CN105200154A

CN105200154A - Brca1和brca2基因突变的多重pcr检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN105200154A
Application number: CN201510726384.XA
Authority: CN
Inventors: 屈武斌; 杭兴宜; 蔡万世
Original assignee: Igenetech Co Ltd
Current assignee: Aiji Taikang (Jiaxing) Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2035-11-02
Also published as: CN105200154B

Abstract

本发明提供了一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒使用了两套PCR引物，第一套PCR引物包括189对PCR引物，分两组，第一组包括引物95对(SEQIDNO.5-SEQIDNO.194)，第二组包括引物94对(SEQIDNO.195-SEQIDNO.382)，每个上游引物的5’端添加序列SEQIDNO.1，每个下游引物的5’端添加序列SEQIDNO.2；第二套PCR引物的上、下游引物序列是SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。

Description

BRCA1和BRCA2基因突变的多重PCR检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，尤其涉及基因突变多重PCR检测。

背景技术

BRCA1和BRCA2是两个具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。已发现的BRCA1和BRCA2的突变有数百种之多，有些与遗传性乳腺癌和卵巢癌有关。总结BRCA1和BRCA2基因突变相关的癌症的终身风险显示，有BRCA1基因突变者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％-85％和15％-45％，有BRCA2基因突变者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％-85％和10％-20％。与普通妇女相比，这些都是很高的患癌几率。

由于BRCA1和BRCA2基因的突变对家族性乳腺癌、卵巢癌的发生有一定的联系，所以检测BRCA1和BRCA2的突变基因对相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的临床意义。另外，由于BRCA1和BRCA2的突变众多，检测这些突变对于相关基因的研究十分有意义，例如对于基因多态性分析和家族进化史研究。

目前，普遍应用的BRCA基因突变检测方法主要为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法，该方法存在以下缺点：实验操作繁琐、检测周期长、成本高、存在第一轮酶切不完全导致的假阳性、非闭管操作、易于污染、难以满足临床检测要求。DNA直接测序法存在以下缺点：检测周期较长、成本高、非闭管操作、难以避免交叉污染、通量不高。另外，DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，通常需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法也难适用于临床检测。

也有已公开专利使用PCR方法来检测乳腺癌易感基因突变，例如专利“检测乳腺癌易感基因突变的多重PCR试剂盒及其制备方法”(授权公告号：CN101200766B)。但是，该专利所用的多重PCR仅限定在BRCA1和BRCA2基因部分外显子上的部分突变位点上，而这明显不能覆盖BRCA1和BRCA2基因遍布在多个外显子上的上百种突变，因此该专利在使用上有较大局限。

因此，本领域需要可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA1和BRCA2基因突变的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的是为了提供可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA1和BRCA2突变的方法和试剂盒。本发明主要是利用多重PCR技术对BRCA1和BRCA2基因编码区进行捕获富集，然后通过高通量测序技术测定富集后的编码区序列，最终通过生物信息学分析高通量测序数据，从而发现编码区的突变情况及其频率。

因此，本发明提供了一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法，所述方法包括

1)捕获：进行第一轮特异性多重PCR反应，使用189对引物对样品DNA进行扩增，所述189对PCR引物分两个试管进行反应，第一个试管引物95对(SEQIDNO.5-SEQIDNO.194)，第二个试管引物94对(SEQIDNO.195-SEQIDNO.382)，每个上游引物的5’端添加序列SEQIDNO.1：

“ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC”，每个下游引物的5’端添加序列SEQIDNO.2：“GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA”；

2)建库：进行第二轮PCR反应，使用PCR引物对：上游引物SEQIDNO.3：“AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC”，下游引物SEQIDNO.4：

“CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT”对步骤1)获得的扩增产物进行扩增；

3)测序，对步骤2)获得的扩增产物进行测序；

4)分析，对步骤3)获得的测序结果进行分析，完成全编码区的突变检测。

本发明还提供了一种BRCA1和BRCA2基因突变多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：两套PCR引物和PCR扩增预混和溶液(例如，来自KAPA2GFast热启动多重扩增试剂盒)；

所述的两套PCR引物，第一套PCR引物包括189对PCR引物，分两组，第一组包括引物95对(SEQIDNO.5-SEQIDNO.194)，第二组包括引物94对(SEQIDNO.195-SEQIDNO.382)，每个上游引物的5’端添加SEQIDNO.1：

“ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC”序列，每个下游引物的5’端添加SEQIDNO.2：“GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA”序列；

第二套PCR引物的上游引物序列SEQIDNO.3是：

“AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC”，下游引物序列SEQIDNO.4是

“CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT”。

在本发明的试剂盒中，所述第一套为特异性多重PCR引物，所述第二套PCR引物是一对常规PCR引物，在其5’端带有测序序列。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括蒸馏水。

在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒中，第一套引物的PCR反应的反应体系按如下比例配制：第一套PCR引物10份、PCR扩增预混和溶液(例如PCR扩增预混和溶液)12.5份、DNA模板3份、水4.5份。

