aatataaaag attttgagac ttctgataca ttttttcaga 60
ctgcaagtgg gaaaaatatt agtgtcgcca aagagtcatt taataaaatt gtaaatttct 120
<210> 99
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ttctttgatc agaaaccaga agaattgcat aacttttcct taaattctga attacattct 60
gacataagaa agaacaaaat ggacattcta agttatgagg aaacagacat agttaaacac 120
<210> 100
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
acacaaaata ctgaaagaaa gtgtcccagt tggtactgga aatcaactag tgaccttcca 60
gggacaaccc gaacgtgatg aaaagatcaa agaacctact ctattgggtt ttcatacagc 120
<210> 101
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
cagctagcgg gaaaaaagtt aaaattgcaa aggaatcttt ggacaaagtg aaaaaccttt 60
ttgatgaaaa agagcaaggt actagtgaaa tcaccagttt tagccatcaa tgggcaaaga 120
<210> 102
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
aagaccctaa agtacagaga ggcctgtaaa gaccttgaat tagcatgtga gaccattgag 60
atcacagctg ccccaaagtg taaagaaatg cagaattctc tcaataatga taaaaacctt 120
<210> 103
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ccttgtttct attgagactg tggtgccacc taagctctta agtgataatt tatgtagaca 60
aactgaaaat ctcaaaacat caaaaagtat ctttttgaaa gttaaagtac atgaaaatgt 120
<210> 104
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
atgtagaaaa agaaacagca aaaagtcctg caacttgtta cacaaatcag tccccttatt 60
cagtcattga aaattcagcc ttagcttttt acacaagttg tagtagaaaa acttctgtga 120
<210> 105
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gtgagtcaga cttcattact tgaagcaaaa aaatggctta gagaaggaat atttgatggt 60
caaccagaaa gaataaatac tgcagattat gtaggaaatt atttgtatga aaataattca 120
<210> 106
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
ttcaaacagt actatagctg aaaatgacaa aaatcatctc tccgaaaaac aagatactta 60
tttaagtaac agtagcatgt ctaacagcta ttcctaccat tctgatgagg tatataatga 120
<210> 107
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
atgattcagg atatctctca aaaaataaac ttgattctgg tattgagcca gtattgaaga 60
atgttgaaga tcaaaaaaac actagttttt ccaaagtaat atccaatgta aaagatgcaa 120
<210> 108
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gcaaatgcat acccacaaac tgtaaatgaa gatatttgcg ttgaggaact tgtgactagc 60
tcttcaccct gcaaaaataa aaatgcagcc attaaattgt ccatatctaa tagtaataat 120
<210> 109
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
taattttgag gtagggccac ctgcatttag gatagccagt ggtaaaatcg tttgtgtttc 60
acatgaaaca attaaaaaag tgaaagacat atttacagac agtttcagta aagtaattaa 120
<210> 110
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ttaaggaaaa caacgagaat aaatcaaaaa tttgccaaac gaaaattatg gcaggttgtt 60
acgaggcatt ggatgattca gaggatattc ttcataactc tctagataat gatgaatgta 120
<210> 111
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tgtagcacgc attcacataa ggtttttgct gacattcaga gtgaagaaat tttacaacat 60
aaccaaaata tgtctggatt ggagaaagtt tctaaaatat caccttgtga tgttagtttg 120
<210> 112
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tttggaaact tcagatatat gtaaatgtag tatagggaag cttcataagt cagtctcatc 60
tgcaaatact tgtgggattt ttagcacagc aagtggaaaa tctgtccagg tatcagatgc 120
<210> 113
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
atgcttcatt acaaaacgca agacaagtgt tttctgaaat agaagatagt accaagcaag 60
tcttttccaa agtattgttt aaaagtaacg aacattcaga ccagctcaca agagaagaaa 120
<210> 114
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gaaaatactg ctatacgtac tccagaacat ttaatatccc aaaaaggctt ttcatataat 60
gtggtaaatt catctgcttt ctctggattt agtacagcaa gtggaaagca agtttccatt 120
<210> 115
