CN101497871B - 乙醇发酵厌氧高温菌培养基,其制备方法和其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用***为培养基营养物质的微生物培养基，提供利用***作为培养基营养物质的乙醇发酵高温厌氧菌的培养基及其制备方法，***及含其的培养基在生产乙醇和培养乙醇发酵厌氧菌中的应用。添加含水量75％的***在培养基中的重量比浓度不低于0.5％时，可取代目前培养技术中利用的蛋白胨和酵母提取物作为培养基营养物质，达到促进厌氧高温菌的生长繁殖并提高乙醇发酵代谢的效果。提供适用于该类微生物的低成本培养基以及应用该培养基的微生物培养方法和乙醇生产的技术。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及用***或与***成分类似的物质为乙醇发酵厌氧高温菌培养基营养物质的微生物培养基，及其制作方法、培养方法以及利用上述方法的乙醇发酵技术，***及含其的培养基在生产乙醇和培养乙醇发酵厌氧菌中的应用。
背景技术：
微生物培养基是供微生物生长繁殖所需的一组人工配制的营养物质，它必需含有微生物生命活动所必需的水分、碳源、氮源和无机盐类等基本营养物质。部分乙醇发酵高温厌氧菌，如热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)等属于生长因子异养型微生物(auxoheterotrophs)。它们除需要上述的基本营养物质外还必需添加某些特殊的生长因子才能使其正常生长繁殖并生物合成特定的代谢产物。目前主要以蛋白胨和酵母抽提物作为氮源和生长因子，得以促进其微生物的生长繁殖和乙醇发酵的代谢活性。但是由于酵母提取物和蛋白胨的原料来源有限、不易取材、价格昂贵等原因，不适合作为工业发酵培养基的原料。探索利用廉价且容易取材的原料，开发一种经济可行、适合于大规模工业发酵的乙醇发酵高温厌氧菌的培养基，并利用该培养基开发低成本的乙醇发酵高温厌氧菌的培养方法和乙醇生产的技术具有重要的应用前景。迄今，现有乙醇发酵高温厌氧菌的培养技术中未有利用***作为培养基原料的报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种用***为培养基营养物质的微生物培养基，乙醇发酵高温厌氧菌的培养基及其制作方法、培养方法以及利用上述方法的乙醇发酵技术，***及含其的培养基在生产乙醇和培养乙醇发酵厌氧菌中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
乙醇发酵厌氧高温菌培养基，用***或与***成分类似的物质为乙醇发酵厌氧高温菌培养基营养物质。
所述***包括***原有的成分和***的固体或液体成分的任何部分。
***在培养基溶液中的重量比浓度范围为：
(1)添加含水量65-85％的***原液时基础培养基中的重量比浓度范围为0.1-6.0％；
(2)添加经干燥处理的***时，按***干重换算后在基础培养基中的重量比浓度范围为0.1-1％。
所述***包括未经任何处理的***原料和利用下列①-③方法之一进行预处理的***；①物理法预处理：干燥、研磨、粉碎、加热、蒸气***等；②化学法：酸处理、碱处理和酸碱分步处理；③进行结合上述化学法和物理法进行的综合性预处理。
所述与***成分类似的物质包括但不限于豆腐、豆乳。
所述的乙醇发酵厌氧高温菌培养基，在常规基础培养基上添加含水量65-85％的***原液，使其在基础培养基中的重量比浓度范围为0.1-6.0％；或添加经干燥处理的***，按***干重换算后在基础培养基中的重量比浓度范围为0.1-1％。
所述的乙醇发酵厌氧高温菌培养基，每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨：0-10g；微结晶纤维素或葡萄糖2-100g；六水氯化镁0.5-2g；二水氯化钙0.075-0.3g；六水硫酸亚铁0.62-2.5mg；磷酸二氢钾0.75-3.0g；磷酸氢二钾1.5-6.0g；盐酸半胱氨酸0.25-1.0g；刃天青0.25-2.0mg；在上述基础培养液中加入***营养原液，分别配制为含有***0.1-6.0％重量比浓度的培养基。
