CN105838652B - 一株强化甘油代谢的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株强化甘油代谢的菌株，所述菌株分类命名为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes）JF1315，已于2016年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016160。本发明还涉及所述产琥珀酸放线杆菌JF1315在发酵生产有机酸中的应用。该菌株在厌氧条件下，相比于对照菌株而言，可以在较低的pH条件下生长代谢，并能高效的利用甘油发酵合成还原型有机酸。在pH4.8‑6.8条件下，该菌株可以正常生长，并代谢葡萄糖合成丁二酸等有机酸；除此之外，在此条件下该菌株可以高效利用甘油进行厌氧发酵，合成并积累有机酸。
Description
技术领域
本发明涉及一株强化甘油代谢的菌株及其应用，属于工业微生物及其发酵技术领域。
背景技术
在传统的微生物发酵领域工程实践过程中中，一般多以糖类物质为碳源进行发酵，如玉米淀粉水解液；对于某些高附加值产品而言，甚至直接以葡萄糖为原料进行产物的合成。虽然采用葡萄糖等原料进行发酵时可以获得较高浓度的产物，但是这极大地增加了整个生产过程的经济成本，造成了资源的浪费。为了解决这一问题，可以试图用廉价生物质材料（如纤维素水解液或甘油）替代葡萄糖进行发酵，但是纤维素水解液中有毒物质的存在及糖浓度较低极大的限制了其应用。
随着生物柴油领域的迅速发展，甘油的合成量巨大（1吨生物柴油可以产生100千克甘油），而对于甘油来说，分子内储存的还原力较高，有利于提高还原性产物的产量及收率。在还原型产物合成过程中，当以葡萄糖为唯一碳源时，葡萄糖经糖酵解途径进行代谢时产生2分子还原力(NADH)，用于强还原型产物合成的还原力会明显不足，产物收率降低；而当以甘油为碳源时，甘油经代谢会产生2分子还原力(NADH)，在此基础之上，菌株生长时也会合成一部分NADH，大量的NADH会增加还原型产物的积累。但是，若合成产物的还原性较低（如丁二酸），菌体内会大量积累NADH，此时过剩的还原力会抑制微生物菌体的生长。为了平衡胞内辅酶代谢，恢复菌体生长的同时保证还原型产物的合成，通过诱变的方式对菌株进行改造，通过适当条件的筛选获得性能优良的菌株。
发明内容
本发明的技术目的之一是提供一株可以高效利用甘油进行厌氧发酵的产琥珀酸放线杆菌。
为实现上述技术目的，本发明采用如下的技术方案：
一株强化甘油代谢的菌株，其分类命名为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315，已于2016年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016160。
本发明所述的产琥珀酸放线杆菌JF1315是将出发菌株产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113 （已公开于同一发明人在先申请的专利中，专利号ZL200610085415.9，保存编号为CGMCC No.1716）经ARTP诱变后，通过邻-硝基苯-β-d-半乳糖苷（ONPG）及荧光染料NPN筛选后获得。筛选后菌株再经厌氧发酵验证其甘油利用及产酸能力。
具体诱变筛选步骤如下：
ARTP诱变：将出发菌株产琥珀酸放线杆菌NJ113接种于装有种子培养基的厌氧血清瓶中培养6-12小时以获得对数生长期的菌株。将种子培养液进行适当稀释至OD660=0.5-1.5后涂布于经高温灭菌并在冰上遇冷的载物铁片上进行诱变。诱变条件选取为：以氦气作为载气，气流量10SLM，电源功率80-120W，诱变时间0-300s，并测定致死率绘制诱变致死曲线。以致死曲线为基准，选取致死率较大（90%以上）的时间为诱变时间，相同条件下对菌株进行诱变处理。
诱变后单菌落分离：将涂布有诱变后种子培养液的载物片放入无菌生理盐水中，混匀后涂布于固体平板培养基中，35-37℃培养8-15小时后分离单菌落。将单菌落接种于含有种子培养基的厌氧血清瓶中，35-37℃培养8-15小时后获得种子培养液。
邻-硝基苯-β-d-半乳糖苷（ONPG）筛选：将种子培养液稀释至OD660=0.5-2.0，取50-200微升稀释液与5-15微升ONPG混合后，于35-37℃下反应2小时后于405nm下检测吸光度值，并将吸光度值较高的菌株进行保存。
荧光染料NPN筛选：将上述筛选到的菌株进行厌氧培养获得种子液后，对种子液进行稀释至OD660=0.5-2.0，取1-3 mL稀释液与10-30微升NPN混合后，于35-37℃下反应2-10分钟后检测荧光值的大小，挑取荧光度值较低的菌株进行保存，即为本发明提供的菌株产琥珀酸放线杆菌JF1315。
上述固体平板培养基和种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L，琼脂粉15-20 g/L。
本发明的另一技术目的是菌株JF1315在生产有机酸的应用。
本发明提供了一种利用本发明提供的菌株厌氧发酵生产丁二酸等有机酸的方法。所述厌氧发酵方法如下：
产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)YJ1315厌氧发酵实验：本发明所述的菌种活化、种子培养步骤是常规的放线杆菌菌种活化方法及种子培养方法，本发明中将产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)JF1315菌株经固体平板培养基活化后，37℃条件下，在厌氧血清瓶中培养12-14小时后转接于种子培养基，在37℃，200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液。