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
cattttagaa agttccttac acaaagttaa gggagtgtta gaggaatttg atttaatcag 60
aactgagcat agtcttcact attcacctac gtctagacaa aatgtatcaa aaatacttcc 120
<210> 116
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
ttcctcgtgt tgataagaga aacccagagc actgtgtaaa ctcagaaatg gaaaaaacct 60
gcagtaaaga atttaaatta tcaaataact taaatgttga aggtggttct tcagaaaata 120
<210> 117
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
aataatcact ctattaaagt ttctccatat ctctctcaat ttcaacaaga caaacaacag 60
ttggtattag gaaccaaagt gtcacttgtt gagaacattc atgttttggg aaaagaacag 120
<210> 118
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
acaggcttca cctaaaaacg taaaaatgga aattggtaaa actgaaactt tttctgatgt 60
tcctgtgaaa acaaatatag aagtttgttc tacttactcc aaagattcag aaaactactt 120
<210> 119
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
actttgaaac agaagcagta gaaattgcta aagcttttat ggaagatgat gaactgacag 60
attctaaact gccaagtcat gccacacatt ctctttttac atgtcccgaa aatgaggaaa 120
<210> 120
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
gaaatggttt tgtcaaattc aagaattgga aaaagaagag gagagcccct tatcttagtg 60
ggtaagtgtt catttttacc tttcgtgttg ccaatcacta tttttaaagt gtttattcag 120
<210> 121
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
ttctttttag gagaaccctc aatcaaaaga aacttattaa atgaatttga caggataata 60
gaaaatcaag aaaaatcctt aaaggcttca aaaagcactc cagatggtaa aattagcttt 120
<210> 122
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
tgtttcctag gcacaataaa agatcgaaga ttgtttatgc atcatgtttc tttagagccg 60
attacctgtg taccctttcg gtaagacatg tttaaatttt tctaaattct aatacagtat 120
<210> 123
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
ttctccccat tgcagcacaa ctaaggaacg tcaagagata cagaatccaa attttaccgc 60
acctggtcaa gaatttctgt ctaaatctca tttgtatgaa catctgactt tggaaaaatc 120
<210> 124
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
aatcttcaag caatttagca gtttcaggac atccatttta tcaagtttct gctacaagaa 60
atgaaaaaat gagacacttg attactacag gcagaccaac caaagtcttt gttccacctt 120
<210> 125
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
accttttaaa actaaatcac attttcacag agttgaacag tgtgttagga atattaactt 60
ggaggaaaac agacaaaagc aaaacattga tggacatggc tctgatgata gtaaaaataa 120
<210> 126
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
aaataagatt aatgacaatg agattcatca gtttaacaaa aacaactcca atcaagcagt 60
agctgtaact ttcacaaagt gtgaagaaga acctttaggt attgtatgac aatttgtgtg 120
<210> 127
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
agtatttatt ctttgataga tttaattaca agtcttcaga atgccagaga tatacaggat 60
atgcgaatta agaagaaaca aaggcaacgc gtctttccac agccaggcag tctgtatctt 120
<210> 128
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
ctgtatcttg caaaaacatc cactctgcct cgaatctctc tgaaagcagc agtaggaggc 60
caagttccct ctgcgtgttc tcataaacag gtatgtgttt gtctacaata ctgatggctt 120
<210> 129
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ttttttgtgt gtgtttattt tgtgtagctg tatacgtatg gcgtttctaa acattgcata 60
aaaattaaca gcaaaaatgc agagtctttt cagtttcaca ctgaagatta ttttggtaag 120
<210> 130
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
tttggtaagg aaagtttatg gactggaaaa ggaatacagt tggctgatgg tggatggctc 60
ataccctcca atgatggaaa ggctggaaaa gaagaatttt ataggtactc tatgcaaaaa 120
<210> 131
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
acttttattt gttcagggct ctgtgtgaca ctccaggtgt ggatccaaag cttatttcta 60