所述的乙醇发酵厌氧高温菌培养基，每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨10g；微结晶纤维素或葡萄糖5g；六水氯化镁1g；二水氯化钙0.15g；六水硫酸亚铁1.25mg；磷酸二氢钾1.5g；磷酸氢二钾3.0g；盐酸半胱氨酸0.5g；刃天青1.0mg；在上述基础培养液中加入***营养原液，分别配制为含有***0.5％-4％重量比浓度的培养基。
本发明乙醇发酵厌氧高温菌培养基在培养乙醇发酵厌氧菌中的应用。
本发明乙醇发酵厌氧高温菌培养基在生产乙醇中的应用。
本发明在没有添加任何维生素类和酵母提取物等生长因子、并降低蛋白胨含量的标准培养基中添加不同量的***作为乙醇发酵高温厌氧菌的培养基。本发明中作为培养基营养物质的***可包括：(1)使用豆腐制作过程中将豆浆过滤后分离的，含水分(一般含水量为70-80％)的豆渣原液成分。(2)使用上述***的固体成分或液体成分。(3)使用经过下列①-③方法进行预处理的***。①经过干燥、研磨、粉碎、加热、蒸气***等物理法预处理的***；②经过：酸处理、碱处理和酸碱分步处理等化学法预处理的***；③结合上述化学法和物理法进行综合性预处理的***。(4)使用与***成分类似的物质如豆腐、豆乳等。
调整pH值为5-8的上述培养基成分，通过煮沸驱氧、气层置换等物理法或利用催化剂等化学方法制作厌氧培养基后分装到厌氧试管或各种厌氧发酵罐中，高温高压灭菌处理，可作为乙醇发酵高温厌氧菌的培养或高温乙醇发酵工业所使用。
本发明在上述培养基中接种乙醇发酵高温厌氧菌，在60摄氏度下厌氧培养96小时后测定菌体的600nm光密度(optical density，OD600)和培养液中的乙醇含量。并与用酵母提取物为营养成分的培养基进行了比较分析，评价了***的促进效果。结果表明，***对乙醇发酵高温厌氧菌的生长繁殖和乙醇生成的促进效果等同或高于酵母提取物。证实了***可以取代酵母提取物和蛋白胨作为乙醇发酵高温厌氧菌的培养基的营养原料。
通过本发明的技术方案，本发明达到了研制成功一种价格低廉、质量稳定、易于大量取材的培养基原料，从而提供乙醇发酵厌氧高温菌的低成本培养基的制作方法以及利用该培养基的菌种培养和乙醇发酵技术的目的。
由于***中仍然残留丰富的植物纤维、粗蛋白、矿物质、维生素类等营养物质，是一种含水量高、容易腐坏、不易储存和运输的食品副产物，能开发为工业发酵微生物培养基原料。因此本发明在尝试了利用***作为培养基营养物质的可适性研究的基础上，经试验结果表明，***对该类微生物的乙醇发酵代谢和生长繁殖具有促进作用，可取代酵酵母粉和蛋白胨成为培养基的营养原料。本发明利用***取代价格昂贵的酵母提取物和蛋白胨，开发为乙醇发酵高温厌氧菌培养基的营养原料，不仅能降低高温乙醇发酵工艺的培养基成本，还能够促进食品副产物的再利用，从而为推动环境友好型的循环经济的发展。
具体实施方式：
以下所列举的实施例是为进一步解释本发明的内容及其效果，不应视为对本发明范围的限制。
实施例1：
***作为营养物质的培养效果：
***营养原液的配制：称量20g***(湿重)，加入80ml纯水中，搅拌均匀后用适量的NaOH溶液将pH值调整为7，作为***营养原液备用。本试验使用的***是未经任何加工或处理的原料，其水分含量为75％。
乙醇发酵高温厌氧菌的基本培养基的配制：将下列组分溶解于1升纯水中，用NaOH溶液将pH值调整为7，作为高温菌培养试验的基础培养基溶液备用。
培养基组分：蛋白胨(peptone)：10g；酵母提取物(Yeast extract)：0g；微结晶纤维素(Avicel)或葡萄糖(Glucose)：5g；六水氯化镁(MgCl2·6H2O)：1g；二水氯化钙(CaCl2·2H2O)：0.15g；六水硫酸亚铁(FeSO4·6H2O)：1.25mg；磷酸二氢钾(KH2PO4)：1.5g；磷酸氢二钾(K2HPO4)：3.0g；盐酸半胱氨酸(Cysteine-HCl·H2O)：0.5g；刃天青(Resazurin)：1mg。
