CN105461720B - 吗啉类酪氨酸激酶抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药化学领域，涉及一类吗啉类酪氨酸激酶抑制剂，具体涉及一类具有Bruton’s tyrosine kinase(BTK)抑制活性的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，以及含有这些化合物的药物组合物和这些化合物或组合物在药物制备中的应用，本发明提供的化合物表现出优于Ibrutinib的BTK抑制活性。
Description
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及一类具有Bruton’s tyrosine kinase(BTK)抑制活性的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，以及含有这些化合物的药物组合物和这些化合物或组合物在药物制备中的应用。
发明背景
B细胞受体(BCR)介导的信号通路对于包括CLL在内的多种淋巴瘤的生存具有重要作用，而Bruton’s tyrosine kinase(BTK)是BCR途径中的关键酶之一。BTK属于非受体酪氨酸激酶Tec家族，除了T淋巴细胞和自然杀伤细胞外，在B淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞等髓系细胞中均有表达，参与生物体内多种信号通路，对于细胞的增殖、分化和凋亡都具有十分重要的作用。
BTK参与了B细胞介导的信号通路，其通过在Src家族分子作用下发生Tyr551位点和Tyr223位点磷酸化后，激活磷脂酶C(PLC-γ)，进而催化细胞膜上的二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解生成第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)，激活下游信号通路。研究表明BTK还参与了Toll样受体介导的信号通路，肥大细胞脱颗粒，Fas、G蛋白偶联受体介导的信号通路等。此外，已经有报道BTK在细胞凋亡中发挥作用。因此，开发BTK抑制剂，对于淋巴瘤、白血病都将是非常有效的。
发明内容
本发明的一个目的是提供通式I的一类具有BTK抑制活性的1-吗啉基取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶类化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，
其中，
X选自键、CH2、O、S、S(O)2、NH、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-；
Y选自氢、卤素、烷基、卤代烷基；
R1选自芳基、C1-6烷基芳基、杂芳基、C1-6烷基杂芳基、C2-4炔基，所述的芳基、杂芳基或炔基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰氨基、烷基酰基氨基、氨基酰基、单烷基氨基酰基、双烷基氨基酰基、酰基、烷基酰基、羟烷基、单烷基氨基、双烷基氨基、单烷基氨基烷基、双烷基氨基烷基、硝基、氰基取代；
R2选自芳基、杂芳基，所述的芳基、杂芳基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰氨基、烷基酰基氨基、氨基酰基、单烷基氨基酰基、双烷基氨基酰基、酰基、烷基酰基、羟烷基、单烷基氨基、双烷基氨基、单烷基氨基烷基、双烷基氨基烷基、硝基、氰基取代；
R3选自-C(O)-R4、-S(O)2-R4，其中R4选自C2-4烯基、C2-4炔基，所述的烯基或炔基可以被一个或多个氰基、烷基、环烷基、卤代烷基、卤代环烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷氧烷基、氨基、单烷基氨基、双烷基氨基、环烷基氨基、氨基烷基、单烷基氨基烷基、双烷基氨基烷基、环烷基氨基烷基、饱和杂环基、饱和杂环基烷基、杂芳基、杂芳基烷基取代。
本发明的另一个目的是提供制备本发明的通式I的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药的方法。
本发明的再一个目的是提供包含本发明的通式I的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药和药学可接受的载体的组合物，以及包含本发明的通式I的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药和另一种或多种BTK抑制剂的组合物。
本发明的还一个目的是提供本发明的通式I的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药治疗和/或预防BTK异常引起的疾病，例如B细胞淋巴瘤、白血病等，以及本发明的通式I的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药在制备用于治疗和/或预防BTK异常引起的疾病的药物中的应用。
针对上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供通式I的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，
其中，
X选自键、CH2、O、S、S(O)2、NH、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-；
Y选自氢、卤素、烷基、卤代烷基；