将所述种子液按照6-10 %（v/v）的接种量接种于含有所述发酵培养基的厌氧血清瓶中。
上述发酵培养基配方为：甘油10-60 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红0.1-2.0 mmol/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L,NaH2PO4 1.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。
上述固体平板培养基和种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L，琼脂粉15-20 g/L。
本发明通过对出发菌株进行ARTP诱变，筛选获得一株可以高效利用甘油的菌株JF1315，与出发菌株相比，其有益效果在于：
本发明通过ARTP诱变手段及合理的菌株筛选方法，获得了一株在发酵培养基中能高效利用甘油生长及代谢的菌株。当以甘油为主要碳源时，厌氧条件下菌株可以利用甘油生长并合成还原型代谢产物：厌氧条件下在复合培养基中发酵48小时后，甘油消耗量可达60 g/L，总还原酸累计量达97 g/L。证明了通过ARTP诱变手段可以改变菌体的生长及代谢性能，降低胞内还原力水平，恢复细胞的生长能力，同时在此基础之上，有利于还原型产物的积累及电能的产生。
附图说明
图1是ARTP诱变时的出发菌株致死曲线。
本发明所述的生物材料，其分类命名为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315，已于2016年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国. 武汉. 武汉大学），其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016160。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本实施例说明本发明产琥珀酸放线杆菌JF1315菌株的构建方法。
本发明筛选JF1315菌株采用的出发菌株产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113菌种已公开于同一发明人在先申请的专利中，专利号ZL200610085415.9，保存编号为CGMCC No.1716。
产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315菌株由产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113经ARTP诱变筛选而来。
具体诱变筛选步骤如下：
ARTP诱变：将出发菌株产琥珀酸放线杆菌NJ113接种于装有种子培养基的厌氧血清瓶中培养6-12小时以获得对数生长期的菌株。将种子培养液进行适当稀释至OD660=0.5-1.5后涂布于遇冷的载物片上进行诱变。诱变条件选取为：以氦气作为载气，气流量10SLM，电源功率80-120W，诱变时间0-300s，并测定致死率绘制诱变致死曲线。以致死曲线为基准，选取致死率较大（90%以上）的时间为诱变时间，相同条件下对菌株进行诱变处理。
图1是ARTP诱变时的出发菌株致死曲线。相同诱变强度下，考察了诱变时间对菌株生长的影响。从图1可以看出，诱变时间越长，菌株存活率越低，诱变致死率就越高。
诱变后单菌落分离：将涂布有诱变后种子培养液的载物片放入无菌生理盐水中，混匀后涂布于固体平板中，35-37℃培养8-15小时后分离单菌落。将单菌落接种于含有种子培养基的厌氧血清瓶中，35-37℃培养8-15小时后获得种子培养液。
邻-硝基苯-β-d-半乳糖苷（ONPG）筛选：将种子培养液稀释至OD660=0.5-2.0，取50-200微升稀释液与5-15微升ONPG混合后，于35-37℃下反应2小时后于405nm下检测吸光度值，并将吸光度值较高的菌株进行保存。
荧光染料NPN筛选：将上述筛选到的菌株进行厌氧培养获得种子液后，对种子液进行稀释至OD660=0.5-2.0，取1-3 mL稀释液与10-30微升NPN混合后，于35-37℃下反应2-10分钟后检测荧光值的大小，挑取荧光度值较低的菌株进行保存，即为本发明提供的菌株产琥珀酸放线杆菌JF1315。
上述固体平板培养基和种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L，琼脂粉15-20 g/L。
实施例2
本实施例说明上述实施例1获取的产琥珀酸放线杆菌JF1315的生理生化特征，具体如下：
诱变后菌株与原始菌Actinobacillussuccinogenes NJ113菌落形态及生长性能并无明显差异：菌株革兰氏阴性，平板菌落呈圆形，边缘整齐光滑，厌氧条件下可代谢葡萄糖、木糖合成有机酸，其中主要酸的组成为丁二酸、乙酸、乳酸和甲酸。菌株为谷氨酸缺陷型菌株，在合成培养基上生长时需添加谷氨酸。
实施例1的产琥珀酸放线杆菌JF1315的遗传稳定性测试，菌株传代发酵实验如下所示。
诱变后的菌株Actinobacillus succinogenes JF1315在低pH(5.0-6.0)条件下进行连续传代培养，定期取样测定不同代时时细胞在低pH条件下细胞的生长及产酸性能，结果如下表1所示。当细胞连续传代培养至10代后，在酸性条件下生长和产酸性能未受影响。
