CN108841989B - 一种甜瓜的ssr分子标记体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用，涉及分子标记技术领域。本发明用于鉴定甜瓜品种的引物对名称分别为C30、MU5499、MU5554‑1、SSR12083及SSR04219。本发明研究的上述SSR分子标记引物对多态性高、条带清晰、重复性稳定，可用于构建甜瓜DNA指纹图谱和鉴定甜瓜品种。尤其鉴定西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29，其效果更明显。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用。
背景技术
SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。
生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制等研究中。
采用SSR分子标记鉴定甜瓜的技术已有研究，但更需要研究出多态性高、条带清晰、重复性稳定的SSR分子标记以用于构建甜瓜DNA指纹图谱。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用，主要目的是解决用于鉴定甜瓜品种的SSR分子标记种类繁多以致无法快速且准确鉴定出甜瓜品种的问题。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种甜瓜的SSR分子标记体系；所述分子标记体系包括5个引物对；
引物对1名称为C30，核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
引物对2名称为MU5499，核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
引物对3名称为MU5554-1，核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
引物对4名称为SSR12083，核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
引物对5名称为SSR04219，核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
作为优选，所述甜瓜的新品种为西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29。
另一方面，本发明实施例提供了上述甜瓜SSR分子标记体系在鉴定甜瓜品种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过筛选甜瓜基因组SSR引物，记录其碱基序列信息及退火温度，筛选出多态性高、条带清晰、重复性稳定的SSR分子标记体系，用于构建甜瓜DNA指纹图谱，可快速准确鉴定出甜瓜品种。
附图说明
图1是本发明实施例2提供的引物73扩增后的凝胶电泳图谱；
图2是本发明实施例2提供的引物47扩增后的凝胶电泳图谱；
图3是本发明实施例2提供的引物14扩增后的凝胶电泳图谱；
图4是本发明实施例2提供的引物53扩增后的凝胶电泳图谱；
图5是本发明实施例2提供的引物5扩增后的凝胶电泳图谱；
图6是本发明实施例3提供的6个甜瓜品种的SSR指纹图谱；
图7A-7F是本发明实施例3提供的6个甜瓜品种的指纹图谱QR编码；
图8是本发明实施例3提供的西州密1号的二维码扫描图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1(采用CTAB法提取甜瓜DNA)
a.取0.2～0.5g幼叶，置研钵中，加充足液氮研磨，直至成粉末状；
b.迅速将粉末转入2ml离心管中；管中已加入760μlCTAB提取缓冲液100mmol/LTris(pH8.0)、1.4mol/LNaCl、50mmol/L EDTA、2％CTAB、2％PVP、20μlβ-巯基乙醇充分混匀；
c.65℃水浴30min，水浴过程中将管盖开闭并晃动2～3次；
d.冷却至室温，加等体积的24∶1(V/V)氯仿：异戊醇，约900μl，混匀；
e.常温离心，12000rpm，15min；
f.取2ml离心管，将上清液(约750μl)转入其中；
g.加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇(V/V为24:1)，倒转离心管数次，混匀；
h.常温离心，12000rpm，15min；
i.重复f～h步骤1～2次，直到有机相与水相交界处白色杂质消失为止；
j.取2ml或5ml离心管，将上清液(约650μl)转入其中；加入预冷过的2×上清液体积的无水乙醇或等体积异丙醇，轻轻旋转试管，然后静置沉淀DNA，管内有絮状DNA出现；
k.取1.5ml离心管，加入1ml 70％乙醇，将DNA挑入其中，轻轻晃动洗涤，倒掉70％乙醇，加入1ml无水乙醇洗涤一次，倒掉无水乙醇，用枪头吸干无水乙醇。放置在超净工作台上，风机打开10～15分钟至乙醇挥发干净；
l.加入500μl TE[10mmol/LTris·HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)]溶解DNA；
m.待DNA完全溶解后，加入1μl10mg/mL RNA酶(终浓度约为20μg/mL)。37℃温育30～60min；
n.可再次加入等体积的氯仿：异戊醇(V/V为24:1)，倒转离心管数次，混匀，常温离心，12000rpm，10min，取1.5ml离心管，将上清液转入其中；
o.加入2×体积预冷的无水乙醇，1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，-20℃放置1～2hr或过夜，沉淀DNA；
p.取0.5ml离心管，用0.5ml 70％乙醇和无水乙醇，洗涤DNA各一次，用枪头吸干无乙醇。在超净工作台上充分干燥；