在一个优选的实施方案中，第二套PCR反应的反应体系按如下比例配制：第二套PCR引物2.5份、PCR扩增预混和溶液(例如PCR扩增预混和溶液)7.5份、第一轮PCR回收产物5份、水4.5份。

和现有技术相比，本发明的检测方法和试剂盒具有如下优点：

1)成本低廉；

2)对待检测样品要求量低，可对血浆和血清中的极低DNA样品进行分析；

3)地毯式引物设计，可实现全编码区突变检测，不但能对已知突变进行分析，还能发现新的突变；

4)灵敏度高；

5)检测时间短，结合高通量测序技术，可短时间内实现全编码区突变检测。

本发明的试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA突变，协助临床医生实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。

应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1：第二轮PCR反应经过2％琼脂糖电泳鉴定结果。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

本发明提供了一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法，虽然在某些情况下，对这些基因的检测对于相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的辅助意义，但这些基因的突变不是必然导致所述疾病的发生，因此对这些基因的检测并不涉及疾病的诊断或治疗方法。另外，本发明的检测突变的方法还可以有许多其他用途，例如进行基因多态性分析和家族进化史研究。本发明的方法还可以用于非特定对象的样品研究，例如对混合血液制品进行检测。

在本发明中，序列SEQIDNO.5-SEQIDNO.382两两配对形成189对第一套PCR引物，即SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8......SEQIDNO.381和SEQIDNO.382分别配对形成189个引物对。

在本发明中，所述189对第一套PCR引物分两组，第一组包括引物95对(SEQIDNO.5-SEQIDNO.194)，第二组包括引物94对(SEQIDNO.195-SEQIDNO.382)，这是经过发明人通过计算机模拟并进行试验进行调整的结果，这样使得避免了引物之间的交叉反应，使得提高PCR的效率和质量。

在本发明中，每个上游引物的5’端添加序列SEQIDNO.1“ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC”，每个下游引物的5’端添加序列SEQIDNO.2“GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA”，上下游引物所添加的共有序列是第二轮PCR反应引物的结合位置。

在本发明中，第二套PCR引物的上游引物序列是：SEQIDNO.3“AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC”，

下游引物序列是SEQIDNO.4“CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT”，其中下游下划线部分序列是barcode序列，用于区分多个样本。

在本发明中，PCR扩增预混和溶液，即含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)的溶液，例如PCR扩增预混和溶液。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的多重PCR检测试剂盒的应用方法如下：

1)提取待检测样品的DNA(例如按照常规方法)作为模板；

2)以第一套引物进行第一轮多重PCR扩增反应，第一组和第二组引物对分别在两个试管中进行；

3)将PCR扩增产物通过磁珠进行纯化回收；

4)用第一轮PCR回收的产物作为模板以第二套引物进行第二轮PCR反应；

5)将PCR扩增产物通过磁珠进行纯化回收；

6)电泳鉴定；

7)收集产物进行上机测序(例如第二代高通量测序)；

8)通过生物信息学分析鉴定BRCA1和BRCA2的基因是否发生了突变。

其中，所述的多重PCR扩增反应条件优选如下：

第一轮PCR反应扩增体系：

第一轮PCR反应扩增条件：

第一轮PCR扩增后产物纯化：

1)将PCR产物加入等体积的回收缓冲液(Tris-Hcl，称量121.1gTris-Hcl置于1L烧杯中，加入越800mL的去离子水中，充分搅拌。加入42mL的Hcl，定容至1L。)

和10ul磁珠(Beckman-B46053)，震荡混匀30s；

2)将混合物放置于磁力架上30s；

3)吸出上清液，晾干30s，离开磁力架；

4)加入洗液W1(70％乙醇)，震荡混匀30s；

5)将混合物放置于磁力架上30s；

6)吸出上清液，晾干30s，离开磁力架；

7)加入洗液W2(H₂O)，震荡混匀30s；

8)将混合物放置于磁力架上30s；

9)吸出上清液，晾干2min，离开磁力架；

10)加入20ul洗脱液(ATE，48.4gTris-Hcl溶于150mL去离子水中，加热45℃搅拌至溶解，14.61gEDTA加入上述溶液，继续搅拌。加入11.42mLAC，边搅拌边加，加完AC后变澄清，EDTA彻底溶解。测PH为8.6，加去离子水定容至200mL)，震荡混匀30s；

