CN105506048A

CN105506048A - 一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法

Info

Publication number: CN105506048A
Application number: CN201511028714.4A
Authority: CN
Inventors: 钟锦潮; 蒋四富; 陈必钦; 文昌; 严必能; 赖荣乾; 戴昌华
Original assignee: Inner Mongolia Kingdomway Pharmaceutical Co Ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Current assignee: Inner Mongolia Kingdomway Pharmaceutical Co Ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2035-12-31
Also published as: CN105506048B

Abstract

本发明公开了一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)一级种子培养；(3)二级种子培养；(4)发酵培养。本发明对设备要求不高、成本投入较小，且原料来源广泛，成本低，β-胡萝卜素的产量较改进前工艺明显提高，因此，可实现规模化生产。

Description

一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法

技术领域

本发明涉及一种制备β-胡萝卜素的发酵方法，特别是涉及一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法。

背景技术

β-胡萝卜素是一种脂溶性不饱和脂肪族碳氢化合物，是类胡萝卜素族的典型代表，也是自然界中最普遍存在最稳定的天然色素，广泛存在于绿色和黄色蔬菜以及水果中。其分子式为C₄₀H₅₆，分子量为536.88，外观呈深红色至暗红色，对氧、热和光不稳定，易发生氧化还原反应，不易溶于水、酸和碱，易溶于氯仿、苯和植物油，微溶于乙醇和***。除了常用作着色剂以外，β-胡萝卜素还具有多种生物活性，是一种与人体健康密切相关的药用有效成分。研究发现，由于β-胡萝卜素的分子式含有2个β-紫罗酮环和4个异戊二烯侧链，中间断裂后即产生两个维生素A分子，在被人体吸收后可以作为维生素A的前体物质；此外，其分子中含有的不饱和结构使它具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，能够有效的预防、延缓和治疗某些疾病，尤其是癌症，同时也能提高机体的免疫功能。因此，在食品、药品、化妆品、和保健品行业得到了广泛的应用。

天然来源的β-胡萝卜素与合成的β-胡萝卜素相比，由于其来源广泛、不含致癌物质、成本较低且生理活性好，在市场上占有主导地位。近年来，国内外天然β-胡萝卜素的生产多采用微生物发酵的方法，利用微生物进行发酵生产具有生产周期短、过程容易控制、不受地域及气候的影响、容易进行规模化操作等优势。在实验过程中，研究人员已经获得了一些具有生产价值的优良菌株，如三孢布拉霉、分歧杆菌、红假单胞菌及红法夫酵母等，其中三孢布拉霉的性能较佳，在生产上也得到较广泛的使用。

三孢布拉霉(Blakesleatrispora)属于毛霉目、笄霉科，是单细胞低等真菌。在一定的培养条件下生长迅速，能在较短的时间内达到较大的生物量，适用于规模化的生产。此外，还有一个特殊之处是三孢布拉霉属于异宗结合菌，分为正、负2种，这两种单性菌株在形态上没有明显的差别，单独培养能够进行无性繁殖，当它们混合发酵时正负菌株的菌丝体互相接触，发生异宗配合进行有性繁殖，即可获得较高产量的β-胡萝卜素。目前，国内外许多学者都在着手探索提高三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的工艺条件，以使其更适合工业化大生产。由于丝状真菌三孢布拉霉本身的生长特性，其发酵培养基多采用粘性较大的物质(如淀粉、大豆粉等)来充当碳氮源，以有利于丝状真菌菌丝的延长，最终形成菌丝球，但粘度较大的发酵液多数时间属于非牛顿性流体，对氧的传递有较大的影响；而且在发酵前期，菌体的快速生长使其对溶氧及营养物质的需求比较高，随着菌体浓度的增加进一步加大了发酵液粘度，从而导致溶氧成为限制菌体生长、产物合成的关键因素，甚至引起代谢异常，影响目标产物的产量。