在基础培养液中加入***营养原液，分别配制为***重量比浓度为含有0.5％、1％、2％、4％的培养试验用培养基溶液，经过煮沸驱氧和铜柱除氧法将10ml培养基分装到螺口厌氧试管中，然后用高压灭菌锅在摄氏120℃条件下进行灭菌处理30分钟。将其作为高温菌培养试验的厌氧培养基。
将指数生长期的热纤梭菌(Clostridium thermocellum ATCC27405)和嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC31550)培养液各0.2ml分别接种到以微结晶纤维素或葡萄糖为碳源的上述培养试验用培养基中，在60℃恒温培养箱中静直培养96小时。培养液供OD600吸光度的测定和乙醇生成量(mM)的分析。结果如表1所示。
如表1所示，培养基中的***的重量比高于0.5％时，具有明显促进细菌的生长繁殖并提高乙醇转换率的效果。但是，将培养基中的***的浓度(比重量)从0.5％提高到4％时，培养夜中菌体OD600值和乙醇生成量都没有显著的变化。
表1培养基添加***为营养原料的效果
添加***的效果
实施例2：
使用的方法与实施例1相同，区别在于每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨：5g；微结晶纤维素或葡萄糖50g；六水氯化镁2g；二水氯化钙0.3g；六水硫酸亚铁2.5mg；磷酸二氢钾3.0g；磷酸氢二钾6.0g；盐酸半胱氨酸1.0g；刃天青2.0mg；在上述基础培养液中加入***营养原液，配制为含有***4.0％重量比浓度的培养基。
实施例3：
使用的方法与实施例1相同，区别在于每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨：10g；微结晶纤维素或葡萄糖100g；六水氯化镁1g；二水氯化钙0.15g；六水硫酸亚铁1.25mg；磷酸二氢钾0.75g；磷酸氢二钾5.0g；盐酸半胱氨酸0.5g；刃天青1.0mg；在上述基础培养液中加入***营养原液，配制为含有***3.0％重量比浓度的培养基。
实施例4：
使用的方法与实施例1相同，区别在于每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨：4g；微结晶纤维素或葡萄糖20g；六水氯化镁0.5g；二水氯化钙0.25g；六水硫酸亚铁2.5mg；磷酸二氢钾2.0g；磷酸氢二钾3.0g；盐酸半胱氨酸0.25g；刃天青0.5mg；在上述基础培养液中加入***营养原液，配制为含有***2.0％重量比浓度的培养基。
实施例5：
使用的方法与实施例1相同，区别在于每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨：3g；微结晶纤维素或葡萄糖40g；六水氯化镁1.5g；二水氯化钙0.1g；六水硫酸亚铁1.25mg；磷酸二氢钾1.25g；磷酸氢二钾1.75g；盐酸半胱氨酸0.5g；刃天青1.0mg；在上述基础培养液中加入***营养原液，配制为含有***6.0％重量比浓度的培养基。
实施例6：
使用的方法与实施例1相同，区别在于每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨：4g；微结晶纤维素或葡萄糖20g；六水氯化镁0.5g；二水氯化钙0.25g；六水硫酸亚铁2.5mg；磷酸二氢钾2.0g；磷酸氢二钾3.0g；盐酸半胱氨酸0.25g；刃天青0.5mg；在上述基础培养液中加入豆腐营养原液，配制为含有豆腐2.0％重量比浓度的培养基。
实施例7：