11)将混合物放置于磁力架上30s；

12)将上清收集备用。

第二轮PCR扩增体系：

第二轮PCR反应扩增条件：

第二轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文第一轮PCR扩增后产物纯化。

实施例

一、本发明多重PCR试剂盒的制备和组装

1.两轮PCR引物的设计与配制

第一轮189对PCR引物，

第一轮PCR引物，分两组，第一组包括引物95对，第二组包括引物94对：每组各取1ul(单个引物浓度1uM)，混匀；

第二轮PCR引物(整体引物浓度0.1uM)：取1.25ul；

所有引物均经过DNA自动合成仪合成。

2.试剂盒的组装

PCR扩增预混和溶液1(KAPA，No：KK5801)：12.5ul；

PCR扩增预混和溶液2(KAPA，No：KK2601)：7.5ul；

第一轮PCR引物第一组：5ul，第一轮PCR引物第二组：5ul

第二轮PCR引物试管：1.25ul。

二、本发明多重PCR试剂盒的应用实验

1.检测样品

所检测的样品来源于某志愿者的血液。

2.检测方法

DNA提取：按照常规方法提取待检测样品的DNA作为模板。

PCR扩增：

第一轮PCR反应扩增体系同上文所述第一轮PCR反应扩增体系。

第一轮PCR反应扩增条件同上文所述第一轮PCR反应扩增条件。

第一轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化。

第二轮PCR扩增体系同上文所述第二轮PCR反应扩增体系。

第二轮PCR反应扩增条件同上文所述第二轮PCR反应扩增条件。

第二轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化。

测定A管260/280为1.79，对应DNA浓度5.02ng/ul。

测定B管260/280为1.81，对应DNA浓度6.87ng/ul。

电泳鉴定结果见图1。

3.检测结果

将两轮PCR的结果上机测序，并进行生物信息学分析。

1)首先对测序数据进行质量评估。

2)对经过评估后的测序数据量进行统计，如下表所示。

3)参考序列比对和depth数据统计

采用Burrows-WheelerAligner(BWA)软件将上一步生成质控后的数据(cleandata)与全基因组进行比对，BWA是一款分析准确、分析效率高的比对软件。比对完成后生成SequenceAlignmentMap(SAM)文件结果。然后采用picard软件除去SAM中的重复序列(PCR过程中产生的多余的信息)，最后，我们利用samtools软件将SAM的结果文件转成BAM文件，BAM格式就是SAM格式的压缩结果，SAM文件格式说明请参见http：//samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf。

项目	值
		测序序列平均长度(Average read length)	139
测序碱基平均质量值(Average base quality)	32
		平均建库长度(Average lab size)	193.8
重复率(Duplication rate)(％)	无
		比对率(Align rate)(％)	82.56
捕获的目标区域大小(Total target base)	15915
		实际测序结果覆盖目标区域的大小(Covered target base)	15662
覆盖率(Coverage rate)(％)	98.41
		总的有效数据量(Total effective base)(Mb)	84.51
目标区域的有效数据量(Effective base on target)(Mb)	14.89
		捕获率(Capture rate)(％)	17.62
目标区域的平均深度(Target average depth)	935.54
		目标区域深度大于4层的区域所占的比例(Target 4X rate)(％)	95.97
目标区域深度大于10层的区域所占的比例(Target 10X rate)(％)	95.27
		(目标区域深度大于20层的区域所占的比例Target 20X rate)(％)	92.57
捕获区域名称(Panel name)	BRCA1/2

比对率：比对上人类基因组的序列-重复序列/cleandata

覆盖率：实际测序结果覆盖目标区域的大小/捕获的目标区域大小

总的有效数据量：比对上人类基因组的序列-重复序列

捕获率：目标区域的有效数据量/

4)本例中发现的突变分布：

外显子同义突变(exonic_synonymous)	9
		外显子无义突变(exonic_nonsynonymous)	12
外显子区突变总数(exonic)	21
		内含子区突变总数(intronic)	4
可变简介区突变总数(splicing)	1
		5’UTR区突变总数(5-UTR)	1

虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述，但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例。结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。

Claims

1.一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法，所述方法包括

1)捕获：进行第一轮特异性多重PCR反应，使用189对引物对样品DNA进行扩增，所述189对PCR引物分两个试管进行反应，第一个试管引物95对SEQIDNO.5-SEQIDNO.194，第二个试管引物94对SEQIDNO.195-SEQIDNO.382，每个上游引物的5’端添加序列SEQIDNO.1，每个下游引物的5’端添加序列SEQIDNO.2；

2)建库：进行第二轮PCR反应，使用PCR引物对：上、下游引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4对步骤1)获得的扩增产物进行扩增；

3)测序，对步骤2)获得的扩增产物进行测序；

2.一种BRCA1和BRCA2基因突变多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：两套PCR引物；

所述的两套PCR引物，第一套PCR引物包括189对PCR引物，分两组，第一组包括引物95对SEQIDNO.5-SEQIDNO.194，第二组包括引物94对SEQIDNO.195-SEQIDNO.382，每个上游引物的5’端添加序列SEQIDNO.1，每个下游引物的5’端添加序列SEQIDNO.2；

第二套PCR引物的上、下游引物序列分别是SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。

3.权利要求2的试剂盒，所述试剂盒还包括PCR扩增预混和溶液(例如，来自KAPA2GFast热启动多重扩增试剂盒的PCR扩增预混和溶液)。

4.权利要求2的试剂盒，所述试剂盒还包括水。

5.权利要求3的试剂盒，所述的试剂盒中，第一套引物的PCR反应的反应体系按如下比例配制：第一套PCR引物10份、PCR扩增预混和溶液12.5份、DNA模板3份、水4.5份。

6.权利要求2的试剂盒，所述的试剂盒中，第二套PCR反应的反应体系按如下比例配制：PCR引物2.5份、PCR扩增预混和溶液7.5份、第一轮PCR回收产物5份、水4.5份。