因此，在以三孢布拉霉为菌株生产β-胡萝卜素的发酵过程中，科研工作者多通过诱变筛选优良菌株或改变发酵的搅拌形式、溶氧供给方式，在发酵过程中添加氧载体或添加能够增加菌体细胞通透性的表面活性剂来提高发酵液中氧浓度及氧的利用率，这些研究对发酵过程的改善有一定的效果，但也存在着这样或那样的不足，或者是最终的产量低，或者是由于设备复杂导致成本高，也有的是仅仅针对一个方面而没有对发酵过程进行综合的考虑。我国专利CN1331343A中公开了一种对搅拌桨叶的形式进行改变的工艺，采用上中层为宽叶推进式、下层为涡轮式的组合式搅拌桨叶，提高了发酵液的传质性能，不过改变搅拌形式后只能适合该菌株的生产特性，不利于发酵罐的全面利用；专利CN102787158A中通过对接种前的培养基进行胶体磨高速剪切乳化来提高发酵液夹带的氧浓度，该技术对设备要求比较高、成本投入较大而且对发酵的工艺并未进行过多的探索，主要对后续的提取工艺进行了深入的研究；专利CN1193048A利用气升式发酵罐进行三孢布拉霉发酵制备β-胡萝卜素，该方法能够较好的避免剪切力，有利于菌丝的生长从而获得较大的生物量，但最终的产量较低，也不容易进行规模化的大生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，即通过调整培养基的配方和制备工艺，将淀粉进行预处理获得粘度适中的发酵培养基，并结合菌体本身的生长变化规律进行补料，从而提高溶解氧浓度并使其得到合理、高效的利用，该方法对提高β-胡萝卜素的产量效果显著。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)一级种子培养；(3)二级种子培养；(4)发酵培养；其中，

(1)菌种活化：在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基上，置于培养箱内，26～30℃培养4～5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为：正菌10⁴个孢子/mL，负菌10⁵个孢子/mL；其中，三孢布拉霉(Blakesleatrispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC14271(+)，ATCC14272(-)；

(2)一级种子培养：将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28℃，转速为400～600r/min，通气量为0.6～0.8vvm，罐压为0.03～0.06MPa，培养时间为20～36h；负菌株的培养温度为28℃，转速为500～700r/min，通气量为0.6～0.8vvm，罐压为0.03～0.06MPa，培养时间为20～36h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液；

(3)二级种子培养：将所述步骤(2)培养得到的所述三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，所述三孢布拉霉正菌株一级种子液与所述三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:5～1:10，接种量为10～15％，培养时间为10～20h，培养条件为：28℃，转速为600～900r/min，通气量为0.6～0.8vvm，罐压为0.03～0.06MPa，得到二级种子液；

(4)发酵培养：采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为10～15％，在pH5.5～7.0的条件下培养96～120h，培养条件为：28℃，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制；发酵过程需要补入植物油，根据取样检测结果补入淀粉水解液，根据菌体的生长情况进行补稀料；其中，发酵培养基组成为：所述淀粉水解液、大豆蛋白粉、鱼粉、植物油、硫酸铜、硫酸镁、磷酸二氢钾、V_E、乳化剂。

具体的，所述步骤(2)每升一级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖22～26g，所述大豆蛋白粉26～30g，所述硫酸镁0.8～1.0g，所述磷酸二氢钾3～5g，氯化钙0.06～0.1g，所述硫酸铜0.06～0.1g，所述V_E0.025～0.05g，所述乳化剂0.5～2g；所述步骤(3)每升二级种子培养基中包括如下重量份组分：所述葡萄糖22～26g，所述大豆蛋白粉26～30g，所述硫酸镁0.8～1.0g，所述磷酸二氢钾3～5g，所述氯化钙0.06～0.1g，所述硫酸铜0.06～0.1g，所述V_E0.025～0.05g，所述乳化剂0.5～2g。

具体的，所述步骤(4)每升所述发酵培养基中具体包括如下组分：所述淀粉水解液0.2～0.4L、所述大豆蛋白粉12～18g、所述鱼粉26～32g、所述植物油20～40g、所述硫酸铜0.06～0.08g、所述硫酸镁0.8～1.0g、所述磷酸二氢钾3～5g、所述V_E0.025～0.05g、所述乳化剂0.5～2g；并用氢氧化钠或氢氧化钾调节所述发酵培养基pH为5.5～7.0。