gaatttgggt ttataatcac tatagatgga tcatatggaa actggcagct atggaatgtg 120
<210> 132
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
tggaatgtgc ctttcctaag gaatttgcta atagatgcct aagcccagaa agggtgcttc 60
ttcaactaaa atacaggcaa gtttaaagca ttacattacg taatcatata cggcagtatg 120
<210> 133
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
tcacttttag atatgatacg gaaattgata gaagcagaag atcggctata aaaaagataa 60
tggaaaggga tgacacagct gcaaaaacac ttgttctctg tgtttctgac ataatttcat 120
<210> 134
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
ttcattgagc gcaaatatat ctgaaacttc tagcaataaa actagtagtg cagataccca 60
aaaagtggcc attattgaac ttacagatgg gtggtatgct gttaaggccc agttagatcc 120
<210> 135
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gatcctcccc tcttagctgt cttaaagaat ggcagactga cagttggtca gaagattatt 60
cttcatggag cagaactggt gggctctcct gatgcctgta cacctcttga agccccagaa 120
<210> 136
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
cagaatctct tatgttaaag gtaaattaat ttgcactctt ggtaaaaatc agtcattgat 60
tcagttaaat tctagaagtt ttacatttaa attttaaatg cttactaagg atgctcaatt 120
<210> 137
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
tcaatatatt tattaatttg tccagatttc tgctaacagt actcggcctg ctcgctggta 60
taccaaactt ggattctttc ctgaccctag accttttcct ctgcccttat catcgctttt 120
<210> 138
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
atcgcttttc agtgatggag gaaatgttgg ttgtgttgat gtaattattc aaagagcata 60
ccctatacag gtatgatgta ttcttgaaac ttaccatata tttctttctt ttgatacaat 120
<210> 139
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gtaacacatt attacagtgg atggagaaga catcatctgg attatacata tttcgcaatg 60
aaagagagga agaaaaggaa gcagcaaaat atgtggaggc ccaacaaaag agactagaag 120
<210> 140
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
gactagaagc cttattcact aaaattcagg aggaatttga agaacatgaa ggtaaaatta 60
gttatatggt acacattgtt atttctaata tgagaacaaa gtcttagaga ctttgaattt 120
<210> 141
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
tagtgaatta ataatccttt tgttttctta gaaaacacaa caaaaccata tttaccatca 60
cgtgcactaa caagacagca agttcgtgct ttgcaagatg gtgcagagct ttatgaagca 120
<210> 142
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
tatgaagcag tgaagaatgc agcagaccca gcttaccttg aggtgagaga gtaagaggac 60
atataatgag gcttgatgat tattcaaggt gagaagctgt tttagactct ctggccatca 120
<210> 143
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
atcttaaatg gtcacagggt tatttcagtg aagagcagtt aagagccttg aataatcaca 60
ggcaaatgtt gaatgataag aaacaagctc agatccagtt ggaaattagg aaggccatgg 120
<210> 144
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
aggccatgga atctgctgaa caaaaggaac aaggtttatc aagggatgtc acaaccgtgt 60
ggaagttgcg tattgtaagc tattcaaaaa aagaaaaaga ttcaggtaag tatgtaaatg 120
<210> 145
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
tctccaaaca gttatactga gtatttggcg tccatcatca gatttatatt ctctgttaac 60
agaaggaaag agatacagaa tttatcatct tgcaacttca aaatctaaaa gtaaatctga 120
<210> 146
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
taaatctgaa agagctaaca tacagttagc agcgacaaaa aaaactcagt atcaacaact 60
accggtacaa acctttcatt gtaatttttc agttttgata agtgcttgtt agtttatgga 120
<210> 147
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
atctccatat gttgaatttt tgttttgttt tctgtaggtt tcagatgaaa ttttatttca 60
gatttaccag ccacgggagc cccttcactt cagcaaattt ttagatccag actttcagcc 120
<210> 148
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