q.加入50～100μl TE[10mmol/L Tris·HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)]溶解DNA；
r.将DNA样分装，一部分供近期使用，一部分长期保存，均置于-20℃保存。
将同一种甜瓜的不同10个单株，(如西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29的10个栽培单株)幼嫩叶片混合,建立基因池，采用上述CTAB法提取各自的基因组DNA；利用琼脂糖电泳法检验DNA片段的完整性和浓度；利用紫外分光光度计上测OD230、OD260、OD280，计算OD260/OD230和OD260/OD280，检测DNA纯度；若OD260/OD280比值在1.60-1.90之间，OD260/OD230大于2.0可用于PCR扩增，否则需要进一步纯化。
实施例2(PCR扩增)
以实施例1提取的甜瓜DNA(如西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29)为扩增模板，分别利用引物73(C30)、引物47(MU5499)、引物14(MU5554-1)、引物53(SSR04219)或引物5(SSR12083)对上述6个甜瓜品种的DNA进行扩增；引物对信息如表1所示，PCR反应体系如表2所示；
表1.甜瓜SSR引物体系
表2.PCR反应体系
| 反应体系 | 体积(20μL) |
| ddH<sub>2</sub>O | 7.9μL |
| DNA模板 | 1.5μL |
| 引物P1、P2 | 各0.3μL |
| 10×Buffer | 10.0μL |
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性15s，合适退火温度15s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸4min；
待PCR扩增结束后，利用移液枪，点入8％的非变形聚丙烯酰胺凝胶上进行垂直电泳，电泳完毕立即取下凝胶进行银染显色，电泳凝胶结果用数码相机拍照记录，如图1-图5。
实施例3(构建甜瓜SSR指纹图谱)
利用实施例2设计的5对SSR引物对表3所示的18个甜瓜材料的基因组DNA(总DNA)进行扩增，每个引物的扩增结果会得到不同的带型(不同的数字代表不同的带型，如图6中的引物73中依次出现的带型分别用1、2、3、4、5表示，即1、2、3、4、5分别代表5个不同的带型)，因此利用引物对73、47、14、53、5可以得到18个材料的指纹图谱，其中新品种西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号及西州密29的指纹图谱如图6所示，图6中的1-18分别代表西州密1号母本、西州密1号、西州密1号父本；西州密3号母本、西州密3号、西州密3号母本；西州密25号母本、西州密25号、西州密25号父本；西州密17号母本、西州密17号、西州密17号父本；西州密21号母本、西州密21号、西州密21号父本；西州密29号母本、西州密29号、西州密29号父本。
表3.甜瓜材料
通过图6可看出，西州密1号指纹代码为33131、西州密3号指纹代码为33253、西州密25号指纹代码为33311、西州密17号指纹代码为53215、西州密21号指纹代码为15511及西州密29号指纹代码为36611。
指纹图谱QR编码应用二维码编辑器进行编码，将各个新品种(上述6种)的材料名称、类型、植物分类学和SSR指纹图谱代码一起录入该软件，形成指纹图谱QR编码，如图7A-7F所示，二维码扫码图如图8所示。
本发明的上述5对引物在西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号和西州密29之间的鉴定效果更明显。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所
<120> 一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 24
<212> DNA
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 8
<211> 22
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcattttca tccaaagggc 20
Claims (1)
1.一种甜瓜的SSR分子标记体系在鉴定甜瓜品种中的应用；所述分子标记体系包括5个引物对；
引物对1名称为C30，核苷酸序列为SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2；
引物对2名称为MU5499，核苷酸序列为SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4；
引物对3名称为MU5554-1，核苷酸序列为SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6；
引物对4名称为SSR12083，核苷酸序列为SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8；
引物对5名称为SSR04219，核苷酸序列为SEQ ID NO .9和SEQ ID NO .10；
所述甜瓜的品种为西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29号。
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| 甜瓜株型性状的遗传分析与分子标记;熊姜玲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180515;附录 * |
| 甜瓜育种亲本材料遗传多样性及群体结构的SSR标记分析;王美荣;《华北农学报》;20100828;第41-46页 * |
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