具体的，所述淀粉水解液由如下方法制得：将淀粉与水配制成淀粉乳，然后加入盐酸搅拌均匀后反应，反应结束后，用所述氢氧化钠或所述氢氧化钾中和制得pH为6.5-7.5的所述淀粉水解液。

进一步的，所述淀粉乳的质量百分比浓度为15～20％，所述盐酸添加量为所述淀粉乳体积总量的0.4～0.6％，所述盐酸为市售浓盐酸，所述淀粉乳与所述盐酸的反应温度控制在40～60℃，反应时间为1～3h。

具体的，所述淀粉为玉米淀粉、番薯淀粉或马铃薯淀粉中的任意一种。

具体的，所述步骤(4)发酵过程中转速和通气量的调节策略为：发酵前期，转速为120～150r/min，通气量为0.6～0.8vvm，罐压为0.03～0.06MPa；随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达到50～60h时，将转速调节为170～250r/min，通气量调节为0.8～1.2vvm，罐压调节为0.03～0.06MPa，然后补入所述稀料，所述稀料包括β-紫罗兰酮和苹果酸，一次补入所述β-紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的0.1～0.4％，一次补入所述苹果酸的量为所述发酵液体积总量的0.1～0.3％。

具体的，所述步骤(4)中，在发酵30～40h时一次补入所述植物油，每升所述发酵液中补入1～3g所述植物油；在发酵过程中，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入所述淀粉水解液，控制所述发酵液中残糖含量为6～10g/L。

具体的，所述植物油为玉米油、大豆油、葵花籽油或棕榈油中的任意一种或几种；所述乳化剂为司班系列产品或吐温系列产品。

与现有技术相比，本发明利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法具有如下优点和显著的进步性：

首先，本发明在发酵培养基配制前将淀粉酸化水解处理，促使淀粉分子在酸解反应过程中糖苷键断裂，从而导致淀粉分子的聚合度急剧降低，淀粉粘度值急剧下降，可以有效地改善发酵液的物理性质，从而提高了溶解氧的浓度，能够满足菌丝体在发酵初期快速积累时对氧气的消耗；同时，淀粉水解液的主要成分是葡萄糖，其次是少量麦芽糖及其它一些二糖、低聚糖等复合糖类，这些物质能够在发酵前期满足菌体快速生长，而部分未完全水解的淀粉，则在菌体积累一定的生物量后成为慢速利用碳源，有利于产物合成。因此，淀粉前处理操作兼顾了生产菌的营养特性和产物合成，从而大大提高了β-胡萝卜素的产量。

其次，本发明在培养基粘度降低的基础上，根据菌体的生长情况分阶段进行通气量的改变，既有利于菌体生长和产物合成又降低了能耗，节约了能源；而且补料直接用淀粉水解物除了能够对β-胡萝卜素的发酵单位有所提高外，与补料用葡萄糖相比，补料量有所降低，从而也降低了原料成本。

第三，本发明对设备要求不高、成本投入较小，且原料来源广泛，成本低，β-胡萝卜素的产量较改进前工艺明显提高，因此，可实现规模化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但以下实施例并不构成对本发明的限制。

实施例1：一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)一级种子培养；(3)二级种子培养；(4)发酵培养；其中，

(1)菌种活化：在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，适于真菌生长)上，置于培养箱内，26℃培养4d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为：正菌10⁴个孢子/mL，负菌10⁵个孢子/mL；其中，三孢布拉霉(Blakesleatrispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC14271(+)，ATCC14272(-)；

(2)一级种子培养：将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28℃，转速为400r/min，通气量为0.6vvm，罐压为0.03MPa，培养时间为36h；负菌株的培养温度为28℃，转速为500r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.0～0.06MPa，培养时间为20h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液；每升一级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖22g，大豆蛋白粉26g，硫酸镁0.8g，磷酸二氢钾3g，氯化钙0.06g，硫酸铜0.06g，V_E0.025g，吐温-600.5g；