ctttcagcca tcttgttctg aggtggacct aataggattt gtcgtttctg ttgtgaaaaa 60
aacaggtaat gcacaatata gttaattttt tttattgatt cttttaaaaa acattgtctt 120
<210> 149
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
cttttctttt ttttccattc taggacttgc ccctttcgtc tatttgtcag acgaatgtta 60
caatttactg gcaataaagt tttggataga ccttaatgag gacattatta agcctcatat 120
<210> 150
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
gttaattgct gcaagcaacc tccagtggcg accagaatcc aaatcaggcc ttcttacttt 60
atttgctgga gatttttctg tgttttctgc tagtccaaaa gagggccact ttcaagagac 120
<210> 151
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
ttcaagagac attcaacaaa atgaaaaata ctgttgaggt aaggttactt ttcagcatca 60
ccacacattt tggtattttt ctattttgac agtccagtat caaggaaata gcttttatac 120
<210> 152
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tatacaaatt ggatagttga ggtagtatgt gaggtaaagt ttaatcatat attaattgcc 60
atgggggaat ggggaaatga catgaacctc aggagcagca actagaaaga gaagaatgac 120
<210> 153
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
cacttatttt cttagaatat tgacatactt tgcaatgaag cagaaaacaa gcttatgcat 60
atactgcatg caaatgatcc caagtggtcc accccaacta aagactgtac ttcagggccg 120
<210> 154
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
tcagggccgt acactgctca aatcattcct ggtacaggaa acaagcttct ggtaagttaa 60
tgtaaactca aggaatatta taagaagtat atatggaggc catcgtatat tctgttgtat 120
<210> 155
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ctacgttttc atttttttat cagatgtctt ctcctaattg tgagatatat tatcaaagtc 60
ctttatcact ttgtatggcc aaaaggaagt ctgtttccac acctgtctca gcccagatga 120
<210> 156
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
cttcaaagtc ttgtaaaggg gagaaagaga ttgatgacca aaagaactgc aaaaagagaa 60
gagccttgga tttcttgagt agactgcctt tacctccacc tgttagtccc atttgtacat 120
<210> 157
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
ttgtttctcc ggctgcacag aaggcatttc agccaccaag gagttgtggc accaaatacg 60
aaacacccat aaagaaaaaa gaactgaatt ctcctcagat gactccattt aaaaaattca 120
<210> 158
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
atgaaatttc tcttttggaa agtaattcaa tagctgacga agaacttgca ttgataaata 60
cccaagctct tttgtctggt tcaacaggag aaaaacaatt tatatctgtc agtgaatcca 120
<210> 159
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
ctaggactgc tcccaccagt tcagaagatt atctcagact gaaacgacgt tgtactacat 60
ctctgatcaa agaacaggag agttcccagg ccagtacgga agaatgtgag aaaaataagc 120
<210> 160
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
aggacacaat tacaactaaa aaatatatct aagcatttgc aaaggcgaca ataaattatt 60
gacgcttaac ctttccagtt tataagactg gaatataatt tcaaaccaca cattagtact 120
<210> 161
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
tatgttgcac aatgagaaaa gaaattagtt tcaaatttac ctcagcgttt gtgtatcggg 60
caaaaatcgt tttgcccgat tccgtattgg tatacttttg cttcagttgc atatcttaaa 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
cacccaggat cctttcttga ttggttcttc caaacaaatg aggcatcagt ctgaaagcca 60
gggagttggt ctgagtgaca aggaattggt ttcagatgat gaagaaagag gaacgggctt 120
<210> 163
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
ttgattggtt cttccaaaca aatgaggcat cagtctgaaa gccagggagt tggtctgagt 60
gacaaggaat tggtttcaga tgatgaagaa agaggaacgg gcttggaaga aaataatcaa 120
<210> 164
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
aggagaattt attatcattg aagaatagct taaatgactg cagtaaccag gtaatattgg 60
caaaggcatc tcaggaacat caccttagtg aggaaacaaa atgttctgct agcttgtttt 120