表1. 低pH条件下传代细胞的生长及产酸性能
实施例3
本实施例说明本发明中诱变后菌株Actinobacillus succinogenes JF1315相比出发菌株的优越性。
本发明中将琥珀酸放线杆菌NJ113和JF1315菌株通过固体平板培养基培养后接种至种子培养基中培养得到种子液；然后将种子液接种到低pH发酵培养基中进行厌氧发酵。所述方法可以包括以下步骤：
（1）产琥珀酸放线杆菌NJ113和JF1315菌株经固体平板培养基活化后转接至厌氧血清瓶，37℃，厌氧条件下培养12-14小时后转接于种子培养基，在37℃，200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液；
（2）将上述种子液按照6-10 %(v/v)的接种量接种于含有低pH发酵培养基(pH5.8)的血清瓶中，于37℃进行厌氧发酵48小时候取样，测定菌体浓度及有机酸含量。
上述固体平板培养基和种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L，琼脂粉15-20 g/L。
上述发酵培养基的配方为：葡萄糖10 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红0.1-2.0 mmol/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L,NaH2PO4 1.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L
检测的有机酸浓度如表2所示：
表2
根据表2，无论是原始菌株NJ113还是诱变菌株JF1315，均能在pH=4.8-6.8范围内存活并发酵生产有机酸，且在pH=6.8时达到最佳的生长和代谢性能。
实施例4本实施例说明本发明中菌株厌氧发酵生产有机酸的方法。
本发明中将产琥珀酸放线杆菌菌株通过固体平板培养基培养后接种至种子培养基中培养得到种子液；然后将种子液接种到发酵培养基中进行厌氧发酵。所述方法可以包括以下步骤：
（1）产琥珀酸放线杆菌菌株经固体平板培养基活化后转接至厌氧血清瓶，37℃，厌氧条件下培养12-14小时后转接于种子培养基，在37℃，200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液；
（2）将上述种子液按照6-10 %(v/v)的接种量接种于含有发酵培养基的电化学装置中，于37℃进行厌氧发酵。
（3）在发酵过程中每隔一段时间进行无菌取样，对样品离心处理后测定碳源及有机酸浓度。
上述固体平板培养基和种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L，琼脂粉15-20 g/L。
实施例5
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113进行厌氧发酵生产有机酸的方法。
产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113按实施例4所述方法进行活化，活化后的以及种子培养12小时，二级种子培养10小时后，将获得种子液后接种于含有发酵培养基的厌氧血清瓶中（发酵pH控制在6.8），同时通入二氧化碳2分钟以保证厌氧环境。发酵48小时后将发酵液样品离心后保留上清，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为：甘油10 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红 1.0 mmol/L, NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。
检测的有机酸浓度如表3所示：
表3 厌氧发酵48h后有机酸含量
实施例6
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315进行厌氧发酵生产有机酸的方法。
产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315按实施例4所述方法进行活化，活化后的以及种子培养12小时，二级种子培养10小时后，将获得种子液后接种于含有发酵培养基的厌氧血清瓶中（发酵pH控制在6.8），同时通入二氧化碳2-3分钟以保证厌氧环境。发酵48小时后将发酵液样品离心后保留上清，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为：甘油10 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红 1.0 mmol/L ，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。
检测的有机酸浓度如表4所示：
表4厌氧发酵48h后有机酸含量
实施例7
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315进行厌氧发酵生产有机酸的方法。