(3)二级种子培养：将步骤(2)培养得到的三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，三孢布拉霉正菌株一级种子液与三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:10，接种量为10％，培养时间为20h，培养条件为：28℃，转速为900r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.03MPa，得到二级种子液；每升二级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖22g，大豆蛋白粉26g，硫酸镁0.8g，磷酸二氢钾3g，氯化钙0.06g，硫酸铜0.06g，V_E0.025g，吐温-600.5g。

(4)发酵培养：采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为10％，在pH5.5的条件下培养96h，培养条件为：28℃，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制，转速和通气量的调节策略为：发酵前期，转速为120r/min，通气量为0.6vvm，罐压为0.03MPa；随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达到56h时，将转速调节为170r/min，通气量调节为0.8vvm，罐压调节为0.06MPa，然后补入稀料，稀料包括β-紫罗兰酮和苹果酸，一次补入β-紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的0.1％，一次补入苹果酸的量为发酵液体积总量的0.1％。在发酵30h时一次补入玉米油，每升发酵液中补入1g植物油；在发酵过程中每隔4h取样测残糖，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入淀粉水解液，控制发酵液中残糖含量为6～10g/L。

每升发酵培养基中具体包括如下组分：淀粉水解液0.2L、大豆蛋白粉12g、鱼粉26g、玉米油20g、硫酸铜0.06g、硫酸镁0.8g、磷酸二氢钾3g、V_E0.025g、吐温-600.5g；并用氢氧化钠调节发酵培养基pH为5.5。

其中，淀粉水解液由如下方法制得：将玉米淀粉与水配制成淀粉乳，淀粉乳的质量百分比浓度为20％，然后加入盐酸，盐酸添加量为淀粉乳体积总量的0.6％，盐酸为市售浓盐酸，淀粉乳与盐酸搅拌均匀后反应，反应温度控制在40℃，反应时间为1h。反应结束后，用氢氧化钠中和制得pH为6.5的淀粉水解液。

收集发酵液获得菌体，测得干重达到59.5g/L，高效液相色谱法检测发酵液中β-胡萝卜素单位可达3.55g/L，β-胡萝卜素在干菌体中的百分比为5.97％。

实施例2：一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)一级种子培养；(3)二级种子培养；(4)发酵培养；其中，

(1)菌种活化：在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，适于真菌生长)上，置于培养箱内，30℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为：正菌10⁴个孢子/mL，负菌10⁵个孢子/mL；其中，三孢布拉霉(Blakesleatrispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC14271(+)，ATCC14272(-)；

(2)一级种子培养：将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28℃，转速为600r/min，通气量为0.6vvm，罐压为0.06MPa，培养时间为20h；负菌株的培养温度为28℃，转速为700r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.06MPa，培养时间为20h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液；每升一级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖26g，大豆蛋白粉30g，硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾5g，氯化钙0.1g，硫酸铜0.1g，V_E0.05g，司班-402g；

(3)二级种子培养：将步骤(2)培养得到的三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，三孢布拉霉正菌株一级种子液与三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:5，接种量为15％，培养时间为10h，培养条件为：28℃，转速为900r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.06MPa，得到二级种子液；每升二级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖26g，大豆蛋白粉30g，硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾5g，氯化钙0.1g，硫酸铜0.1g，V_E0.05g，司班-402g。

(4)发酵培养：采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为15％，在pH7.0的条件下培养120h，培养条件为：28℃，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制，转速和通气量的调节策略为：发酵前期，转速为150r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.06MPa；随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达到60h时，将转速调节为250r/min，通气量调节为1.2vvm，罐压调节为0.06MPa，然后补入稀料，稀料包括β-紫罗兰酮和苹果酸，一次补入β-紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的0.4％，一次补入苹果酸的量为发酵液体积总量的0.3％。在发酵30h时一次补入大豆油，每升发酵液中补入1g大豆油；在发酵过程中每隔4h取样测残糖，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入淀粉水解液，控制发酵液中残糖含量为6～10g/L。

每升发酵培养基中具体包括如下组分：淀粉水解液0.4L、大豆蛋白粉18g、鱼粉32g、大豆油40g、硫酸铜0.08g、硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾5g、V_E0.05g、司班-402g；并用氢氧化钾调节发酵培养基pH为7.0。

其中，淀粉水解液由如下方法制得：将番薯淀粉与水配制成淀粉乳，淀粉乳的质量百分比浓度为15％，然后加入盐酸，盐酸添加量为淀粉乳体积总量的0.4％，盐酸为市售浓盐酸，淀粉乳与盐酸搅拌均匀后反应，反应温度控制在40℃，反应时间为3h。反应结束后，用氢氧化钾中和制得pH为7.5的淀粉水解液。

收集发酵液获得菌体，测得干重达到65.2g/L，高效液相色谱法检测发酵液中β-胡萝卜素单位可达4.68g/L，β-胡萝卜素在干菌体中的百分比为7.18％。

实施例3：一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)一级种子培养；(3)二级种子培养；(4)发酵培养；其中，

(1)菌种活化：在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，适于真菌生长)上，置于培养箱内，28℃培养4d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为：正菌10⁴个孢子/mL，负菌10⁵个孢子/mL；其中，三孢布拉霉(Blakesleatrispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC14271(+)，ATCC14272(-)；

(2)一级种子培养：将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28℃，转速为500r/min，通气量为0.7vvm，罐压为0.04MPa，培养时间为28h；负菌株的培养温度为28℃，转速为600r/min，通气量为0.7vvm，罐压为5MPa，培养时间为28h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液；每升一级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖24g，大豆蛋白粉28g，硫酸镁0.9g，磷酸二氢钾4g，氯化钙0.08g，硫酸铜0.08g，V_E0.035g，司班-401.5g；

(3)二级种子培养：将步骤(2)培养得到的三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，三孢布拉霉正菌株一级种子液与三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:8，接种量为12％，培养时间为15h，培养条件为：28℃，转速为750r/min，通气量为0.7vvm，罐压为0.05MPa，得到二级种子液；每升二级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖24g，大豆蛋白粉28g，硫酸镁0.9g，磷酸二氢钾4g，氯化钙0.08g，硫酸铜0.08g，V_E0.035g，司班-401.5g。

(4)发酵培养：采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为12％，在pH6的条件下培养105h，培养条件为：28℃，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制，转速和通气量的调节策略为：发酵前期，转速为130r/min，通气量为0.7vvm，罐压为0.04MPa；随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达到55h时，将转速调节为210r/min，通气量调节为1.0vvm，罐压调节为0.04MPa，然后补入稀料，稀料包括β-紫罗兰酮和苹果酸，一次补入β-紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的0.2％，一次补入苹果酸的量为发酵液体积总量的0.2％。在发酵35h时一次补入葵花籽油，每升发酵液中补入2g葵花籽油；在发酵过程中每隔4h取样测残糖，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入淀粉水解液，控制发酵液中残糖含量为6～10g/L。

每升发酵培养基中具体包括如下组分：淀粉水解液0.3L、大豆蛋白粉15g、鱼粉29g、葵花籽油30g、硫酸铜0.07g、硫酸镁0.9g、磷酸二氢钾4g、V_E0.035g、司班-401g；并用氢氧化钠调节发酵培养基pH为6。

其中，淀粉水解液由如下方法制得：将马铃薯淀粉与水配制成淀粉乳，淀粉乳的质量百分比浓度为18％，然后加入盐酸，盐酸添加量为淀粉乳体积总量的0.5％，盐酸为市售浓盐酸，淀粉乳与盐酸搅拌均匀后反应，反应温度控制在50℃，反应时间为2h。反应结束后，用氢氧化钠中和制得pH为7的淀粉水解液。

收集发酵液获得菌体，测得干重达到62.3g/L，高效液相色谱法检测发酵液中β-胡萝卜素单位可达4.01g/L，β-胡萝卜素在干菌体中的百分比为6.44％。

对比实施例：本实施例与实施例1不同之处在于：

1)步骤(4)中发酵培养基采用等量的淀粉替代淀粉水解液，中间取样检测残糖低于5g/L时补入葡萄糖，并使残糖的控制范围在6～10g/L；2)步骤(4)发酵过程中工艺的控制策略为：转速200r/min，通气量1.0vvm，罐压0.06MPa，温度28℃，pH6.5条件下发酵120h结束，过程中于50h补入0.1％的β-紫罗兰酮和0.1％的苹果酸；其余步骤及参数完全相同。

发酵完成后收集发酵液获得菌体，测得干重为80.3g/L，高效液相色谱法检测发酵液中β-胡萝卜素单位只有1.72g/L，β-胡萝卜素在干菌体中的百分比为2.14％，明显低于实施例1获得的β-胡萝卜素在干菌体中的百分比。

Claims

1.一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)一级种子培养；(3)二级种子培养；(4)发酵培养；其中，

(1)菌种活化：在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基上，置于培养箱内，26～30℃培养4～5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为：正菌10⁴个孢子/mL，负菌10⁵个孢子/mL；

2.根据权利要求1所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)每升一级种子培养基中包括如下重量份组分：葡萄糖22～26g，所述大豆蛋白粉26～30g，所述硫酸镁0.8～1.0g，所述磷酸二氢钾3～5g，氯化钙0.06～0.1g，所述硫酸铜0.06～0.1g，所述V_E0.025～0.05g，所述乳化剂0.5～2g；所述步骤(3)每升二级种子培养基中包括如下重量份组分：所述葡萄糖22～26g，所述大豆蛋白粉26～30g，所述硫酸镁0.8～1.0g，所述磷酸二氢钾3～5g，所述氯化钙0.06～0.1g，所述硫酸铜0.06～0.1g，所述V_E0.025～0.05g，所述乳化剂0.5～2g。

3.根据权利要求1所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述步骤(4)每升所述发酵培养基中具体包括如下组分：所述淀粉水解液0.2～0.4L、所述大豆蛋白粉12～18g、所述鱼粉26～32g、所述植物油20～40g、所述硫酸铜0.06～0.08g、所述硫酸镁0.8～1.0g、所述磷酸二氢钾3～5g、所述V_E0.025～0.05g、所述乳化剂0.5～2g；并用氢氧化钠或氢氧化钾调节所述发酵培养基pH为5.5～7.0。

4.根据权利要求1或3所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述淀粉水解液由如下方法制得：将淀粉与水配制成淀粉乳，然后加入盐酸搅拌均匀后反应，反应结束后，用所述氢氧化钠或所述氢氧化钾中和制得pH为6.5-7.5的所述淀粉水解液。

5.根据权利要求4所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述淀粉乳的质量百分比浓度为15～20％，所述盐酸添加量为所述淀粉乳体积总量的0.4～0.6％，所述淀粉乳与所述盐酸的反应温度控制在40～60℃，反应时间为1～3h。

6.根据权利要求5所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述淀粉为玉米淀粉、番薯淀粉或马铃薯淀粉中的任意一种。

7.根据权利要求1所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述步骤(4)发酵过程中转速和通气量的调节策略为：发酵前期，转速为120～150r/min，通气量为0.6～0.8vvm，罐压为0.03～0.06MPa；发酵时间达到50～60h时，将转速调节为170～250r/min，通气量调节为0.8～1.2vvm，罐压调节为0.03～0.06MPa，然后补入所述稀料，所述稀料包括β-紫罗兰酮和苹果酸，一次补入所述β-紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的0.1～0.4％，一次补入所述苹果酸的量为所述发酵液体积总量的0.1～0.3％。

8.根据权利要求1所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述步骤(4)中，在发酵30～40h时一次补入所述植物油，每升所述发酵液中补入1～3g所述植物油；在发酵过程中，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入所述淀粉水解液，控制所述发酵液中残糖含量为6～10g/L。

9.根据权利要求2或3或8所述的一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其特征在于，所述植物油为玉米油、大豆油、葵花籽油或棕榈油中的任意一种或几种；所述乳化剂为司班系列产品或吐温系列产品。