R1选自芳基、C1-6烷基芳基、杂芳基、C1-6烷基杂芳基、C2-4炔基，所述的芳基、杂芳基或炔基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰氨基、烷基酰基氨基、氨基酰基、单烷基氨基酰基、双烷基氨基酰基、酰基、烷基酰基、羟烷基、单烷基氨基、双烷基氨基、单烷基氨基烷基、双烷基氨基烷基、硝基、氰基取代；
R2选自芳基、杂芳基，所述的芳基、杂芳基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰氨基、烷基酰基氨基、氨基酰基、单烷基氨基酰基、双烷基氨基酰基、酰基、烷基酰基、羟烷基、单烷基氨基、双烷基氨基、单烷基氨基烷基、双烷基氨基烷基、硝基、氰基取代；
R3选自-C(O)-R4、-S(O)2-R4，其中R4选自C2-4烯基、C2-4炔基，所述的烯基或炔基可以被一个或多个氰基、烷基、环烷基、卤代烷基、卤代环烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷氧烷基、氨基、单烷基氨基、双烷基氨基、环烷基氨基、氨基烷基、单烷基氨基烷基、双烷基氨基烷基、环烷基氨基烷基、饱和杂环基、饱和杂环基烷基、杂芳基、杂芳基烷基取代。
在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，其中：
X选自键、CH2、O、S；
进一步优选地，
X选自键、O。
在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，其中：
Y选自氢、氟、氯、C1-6烷基；
进一步优选地，
Y选自氢、氟、甲基、乙基。
在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，其中：
R1选自芳基、C1-3烷基芳基、杂芳基、C1-3烷基杂芳基、C2-4炔基，所述的芳基、杂芳基或炔基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷氧基、酰氨基、C1-6烷基酰基氨基、氨基酰基、单C1-6烷基氨基酰基、双C1-6烷基氨基酰基、酰基、C1-6烷基酰基、羟C1-6烷基、单C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基、单C1-6烷基氨基-C1-6烷基、双C1-6烷基氨基-C1-6烷基、硝基、氰基取代；
进一步优选地，
R1选自苯基、萘基、吡啶基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、C1-3烷基苯基、C1-3烷基萘基、C1-3烷基吡啶基、C1-3烷基噁唑基、C1-3烷基异噁唑基、C1-3烷基噁二唑基、C1-3烷基噻唑基、C1-3烷基异噻唑基、C1-3烷基噻二唑基、C1-3烷基呋喃基、C1-3烷基噻吩基、C1-3烷基吲哚基、C1-3烷基异吲哚基、C1-3烷基喹啉基、C1-3烷基异喹啉基、乙炔基，所述的苯基、萘基、吡啶基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基或炔基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷氧基、酰氨基、C1-6烷基酰基氨基、氨基酰基、单C1-6烷基氨基酰基、双C1-6烷基氨基酰基、酰基、C1-6烷基酰基、羟-C1-6烷基、单C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基、单C1-6烷基氨基-C1-6烷基、双C1-6烷基氨基-C1-6烷基、硝基、氰基取代；
更进一步优选地，
R1选自苯基、萘基、吡啶基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、乙炔基，所述的苯基、萘基、吡啶基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基或炔基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氧基-C1-3烷基、C1-3烷氧基-C1-3烷氧基、酰氨基、C1-3烷基酰基氨基、氨基酰基、单C1-3烷基氨基酰基、双C1-3烷基氨基酰基、酰基、C1-3烷基酰基、羟-C1-3烷基、单C1-3烷基氨基、双C1-3烷基氨基、单C1-3烷基氨基-C1-3烷基、双C1-3烷基氨基-C1-3烷基、硝基、氰基取代。
在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，其中：
R2选自芳基、杂芳基，所述的芳基、杂芳基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷氧基、酰氨基、C1-6烷基酰基氨基、氨基酰基、单C1-6烷基氨基酰基、双C1-6烷基氨基酰基、酰基、C1-6烷基酰基、羟C1-6烷基、单C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基、单C1-6烷基氨基-C1-6烷基、双C1-6烷基氨基-C1-6烷基、硝基、氰基取代；
进一步优选地，
R2选自苯基、萘基、吡啶基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基，所述的苯基、萘基、吡啶基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基可以被一个或多个卤素、羟基、羧基、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氧基-C1-3烷基、C1-3烷氧基-C1-3烷氧基、酰氨基、C1-3烷基酰基氨基、氨基酰基、单C1-3烷基氨基酰基、双C1-3烷基氨基酰基、酰基、C1-3烷基酰基、羟C1-3烷基、单C1-3烷基氨基、双C1-3烷基氨基、单C1-3烷基氨基-C1-3烷基、双C1-3烷基氨基-C1-3烷基、硝基、氰基取代。
在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，其中：
R3选自-C(O)-R4、-S(O)2-R4，其中，R4选自C2-4烯基、C2-4炔基，所述的烯基或炔基可以被一个或多个氰基、C1-6烷基、C3-8环烷基、卤代-C1-6烷基、卤代C3-8环烷基、羟基-C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、氨基、单C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基、C3-8环烷基氨基、氨基-C1-6烷基、单C1-6烷基氨基-C1-6烷基、双C1-6烷基氨基-C1-6烷基、C3-8环烷基氨基-C1-6烷基、饱和C4-8杂环基、饱和C4-8杂环基-C1-6烷基、杂芳基、杂芳基-C1-6烷基取代；
进一步优选地，
R3选自-C(O)-R4、-S(O)2-R4，其中，R4选自C2-4烯基、C2-4炔基，所述的烯基或炔基可以被一个或多个氰基、C1-3烷基、C3-6环烷基、卤代-C1-3烷基、卤代C3-6环烷基、羟基-C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代-C1-3烷氧基、C1-3烷氧基-C1-3烷基、氨基、单C1-3烷基氨基、双C1-3烷基氨基、C3-6环烷基氨基、氨基-C1-3烷基、单C1-3烷基氨基-C1-3烷基、双C1-3烷基氨基-C1-3烷基、C3-6环烷基氨基-C1-3烷基、饱和C4-8杂环基、饱和C4-8杂环基-C1-3烷基、杂芳基、杂芳基-C1-3烷基取代。
在一些优选的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药，其中：
X选自键、CH2、O、S；
Y选自氢、氟、C1-3烷基；
R1选自苯基、萘基、吡啶基、乙炔基，所述的苯基、萘基、吡啶基、乙炔基可以被一个或多个卤素、羟基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基-C1-6烷基、硝基、氰基取代；
R2选自苯基、萘基、吡啶基，所述的苯基、萘基、吡啶基可以被一个或多个卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基-C1-6烷基、硝基、氰基取代；
R3选自-C(O)-R4、-S(O)2-R4，其中，R4选自乙烯基、乙炔基，所述的乙烯基、乙炔基可以被一个或多个氰基、C1-6烷基、C3-8环烷基、卤代-C1-6烷基、卤代C3-8环烷基、羟基-C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、氨基、单C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基、C3-6环烷基氨基、氨基-C1-6烷基、单C1-6烷基氨基C1-6烷基、双C1-6烷基氨基-C1-6烷基、C3-6环烷基氨基-C1-6烷基、饱和C3-8杂环基、饱和C3-8杂环基-C1-6烷基、杂芳基、杂芳基-C1-6烷基取代。
本发明提供了以下具体化合物：
另一方面，本发明提供本发明的通式化合物的制备方法，通式I的化合物的制备方法包括如下步骤：
a)式(1)的化合物与式(2)的化合物反应得到式(3)的化合物；
b)式(3)的化合物与式(4)的化合物缩合得到式(5)的化合物；
c)式(5)的化合物脱去保护基得到式(6)的化合物；
d)式(6)的化合物通过缩合反应得到式(I)的通式化合物。
其中，X、Y、R1、R2、R3具有通式中的定义，Pro表示氨基保护基，优选选自叔丁氧羰基、苄基、苄氧羰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基，M表示卤素，优选选自溴、碘。
第三方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药。
在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的化合物、异构体、溶剂合物、结晶或前药，还包含选自下列组成的一种或多种：Ibrutinib、Abexinostat、PCI-27483、Motexafin、gadolinium、CC-292等。
可以将本发明的化合物、异构体、溶剂合物、结晶或前药与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
第四方面，本发明提供本发明的化合物、异构体、溶剂合物、结晶或前药或本发明的药物组合物治疗或预防由BTK异常引起的疾病的方法和在制备预防或治疗BTK异常引起的疾病药物中的应用，包括向白血病患者、淋巴瘤患者施用本发明的化合物、异构体、溶剂合物、结晶或前药或者包含本发明的化合物、异构体、溶剂合物、结晶或前药的药物组合物，以有效抑制BTK异常激发的信号通路，阻止病程进展。
术语说明
本发明的“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。
本发明的“环烷基”是指环状的饱和烃基。
本发明的“烷氧基”是指-O-烷基。
本发明的“卤素”是指氟、氯、溴、碘。
本发明的“卤代烷基”是指至少被一个卤素取代的烷基。
本发明的“卤代烷氧基”是指至少被一个卤素取代的烷氧基。
本发明的“芳基”是指可以包含单环或多稠环例如二环或三环的芳香环的芳香系，其中至少稠合的环的一部分形成共轭的芳香系，其含有5至50个碳原子，优选约6至约14个碳原子。合适的芳基包括但不限于苯基、萘基、联苯基、蒽基、四氢萘基、芴基、茚满基、亚联苯基和苊基。
本发明的“杂芳基”是指芳族单环或多稠环如二环或三环的至少有一个碳原子被杂原子替代的芳香性基团，所述的杂原子为O、S、N。合适的杂芳基包括但不限于咪唑基、苯并咪唑基、咪唑并吡啶基、喹唑啉酮基、吡咯基、咪唑酮基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、***基、吡啶基等。
本发明的“溶剂合物”在常规意义上是指溶质(如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂(如水)组合形成的复合物。溶剂是指本领域的技术人员所知的或容易确定的溶剂。如果是水，则溶剂合物通常被称作水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。
本发明的“结晶”是指本发明所述的化合物形成的各种固体形态，包括晶型、无定形。
本发明的“异构体”是指分子中原子在空间上排列方式不同所产生的立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体。
本发明的“前药”是指在生物体的生理条件下，由于与酶、胃酸等反应而转化成本发明的化合物，即通过酶的氧化、还原、水解等转化成本发明的化合物和/或通过胃酸等的水解反应等转化成本发明的化合物。
本发明的“药学可接受的盐”是指本发明的化合物与酸形成的药学上可接受的盐，所述的酸包括但不限于磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、柠檬酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、醋酸、乳酸、硝酸等等。
本发明的“药物组合物”是指包含任何一种本文所述的化合物，包括异构体、前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或其化学的保护形式，和一种或多种药学上可接受载体的混合物。
本发明的“药学上可接受的载体”是指对有机体不引起明显刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体，包含溶剂、稀释剂或其它赋形剂、分散剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容。可以作为药学上可接受的载体的一些实例包括，但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、以及纤维素和乙酸纤维素；麦芽、明胶等。
本发明的“赋形剂”指加入到药用组合物中以进一步促进给予化合物的惰性物质。赋形剂可以包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇。
具体实施方式
下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。
实施例1 1-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-烯-1-酮
步骤1 2-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基-4-甲酸叔丁酯
称取0.1g3-碘-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶于反应瓶中，加入5ml DMF溶解后，加入78mg2-羟基-4-叔丁氧羰基吗啉、157mg三丁基膦((n-Bu)3P)、191mg偶氮二甲酰二哌啶(ADDP)，室温搅拌至反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，干燥，过滤，浓缩，柱层析，得标题化合物。
步骤2 2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基-4-甲酸叔丁酯
称取220mg步骤1制备的化合物2-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基-4-甲酸叔丁酯于反应瓶中，加入10ml DMF溶解后，加入296mg4-苯氧基苯硼酸频哪醇酯、17mg双三苯基磷二氯钯、326mg碳酸铯(Cs2CO3)，90℃搅拌至反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，干燥，过滤，浓缩，柱层析，得标题化合物。
步骤3 1-(吗啉基-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺
称取100mg步骤2制备的化合物2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基-4-甲酸叔丁酯于反应瓶中，加入5ml HCl饱和的乙酸乙酯溶液，搅拌至反应结束，浓缩，得标题化合物，直接进行下一步反应。
步骤4 1-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-烯-1-酮
称取100mg步骤3制备的化合物1-(吗啉基-2-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺，19mg丙烯酸，39mg N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)于反应瓶中，加入2ml二氯甲烷溶解后，加入99mg HBTU，搅拌至反应结束后，二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩，纯化，得标题化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：8.42(s,1H,ArH)；7.67～7.07(m,9H,9×ArH)；6.60～6.33(m,3H,COCHCH 2)；5.70(s,1H,NCHO)；4.82～3.35(m,6H,3×CH 2)。
ESI-MS m/z：443.2[M+H]+。
实施例2 1-(2-(4-氨基-3-(6-(吡啶基-2-基氧基)萘-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-烯-1-酮
步骤1 6-(吡啶-2-基氧基)萘-2-基硼酸频哪醇酯
称取5g6-溴-2-萘酚，4.63g K2CO3，0.1g CuI于反应瓶中，加入30mL DMF溶解，氩气保护下110℃反应1h后，加入4.25g2-溴吡啶，反应4h，反应结束后，加入150mL水和150ml乙酸乙酯萃取，收集有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化得2-((6-溴萘-2-基)氧基)吡啶。
称取2.38g2-((6-溴萘-2-基)氧基)吡啶，1.57g KOAc，2.40g双(频哪醇合)二硼，0.30g Pd(dppf)2Cl2于反应瓶中，加30ml入1,4-二氧六环溶解，氩气保护下110℃3h，反应结束后过滤，减压除去溶剂，柱层析纯化得标题化合物。
步骤2 1-(2-(4-氨基-3-(6-(吡啶基-2-基氧基)萘-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-烯-1-酮
以3-碘-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶、2-羟基-4-叔丁氧羰基吗啉、步骤1所得物6-(吡啶-2-基氧基)萘-2-基硼酸频哪醇酯和丙烯酸为原料，同实施例1的方法制得标题化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：8.52～7.07(m,11H,11×ArH)；6.63～6.08(m,3H,COCHCH 2)；5.76(s,1H,NCHO)；4.17～3.67(m,6H,3×CH 2)。
ESI-MS m/z：494.2[M+H]+。
实施例3 1-(2-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶基-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-烯-1-酮
步骤1 6-苯氧基吡啶-3-基-3-硼酸频哪醇酯
以5-溴-2-羟基吡啶、溴苯、双(频哪醇合)二硼和Pd(dppf)2Cl2为原料，同实施例2步骤1的方法制得标题化合物。
步骤2 1-(2-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶基-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-烯-1-酮
以3-碘-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶、2-羟基-4-叔丁氧羰基吗啉、步骤1所得物6-苯氧基吡啶-3-基-3-硼酸频哪醇酯和丙烯酸为原料，同实施例1的方法制得标题化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：8.52～7.07(m,9H,9×ArH)；6.63～6.08(m,3H,COCHCH 2)；5.76(s,1H,NCHO)；4.82～3.35(m,6H,3×CH 2)。
ESI-MS m/z：444.2[M+H]+。
实施例4 1-(2-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶基-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮
以3-碘-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶、2-羟基-4-叔丁氧羰基吗啉、实施例3步骤1所得物6-苯氧基吡啶-3-基-3-硼酸频哪醇酯和2-甲基丙烯酸为原料，同实施例1的方法制得标题化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：7.62～7.08(m,9H,9×ArH)；6.09(m,1H,NCHO)；5.27～5.13(d,2H,COCCH 2)；4.13～3.86(m,6H,3×CH 2)；1.98(s,3H,CH 3)。
ESI-MS m/z：458.2[M+H]+。
实施例5 1-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-炔基-1-酮
以3-碘-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶、2-羟基-4-叔丁氧羰基吗啉、4-苯氧基苯硼酸频哪醇酯和丙炔酸为原料，同实施例1的方法制得标题化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：8.42(d,1H,ArH)；7.68～7.08(m,9H,9×ArH)；6.13～6.05(m,1H,NCHO)；4.67～3.32(m,6H,3×CH 2)；3.21～3.11(d,1H,CCH)。
ESI-MS m/z：441.3[M+H]+。
实施例6 1-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮
以3-碘-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶、2-羟基-4-叔丁氧羰基吗啉、4-苯氧基苯硼酸频哪醇酯和2-甲基丙烯酸为原料，同实施例1的方法制得标题化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：8.32(s,1H,ArH)；7.62～7.08(m,9H,9×ArH)；6.06(m,1H,NCHO)；5.27～5.13(d,2H,COCCH 2)；4.14～3.49(m,6H,3×CH 2)；1.97(s,3H,CH 3)。
ESI-MS m/z：457.2[M+H]+。
实施例7 1-(2-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶基-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吗啉基)丙-2-炔基-1-酮
以3-碘-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶、2-羟基-4-叔丁氧羰基吗啉、实施例3步骤1所得物6-苯氧基吡啶-3-基-3-硼酸频哪醇酯和丙炔酸为原料，同实施例1的方法制得标题化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：8.52～7.07(m,9H,9×ArH)；6.13～6.05(m,1H,NCHO)；4.82～3.35(m,6H,3×CH 2)；3.21～3.11(d,1H,CCH)。
ESI-MS m/z：442.1[M+H]+。
实验例1本发明的化合物体外激酶活性评价
1实验材料
1.1化合物
以上实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用DMSO稀释至10mM后，依次稀释至1uM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM。
1.2试剂
BTK(Bruton’s tyrosine kinase,Bruton酪氨酸蛋白激酶)，购自于日本CarnaBiosciences公司；
二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)，购自于美国Sigma公司；
EDTA，购自于美国Sigma公司；
96孔板(96well plate)，购自于美国Corning公司；
384孔板(384well plate)，购自于美国Corning公司。
1×激酶缓冲液(50mM HEPES,pH7.5,0.0015％Brij-35,10mM MgCl2,2mM DTT)，临用前配制；
终止液(100mM HEPES,pH7.5,0.015％Brij-35,0.2％Coating Reagent#3，50mMEDTA)，临用前配制。
1.3仪器
LabChip EZ Reader，购自于美国Caliper公司。
2实验方法
1)取每个浓度的化合物溶液10μl至96孔板中，加入90μl1×激酶缓冲液；同时设立DMSO对照组和无酶活对照组，均仅含10μl DMSO和90μl1×激酶缓冲液。各组在室温下混匀10min，然后分别转移5μl至384孔板中；
2)将激酶BTK溶于1×激酶缓冲液，配制成2.5×激酶溶液，然后转移10μl2.5×激酶溶液至上述含各浓度化合物的384孔板中；DMSO对照组加入10μl2.5×激酶溶液；无酶活对照组加入10μl不含激酶的1×激酶缓冲液。室温下孵育10min；
3)将FAM标记的多肽和ATP溶于1×激酶缓冲液，配制成2.5×底物溶液，然后转移10μl2.5×底物溶液至上述384孔板中，28℃孵育1hr；
4)各孔中加入25μl终止液终止反应；
5)置于LabChip EZ Reader上读取转化率数据，并计算抑制率I％，计算公式为I％＝(Max-Conversion)/(Max-Min)×100，其中Max为DMSO对照组的转化率，Min为无酶活对照组的转化率，Conversion为化合物处理组的转化率。数据经XLfit处理，拟合得IC50。IC50值表示与未加化合物处理组相比，化合物抑制50％酶活力时对应的化合物浓度。IC50结果见表1。
表1
| 受试化合物 | IC<sub>50</sub>(nM) | 受试化合物 | IC<sub>50</sub>(nM) |
| 实施例1 | 1.0 | 实施例2 | 0.9 |
| 实施例3 | 0.6 | 实施例4 | 0.5 |
| 实施例5 | 0.8 | 实施例6 | 1.2 |
| 实施例7 | 1.4 |
本发明的化合物抑制BTK激酶的IC50范围在nM级别，体现了良好的BTK激酶抑制活性。
实验例2本发明的化合物体外细胞活性评价
1实验材料
1.1化合物
以上实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用DMSO稀释至10mM，依次稀释为20uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、0.1nM。
1.2试剂
RPMI-1640，购自于美国Invitrogen公司；
FBS，购自于美国Invitrogen公司；
培养基：RPMI1640和FBS按体积比4:1配制。
EDTA，购自于美国Sigma公司；
96孔板(96well plate)，购自于美国Corning公司；
Luminescent Cell Viability Assay Kit，购自于美国Progema公司；
Backseal膜，购自于美国Perkin Elmer公司。
2实验方法
1)Mino(ATCC:CRL3000)细胞培养：
细胞复苏：将Mino细胞置于37度水浴中溶解，然后转移到15ml已预热的培养基中，1000rpm离心5分钟，弃去培养基，用15ml新鲜培养基重悬细胞，转移至T75培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，24小时后细胞更换新鲜培养基。
细胞传代：将上述复苏的细胞转移到50ml无菌离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去培养基，取分散均匀的细胞计数，调整合适的细胞浓度到15ml新鲜培养基，加入到T75培养瓶中，置于37度，5％CO2的培养箱中培养。
2)实验步骤：
T75细胞培养瓶中细胞长至1x105-1x106cells/ml后，使用新鲜培养基(RPMI1640+20％FBS)重悬，并计数。将重悬的细胞调整细胞浓度至10,000cells/ml，20,000cells/ml，30,000cells/ml，50,000cells/ml，80,000cells/ml，100,000cells/ml，150,000cells/mland200,000cells/ml8个浓度梯度。将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔加入100μl(1,000cells/well,2,000cells/well,3,000cells/well,5,000cells/well,8,000cells/well,10,000cells/well,15,000cells/well and20,000cells/well)。每种浓度两复孔，铺三块板。72h后向待测孔加入100μlLuminescent Cell Viability Assaybuffer。轻轻摇匀。10分钟后，在Assay板底部贴上Backseal膜，置于Envison上读取荧光读数，并计算细胞存活率(cell survive(％))，计算公式为cell survive(％)＝(药物孔读数-Min)/(Max-Min)，其中Max为溶媒对照组的读数，Min为无细胞对照组的读数，药物组为化合物处理组的读数，数据经XLfit处理，拟合得IC50，实验结果见表2。
表2
| 受试化合物 | IC<sub>50</sub>(μM) | 受试化合物 | IC<sub>50</sub>(μM) |
| 实施例1 | 0.037 | 实施例2 | 0.659 |
| 实施例3 | 0.754 | 实施例4 | 0.093 |
| 实施例5 | 0.018 | 实施例6 | 0.065 |
| 实施例7 | 0.784 |
本发明的化合物体外Mino细胞也表现出了良好的抑制活性。
实验例3本发明的化合物的BTK占有率评价
1实验材料
1.1化合物
以上实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用CMC-Na溶解至6mg/ml，给药剂量为30mg/kg。
1.2试剂
RBC溶液缓冲液，购自于美国波斯顿生物制品公司；
培养基：RPMI完全培养基；
小鼠抗BTK抗体，购自于贝克顿迪克逊BectonDickinson公司；
二次山羊抗小鼠HRP抗体，购自泽姆德Zymed公司；
涂有抗生蛋白链菌素的ELISA板，购自于美国皮尔斯公司；
拜耳瑞德溶解缓冲液，购自美国Biorad公司；
重组BTK，购自美国英杰公司；
B220+抗体-磁珠粒结合物。购自德国美天旎公司；
2实验方法
经口给予大鼠30mg/kg化合物，并在化合物处理后2小时或24小时后收集脾脏。在覆有毛玻璃的2个显微镜之间破坏大鼠的脾脏，以回收单细胞悬浮液。通过在室温下与RBC溶解缓冲液一起培育2分钟来溶解红细胞，随后将这些细胞再悬浮于RMPI完全培养基中，并借助离心使其聚结成团。通过用B220+抗体-磁珠粒结合物进行阳性选择来分离大鼠B细胞，借助MACS柱进行纯化，并以106个细胞/100ul的浓度溶于拜耳瑞德溶解缓冲液中进行溶解，加入探针化合物使其达到终浓度1uM，在室温下，于混合板中振荡培育1小时，以使探针结合于游离的BTK。一起培育后，将样品添加到经过洗涤的涂有抗生蛋白链霉素的ELISA板上，并在室温下振荡培育1小时。随后使用自动洗板机，用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤板。在含0.5％BSA的PBS(含0.05％Tween-20)中以1:1000的稀释度制备抗BTK抗体，并添加到ELISA板中。在室温下，振荡培育1小时。如上文所述，洗涤板，并在含0.5％BSA的PBS(含0.05％Tween-20)中以1:5000的稀释度制备抗二次HRP抗体。培育板，如上文所述进行洗涤。将TMB添加到板中，并监测OD650，直达到1个OD单位。随后通过添加H2SO4使反应终止。使用Gen5软件对板进行分析，并使用4参数逻辑斯蒂(4Parameter Logistic curve)曲线定量样品。对于标准曲线，使用重组BTK。实验结果见表3。
表3
| 处理组别 | 2小时BTK占有率 | 24小时BTK占有率 |
| 溶媒 | 0 | 0 |
| 实施例1 | 96 | 81 |
| 实施例2 | 87 | 70 |
| 实施例3 | 81 | 64 |
| 实施例4 | 95 | 73 |
| 实施例5 | 93 | 84 |
| 实施例6 | 94 | 51 |
| 实施例7 | 90 | 49 |
上述结果表明本发明的化合物维持药效的时间较长，经历24小时候依然保持较高的BTK占有率。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。
Claims (4)
1.通式(I)所示的化合物或其药学可接受的盐，
其中，
X为-O-；
Y为氢；
R1选自萘基和吡啶基；
R2选自苯基和吡啶基；和
R3选自-C(O)-R4，其中R4选自C2-4烯基和C2-4炔基，所述的烯基或炔基可以被一个或多个C1-6烷基取代。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其中所述化合物为选自以下的化合物：
3.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
4.权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
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