使用的方法与实施例1相同，区别在于每升培养基中各组分的含量为：蛋白胨：3g；微结晶纤维素或葡萄糖40g；六水氯化镁1.5g；二水氯化钙0.1g；六水硫酸亚铁1.25mg；磷酸二氢钾1.25g；磷酸氢二钾1.75g；盐酸半胱氨酸0.5g；刃天青1.0mg；在上述基础培养液中加入豆乳营养原液，配制为含有豆乳6.0％重量比浓度的培养基。
实施例8：
对比试验例：酵母提取物作为营养物质的培养效果：
酵母提取物原液的配制：称量10g酵母提取物(粉末)，加入90ml纯水中，搅拌均匀后用适量的NaOH溶液将pH值调整为7，作为酵母提取物原液备用。
乙醇发酵高温菌的基本培养基的配制：将下列组分溶解于1升纯水中，用NaOH溶液将pH值调整为7，作为高温菌培养试验的基础培养基溶液备用。
培养基组分：蛋白胨(peptone)：10g；微结晶纤维素(Avicel)或葡萄糖(Glucose)：5g；六水氯化镁(MgCl2·6H2O)：1g；二水氯化钙(CaCl2·2H2O)：0.15g；六水硫酸亚铁(FeSO4·6H2O)：1.25mg；磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.15g；磷酸氢二钾(K2HPO4)：7.0g；盐酸半胱氨酸(Cysteine-HCl·H2O)：0.75g；刃天青(Resazurin)：0.5mg。
在基础培养液中加入酵母提取物原液，分别配制成重量比含量为0％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％的培养试验用培养基溶液，经过煮沸驱氧和铜柱除氧法将10ml培养基分装到螺口厌氧试管中。然后用高压灭菌锅在摄氏120℃条件下进行灭菌处理30分钟。将其作为高温菌培养试验的厌氧培养基。
将指数生长期的热纤梭菌(Clostridium thermocellum ATCC27405)和嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC31550)培养液各0.2ml分别接种到以微结晶纤维素或葡萄糖为碳源的上述培养试验用培养基中，在60℃恒温培养箱中静直培养96小时。培养液供OD600吸光度的测定和乙醇生成量(mM)的分析。结果如表2所示。
表2培养基添加酵母提取物为营养原料的效果
添加酵母提取物的效果
如表2所示，培养基中的酵母提取物浓度(比重量)高于0.2％时，具有明显促进细菌的生长繁殖并提高乙醇生成量的效果。但是，将培养基中的酵母提取物浓度(比重量)从0.4％提高到1.6％时，培养夜的OD600值和乙醇生成量都没有显著的变化。
本发明在实施例中所配制的以***为营养原料的培养基具有等同或优越于目前普遍使用的以蛋白胨和酵母提取物(比较例)，具有促进乙醇发酵高温厌氧菌的生长繁殖和提高乙醇生成量的效果。
Claims (2)
1.乙醇发酵厌氧高温菌培养基，其特征在于在基础培养基中添加***营养原液，使***重量含量为0.1％-6.0％的培养基，所述的基础培养基每升中各组分的含量为：蛋白胨：5-10g，微结晶纤维素或葡萄糖2-100g，六水氯化镁0.5-2g，二水氯化钙0.075-0.3g，六水硫酸亚铁0.62-2.5mg，磷酸二氢钾0.75-3.0g，磷酸氢二钾1.5-6.0g，盐酸半胱氨酸0.25-1.0g，刃天青0.25-2.0mg；所述的***营养原液配制方法如下：称量20g湿重***，加入80ml纯水中，搅拌均匀后用适量的NaOH溶液将pH值调整为7，其中***是未经任何加工或处理的原料，其水分含量为65％-85％。
2.如权利要求1所述的乙醇发酵厌氧高温菌培养基，其中所述***重量含量为0.5％-4％，所述的基础培养基每升中各组分的含量为：蛋白胨10g，微结晶纤维素或葡萄糖5g，六水氯化镁1g，二水氯化钙0.15g，六水硫酸亚铁1.25mg，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾3.0g，盐酸半胱氨酸0.5g，刃天青1.0mg。
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