产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315按实施例4所述方法进行活化，活化后的以及种子培养12小时，二级种子培养10小时后，将获得种子液后接种于含有发酵培养基的厌氧血清瓶中（发酵pH控制在6.8），同时通入二氧化碳以保证厌氧环境。发酵48小时后将发酵液样品离心后保留上清，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为：甘油20 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红 1.0 mmol/L ，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。检测的有机酸浓度如表5所示：
表5厌氧发酵48h后有机酸含量
实施例8
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315进行厌氧发酵生产有机酸的方法。
产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315按实施例4所述方法进行活化，活化后的以及种子培养12小时，二级种子培养10小时后，将获得种子液后接种于含有发酵培养基的厌氧血清瓶中（发酵pH控制在6.8），同时通入二氧化碳以保证厌氧环境。发酵48小时后将发酵液样品离心后保留上清，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为：甘油30 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红 1.0 mmol/L ，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。
检测的有机酸浓度如表6所示：
表6厌氧发酵48h后有机酸含量
实施例9
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315进行厌氧发酵生产有机酸的方法。
产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）JF1315按实施例4所述方法进行活化，活化后的以及种子培养12小时，二级种子培养10小时后，将获得种子液后接种于含有发酵培养基的厌氧血清瓶中（发酵pH控制在6.8），同时通入二氧化碳以保证厌氧环境。发酵48小时后将发酵液样品离心后保留上清，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为：甘油60 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红 1.0 mmol/L ，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2PO41.6 g/L, Na2HPO4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。
检测的有机酸浓度如表7所示：
表7厌氧发酵48h后有机酸含量
Claims (8)
1.一株强化甘油代谢的菌株，其特征在于，所述菌株分类命名为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes），自命名JF1315，已于2016年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016160。
2.权利要求1所述菌株在生产有机酸中的应用，其特征在于，所述有机酸为丁二酸、乙酸、乳酸和甲酸。
3.根据权利要求2所述菌株在生产有机酸中的应用，其特征在于，所述菌株的发酵培养pH范围为4.8-6.8。
4.根据权利要求2或3所述菌株在生产有机酸中的应用，其特征在于，所述菌株的发酵培养pH为6.8。
5.根据权利要求2所述菌株在生产有机酸中的应用，其特征在于，所述菌株的发酵培养过程中，以甘油或葡萄糖为发酵培养碳源。
6.根据权利要求2所述菌株在生产有机酸中的应用，其特征在于，所述菌株的发酵培养过程中，以高浓度甘油为碳源，所述甘油浓度为10 g/L ~60 g/L。
7.根据权利要求2所述菌株在生产有机酸中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）产琥珀酸放线杆菌菌株经固体平板培养基活化后转接至厌氧血清瓶，37℃，厌氧条件下培养12-14小时后转接于种子培养基，在37℃，200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液；
（2）将步骤（1）所述种子液按照6-10%(v/v)的接种量接种于含有发酵培养基的电化学装置中，于37℃进行厌氧发酵；
（3）在发酵过程中每隔一段时间进行无菌取样，对样品离心处理后测定碳源及有机酸浓度。
8.根据权利要求7所述菌株在生产有机酸中的应用，其特征在于，
所述固体平板培养基和种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，NaH2PO4 1.6g/L，Na2HPO4 0.3 g/L，K2HPO4 3 g/L，琼脂粉15-20 g/L；
所述发酵培养基配方为：甘油10~60 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，酵母粉10 g/L，乙酸钠1.36 g/L，中性红1.0 mmol/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，NaH2PO4 1.6g/L，Na2HPO4 0.3 g/L，K2HPO4 3 g/L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |