CN103695500A - 一种提高普鲁兰多糖产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵过程中分段添加生长因子来提高普鲁兰多糖产量的方法，属于生物发酵工程技术领域。利用出芽短梗霉CGMCC NO.7055发酵生产普鲁兰多糖，并在菌体生长处于对数期初期时，加入0.03-0.05‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.02-0.04‰的尿嘧啶核苷酸，从而达到引导促进次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累。本发明有针对性的根据不同生长周期和发酵过程中产糖的特点来添加生长因子，操作便捷，效果明显，极大地缩短了发酵周期，提高了底物的转化率，降低了普鲁兰多糖的成本。
Description
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵生产普鲁兰多糖的方法，具体涉及一种发酵过程中分段添加生长因子来提高普鲁兰多糖产量的方法。属于生物发酵工程技术领域。
背景技术：
普鲁兰多糖是一种水溶性的不定形葡聚糖并作为水溶性多糖的模式多糖，它已作为乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、成膜剂和润滑剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。普鲁兰多糖将是今后新型发酵工程的一个重要发展方向，越来越受到国内企业的重视。
生长因子是指微生物生长过程中必须的，必须由外界直接提供的营养成分，常见的生长因子有维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶等。生长因子可以提供微生物重要化学物质、辅助因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢。普鲁兰多糖属于次级代谢产物，在菌体处于对数期后期，稳定期前期开始产生。
目前文献当中关于普鲁兰多糖产量提高主要是通过菌种诱变、培养基成分优化，往往效果不太明显，发酵周期长，且底物的转化率不高，导致普鲁兰多糖成本居高不下。申请号为201210594876.4的中国发明专利《大量生产普鲁兰多糖的诱变菌株及其培养方法》，公开了一株产普鲁兰多糖的出芽短梗霉CGMCC NO.7055，并公开了利用该菌株生产普鲁兰多糖的方法，以及发酵培养基组成。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）BCSWGHPL101在发酵培养基发酵生产普鲁兰多糖产量为96g/L，较原始菌株68±5.2g/L的产量，提高了41.2%，发酵条件为28℃，200±20rpm下培养3d。但仍存在发酵周期较长，且底物转化率较低，底物利用率不高的问题，导致普鲁兰多糖成本较高，不利于大批量、规模化生产。
发明内容：
为了解决普鲁兰多糖传统优化过程中的不足，有针对性的提高普鲁兰多糖产量，缩短普鲁兰多糖发酵周期，提高底物转化率，本发明提供了一种分段添加生长因子来提高普鲁兰多糖产量的方法，不仅操作方便，而且在提高产量的同时也减少了色素的产生。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
1.一种提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下步骤：
1）种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28-32h。
所述种子培养基组成：蔗糖8g，酵母浸粉0.2g，氯化钠0.15g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸铵0.1g，硫酸镁0.04g，硫酸亚铁0.05g，蒸馏水定容至100mL。
2）发酵培养
500mL挡板瓶瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm进行培养。菌体生长处于对数期初期时，加入0.03-0.05‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.02-0.04‰的尿嘧啶核苷酸，培养57-63h，从而达到引导促进次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累，提高底物转化率，缩短发酵周期。
所述发酵培养基组成：蔗糖10g，蛋白胨0.4g，氯化钠0.3g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.04g，硫酸亚铁0.05g，蒸馏水定容至100mL，初始pH5.5-6.5。
所述维生素B1及尿嘧啶核苷酸用去离子水配制成浓度0.01g/L的溶液然后通过0.45um无菌滤膜过滤制备。
3）普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品。
所述出芽短梗霉BCSWGHPL101（Aureobasidium pullulans）是由实验室保藏的一株产色素量少的出芽短梗霉TKPM10017经筛选诱变获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2012年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.7055。
所述出芽短梗霉TKPM10017产量比较稳定约50-60g/L，色素产生较少，但发酵周期较长，底物转化率较低。
所述诱变过程包括如下步骤：
1.打开紫外灯预热30min。取5mL孢子悬浮液，加入放有无菌转子的50mm培养皿中，置于磁力搅拌器上，放于至波长254nm，功率30w的紫外诱变箱中，调整培养皿与紫外灯的距离为30cm。打开盖，开启磁力搅拌器恒速搅拌，紫外灯下分别照射0s，60s，120s，180s，240s，300s，360s。所有操作均避光进行，将照射后的菌悬液做梯度稀释，涂布于PDA固体培养基上28℃恒温避光培养72h。
2.将涂布于PDA培养基上的经过诱变的孢子悬浮液28℃培养72小时，利用游标卡尺测定单菌落的直径，并观察颜色，挑取出芽短梗霉（菌落直径大、表面湿润、颜色浅或白色）的变异株。
3.将通过平板初筛得到的单菌落，挑取单个菌落接种到发酵培养基(100mL/500mL)中，28℃、180r/min，利用摇床振荡培养96h，测定发酵液颜色并测定普鲁兰多糖产量。
4.将复筛选出的菌株在斜面上连续转接十五代，挑取第三代、第六代、第九代、第十二代和第十五代进行发酵实验，测定其颜色并测定普鲁兰多糖产量，选择产量稳定且色素产生少，发酵周期短，底物转化率高的菌株进行保藏，得到普鲁兰多糖高产菌株CGMCC NO.7055。
所述出芽短梗霉CGMCC NO.7055特性如下：
发酵液中主要呈现酵母样形态，椭圆形且大小均一，菌株的繁殖方式类似于酵母的出芽生殖方式；菌落呈圆形,中心***,表面光滑,湿润,不易挑取,生长后期有菌丝体产生。可以利用的碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、糊精其中之一。可以利用的氮源：牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、硝酸钠、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵等，上述氮源可以混合使用，也可单一使用。
所述添加生长因子优化过程：
普鲁兰多糖属于次级代谢产物，已证实在微生物对数期后期、稳定期前期开始产生；为了缩短发酵周期，提高底物转化率，采取添加生长因子促进菌体快速生长，迅速进入产糖阶段，在产糖阶段通过筛选添加某种生长因子，从而促进菌体利用底物转化为多糖。
实验室对出芽短梗霉的发酵研究中发现出芽短梗霉缺乏合成B族维生素的能力，而B族维生素不足正是制约出芽短梗霉生产普鲁兰多糖的产量和产率的原因所在。实验室对此进行了大量研究，对维生素B族元素进行了筛选，对用量进行了优化，结果如表1：
表1：不同B族维生素不同用量对发酵周期的影响
由表1可以得出添加VB1明显缩短了菌体到达对数期后期的时间。
表2：不同浓度VB1对发酵周期的影响
| VB1(硫胺素)浓度（‰） | 菌体进入对数期后期（OD620=0.5）的时间（h） |
| 0.01 | 18 |
| 0.02 | 17 |
| 0.03 | 14 |
| 0.04 | 13 |
| 0.05 | 13 |
由表2可以得出添加0.03-0.05‰的VB1对菌体的生长均有明显的促进作用,将菌体进入对数期后期的时间缩短为13-14h。
1973年Taguchi等报道出芽短梗霉细胞经破碎后制成的无细胞酶液可利用ATP将UDPG经转糖苷作用可以合成普鲁兰多糖；本实验室对核苷酸碱基进行了筛选优化：表3核苷酸碱基对普鲁兰多糖发酵的影响
由表3可以得出尿嘧啶可显著提高普鲁兰多糖的终产量，提高底物的转化率。
表4：不同浓度的尿嘧啶对普鲁兰多糖发酵的影响
由表4可以得出添加0.02-0.04‰的尿嘧啶对普鲁兰多糖的产生有明显的促进作用，提高了终产量和转化率，缩短了发酵所需时间。
有益效果
本发明针对出芽短梗霉CGMCC NO.7055发酵生产普鲁兰多糖过程中存在周期长、底物转化率低的缺陷，经过大量研究，确定了原因在于出芽短梗霉自身缺乏合成维生素的能力，而B族维生素是构成辅酶的重要组成部分，因此，有针对性的在对数期初期加入适量维生素B1促进菌体生长，从而极大地缩短了菌体到达稳定期的时间，使菌体大量积累，为后续普鲁兰多糖的合成提供了保证。本发明有针对性的根据不同生长周期和发酵过程中产糖的特点来添加生长因子，操作便捷，效果明显，极大地缩短了发酵周期，提高了底物的转化率，降低了普鲁兰多糖的成本。与背景技术中引用的发明相比，虽然产量较低，但其转化率明显提高，提高了底物的利用效率，且发酵周期较短，大大降低了普鲁兰多糖的成本。
具体实施方式：
实施例1
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28h。
(2)发酵培养
500mL挡板瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm进行培养。菌体生长处于对数期初期时，加入0.03‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.04‰的尿嘧啶核苷酸进行次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累。
(3)普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品76.3g/L。
发酵周期为58h，与未添加生长因子发酵周期需要3d相比，缩短了12h；底物转化率达75%。
实施例2
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为30h。
(2)发酵培养
500mL挡板瓶瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm进行培养。菌体生长处于对数期初期时，加入0.04‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.03‰的尿嘧啶核苷酸进行次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累。
(3)普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品76.4g/L。
发酵周期为59h,与未添加生长因子发酵周期需要3d相比，缩短了13h；底物转化率达74%。
实施例3
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为32h。
(2)发酵培养
500mL挡板瓶瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm，进行培养。菌体生长处于对数期初期时，加入0.05‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.02‰的尿嘧啶核苷酸进行次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累。
(3)普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品75.6g/L。
发酵周期为61h,与未添加生长因子发酵周期需要3d相比，缩短了11h;底物转化率达73%。
Claims (9)
1.一种提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下步骤：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28-32h；
(2)发酵培养
500mL挡板瓶瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm，培养57-63h；
(3)普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品；
其特征在于，菌体生长处于对数期初期时，加入0.03-0.05‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.02-0.04‰的尿嘧啶核苷酸；
所述出芽短梗霉BCSWGHPL101（Aureobasidium pullulans）保藏编号为CGMCC NO.7055。
2.根据权利要求1所述提高普鲁兰多糖产量的方法，其特征在于，所述维生素B1及尿嘧啶核苷酸经过0.45um无菌滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述提高普鲁兰多糖产量的方法，其特征在于，所述种子培养，培养基组成为：蔗糖8g，酵母浸粉0.2g，氯化钠0.15g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸铵0.1g，硫酸镁0.04g，硫酸亚铁0.05g，蒸馏水定容至100mL。
4.根据权利要求1所述提高普鲁兰多糖产量的方法，其特征在于，所述发酵培养，培养基组成为：蔗糖10g，蛋白胨0.4g，氯化钠0.3g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.04g，硫酸亚铁0.05g，蒸馏水定容至100mL，初始pH5.5-6.5。
5.根据权利要求1所述提高普鲁兰多糖产量的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28h；
(2)发酵培养
500mL挡板瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm培养58h；菌体生长处于对数期初期时，加入0.03‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.04‰的尿嘧啶核苷酸；
(3)普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品76.3g/L。
6.根据权利要求1所述提高普鲁兰多糖产量的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为30h；
(2)发酵培养
500mL挡板瓶瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm培养59h；菌体生长处于对数期初期时，加入0.04‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.03‰的尿嘧啶核苷酸；
(3)普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品76.4g/L。
7.根据权利要求1所述提高普鲁兰多糖产量的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为32h；
(2)发酵培养
500mL挡板瓶瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm，培养61h；菌体生长处于对数期初期时，加入0.05‰的维生素B1，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.02‰的尿嘧啶核苷酸；
(3)普鲁兰多糖的分离
发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品75.6g/L。
8.根据权利要求1-7任一所述提高普鲁兰多糖产量的方法在普鲁兰多糖生产中的应用。
9.根据权利要求1-7任一所述提高普鲁兰多糖产量的方法制备的普鲁兰多糖。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140402 |