CN105452241B - ((嘧啶‑4‑基)氧基)‑1h‑吲哚‑1‑甲酰胺衍生物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及N‑(1‑甲基‑5‑(三氟甲基)‑1H‑吡唑‑3‑基)‑5‑((6‑((甲基氨基)甲基)嘧啶‑4‑基)氧基)‑1H‑吲哚‑1‑甲酰胺的某些代谢物。具体而言，本发明涉及包含这些代谢物的药物组合物以及它们的制备方法和它们在治疗疾病中的用途。

Description

((嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺衍生物及其用途

发明领域

本发明涉及N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的某些类似物。具体而言，本发明涉及包含这些化合物的药物组合物以及它们的制备方法和它们在治疗蛋白激酶介导的病症如VEGF-R受体依赖性疾病中的用途。

发明背景

WO2010/066684(其相关公开内容***本文作为参考)公开了一系列作为激酶抑制剂的杂双环甲酰胺。因此，现在已经发现这些化合物显示出对多种蛋白激酶的抑制。WO2010/066684中所述的化合物尤其显示出对一种或多种如下蛋白激酶的抑制：EphB4、c-Abl、Bcr-Abl、c-Kit、Raf激酶如尤其是B-Raf、转染期间重排(RET)原癌基因、血小板衍生生长因子受体(PDGFRs)、Lck、Hck和最尤其是血管内皮生长因子受体(VEGF-Rs)如特别是VEGF-R1和VEGF-R2。所述化合物还抑制所述激酶的突变体。鉴于这些活性，WO2010/066684中所述的化合物可用于治疗与这类激酶类型、尤其是所提及那些的尤其是异常或过度活性相关的疾病。该类别中的一种具体化合物是N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，其可以以游离碱或盐酸盐形式获得。N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结构如下所示：

发明简述

已知N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺通过如下反应表征的代谢转化进行代谢：

代谢反应包括：

-硝酮和肟的形成，

-嘧啶-羧酸和嘧啶-甲醇的形成，

-嘧啶-酰胺部分的形成，

-甲基-5-三氟甲基-吡唑部分的脱甲基化，

-甲基氨基甲基-嘧啶部分的脱甲基化，

-N-乙酰基-半胱氨酸加合物的形成，

-N-乙酰化，

-硫酸化，

-葡糖苷酸化，

-通过体外和体内代谢反应产生了某些另外的代谢物并在下文进行了讨论。

现在已经鉴别和表征了N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的某些类似物。这些类似物是用于治疗眼科疾病如年龄相关性黄斑变性的新的强效药物。

因此，本发明涉及N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基-1H-吲哚-1-甲酰胺的分离形式的任意代谢物或其盐以及其药物组合物、治疗方法和用途。

本发明还涉及制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的方法和/或其盐和多晶型物以及其药物组合物、治疗方法和用途。

附图简述

图1.说明了N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺HCl盐形式A的x-射线粉末衍射图。

图2.说明了结晶N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺HCl盐形式A的示差扫描量热(DSC)。

图3.说明了N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺HCl盐形式B的x-射线粉末衍射图。

图4.说明了结晶N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺HCl盐形式B的示差扫描量热(DSC)。

图5.说明了N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺形式A的x-射线粉末衍射图。

图6.说明了结晶N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺形式A的示差扫描量热(DSC)。

发明公开内容

因此，本发明涉及如下化合物，它是通过N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在动物、人和/或体外细胞实验中代谢所形成的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的类似物。

在以下化合物中，化合物的一部分周围的框标记了“氧化”以指：在沿着化合物的所示区域的长度的某处，存在另外的氧，例如N-氧化物或羟基基团。

在以下化合物中，化合物周围的框标记了“葡糖苷酸”以指：在沿着化合物的长度的某处，存在葡糖醛酸向分子的某个部分的转移，即，产物是UDP-葡糖醛酸的葡糖醛酸组分向N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺分子的一部分的转移。

在以下化合物中，化合物周围的框标记了“硫酸化”以指：在沿着化合物的长度的某处，存在硫酸向分子的某个部分的转移，即，产物是硫酸组分通过PAPS(3′-磷酸基-腺苷-5′-磷酸硫酸)向N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺分子的一部分的转移。

因此，在第一个方面，本发明涉及N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的分离形式的任意代谢物或其盐。

在第2项实施方案中，本发明是根据第1项实施方案的代谢物或其盐，其中所述代谢物选自：

在第3项实施方案中，本发明是根据第1项实施方案的代谢物或其盐，其中所述代谢物选自:

在第4项实施方案中，本发明是根据第1项实施方案的代谢物或其盐，其中所述代谢物是：

在第5项实施方案中，本发明是包含第1-4项实施方案的代谢物或其盐和至少一种可药用赋形剂的药物制剂。

在第6项实施方案中，本发明是在患者中治疗眼新生血管疾病的方法，该方法包括给需要该治疗的患者施用第1-4项实施方案的代谢物或其盐的步骤。

在第7项实施方案中，本发明是第1-4项实施方案任一项的代谢物或其盐在治疗个体的受蛋白激酶、尤其是蛋白酪氨酸激酶介导的疾病或障碍、更尤其是VEGF-R受体依赖性疾病中的用途。

在第8项实施方案中，本发明是第1-4项实施方案任一项的代谢物在治疗个体的以蛋白激酶、尤其是蛋白酪氨酸激酶、更尤其是VEGF-R受体的异常活性为特征的障碍或疾病中的用途。

在第9项实施方案中，本发明是抑制个体的VEGF-R活性的方法,其中该方法包括给个体施用治疗有效量的第1-4项实施方案任一项的代谢物。

在第10项实施方案中，本发明是治疗个体的受VEGF-R介导的障碍或疾病的方法，其中该方法包括给个体施用治疗有效量的第1-4项实施方案任一项的代谢物。

在第11项实施方案中，本发明是第10项实施方案的方法，其中所述疾病是AMD或糖尿病性视网膜病。

在第12项实施方案中，本发明是N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的结晶形式。

在第13项实施方案中，本发明是根据第12项实施方案的结晶形式，其包含N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐形式A。

在第14项实施方案中，本发明是根据第12或13项实施方案的结晶形式，其基本上由形式A组成。

在第15项实施方案中，本发明是根据第11-14项的结晶形式，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第16项实施方案中，本发明是根据第11-15项实施方案的结晶形式， 其特征在于x-射线粉末衍射图包含四个或更多个选自如下的2θ值：6.391±0.2°,8.6±0.2°,9.532±0.2°,10.333±0.2°,11.74±0.2°,12.691±0.2°,13.486±0.2°,14.767±0.2°,15.105±0.2°,15.767±0.2°,16.571±0.2°,16.973±0.2°,17.39±0.2°,17.986±0.2°,18.854±0.2°,19.427±0.2°,19.99±0.2°,20.472±0.2°,20.993±0.2°,22.593±0.2°,23.166±0.2°,24.012±0.2°,24.413±0.2°,25.212±0.2°,25.788±0.2°,26.174±0.2°,26.974±0.2°,27.245±0.2°,28.231±0.2°,32.809±0.2°,34.843±0.2°和38.831±0.2°，温度为约22℃。

在第17项实施方案中，本发明是第16项实施方案的结晶形式，其进一步的特征在于x-射线粉末衍射图包含五个或更多个选自如下的2θ值：6.391±0.2°,8.6±0.2°,9.532±0.2°,10.333±0.2°,11.74±0.2°,12.691±0.2°,13.486±0.2°,14.767±0.2°,15.105±0.2°,15.767±0.2°,16.571±0.2°,16.973±0.2°,17.39±0.2°,17.986±0.2°,18.854±0.2°,19.427±0.2°,19.99±0.2°,20.472±0.2°,20.993±0.2°,22.593±0.2°,23.166±0.2°,24.012±0.2°,24.413±0.2°,25.212±0.2°,25.788±0.2°,26.174±0.2°,26.974±0.2°,27.245±0.2°,28.231±0.2°,32.809±0.2°,34.843±0.2°和38.831±0.2°，温度为约22℃。

在第18项实施方案中，本发明是具有与图1所示的X-射线粉末衍射谱基本相同的X-射线衍射谱的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的结晶形式。

在第19项实施方案中，本发明是具有与图2所示基本相同的示差扫描量热(DSC)热分析图的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的结晶形式。

在第20项实施方案中，本发明是包含第11-19项实施方案的结晶形式和可药用载体或稀释剂的药物组合物。

在第21项实施方案中，本发明是根据第20项实施方案的药物组合物，其中所述结晶形式是形式A。

在第22项实施方案中，本发明是根据第21项实施方案的药物组合物，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第23项实施方案中，本发明是组合产品、特别是药物组合产品，其包含治疗有效量的第11-19项实施方案任一项的结晶形式和第二种治疗活性剂。

在第24项实施方案中，本发明是根据第23项实施方案的药物组合物，其中所述结晶形式是形式A。

在第25项实施方案中，本发明是根据第24项实施方案的药物组合物，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第26项实施方案中，本发明是治疗个体的受VEGF-R介导的障碍或疾病的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的第11-19项实施方案的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的结晶形式。

在第27项实施方案中，本发明是根据第26项实施方案的方法，其中所述结晶形式是形式A。

在第28项实施方案中，本发明是根据第27项实施方案的方法，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第29项实施方案中，本发明是根据第26项实施方案的方法，其中所述个体是人。

在第30项实施方案中，本发明是包含基于组合物重量计至少90重量％的第11-19项实施方案的结晶形式的组合物。

在第31项实施方案中，本发明是制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的形式A的方法，该方法包括实施例5的步骤。

在第32项实施方案中，本发明是根据第12项实施方案的结晶形式，包含N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐形式B。

在第33项实施方案中，本发明是根据第12或32项实施方案的结晶形式，基本上由形式B组成。

在第34项实施方案中，本发明是根据第32-33项实施方案的结晶形式，其中所述形式B是基本上纯的形式。

在第35项实施方案中，本发明是根据第12或32-34项实施方案的结晶形式，其特征在于x-射线粉末衍射图包含四个或更多个选自如下的2θ值：8.4113±0.2°,8.836±0.2°,12.6789±0.2°,13.5686±0.2°,15.7124±0.2°,16.8248±0.2°,17.3911±0.2°,18.7462±0.2°,20.4248±0.2°,21.072±0.2°,24.126±0.2°,24.6518±0.2°,25.2788±0.2°,26.5327±0.2°,27.726±0.2°和35.4721±0.2°，温度为约22℃。

在第36项实施方案中，本发明是根据第35项实施方案的结晶形式，其进一步的特征是x-射线粉末衍射图包含五个或更多个选自如下的2θ值：8.4113±0.2°,8.836±0.2°,12.6789±0.2°,13.5686±0.2°,15.7124±0.2°,16.8248±0.2°,17.3911±0.2°,18.7462±0.2°,20.4248±0.2°,21.072±0.2°,24.126±0.2°,24.6518±0.2°,25.2788±0.2°,26.5327±0.2°,27.726±0.2°和35.4721±0.2°，温度为约22℃。

在第37项实施方案中，本发明是具有与图3所示的X-射线粉末衍射谱基本上相同的X-射线衍射谱的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的结晶形式。

在第38项实施方案中，本发明是具有与图4所示基本上相同的示差扫描量热(DSC)热分析图的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的结晶形式。

在第39项实施方案中，本发明是包含第12或32-38项实施方案的结晶形式和可药用载体或稀释剂的药物组合物。

在第40项实施方案中，本发明是根据第39项实施方案的药物组合物，其中所述结晶形式是形式B。

在第41项实施方案中，本发明是根据第40项实施方案的药物组合物，其中所述形式B是基本上纯的形式。

在第42项实施方案中，本发明是组合产品、特别是药物组合产品，包含治疗有效量的第12或32-38项实施方案任一项的结晶形式和第二种治疗活性剂。

在第43项实施方案中，本发明是根据第42项实施方案的药物组合物， 其中所述结晶形式是形式B。

在第44项实施方案中，本发明是根据第43项实施方案的药物组合物，其中所述形式B是基本上纯的形式。

在第45项实施方案中，本发明是治疗个体的受VEGF-R介导的障碍或疾病的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的第12或32-38项实施方案的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的结晶形式。

在第46项实施方案中，本发明是根据第45项实施方案的方法，其中所述结晶形式是形式B。

在第47项实施方案中，本发明是根据第46项实施方案的方法，其中所述形式B是基本上纯的形式。

在第48项实施方案中，本发明是根据第45项实施方案的方法，其中所述个体是人。

在第49项实施方案中，本发明是包含基于组合物重量计至少90重量％的第12或32-38项实施方案的结晶形式的组合物。

在第50项实施方案中，本发明是制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的形式B的方法，该方法包括实施例6的步骤。

在第51项实施方案中，本发明是N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结晶形式。

在第52项实施方案中，本发明是根据第51项实施方案的结晶形式，其包含N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺形式A。

在第53项实施方案中，本发明是根据第51或52项实施方案的结晶形式，其基本上由形式A组成。

在第54项实施方案中，本发明是根据第51-53项实施方案的结晶形式，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第55项实施方案中，本发明是根据第51-54项实施方案的结晶形式，其特征在于x-射线粉末衍射图包含四个或更多个选自如下的2θ值： 8.664±0.2°,16.595±0.2°,17.423±0.2°,18.017±0.2°,19.448±0.2°,20.002±0.2°,20.468±0.2°,21.071±0.2°,22.649±0.2°,23.215±0.2°,24.468±0.2°和25.839±0.2°，温度为约22℃。

在第56项实施方案中，本发明是根据第55项实施方案的结晶形式，进一步的特征是x-射线粉末衍射图包含五个或更多个选自如下的2θ值：8.664±0.2°,16.595±0.2°,17.423±0.2°,18.017±0.2°,19.448±0.2°,20.002±0.2°,20.468±0.2°,21.071±0.2°,22.649±0.2°,23.215±0.2°,24.468±0.2°和25.839±0.2°，温度为约22℃。

在第57项实施方案中，本发明是具有与图5所示的X-射线粉末衍射谱基本上相同的X-射线衍射谱的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结晶形式。

在第58项实施方案中，本发明是具有与图6所示基本上相同的示差扫描量热(DSC)热分析图的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结晶形式。

在第59项实施方案中，本发明是包含第51-58项实施方案的结晶形式和可药用载体或稀释剂的药物组合物。

在第60项实施方案中，本发明是根据第59项实施方案的药物组合物，其中所述结晶形式是形式A。

在第61项实施方案中，本发明是根据第60项实施方案的药物组合物，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第62项实施方案中，本发明是组合产品、特别是药物组合产品，包含治疗有效量的第51-58项实施方案任一项的结晶形式和第二种治疗活性剂。

在第63项实施方案中，本发明是根据第62项实施方案的药物组合物，其中所述结晶形式是形式A。

在第64项实施方案中，本发明是根据第63项实施方案的药物组合物，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第65项实施方案中，本发明是治疗个体的受VEGF-R介导的障碍或疾病的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的第51-58项实施 方案的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结晶形式。

在第66项实施方案中，本发明是根据第65项实施方案的方法，其中所述结晶形式是形式A。

在第67项实施方案中，本发明是根据第66项实施方案的方法，其中所述形式A是基本上纯的形式。

在第68项实施方案中，本发明是根据第65项实施方案的方法，其中所述个体是人。

在第69项实施方案中，本发明是包含基于组合物重量计至少90重量％的第51-58项实施方案的结晶形式的组合物。

在第70项实施方案中，本发明是制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐的形式A的方法，该方法包括实施例7的步骤。

在第71项实施方案中，本发明是根据实施例8的制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的方法。

“分离形式”指化合物不含当其在体内代谢形成时将正常地伴随它的任意组分。例如，其不含任何生物学物质如血浆组分以及体内形成的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的其它代谢物。适宜地，所述化合物是纯化和分离形式。“纯化”指化合物方便地是高于75％纯、更方便地是高于90％纯和优选高于95％纯和最优选高于98％纯。

如本文所用的术语“异构体”指具有相同分子式但是原子的排列和构型不同的不同化合物。还如本文所用的术语“旋光异构体”或“立体异构体”指对于给定的本发明的化合物而言可以存在的任意不同的立体异构构型，包括几何异构体。可以理解，取代基可以连接在碳原子的手性中心处。因此，本发明包括化合物的对映异构体、非对映异构体或外消旋物。“对映异构体”是相互为不可重叠镜像的一对立体异构体。一对对映异构体的1:1混合物是“外消旋”混合物。当适当时，该术语用于表示外消旋混合物。“非对映异构 体”是具有至少两个不对称原子但是相互不是镜像的立体异构体。绝对立体化学根据Cahn-lngold-Prelog R-S***来说明。当化合物是纯的对映异构体时，在各手性碳处的立体化学可以通过R或S来说明。绝对构型未知的被拆分的化合物可以被标明(+)或(-)，这取决于它们在钠D线的波长处使平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)。本文描述的某些化合物含有一个或多个不对称中心，因此它们可以产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，这些形式的绝对立体化学可以被定义为(R)-或(S)-。本发明意欲包括所有这些可能的异构体、包括外消旋混合物、旋光纯的形式和中间混合物。具有旋光活性的(R)-和(S)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或者使用常规技术来拆分。如果化合物含有双键，则取代基可以是E或Z构型。如果化合物含有二取代的环烷基，则环烷基取代基可以具有顺式或反式构型。所有互变异构形式也意欲被包括在内。

如本文所用的术语“可药用盐”指保持本发明的化合物的生物学有效性和性质并且在生物学上或在其它方面不是不希望的盐。在多种情况下，由于氨基和/或羧基或与其相似的基团的存在，本发明的化合物能够形成酸和/或碱盐。可以用无机酸和有机酸形成可药用的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟基苯甲酰苯甲酸盐(hibenzate)、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟醋酸盐。可以由其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。可以由其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。可以用无机碱和有机碱形成可药用的碱加成盐。可以由其衍生盐的无机碱例如包括钠、钾、锂、氨、钙、镁、铁、锌、铜、 锰和铝；特别优选氨、钾、钠、钙和镁盐。可以由其衍生盐的有机碱例如包括伯、仲和叔胺、取代的胺、包括天然存在的取代的胺、环胺和碱离子交换树脂，具体例如有异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。本发明的可药用盐可以由母体化合物、碱性或酸性部分通过常规化学方法来合成。通常，这类盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应来制备，或者通过使这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当酸反应来制备。这类反应通常在水或有机溶剂或这二者的混合物中进行。通常，当可行时优选非水介质如(乙)醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。另外的适宜盐的名单可以例如在Remington'sPharmaceutical Sciences,第20版,Mack出版公司,伊斯顿,Pa.,(1985)和Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,Weinheim,德国,2002)中找到。

本发明包括所有可药用的同位素标记的本发明的化合物、即第1-70项实施方案的化合物，其中(1)一个或多个原子被具有相同原子数、但是原子质量或质量数与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子所替代，和/或(2)一个或多个原子的同位素比例与天然发生的比例不同。

适于包含在本发明的化合物中的同位素的实例包括如下元素的同位素：氢，例如²H和³H；碳，例如¹¹C、¹³C和¹⁴C；氯，例如³⁶Cl；氟，例如¹⁸F；碘，例如¹²³I和¹²⁵I；氮，例如¹³N和¹⁵N；氧，例如¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O；磷，例如³²P；和硫，例如³⁵S。

某些同位素标记的第1-70项实施方案的化合物、例如***了放射性同位素的那些可用于药物和/或底物组织分布研究中。放射性同位素氚、即³H和碳-14、即¹⁴C可特别用于该目的，因为它们容易掺入和容易检测。

用较重的同位素如氘、即²H取代可以由于更大的代谢稳定性、例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求而获得某些治疗益处，因此在一些情况中可以是优选的。在第1-70项实施方案的某些化合物中，残基R₉或通过R₈和R₉的组合形成的环可以包含一个或多个氘原子以改善化合物的体内代谢稳定性。

用正电子发射同位素如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究来检查底物受体占据。

同位素标记的第1-70项实施方案的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或者通过与所附实施例和制备例中描述的方法类似的方法、采用适当的同位素标记的试剂代替以前所采用的未标记试剂来制备。

本发明的可药用的溶剂合物包括其中用于结晶的溶剂可以是同位素取代的那些，例如D₂O、d₆-丙酮、d₆-DMSO。

含有能够作为氢键的供体和/或受体起作用的基团的本发明的化合物、即第1-70项实施方案的化合物能够用适宜的共晶体形成剂形成共晶体。这些共晶体可以由第1-70项实施方案的化合物通过已知的共晶体形成方法来制备。这类方法包括研磨、加热、共升华、共熔或在溶液中将第1-70项实施方案的化合物与共晶体形成剂在结晶条件下接触和分离由此形成的共晶体。适宜的共晶体形成剂包括WO 2004/078163中描述的那些。因此，本发明还提供了包含第1-70项实施方案的化合物的共晶体。

如本文所用的术语“可药用载体”包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这类类似的材料及其组合，如可以是本领域普通技术人员已知的(例如参见Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Mack出版公司,1990,第1289-1329页)。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况，关注了其在治疗性或药物组合物中的用途。

术语本发明的化合物的"治疗有效量”指将引起个体的生物学或医学响应、例如降低或抑制酶或蛋白质活性或者改善症状、减轻病症、减慢或延缓疾病发展或者预防疾病等的本发明的化合物的量。在一项非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”指如下定义的本发明的化合物的量：当施用于个体时，可有效地：(1)至少部分减轻、抑制、阻止和/或改善病症或障碍或疾病，所述的病症或障碍或疾病(i)受VEGF或其受体所介导或(ii)与VEGF活性或VEGF受体活性有关或(iii)以VEGF或其受体的异常活性为特征；或者(2)降低或抑制VEGF或其受体的活性；或者(3)降低或抑制VEGF或其受 体的表达。在另一项非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”指如下定义的本发明的化合物的量：当施用于细胞或组织或非细胞生物材料或介质时，可有效地至少部分降低或抑制VEGF或其受体的活性；或者至少部分降低或抑制VEGF或其受体的表达。如在以上实施方案中对VEGF或其受体所说明的术语“治疗有效量”的含义可以以相同的方式应用于任意其它相关的蛋白质/肽/酶如Ret、PDGFRα和β和ckit。

如本文所用的术语“个体”指动物。优选动物是哺乳动物。所述个体还指例如灵长类(如人类)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在优选的实施方案中，所述个体是人。

如本文所用的术语“抑制”指减轻或抑制给定的病症、症状或障碍或疾病或者生物活性或过程的基础活性显著降低。

如本文所用的术语任意疾病或障碍的“治疗”在一项实施方案中指改善疾病或障碍(即：减慢或阻止或降低疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一项实施方案中，“治疗”指减轻或改善至少一种身体参数、包括患者不可辨别的那些。在另一项实施方案中，“治疗”指在身体上(例如稳定可辨别的症状)、在生理上(例如稳定身体参数)或在二者上调节疾病或障碍。在另一项实施方案中，“治疗”指阻止或延缓疾病或障碍的发作或发展或进展。

如本文所用的术语“一个”、“一种”等以及在本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)所用的类似术语可解释为既包括单数也包括复数，本文另有说明或明显地与上下文矛盾除外。

本文描述的所有方法均可以按任意适宜的顺序来进行，本文另有说明或另外明显地与上下文矛盾除外。本文提供的任意和所有实例或示例性语言(如"例如”)的使用仅意欲更好地说明本发明而非限制另外声明的本发明的范围。

本发明的化合物的任意不对称原子(例如碳等)可以以外消旋或对映异构体富含的形式、例如以(R)-、(S)-或(R,S)-构型存在。在一些实施方案中，不对称原子各自具有至少50％对映异构体过量、至少60％对映异构体过量、至少70％对映异构体过量、至少80％对映异构体过量、至少90％对映异构体过量、至少95％对映异构体过量或至少99％对映异构体过量的(R)-或(S)- 构型。如果可能的话，在具有不饱和键的原子处的取代基可以以顺式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。

因此，如本文所用的本发明的化合物可以是可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体之一或其混合物的形式，例如作为基本上纯的几何(顺式或反式)异构体、非对映异构体、旋光异构体(对映体)、外消旋物或其混合物。

可以根据组分的物理化学差异、例如通过色谱法和/或分步结晶将任意所得的异构体混合物分离为纯的或基本上纯的几何或旋光异构体、非对映异构体、外消旋物。

可以通过已知方法将任意所得的终产物或中间体的外消旋物拆分为旋光对映体，例如通过分离用旋光活性的酸或碱得到的其非对映异构的盐并且释放旋光活性的酸性或碱性化合物而进行拆分。特别地，碱性部分可以由此用于将本发明的化合物拆分为其旋光对映体，例如通过将用旋光活性的酸所形成的盐进行分步结晶而进行拆分，所述的旋光活性的酸例如有酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二乙酰基酒石酸、二-O,O'-对-甲苯酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸。还可以通过手性色谱法、例如使用手性吸附剂进行的高压液相色谱法(HPLC)来拆分外消旋产物。

本发明的化合物以游离形式、作为其盐或作为其前药衍生物而得到。

当在同一分子内既存在碱性基团又存在酸性基团时，本发明的化合物还可以形成内盐，例如两性离子分子。

本发明还提供了本发明的化合物的前药，其可在体内转化为本发明的化合物。前药是在将前药施用于个体后通过体内生理作用如水解、代谢等被化学修饰为本发明的化合物的有活性或无活性的化合物。在制备和使用前药中所涉及的适应性和技术是本领域技术人员熟知的。前药在概念上可以被分成非专有的两类：生物前体前药和载体前药。参见ThePractice of Medicinal Chemistry,第31-32章(Wermuth编辑,学术出版社(AcademicPress),圣地亚哥,加利福尼亚州,2001)。通常，生物前体前药是无活性或者与相应的活性药物化合物相比具有低活性的化合物，其含有一个或多个保护基团并且通过代谢或溶剂解被转化为活性形式。活性药物形式和任意 被释放的代谢产物均应具有可接受的低毒性。

载体前药是含有转运部分、例如提高摄取和/或向作用部位的局部传递的转运部分的药物化合物。期望的是，对于这类载体前药，药物部分与转运部分之间的连接是共价键，前药是无活性的或者比药物化合物的活性低，并且任意被释放的转运部分可接受地是无毒的。对于其中转运部分用于促进摄取的前药而言，通常转运部分的释放应该是迅速的。在其它情况下，希望采用可提供缓慢释放的部分，例如某些聚合物或其它部分如环糊精。载体前药可以例如用于改善一种或多种以下性质：增加亲油性、增加药理作用的持续时间、增加部位特异性、降低毒性和不良反应和/或改善药物配制(例如稳定性、水溶性、抑制不希望的感官或生理化学性质)。例如，可以通过(a)羟基与亲脂性羧酸(具有至少一个亲脂性部分的羧酸)的酯化或者(b)羧酸基团与醇如脂肪族醇(具有至少一个亲脂性部分的醇，例如脂肪族醇)的酯化来增加亲油性。

示例性前药例如有游离羧酸的酯以及硫羟的S-酰基衍生物和醇或酚的O-酰基衍生物，其中酰基具有如本文定义的含义。优选可在生理条件下通过溶剂解而转化为母体羧酸的可药用的酯衍生物，例如低级烷基酯、环烷基酯、低级链烯基酯、苄基酯、单或二取代的低级烷基酯，如ω-(氨基、单或二低级烷基氨基、羧基、低级烷氧基羰基)-低级烷基酯、α-(低级烷酰基氧基、低级烷氧基羰基或二低级烷基氨基羰基)-低级烷基酯如新戊酰氧基甲基酯，以及本领域中常规使用的相似的酯。此外，胺已经被掩蔽为芳基羰基氧基甲基取代的衍生物，其在体内被酯酶裂解，释放出游离药物和甲醛(Bundgaard,J.Med.Chem.2503(1989))。而且，含有酸性NH基团如咪唑、二酰亚胺、吲哚等的药物已经被N-酰氧基甲基所掩蔽(Bundgaard,Design of Prodrugs,Elsevier,(1985))。羟基已经被掩蔽为酯和醚。EP039,051(Sloan和Little)公开了曼尼西碱异羟肟酸前药、其制备和用途。

而且，包括其盐在内的本发明的化合物还可以以其水合物的形式而得到，或者包括用于其结晶的其它溶剂。

另一方面，本发明提供了包含本发明的化合物和载体如可药用载体的药物组合物。药物组合物可以被配制用于特定的施用途径如口服施用、胃 肠道外施用(例如局部施用、玻璃体内注射、植入(包括玻璃体内、经巩膜、眼筋膜下等、贮库制剂等)和胃肠施用等。此外，本发明的药物组合物还可以被制备成固体形式、包括胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉末或栓剂，或者被制备成液体形式、包括溶液剂、混悬剂或乳剂。药物组合物可以进行常规的药物操作如灭菌和/或可以含有常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂以及佐剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。

通常，药物组合物是片剂和明胶胶囊剂，其包含活性成分以及：

a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；

b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还有

c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要的话，还有

d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或者泡腾合剂；和/或

e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。

可以按照本领域已知的方法对片剂进行膜包衣或肠溶包衣。

适于口服施用的组合物包括如下形式的有效量的本发明的化合物：片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊剂或者糖浆剂或酏剂。用于口服使用的组合物可按照本领域已知用于制备药物组合物的任意方法来制备，这类组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的物质以提供药学上美观和可口的制剂。片剂含有活性成分以及适于制备片剂的无毒的可药用赋形剂。这些赋形剂例如有：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或***胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂是未被包衣的或者通过已知技术被包衣以延缓在胃肠道中的崩解和吸收并由此提供历经更长时间的持续作用。例如，可以采用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服使用的制剂可以作为其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或白陶土混合的硬明胶胶囊剂来呈现，或者作为其中活 性成分与水或油介质如花生油、液状石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊剂来呈现。

一些注射用组合物优选是水性等张溶液或混悬液，栓剂可有利地由脂肪乳剂或混悬剂来制备。所述组合物可以被灭菌和/或含有佐剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物分别按照常规的混合、制粒或包衣方法制得，含有约0.1-75％或含有约1-50％的活性成分。

一些注射用组合物包括适于眼内、眼周、结膜下和/或眼筋膜下施用的眼用植入剂和眼用贮库制剂。通常，注射用组合物包含与生物相容的或可生物降解的聚合材料组合的第1-70项实施方案的化合物。

适于透皮应用的组合物包括有效量的本发明的化合物和载体。载体包括可吸收的药理学上可接受的溶剂以帮助穿过宿主的皮肤。例如，透皮装置是绷带剂的形式，包含背衬膜、含有化合物和任选的载体的贮库、任选的速率控制屏障(历经延长了的时间以受控和预定的速率递送化合物至宿主皮肤)和确保该装置在皮肤上的手段。

适于局部应用、例如应用于皮肤和眼的组合物包括水性溶液、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂或可喷雾制剂，例如用于通过气雾剂等进行递送。这类局部递送***可特别适于眼应用，例如用于治疗眼睛疾病，例如用于在治疗黄斑变性、糖尿病性视网膜病、虹膜红变和角膜、巩膜、视网膜或其它眼组织的新生血管形成等中的预防性或治疗性使用。因此，它们特别适用于本领域熟知的局部制剂。这类制剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

某些适宜的局部滴眼剂制剂包含第1-70项实施方案的化合物的水性溶液或水性混悬液，任选地还包含一种或多种防腐剂、张力调节剂和/或润滑剂。如本文所用的局部应用还可以涉及吸入或鼻内应用。它们方便地以干粉形式(单独或作为混合物，例如与乳糖的干燥掺合物或者混合的组分颗粒，例如与磷脂)从干粉吸入器或者以气雾剂喷雾呈现形式从加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器中递送，使用或不使用适宜的抛射剂。

配制本发明的眼用组合物以便与眼睛和/或待用所述组合物治疗的其 它组织相容。对于局部应用于眼，本发明的组合物通常将配制成无菌水性组合物(例如混悬液、溶液、乳剂等)，通常包含至少70w/v％、更通常80w/v％和甚至更通常至少90或95w/v％纯水。组合物可以包括如下成分的任意组合：一种或多种防腐剂(例如聚合季铵化合物)、一种或多种表面活性剂(例如聚山梨酯、泰洛沙泊、聚氧乙烯化蓖麻油或其组合等)、一种或多种粘度剂(例如取代的纤维素、半乳甘露聚糖聚合物、羧乙烯基聚合物或其组合等)、一种或多种缓冲剂(例如硼酸盐)、一种或多种张力调节剂(例如氯化钠)、一种或多种多元醇(例如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇或其组合等)或其它适宜的成分。意欲直接应用于眼角膜表面的眼用组合物将被配制成具有与眼睛相容的pH和张力。所述组合物通常将具有4-9、优选5.5-8.5和最优选5.5-8.0的pH。特别期望的pH范围为6.0-7.8、更特别是6.4-7.6。所述组合物将具有200至400或450毫渗透压摩尔/千克(mOsm/kg)、更优选240至360mOsm/kg的渗透压。而且，适于多剂量局部应用的眼用组合物通常配置在滴眼管中，所述滴眼管可将单独的滴分配至眼角膜表面。

本发明还提供了包含本发明的化合物作为活性成分的无水药物组合物和剂量形式，因为水可以促进某些化合物的降解。可以采用无水或低含水量的成分和低水分或低湿度条件制备本发明的无水药物组合物和剂量形式。可以制备和储存无水药物组合物以便维持其无水性质。因此，无水组合物优选采用已知防止接触水的材料进行包装，以便它们被包括在适宜的配方药盒中。适宜包装的实例包括但不限于密封箔、塑料、单位剂量容器(例如管形瓶)、泡罩包装和条形袋。

本发明还提供了包含一种或多种降低作为活性成分的本发明的化合物的降解速率的物质的药物组合物和剂量形式。这类物质在本文中称为"稳定剂”，其包括但不限于抗氧化剂如抗坏血酸、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。

游离形式或可药用盐形式的本发明的化合物呈现出有价值的药理学性质，例如VEGF受体调节性质，例如在下一章节中提供的体外和体内实验中所指示的，因此被指示用于治疗。

根据第1-70项实施方案的化合物作为强效VEGF受体抑制剂的性质，第1-70项实施方案的化合物尤其适于治疗与血管生成失控相关的疾病，尤 其是眼新生血管形成所导致的疾病，尤其是视网膜病如糖尿病性视网膜病或年龄相关性黄斑变性、虹膜红变、银屑病、Von Hippel Lindau疾病、成血管细胞瘤、血管瘤、肾小球膜细胞增殖性障碍如慢性或急性肾脏疾病如糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征或移植排斥，或者尤其是炎性肾脏疾病如肾小球肾炎、尤其是系膜增生性肾小球肾炎、溶血性***综合征、糖尿病性肾病、高血压性肾硬化、粉瘤、动脉再狭窄、自身免疫疾病、急性炎症、纤维变性障碍(如肝硬化)、糖尿病、子宫内膜异位症、慢性气喘、动脉或移植后动脉粥样硬化、神经变性障碍和尤其是瘤形成疾病(尤其是实体瘤，但是还有白血病)、例如尤其是乳癌、腺癌、结肠直肠癌、肺癌(尤其是非小细胞肺癌)、肾癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌或***癌以及骨髓瘤、尤其是多发性骨髓瘤、骨髓发育不良综合征、AML(急性髓样白血病)、AMM(特发性骨髓外化生)、间皮瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤。第1-70项实施方案的化合物尤其是还适于防止肿瘤的转移性扩散和微小转移的生长。

因此，作为其它实施方案，本发明提供了第1-70项实施方案的化合物在疗法中的用途。在另一项实施方案中，所述疗法选自通过抑制VEGF受体活性而改善的疾病。在另外的实施方案中，所述疾病选自上文提及的名单，适宜地是眼疾病，更适宜地是湿性和干性年龄相关性黄斑变性、地图状萎缩、浆液性中心性视网膜病变、囊样黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、增殖性糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、虹膜红变、早产儿视网膜病、视网膜中央静脉和分支静脉闭塞、炎性/传染性视网膜新生血管形成/水肿(例如后眼色素层炎、结节病、弓形体病、组织胞浆菌病、Vogt-Koyanagi-Harada疾病、慢性眼色素层炎、tuberculsosis、syphyllis、点状和多灶性内脉络膜病变)、视网膜母细胞瘤、黑素瘤、眼肿瘤、视网膜脱离、近视新生血管形成、angiod streaks、Eales疾病、缺血性视网膜病变(视网膜动脉闭塞、Takayasu’s、颈动脉闭塞)、脉络膜破裂、接触镜佩戴、干眼、睑缘炎、角膜营养不良、角膜创伤和既往手术(角膜移植、LASIK、LASEK)、角膜感染(细菌性、病毒性、寄生物性、疱疹性)、角膜灼伤(化学物质、碱、酸)、角膜移植排斥、免疫性角膜疾病(类天疱疮、Stevens-Johnsons综合征)和变性角膜疾病。

对于约50-70kg的个体而言，本发明的药物组合物或组合可以是约1-1000mg活性成分、优选约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg活性成分的单位剂量。化合物、其药物组合物或组合的治疗有效剂量取决于个体的种属、体重、年龄和个体病症、所治疗的障碍或疾病或其严重性。具有普通技术的医师、临床医师或兽医可以容易地确定各活性成分预防、治疗或抑制障碍或疾病发展所需的有效量。

以上引用的剂量性质可在体外和体内试验中有利地使用哺乳动物如小鼠、大鼠、狗、猴或其离体器官、组织和制备物来证明。本发明的化合物可以在体外以溶液、例如优选水性溶液的形式以及在体内经肠内、胃肠道外、有利地经静脉内、例如作为混悬液或在水性溶液中应用。体外剂量的范围可以在约10^-3摩尔至约10^-9摩尔浓度之间。体内治疗有效量的范围根据施用途径可以在约0.1-500mg/kg之间或在约1-100mg/kg之间。

在其它实施方案中，提供了其中包含至少一种第1-70项实施方案的化合物和至少一种载体的药物组合物。

第1-70项实施方案的化合物还可用于有利地与其它抗增殖剂组合。这类抗增殖剂包括但不限于芳香酶抑制剂；抗***药；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂；烷化剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；诱导细胞分化过程的化合物；环加氧酶抑制剂；MMP抑制剂；mTOR抑制剂；抗肿瘤性抗代谢物；铂化合物；靶向于/降低蛋白激酶或脂激酶活性的化合物和其它抗血管生成化合物；靶向于、降低或抑制蛋白磷酸酶或脂质磷酸酶活性的化合物；戈那瑞林激动剂；抗雄激素药；甲硫氨酸氨肽酶抑制剂；双膦酸化合物；生物应答调节剂；抗增殖性抗体；类肝素酶抑制剂；Ras致癌同工型抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；用于治疗血液学恶性病的药物；靶向于、降低或抑制Flt-3活性的化合物；Hsp90抑制剂；替莫唑胺和亚叶酸。

第1-70项实施方案的化合物还可用于有利地与其它眼治疗组合，所述眼治疗包括但不限于Macugen、VEGF trap、光动力疗法、醋酸阿奈可他、类固醇、非甾体抗炎药(例如萘普生、布洛芬、双氯芬酸)Cox-1和Cox-2 抑制剂、环胞菌素、***、mtor(雷帕霉素哺乳动物靶标)抑制剂如雷帕霉素、依维莫司等、PKC(蛋白激酶C)β抑制剂、肿瘤坏死α抑制剂、白细胞介素Iβ抑制剂、血小板衍生生长因子β和α和受体抑制剂、 阿瓦斯丁、Eylea、VEGF抗体、PLGF抗体、siRNA抗VEGF家族(A-E、PLGF、神经毡蛋白)/VEGF受体、靶向于经典途径、旁路途径和凝集素途径的补体抑制剂、IL-10抑制剂、C5aR抑制剂、C3aR抑制剂以及磷酸鞘氨醇和受体的抑制剂。本发明的化合物可以与至少一种其它治疗剂同时或其之前或之后施用。本发明的化合物可以通过相同或不同的施用途径单独施用或者在同一药物组合物中一起施用。

在一项实施方案中，所述其它治疗活性剂选自：

本文所用的术语“芳香酶抑制剂”涉及抑制***产生、即抑制底物雄甾烯二酮和睾酮分别向雌酮和***转化的化合物。该术语包括但不限于类固醇，尤其是阿他美坦、依西美坦和福美司坦，以及特别是非甾族化合物，尤其是氨鲁米特、罗谷亚胺、吡鲁米特、曲洛司坦、睾内酯、酮康唑、伏罗唑、法曲唑、阿那曲唑和来曲唑。依西美坦可以例如以其市售形式、例如以商标AROMASIN市售的形式施用。福美司坦可以例如以其市售形式、例如以商标LENTARON市售的形式施用。法曲唑可以例如以其市售形式、例如以商标AFEMA市售的形式施用。阿那曲唑可以例如以其市售形式、例如以商标ARIMIDEX市售的形式施用。来曲唑可以例如以其市售形式、例如以商标FEMARA或FEMAR市售的形式施用。氨鲁米特可以例如以其市售形式、例如以商标ORIMETEN市售的形式施用。包含为芳香酶抑制剂的化疗剂的本发明的组合特别可用于治疗激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。

本文所用的术语“抗***药”涉及在***受体水平上拮抗***效应的化合物。该术语包括但不限于他莫昔芬、氟维司群、雷洛昔芬和盐酸雷洛昔芬。他莫昔芬可以例如以其市售形式、例如以商标NOLVADEX市售的形式施用。盐酸雷洛昔芬可以例如以其市售形式、例如以商标EVISTA市售的形式施用。氟维司群可以如US 4,659,516中所公开的那样进行配制或者可以例如以其市售形式、例如以商标FASLODEX市售的形式施用。 包含为抗***药的化疗剂的本发明的组合特别可用于治疗***受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。

本文所用的术语“抗雄激素药”涉及任何能抑制雄性激素生物效应的物质，包括但不限于比卡鲁胺(CASODEX)，其可以例如如US 4,636,505中所公开的那样进行配制。

本文所用的术语“戈那瑞林激动剂”包括但不限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和乙酸戈舍瑞林。戈舍瑞林公开在US 4,100,274中，可以例如以其市售形式、例如以商标ZOLADEX市售的形式施用。阿巴瑞克可以例如如US 5,843,901中所公开的那样进行配制。

本文所用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不限于拓扑替康、吉马替康(gimatecan)、伊立替康、喜树碱及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱缀合物PNU-166148(WO 99/17804中的化合物A1)。伊立替康可以例如以其市售形式、例如以商标CAMPTOSAR市售的形式施用。拓扑替康可以例如以其市售形式、例如以商标HYCAMTIN市售的形式施用。

本文所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不限于蒽环类，如阿霉素(包括脂质体制剂，例如CAELYX)、柔红霉素、表阿霉素、伊达比星和奈莫柔比星，蒽醌类的米托蒽醌和洛索蒽醌，以及鬼臼毒素类的依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可以例如以其市售形式、例如以商标ETOPOPHOS市售的形式施用。替尼泊苷可以例如以其市售形式、例如以商标VM 26-BRISTOL市售的形式施用。阿霉素可以例如以其市售形式、例如以商标ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN市售的形式施用。表阿霉素可以例如以其市售形式、例如以商标FARMORUBICIN市售的形式施用。伊达比星可以例如以其市售形式、例如以商标ZAVEDOS市售的形式施用。米托蒽醌可以例如以其市售形式、例如以商标NOVANTRON市售的形式施用。

术语“微管活性剂”涉及微管稳定剂、微管去稳定剂和微管蛋白聚合抑制剂，包括但不限于紫杉烷类(taxanes)，例如紫杉醇和多西他赛；长春花生物碱，例如长春碱，尤其是硫酸长春碱、长春新碱，尤其硫酸长春新碱和长春瑞滨；淅皮海绵内酯(discodermolides)；秋水仙碱；和埃坡霉素及其 衍生物，例如埃坡霉素B或D或其衍生物。紫杉醇可以例如以其市售形式、例如以TAXOL市售的形式施用。多西他赛可以例如以其市售形式、例如以商标TAXOTERE市售的形式施用。硫酸长春碱可以例如以其市售形式、例如以商标VINBLASTINR.P.市售的形式施用。硫酸长春新碱可以例如以其市售形式、例如以商标FARMISTIN市售的形式施用。淅皮海绵内酯可以例如如US 5,010,099中所公开的那样得到。还包括WO 98/10121、US 6,194,181、WO 98/25929、WO 98/08849、WO 99/43653、WO 98/22461和WO 00/31247中所公开的埃坡霉素衍生物。尤其优选埃坡霉素A和/或B。

本文所用的术语“烷化剂”包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑或亚硝基脲(BCNU或Gliadel)。环磷酰胺可以例如以其市售形式、例如以商标CYCLOSTIN市售的形式施用。异环磷酰胺可以例如以其市售形式、例如以商标HOLOXAN市售的形式施用。

术语“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”或“HDAC抑制剂”涉及抑制组蛋白脱乙酰酶并且具有抗增殖活性的化合物。这包括WO 02/22577中所公开的化合物，尤其是N-羟基-3-[4-[[(2-羟基乙基)[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺、N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺及其可药用盐。还尤其包括辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。

术语“抗肿瘤性抗代谢物”包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、吉西他滨、DNA去甲基化剂如5-氮杂胞苷和地西他滨、甲氨蝶呤、依达曲沙和叶酸拮抗剂如培美曲塞。卡培他滨可以例如以其市售形式、例如以商标XELODA市售的形式施用。吉西他滨可以例如以其市售形式、例如以商标GEMZAR市售的形式施用。还包括单克隆抗体曲妥单抗，其可以例如以其市售形式、例如以商标HERCEPTIN市售的形式施用。

本文所用的术语“铂化合物”包括但不限于卡铂、顺-铂、顺铂和奥沙利铂。卡铂可以例如以其市售形式、例如以商标CARBOPLAT市售的形式施用。奥沙利铂可以例如以其市售形式、例如以商标ELOXATIN市售的形式施用。

本文所用的术语“靶向于/降低蛋白激酶或脂激酶活性的化合物和其它 抗血管生成化合物”包括但不限于蛋白酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或者脂激酶抑制剂，例如：

a)靶向于、降低或抑制成纤维细胞生长因子受体(FGF-Rs)活性的化合物；

b)靶向于、降低或抑制***I受体(IGF-IR)活性的化合物，尤其是抑制IGF-IR的化合物，例如WO 02/092599中公开的那些化合物；

c)靶向于、降低或抑制Trk受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；

d)靶向于、降低或抑制Axl受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；

e)靶向于、降低或抑制c-Met受体活性的化合物；

f)靶向于、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和丝氨酸/苏氨酸激酶Raf家族成员以及MEK、SRC、JAK、FAK、PDK和Ras/MAPK家族成员或PI(3)激酶家族成员或PI(3)激酶相关性激酶家族成员和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)成员活性的化合物，尤其是US 5,093,330中公开的那些星孢素衍生物，例如米哚妥林；其它化合物的实例例如包括UCN-01、沙芬戈、BAY 43-9006、苔藓抑素1、哌立福辛；伊莫福新；RO 318220和RO 320432；GO 6976；Isis3521；LY333531/LY379196；异喹啉化合物，例如WO 00/09495中公开的那些；FTIs；PD184352或QAN697(P13K抑制剂)；

g)靶向于、降低或抑制蛋白酪氨酸激酶活性的化合物，例如甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)或tyrphostin。Tyrphostin优选是低分子量(Mr<1500)化合物，或其可药用盐，尤其是选自亚苄基丙二腈类或者S-芳基苯丙二腈或双底物喹啉类化合物的化合物，更尤其是选自下组的任意化合物：Tyrphostin A23/RG-50810；AG 99；Tyrphostin AG 213；Tyrphostin AG1748；Tyrphostin AG 490；Tyrphostin B44；Tyrphostin B44(+)对映异构体；Tyrphostin AG 555；AG 494；Tyrphostin AG 556,AG957和adaphostin(4-{[(2,5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷基酯；NSC680410，adaphostin)；和

h)靶向于、降低或抑制受体酪氨酸激酶的表皮生长因子家族(EGF-R,ErbB2,ErbB3,ErbB4,为均聚物或杂二聚物)活性的化合物，例如靶向 于、降低或抑制表皮生长因子受体家族活性的化合物，尤其是抑制EGF受体酪氨酸激酶家族成员如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4或者与EGF或EGF相关性配体结合的化合物、蛋白质或抗体，特别是概括地和具体地在下列文献中公开的那些化合物、蛋白质或单克隆抗体：WO 97/02266，例如实施例39的化合物，或者EP 0564409、WO99/03854、EP 0520722、EP 0566226、EP 0787722、EP0837063、US 5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO97/38983、尤其是WO96/30347(例如被称为CP 358774的化合物)、WO96/33980(例如化合物ZD 1839)和WO 95/03283(例如化合物ZM105180)；例如曲妥单抗(HERCEPTIN)、西妥昔单抗、Iressa、厄洛替尼(TarcevaTM)、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3和WO 03/013541中公开的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物。

其它抗血管生成化合物包括具有另一种活性机理的化合物，例如与蛋白激酶或脂激酶抑制作用无关的机理，例如沙利度胺(THALOMID)和TNP-470。

靶向于、降低或抑制蛋白磷酸酶或脂质磷酸酶活性的化合物有例如磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25的抑制剂，例如冈田酸(okadaic acid)或其衍生物。

诱导细胞分化过程的化合物有例如视黄酸、α-、γ-或δ-生育酚或者α-、γ-或δ-生育三烯酸。

本文所用的术语“环加氧酶抑制剂”包括但不限于例如COX-2抑制剂、5-烷基取代的2-芳基氨基苯基乙酸与衍生物，例如塞来考昔(CELEBREX)、罗非考昔(VIOXX)、艾托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸(例如5-甲基-2-(2’-氯-6’-氟苯氨基)苯基乙酸)、鲁米考昔(lumiracoxib)。

术语“mTOR抑制剂”涉及抑制雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)并且具有抗增殖活性的化合物，例如西罗莫司依维莫司(CerticanTM)、CCI-779和ABT578。

本文所用的术语“双膦酸化合物”包括但不限于依替膦酸、氯膦酸、替 鲁膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑来膦酸。“依替膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标DIDRONEL市售的形式施用。“氯膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标BONEFOS市售的形式施用。“替鲁膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标SKELID市售的形式施用。“帕米膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标AREDIA^TM市售的形式施用。“阿仑膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标FOSAMAX市售的形式施用。“伊班膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标BONDRANAT市售的形式施用。“利塞膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标ACTONEL市售的形式施用。“唑来膦酸”可以例如以其市售形式、例如以商标ZOMETA市售的形式施用。

本文所用的术语“类肝素酶抑制剂”指靶向于、降低或抑制硫酸肝素降解的化合物。该术语包括但不限于PI-88。

本文所用的术语“生物应答调节剂”指淋巴因子或干扰素，例如干扰素γ。

本文所用的术语“Ras致癌同工型抑制剂”(如H-Ras、K-Ras或N-Ras)指靶向于、降低或抑制Ras的致癌活性的化合物，例如“法尼基转移酶抑制剂”，例如L-744832、DK8G557或R115777(Zarnestra)。

本文所用的术语“端粒酶抑制剂”指靶向于、降低或抑制端粒酶活性的化合物。靶向于、降低或抑制端粒酶活性的化合物尤其是抑制端粒酶受体的化合物，例如telomestatin(替莫美他汀)。

本文所用的术语“甲硫氨酸氨肽酶抑制剂”指靶向于、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物。靶向于、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物有例如bengamide(比格麦德)或其衍生物。

本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”指靶向于、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物。靶向于、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物包括例如PS-341和MLN 341。

本文所用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”或“MMP抑制剂”包括但不限于胶原拟肽和非拟肽抑制剂、四环素衍生物，例如异羟肟酸拟肽抑制剂巴马司他和其口服可生物利用的类似物马立马司他(BB-2516)、普啉司他 (AG3340)、metastat(NSC 683551)BMS-279251、BAY 12-9566、TAA211、MMI270B或AAJ996。

本文所用的术语“用于治疗血液学恶性病的药物”包括但不限于FMS-样酪氨酸激酶抑制剂，例如靶向于、降低或抑制Flt-3活性的化合物；干扰素、1-b-D-***呋喃糖基胞嘧啶(ara-c)和白消安(bisulfan)；和ALK抑制剂，例如靶向于、降低或抑制间变性淋巴瘤激酶的化合物。

术语“靶向于、降低或抑制Flt-3活性的化合物”尤其是抑制Flt-3的化合物、蛋白质或抗体，例如PKC412、米哚妥林、星孢素衍生物、SU11248和MLN518。

本文所用的术语“HSP90抑制剂”包括但不限于靶向于、降低或抑制HSP90的内源性ATP酶活性的化合物；经由遍在蛋白质蛋白酶体途径降解、靶向于、降低或抑制HSP90客户蛋白(client protein)的化合物。靶向于、降低或抑制HSP90的内源性ATP酶活性的化合物尤其是抑制HSP90的ATP酶活性的化合物、蛋白质或抗体，例如17-烯丙基氨基,17-去甲氧基格尔德霉素(17AAG)—一种格尔德霉素衍生物；其它与格尔德霉素相关的化合物；根赤壳菌素和HDAC抑制剂。

本文所用的术语“抗增殖性抗体”包括但不限于曲妥单抗(Herceptin^TM)、曲妥单抗-DM1、雷珠单抗贝伐单抗(Avastin^TM)、利妥昔单抗PRO64553(抗-CD40)和2C4抗体以及抗体意指例如完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体形成的多特异性抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。

对于急性髓性白血病(AML)的治疗而言，第1-70项实施方案的化合物可以与标准白血病疗法组合使用，尤其是与用于治疗AML的疗法组合使用。具体而言，第1-70项实施方案的化合物可以与例如法尼基转移酶抑制剂和/或其它可用于治疗AML的药物组合施用，例如柔红霉素、阿霉素、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、伊达比星、卡铂和PKC412。

由代码号、通用名或商品名确定的活性成分的结构可以从标准汇编“默克索引”的现行版本或者从数据库如Patents International(例如IMS World Publications)获得。上述可以与第1-70项实施方案的化合物组合使用的化合物可以如现有技术、例如上文所引用的文献中所描述的那样进行制备和施用。

第1-70项实施方案的化合物还可以有利地用于与已知的治疗过程组合，例如激素施用或者尤其是放射。

第1-70项实施方案的化合物特别可用作放射致敏剂，尤其是用于治疗对放射疗法敏感性差的肿瘤。

在一项实施方案中，本发明提供了作为用于同时、单独或依次用于疗法的组合制剂的包含第1-70项实施方案的化合物和至少一种其它治疗剂的产品。在一项实施方案中，所述疗法是治疗受VEGF或VEGF受体活性介导的疾病或病症。作为组合制剂提供的产品包括包含一起处于同一药物组合物中的第1-70项实施方案的化合物和其它治疗剂的组合物，或者包含单独形式、例如套药包形式的第1-70项实施方案的化合物和其它治疗剂的组合物。

在一项实施方案中，本发明提供了包含第1-70项实施方案的化合物和其它治疗剂的药物组合物。任选地，所述药物组合物可以包含可药用赋形剂，如上文所述。

在一项实施方案中，本发明提供了包含两种或更多种单独药物组合物的套药包，其中至少一种含有第1-70项实施方案的化合物。在一项实施方案中，套药包包含单独保留所述组合物的工具，例如容器、分隔瓶或分隔箔袋。这类套药包的实例有泡罩包装，如常用于包装片剂、胶囊剂等那样。

本发明的套药包还可用于施用不同的剂量形式如口服和胃肠道外，用于在不同的剂量间隔施用单独组合物，或用于相对于另一种逐渐增加单独组合物。为了帮助顺应性，本发明的套药包通常包含施用说明书。在本发明的组合治疗中，本发明的化合物和其它治疗剂可以由相同或不同生产商生产和/或配制。而且，本发明的化合物和其它疗法可以如下一起带入组合疗法中：(i)在将组合产品发放给医师之前(例如就包含本发明的化合物和其它治疗剂的套药包而言)；(ii)由医师自身(或在医师指导下)在临施用前；(iii)在患者自身中，例如在依次施用本发明的化合物和其它治疗剂期间。

因此，本发明提供了第1-70项实施方案的化合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗受VEGF或VEGF受体活性介导的疾病或病症，其中所述药剂被制备成用于与其它治疗剂一起施用。本发明还提供了其它治疗剂在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗受VEGF或VEGF受体活性介导的疾病或病症，其中所述药剂被制备成用于与第1-70项实施方案的化合物一起施用。

本发明还提供了第1-70项实施方案的化合物，其用于治疗受VEGF或VEGF受体活性介导的疾病或病症的方法，其中第1-70项实施方案的化合物被制备成用于与其它治疗剂一起施用。本发明还提供了其它治疗剂，其用于治疗受VEGF或VEGF受体活性介导的疾病或病症的方法，其中所述其它治疗剂被制备成用于与第1-70项实施方案的化合物一起施用。本发明还提供了第1-70项实施方案的化合物，其用于治疗受VEGF或VEGF受体活性介导的疾病或病症的方法，其中第1-70项实施方案的化合物与其它治疗剂一起施用。本发明还提供了其它治疗剂，其用于治疗受VEGF或VEGF受体活性介导的疾病或病症的方法，其中所述其它治疗剂与第1-70项实施方案的化合物一起施用。

本发明还提供了第1-70项实施方案的化合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗受VEGF或VEGF受体介导的疾病或病症，其中所述患者之前(例如24小时内)已经用其它治疗剂进行过治疗。本发明还提供了其它治疗剂在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗受VEGF或其受体介导的疾病或病症，其中所述患者之前(例如24小时内)已经用第1-70项实施方案的化合物进行过治疗。

以下实施例意欲说明本发明，而不解释为限制本发明。温度以摄氏度给出。若无另外提及，则所有蒸发在减压下进行，优选约15mmHg至100mm Hg(＝20-133mbar)之间。终产物、中间体和原料的结构通过标准分析方法如微量分析和光谱特征如MS、IR、NMR确定。所用缩略语是本领域常规的那些。

用于合成本发明的化合物的所有原料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂可以购买获得或者通过本领域技术人员已知的有机合 成方法制备(Houben-Weyl,第4版.1952,Methods of Organic Synthesis,Thieme,第21卷)。而且，本发明的化合物可以通过如以下实施例中所示的本领域技术人员已知的有机合成方法制得。

基于第1-70项实施方案的化合物作为强效VEGF受体抑制剂的性质，第1-70项实施方案的化合物尤其适于治疗与血管生成失控相关的疾病，尤其是眼新生血管形成所导致的疾病，尤其是视网膜病如糖尿病性视网膜病或年龄相关性黄斑变性、银屑病、Von HippelLindau疾病、成血管细胞瘤、血管瘤、肾小球膜细胞增殖性障碍如慢性或急性肾脏疾病如糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征或移植排斥，或者尤其是炎性肾脏疾病如肾小球肾炎、尤其是系膜增生性肾小球肾炎、溶血性***综合征、糖尿病性肾病、高血压性肾硬化、粉瘤、动脉再狭窄、自身免疫疾病、急性炎症且包括类风湿性关节炎、纤维变性障碍(如肝硬化)、糖尿病、子宫内膜异位症、慢性气喘、动脉或移植后动脉粥样硬化、神经变性障碍(如多发性硬化)和尤其是瘤形成疾病如癌症(尤其是实体瘤，但是还有白血病)、例如尤其是乳癌、腺癌、结肠直肠癌、肺癌(尤其是非小细胞肺癌)、肾癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌或***癌以及骨髓瘤、尤其是多发性骨髓瘤、骨髓发育不良综合征、AML(急性髓样白血病)、AMM(特发性骨髓外化生)、间皮瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤。第1-70项实施方案的化合物尤其是还适于防止肿瘤的转移性扩散和微小转移的生长。第1-70项实施方案的化合物由于它们的激酶活性还可用于与移植联合用于治疗。

结晶化合物

如本文所用的“多晶型物”指具有相同化学组成、但是形成晶体的分子、原子和/或离子的空间排列不同的结晶形式。

如本文所用的“溶剂合物”指还包含掺入结晶晶格结构中的一种或多种溶剂分子的分子、原子和/或离子的结晶形式。溶剂合物中的溶剂分子可以以有规则排列和/或无规则排列存在。溶剂合物可以包含化学计算量或非化学计算量的溶剂分子。例如，具有非化学计算量的溶剂分子的溶剂合物可以产生于从溶剂合物中部分失去溶剂。溶剂合物可以作为在结晶晶格结构 中包含多于一个分子或N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的二聚物或低聚物存在。

如本文所用的“无定形物”指不是结晶的分子、原子和/或离子的固体形式。无定形物固体不呈现出明确的X-射线衍射图。

如本文所用的“基本上纯的”当用于指形式时指化合物基于化合物重量计具有高于90重量％、包括高于90、91、92、93、94、95、96、97、98、99重量％和还包括等于约100重量％N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的纯度。剩余的物质包括所述化合物的一种或多种其它形式和/或其制备中产生的反应杂质和/或加工杂质。例如，当其具有高于90重量％的纯度(如通过此时本领域已知的和通常接受的方法所测定)时，N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结晶形式可以被认为是基本上纯的，其中剩余的少于10重量％的材料包含N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的一种或多种其它形式和/或反应杂质和/或加工杂质。

其它定义基本上纯的方法如下：

如本文所用的术语“基本上纯”当涉及特定多晶型形式时指多晶型形式包括少于10％、优选少于5％、更优选少于3％、最优选少于1％重量的任意其它物理形式的化合物。

在本公开内容的一项实施方案中，N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结晶形式以基本上纯的形式提供。这种基本上纯的形式的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的结晶形式可以用于药物组合物中，所述药物组合物可以任选地包含一种或多种例如选自赋形剂、载体和具有不同分子结构的其它活性药物成分活性化学实体之一的其它组分。

优选地，所述结晶形式具有基本上纯的相均质性(phase homogeneity)，如通过在实验测定的XRPD图中有少于10％、优选少于5％、更优选少于 2％的峰总面积产生于不存在于模拟PXRD图中的额外峰所示。最优选的是具有在实验测定的PXRD图中有少于1％的峰总面积产生于不存在于模拟PXRD图中的额外峰的基本上纯的相均质性的结晶形式。

术语“基本上相同”当涉及X-射线衍射峰位时意味着考虑了典型的峰位和强度变异。例如，本领域技术人员将理解，峰位(2θ)将显示出一些仪器内差异，通常多至0.2°。而且，本领域技术人员将理解，相对峰强度将显示出仪器内差异以及归因于结晶度、择优取向、所制备的样品表面和其它本领域技术人员已知的因素的差异，并且应当仅用作定性测量。

结晶材料的制备：

结晶形式可以通过多种方法制备，例如包括从适宜溶剂中结晶或重结晶、升华、由熔化物生长、由另一种相进行固态变化、由超临界液体结晶和喷射雾化。从溶剂混合物中结晶或重结晶出结晶形式的技术包括例如蒸发溶剂、降低溶剂混合物的温度、给分子和/或盐的超饱和溶剂混合物加入晶种、冷冻干燥溶剂混合物和向溶剂混合物中加入抗溶剂(反萃溶剂)。也可以采用高流通量结晶技术来制备结晶形式、包括多晶型物。

药物晶体、包括多晶型物以及药物晶体的制备方法和表征在固体-StateChemistry of Drugs,S.R.Byrn,R.R.Pfeiffer和J.G.Stowell,第2版,SSCI,WestLafayette,Indiana(1999)中进行了讨论。

对于采用溶剂的结晶技术，一种或多种溶剂的选择通常取决于一种或多种因素，例如化合物的溶解度、结晶技术和溶剂的蒸汽压。可以采用溶剂的组合，例如，可以将化合物溶解入第一种溶剂中以获得溶液，然后加入抗溶剂以降低化合物在溶液中的溶解度和获得结晶的形成。抗溶剂是化合物在其中具有低溶解性的溶剂。

在一种制备晶体的方法中，将化合物混悬于和/或搅拌于适宜的溶剂中，得到浆液，可以将其加热以促进溶解。如本文所用的术语“浆液”指化合物的饱和溶液，其还可以含有另外量的化合物以得到在给定温度下的化合物和溶剂的非均质混合物。

可以向任意结晶混合物中加入晶种以促进结晶。可以采用加入晶种来 控制特定多晶型物的生长或控制结晶产物的粒度分布。因此，所需晶种的量的计算取决于可获得的晶种的尺寸和平均产物颗粒的预期尺寸，如例如“Programmed Cooling of BatchCrystallizers,”J.W.Mullin和J.Nyvlt,Chemical Engineering Science,1971,26,369-377中所述。通常，需要具有小尺寸的晶种以有效地控制批料中的晶体的生长。具有小尺寸的晶种可以通过将大晶体过筛、研磨或微粉化或者通过将溶液微结晶来产生。应当注意，晶体的研磨或微粉化不使得形成预期晶体形式的结晶性产生任何变化(即变化为无定形物或其它多晶型物)。

可以将冷的结晶混合物在真空下过滤，并且可以将所分离的固体用适宜的溶剂如冷的重结晶溶剂洗涤和在氮气气流下干燥，得到预期的结晶形式。可以将所分离的固体通过适宜的光谱或分析技术如固态核磁共振、示差扫描量热法、x-射线粉末衍射等进行分析，以保证形成产物的优选的结晶形式。基于在结晶操作中最初采用的化合物的重量计，通常以高于约70重量％分离产率、优选高于90重量％分离产率的量产生所得结晶形式。如果需要的话，可以将产物进行共研磨或过筛以使产物不结块。

可以直接由用于制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的最终方法的反应介质制备结晶形式。这可以例如通过在最终方法步骤中应用N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺可以从其中结晶的溶剂或溶剂混合物来达到。或者，结晶形式可以通过蒸馏或溶剂添加技术来获得。适于该目的的溶剂包括例如上文提及的非极性溶剂和极性溶剂、包括质子极性溶剂如醇和质子惰性极性溶剂如酮。

样品中多于一种多晶型物的存在可以通过诸如x-射线粉末衍射(PXRD)或固态核磁共振光谱的技术来确定。例如，实验测定的PXRD图与模拟PXRD图相比存在额外的峰可以表明样品中有多于一种多晶型物。模拟PXRD可以由单晶x-射线数据计算，参见Smith,D.K.,“A FORTRAN Program for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns,”劳伦斯辐射实验室,利弗莫尔,加利福尼亚,UCRL-7196(1963年4月)或TOPAS程序(Total PatternAnalysis Solution,可通过Brucker AXS Inc.获得)。

多种分析方法可用于表征：

I.X-射线粉末衍射测定

本领域普通技术人员将理解，可以获得测定误差依赖于所采用的测定条件的X-射线衍射图。特别地，通常已知的是，X-射线衍射图中的强度可以根据所采用的测定条件而波动。还应当理解：相对强度还可以根据实验条件而改变；因此，强度的确切级别不应当纳入考虑。另外，常规X-射线衍射图的衍射角的测定误差通常为约5％或更低，测定误差的该程度在涉及上文提及的衍射角时应当纳入考虑。因此，应当理解，本发明的晶体形式不限于提供了与本文公开的附图中所绘的X-射线衍射图完全相同的X-射线衍射图的晶体形式。提供了与附图所公开的那些基本上相同的X-射线衍射图的任意结晶形式落入了本发明的范围。确定X-射线衍射图基本相同的能力在本领域普通技术人员的范围内。

II.示差扫描量热(DSC)

用于测试结晶形式的DSC仪器是TA示差扫描量热2910型、TA调制示差扫描量热2920型或TA调制示差扫描量热Q1000型。将DSC池/样品室用100ml/min超高纯度的氮气净化。将仪器用高纯度铟校准。该方法的所测定样品温度的准确度为约±1℃内，熔解热可以在约±5％的相对误差内测定。将样品放置在开放的铝DSC盘中，相对于空的参比盘进行测定。将约2-6mg样品粉末放置在盘子底部，轻轻压下使得与盘子接触。精确测定样品重量，记录至百分之一毫克。使仪器在25-300℃之间的温度范围以10℃/分钟程序加热。

将通过样品重量标准化的热流对所测定的样品温度作图。所报道数据的单位为瓦特/克("W/g")。以吸热峰尖向下作图。在该分析中，对外推始点温度、峰温度和熔解热评价了吸热熔融峰。

III.热重分析(TGA)

用于测试结晶形式的TGA仪器是TA Instruments.RTM.高分辨热重分析仪Q500或TA Instruments.RTM.高分辨热重分析仪2950。将15-20毫克样品在25℃至约300℃的温度范围以10℃/分钟的加热速率进行分析。

实施例

通过如下实施例说明了本发明，但是不以任何方式限制本发明。

缩略语

ACN 乙腈

app 近似

aq 水性的，含水的

atm 大气压

ATP 腺苷5'-三磷酸

BOC 叔丁基羧基

BOP (苯并***-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐

br 宽

BSA 牛血清清蛋白

d 双重峰

DBU 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯

DCE 1,2-二氯乙烷

dd 双二重峰

DCM 二氯甲烷

DIEA 二异丙基乙胺

DMAP 4,4-二甲基氨基吡啶

DME 1,4-二甲氧基乙烷

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DMP Dess-Martin试剂；1,1,1-三乙酰基1,1-二氢-1,2-苯并碘杂氧杂

环戊烯-3(1H)-酮

DMSO 二甲基亚砜

DTT 二硫苏糖醇

EDTA 乙二胺四乙酸

ESI 电喷雾电离

EtOAc 乙酸乙酯

FCC 快速柱色谱法

g 克

g(斜体) 重力加速度常数

GSH 谷胱甘肽

h 小时

HATU 2-(1H-7-氮杂苯并***-1-基)--1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

甲胺鎓

HBTU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-苯并***鎓六氟磷酸盐(1-)3-

氧化物

HOBt 1-羟基-7-氮杂苯并***

HPLC 高效液相色谱法

IR 红外光谱法

LCMS 液相色谱法质谱法联用

LTMP 锂2,2’,6,6’-四甲基哌啶

M 摩尔

m 多重峰

MeOH 甲醇

min 分钟

mL 毫升

mmol 毫摩尔

MS 质谱法

MsOH 甲磺酸

m/z 质荷比

N 当量

NADPH β-烟酰胺磷酸二核苷酸,还原形式

NMR 核磁共振

Pd/C 披钯碳

ppm 兆北率

PyBOP 苯并***-1-基氧基三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐

rac 外消旋

rt 室温

R_t 保留时间

s 单峰

sat 饱和

SFC 超临界流体色谱法

t 三重峰

TBSCl 叔丁基二甲基硅烷基氯

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

UDPGA 尿苷5’-二磷酰-α-D-葡糖醛酸

实施例1–制备(Z)-N-((6-((1-((1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)氨甲酰 基)-1H-吲哚-5-基)氧基)嘧啶-4-基)亚甲基)甲胺氧化物

于室温向如WO2010066684中所述制备的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(3.06g,6.87mmol)在乙腈(140mL)中的混悬液中加入H₂O₂在水中的30wt％溶液(147ml,1443mmol)。将反应物搅拌3小时。然后将混合物用500mL DCM、然后用400mL水稀释，分离所得各层。水层用另外250mLDCM萃取。合并有机层，然后依次用盐水(150mL)、然后饱和NaHSO₃(150mL)和然后再用盐水(150mL)洗涤。然后将有机相经颗粒Na2SO₄干燥，过滤，浓缩。将所得残余物经快速硅胶柱色谱法部分纯化(MeOH在DCM中的0至10％溶 液)，然后通过缓慢加入庚烷、然后缓慢冷却至室温而从温热(～60℃)乙酸乙酯溶液中沉淀出进行进一步纯化。过滤收集所得固体，用冷2:1庚烷:乙酸乙酯洗涤，得到(Z)-N-((6-((1-((1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)氨甲酰基)-1H-吲哚-5-基)氧基)嘧啶-4-基)亚甲基)甲胺氧化物，25％产率。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝11.07(s,1H),8.78(d,J＝1.0Hz,1H),8.42(d,J＝1.5Hz,1H),8.32(d,J＝9.1Hz,1H),8.19(d,J＝3.5Hz,1H),8.07(s,1H),7.49(d,J＝2.5Hz,1H),7.16(dd,J＝2.3,8.8Hz,2H),7.08(s,1H),6.77(d,J＝4.0Hz,2H),3.95(s,3H),3.89(s,3H)。HRMS:C₂₀H₁₇F₃N₇O₃计算值460.1345,实测值460.1341。

实施例2–制备5-((6-氨甲酰基嘧啶-4-基)氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H- 吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺

向5-((6-(羟基甲基)嘧啶-4-基)氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(700mg,1.619mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入Dess-Martin过碘烷(1030mg,2.429mmol)。将反应物搅拌2小时。此时，加入NaHCO₃饱和水溶液。分离各层，有机相用DCM萃取。合并有机层，经硫酸钠干燥，蒸发。向所得残余物中加入tBuOH(16mL)/H₂O(4mL)，然后加入亚氯酸钠(946mg,8.37mmol)、磷酸二氢钠(1004mg,8.37mmol)和2-甲基-2-丁烯(6.65ml,62.7mmol)。将反应物搅拌4小时。此时，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将产物用EtOAc萃取。于0℃向在DCM(2mL)中的一部分粗混合物(100mg,0.224mmol)中加入草酰氯(0.029ml,0.336mmol)和DMF(1.735μl,0.022mmol)。2分钟后，加入氨在二噁烷中的0.5M溶液(13.44ml,6.72mmol)，将反应物温热至室温，搅拌过夜。将反应 物蒸发，直接采用FCC用庚烷:EtOAc 100:0至0:100洗脱纯化。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 11.07(s,1H)8.87(d,J＝1.01Hz,1H)8.34(d,J＝8.84Hz,1H)8.28(s,1H)8.20(d,J＝3.79Hz,1H)7.97(s,1H)7.53(d,J＝2.02Hz,1H)7.41(d,J＝1.01Hz,1H)7.19(dd,J＝9.09,2.53Hz,1H)7.08(s,1H)6.78(d,J＝3.79Hz,1H)3.95(s,3H).MS(ESI+)m/z 445.93(M+H)。

实施例3–制备5-(6-(氨基甲基)嘧啶-4-基氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲 基)-1H- 吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺

a)5-(6-(苄基氧基甲基)嘧啶-4-基氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺

于0℃在氮气下向如WO010066684中所述制备的5-((6-((苄基氧基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚(2.88g,8.69mmol)和如WO010066684中所述制备的(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)氨甲酸苯基酯(3.10g,10.86mmol)在DMF(87mL)中的溶液中加入NaH(60％,在矿物油中,1.043g,26.1mmol)。

30分钟后，将反应物用乙酸乙酯(100mL)稀释，用30mL饱和NH₄Cl水溶液萃取。加入水(50mL)。水层用另外2X50mL乙酸乙酯萃取。合并的有机物经硫酸镁干燥，过滤，浓缩。将粗油经快速柱色谱法纯化(0-100％乙酸乙酯:庚烷)，得到标题化合物。MS(ESI+)m/z 523.0(M+H)。

b)5-(6-(羟基甲基)嘧啶-4-基氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺

将5-(6-(苄基氧基甲基)嘧啶-4-基氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(3.26g,6.24mmol)加入TFA(100mL)中，于100℃加热。3小时后，将反应物浓缩，经快速柱色谱法纯化(甲醇在DCM中的0-10％溶液；含甲醇的10％氢氧化铵)，得到标题化合物。MS(ESI+)m/z433.0(M+H)。

c)甲磺酸(6-(1-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基氨甲酰基)-1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基酯

向5-(6-(羟基甲基)嘧啶-4-基氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(0.93g,2.151mmol)在DCM(19.55mL)中的溶液中加入甲磺酸氯(0.252ml,3.23mmol)、三乙胺(0.599ml,4.30mmol)和DMAP(26mg,0.213mmol)。1小时后，加入另外的甲磺酸氯(0.126ml,1.61mmol)和三乙胺(0.300ml,2.15mmol)。2小时后，将反应物用水(20mL)萃取和用DCM(3X10mL)萃取，经MgSO₄干燥，过滤，浓缩，得到标题化合物。MS(ESI+)m/z 510.9(M+H)。

d)5-(6-(氨基甲基)嘧啶-4-基氧基)-N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺

向甲磺酸(6-(1-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基氨甲酰基)-1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基酯(107mg,0.210mmol)在THF(2.10mL)中的溶液中加入氨(0.5M,在二噁烷中,4.192ml,2.096mmol)。将反应物于室温搅拌1天，然后于40℃搅拌1天。将反应物浓缩，加入THF(2mL)和氨(7M,在甲醇中,1.50ml,10.48mmol)中，于35℃加热过夜。将反应物浓缩，吸收在硅胶上以经过FCC纯化(甲醇在DCM中的0-5％溶液；含甲醇的10％氢氧化铵)。将产物进一步通过HPLC纯化(20-100％乙腈:水梯度,Sunfire C8OBD 5um 30x100柱)，得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 8.65(s,1H)8.32(d,J＝8.84Hz,1H)8.18(d,J＝3.54Hz,1H)7.46(d,J＝2.53Hz,1H)7.10-7.15(m,2H)7.07(s,1H)6.76(d,J＝3.79Hz,1H)3.95(d,J＝1.01Hz,3H)3.82(s,2H)。HRMS C₁₉H₁₆F₃N₇O₂(M+H)⁺计算值432.1396,实测值432.1407。

实施例4–N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧 啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的其它代谢物的分离/表征

体外方案

将[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺与来自雄性Sprague-Dawley大鼠、雄性新西兰白兔、雄性食蟹猴和人的肝细胞一起在10μmol/L浓度下培养6小时。还将10μmol/L[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺与人肝微粒体培养1小时。通过具有放射活性监测的HPLC分析了培养物。通过LC-MS表征了代谢物结构。

[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在肝细胞和人肝微粒体中的概括代谢途径

将[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺和未放射性标记的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺溶于DMSO中以获得浓度为10mmol/L的溶液。为了易于进行LC-MS分析，将¹⁴C-标记在最终储备液中的程度调节为约50％。因此，将60μL[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺溶液与40μL非放射性的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺溶液混合。该研究中使用了表1描述的冷藏保存的肝细胞。

表1.所用肝细胞的来源

种属	大鼠	兔	猴	人
					汇合的/供体号	汇合的/n＝14	汇合的/n＝3	汇合的/n＝3	汇合的/n＝20
品系	Sprague-Dawley	新西兰白兔	食蟹猴	混合的
					性别	雄性	雄性	雄性	混合的
供应商	Celsis	Celsis	Celsis	Celsis
					序号	M00005	M0045	M0035	X008000
批量	LSC	BMC	OAY	SSY

将冷藏保存的肝细胞在液N₂中储存。在培养当天，将肝细胞根据供应商提供的说明书解冻。

肝细胞孵育和存活力测定

将冷藏保存的肝细胞解冻后，通过在HepatoZYME细胞培养基(Gibco Invitrogen)中离心使存活细胞富集。对于此目的，将细胞加入45mL 37℃温 热HepatoZYME中，于室温和50g离心5分钟。弃去含有死细胞的上清液，将沉淀物中的细胞重新混悬于HepatoZYME中。

通过Guava EasyCyteTMMini***、采用如供应商(Guava Technologies,Hayward,CA,USA)所述的分析测定重新混悬的肝细胞的存活。在细胞计数后，通过添加HepatoZYME将细胞浓度调节至约1·10⁶个存活细胞/mL。随后，通过添加[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺和未标记的N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在DMSO中的溶液开始孵育。孵育物中DMSO的最终浓度为0.1％(v/v)。

对于代谢物模式分析而言，[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在孵育物中的初始浓度为10μmol/L(4.2kBq/mL)。对于所有孵育，使用了25mL组织培养瓶(Becton Dickinson FranklinLakes)，在不同时间点(0h和6h)取500μL的等分试样。

为了检测[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在孵育条件下的化学稳定性，将化合物在HepatoZYME中、在没有肝细胞的情况下于10μmol/L的浓度孵育。在没有受试化合物的存在下用所有种属的肝细胞进行第二个系列的对照孵育，以研究后者对存活的影响。这些实验在12x6mL MultiWellTM板(Art.393503,Beckton Dickinson)中进行。表2给出了孵育的进一步细节。

表2.代谢物模式和代谢物结构表征的肝细胞孵育条件

在Heraeus孵育器/cytoperm(Kendro Laboratory Products AG,Zürich,瑞士)中在95％相对湿度的潮湿气氛和5％CO₂下于37℃进行孵育。在孵育期间，将板和小瓶于300击/分钟振摇。6小时(孵育结束)后测定肝细胞的存活。

放射活性标记的代谢稳定性的评价

单独进行N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的另外孵育以评价放射活性标记的代谢稳定性。如上所述进行孵育，但是对于猴肝细胞使用新的批次(SZH)。在0、2、4和6小时的时间点，吸取50μL等分试样(一式四份样品)直接加入含有10mL Rialuma(Lumac,荷兰)的20mL Zinsser小瓶中。吸取另外50μL等分试样(一式四份样品)加入空的20mL Zinsser小瓶中，将样品在其中干燥过夜，然后将它们与10mL Rialuma混合，超声60分钟用于放射活性测定。

人肝微粒体孵育

在该研究中，使用了购买获得的表3所述的人肝微粒体。批次就供应商的各种酶的活性而言进行表征(数据未显示，但是保存在文件中)。在干冰上接受微粒体并于-80℃储存备用。

表3.肝微粒体的技术数据

种属	人
		性别	女性和男性的汇合
供应商	Gentest
		目录号/产品号	457081
批次号	82087(Novartis Global批料)
		汇合个体的数	50
蛋白质含量(mg/mL)	20

代谢物模式的微粒体孵育

在一个研究时间点(60分钟)在10μmol/L[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(约50％放射性标记)进行代谢物模式的微粒体孵育。于37℃在0.1mol/L磷酸 钠缓冲液pH7.4中进行孵育。孵育混合物中的最终浓度为：4mmol/L UDPGA(Sigma-Aldrich)、1mmol/Lβ-NADPH(Sigma-Aldrich)、5mmol/L MgCl₂和60μg阿拉霉素(Sigma-Aldrich)，相对于每mg微粒体蛋白质而言。将***孵育10分钟，然后加入受试化合物以允许与阿拉霉素形成孔。通过加入[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺开始代谢反应，通过加入两体积冰冷的乙腈终止。将样品于-20℃储存至分析。进行没有微粒体的存在的对照孵育以测定[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在孵育混合物中历经60分钟的化学稳定性。

表4.代谢物模式和代谢物结构表征的肝微粒体孵育条件

样品制备

受试化合物和条件

使用[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在DMSO中的10mmol/L储备溶液进行微粒体和肝细胞孵育。

采样时间

用肝细胞在6h孵育时间进行所有种属的代谢物描绘，而人肝微粒体的代谢物描绘在1h孵育时间进行。

代谢物描绘的孵育方法

对于肝细胞孵育，将[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在含有约1*10⁶个存活肝细胞/mL的无血清培养介质(HepatoZYME)中以10μmol/L的初始 浓度进行孵育。

对于人肝微粒体孵育，将[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在含有0.5mg微粒体/L和辅因子NADPH、GSH和UDPGA的磷酸盐缓冲液中以10μmol/L的初始浓度进行孵育。

采用来自肝细胞和微粒体的孵育上清液、通过在线放射活性检测和LC-MS分析(包括精确质量测定)完成了代谢物的结构表征。

样品制备

在孵育期结束时，将500μL等分试样的孵育上清液与两体积冰冷的乙腈混合以终止酶反应。将混合物涡旋混合，然后于-20℃储存至少4小时至分析以完全蛋白质沉淀。然后，将每份样品解冻，于10000g离心10min，然后除去上清液S1。采用样品浓缩器将上清液S1蒸发，于-20℃储存至进一步使用。在HPLC进样之前，将浓缩的样品用流动相A稀释。

将所得沉淀物用500μL Solvable/异丙醇2/1(v/v)溶解，用200μL盐酸(2M)中和。

用于测定回收的放射活性测定

用液体闪烁分析仪测定放射活性(型号TriCarb 2200CA,Packard Inst.)。在加入10-15mL闪烁合剂(Rialuma)后测定孵育混合物的等分试样(50μL)。在加入17.5mL闪烁合剂(IrgaSafe Plus,Zinsser analytic,Frankfurt,德国)后测定溶解的沉淀物。

对于孵育中的总回收的计算，必须将沉淀物溶解，并且损失一些放射活性是可能的。但是，4个种属在6h时在沉淀物和重构上清液中的放射活性回收为92.3％至97.7％之间，因此假定是几乎完全的。

发现肝细胞孵育的沉淀物中的放射活性在所有样品中在0h为低于1.1％和在6h为低于4.5％。在人微粒体孵育的沉淀物中，放射活性在孵育结束时在0h时为0.7％和在1h时为1.3％。增补的肝细胞孵育的沉淀物中的放射活性在所有样品中在6h时为4.2％至9.5％之间。

肝细胞存活

在用[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(10μmol/L)孵育期间，来自大鼠、兔、猴和人的肝细胞的存活(存活细胞相对于总细胞的百分数)在6小时后从初始的70-93％降低至8-42％。存活性的降低等级遵循以下顺序：(人≈猴)<大鼠<兔。在没有化合物存在下的对照孵育在6小时后显示出多少较低的4-21％的存活性。

储备溶液和对照孵育

通过具有在线放射活性检测的HPLC分析本研究中所用的[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺储备溶液。放射化学纯度为99.6％。所有杂质的总和计为0.4％。没有肝细胞或肝微粒体存在的[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的对照孵育证明了化合物在孵育介质中孵育期间的稳定性。

体内方案

动物

动物许可号

No.18,KantonalesBasel

种属、品系、性别

大鼠,Wistar(Han:WIST,白变种),雄性大鼠,棕色挪威(BN/Crl,色素沉着),雄性

供应商

Han:WIST:Harlan,Netherlands BN/Crl:Janvier,法国

水/饮食

全天自由饮用自来水和食用NAFAG片No.890(Eberle NAFAG AG,Gossau,瑞士)

环境条件

22±2℃

制剂

在施用当天新鲜制备受试制剂。将药物物质溶于10％N-甲基吡咯烷酮(NMP)、70％单分散PEG200(四甘醇)和20％水性0.9％NaCl溶液中。对于10mg化合物，加入1克NMP以溶解化合物，然后依次加入7g PEG200和2g0.9％NaCl获得总共10g。

剂量

将剂量溶液(1g/kg)快速浓注施用给所有大鼠的股静脉，通过氧气/异氟烷(Forene)混合物(97/3,v/v)处死。标称剂量为1mg/kg。

血/血浆

舌下收集血样。对于样品收集，将大鼠通过吸入氧气/异氟烷(Forene)混合物(97/3,v/v)处死。采用细针刺穿舌下静脉，在K3-EDTA小瓶中收集所要求的血液。在10-15秒内通过在伤口上压棉拭子止血。大鼠每次样品收集失去知觉约2至3分钟。

将收集的血液在收集后10分钟内离心(3000g,10min,室温)。分离血浆，移出20μL等分试样，称重，通过LSC分析放射活性。将剩余的血浆在约-80℃储存直至通过ABA(组1,5a)或IDD(组2)测定N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺。对于组3和4中采集的血液，移出20μL等分试样的采集血液，称重，通过LSC分析放射活性。

***物、屠体和笼子洗涤

从组2和5a的每只大鼠定量取尿液和粪便。尿液在干冰上收集。粪便在室温下收集。每次尿液收集后，将收集小瓶用3至5mL水冲洗，加入各自尿样中。各尿样取两个等分试样(各自～0.05g)，称重，进行放射活性测定。将剩余的尿液于约-80℃储存直至通过IDD分析。将各粪便样品称重，加入1％羧甲基纤维素水溶液(约10倍于粪便重量)，然后采用旋转刀匀化器 (Polytron)进行匀化。取出将各粪便匀化物的3个等分试样(各2-3g)，称重，用CO₂封住后测定放射活性。将剩余的粪便匀化物于-20℃储存直至通过IDD分析。

在研究结束时在组2和5a中收集屠体。将这些进行进一步加工用于测定放射活性。通过将笼子用Radiacwash(Biodex Medical Systems,纽约,USA；1:10稀释)、水和乙醇冲洗获得笼子洗涤液。将所有用于洗涤操作的液体收集在一起用于测定放射活性。

挥发性CO2捕获(trapping)

体内CO2捕获

将组5a的两只大鼠1a和2a维持在适应的代谢玻璃笼中48小时。按照采样方案从每只大鼠在两种捕获介质乙醇胺:甲醇(1:10)和甲醇中测定捕获的总14CO2的放射活性。

来自粪便的CO2捕获

将含有粪便匀化物的小瓶在维持在气流(2.1-3.6mL/min)下的室中打开。将流充入分别含有捕获介质乙醇胺:甲醇(1:10)和甲醇的两个连续烧瓶中。将那些介质进行放射活性测定。

液体闪烁计数

通过采用来自Packard Instr的2500TR液体闪烁计数器的LSC测定生物学样品(血液、血浆、尿液、粪便和屠体对于)等分试样中的放射活性。对于淬灭校准，使用了外标方法。通过密封的标准(Packard Instr)建立了淬灭校准曲线。采用各个基质的空白样品获得了每个样品批次的背景值。LOD定义为背景值的1.8倍。采用称重的样品进行放射活性的所有测定。

样品制备期间的放射活性测定

如下通过液体闪烁计数测定了生物样品中的放射活性含量和用于代谢物模式的样品制备后的放射活性回收：在含有10-20mL Irgasafe Plus液体 闪烁合剂(PerkinElmer)的20mL抗静电聚乙烯小瓶(Packard BioScience,Groningen,荷兰)中直接测定均匀样品(血浆、尿液、粪便、提取物)。将非均匀样品(粪便,沉淀物)溶于0.5-2mL Solvable(Perkin-Elmer)/异丙醇(1:1,v/v)的混合物中。在溶出完成后，将样品用盐酸中和，与15-20mL Rialuma液体闪烁合剂(Zinsser Analytic Maidenhead,Berkshire,UK)混合用于液体闪烁计数。采用CO2捕获方法测定0-48h粪便汇集物中的放射活性。采用用于淬灭校准的外标比例方法在LSC计数器Tri-Carb型(Packard Instruments,Meriden,CT,USA)中分析了样品的14C-放射活性。

血浆的样品制备方法(用于代谢物模式)

对于代谢物模式分析，在i.v.给药后制备如下时间点的血浆汇集物(相同体积，每个时间点和大鼠3至15μL)：(0.083h,0.5h,1h,4h,8h,和24h)(n＝4/采样)。将血浆样品直接用于具有放射活性检测的HPLC分析。在HPLC进样之前，加入20μL含有参比化合物的混合物和230μL溶剂A。在单独的代表性运行中用0.5h和8h血浆汇集物(n＝4)测定了放射活性的HPLC回收。回收分别为93.4和106.2％之间。因此，放射活性的回收显示是完全的。

在单独的代表性运行中用0.5h和8h血浆汇集物(n＝4)测定了放射活性的HPLC回收。回收分别为93.4和106.2％之间。因此，放射活性的回收显示是完全的，对称重的粪便匀化物的等分试样(11.72g)。将混合物涡旋1分钟，超声15分钟，然后于2000g离心15分钟。然后从沉淀物P1移去上清液S1。在第二个萃取步骤中，将沉淀物P1溶于10mL水中，如以前所述用30mL乙腈萃取，得到上清液S2和沉淀物P2。移去上清液S2，将沉淀物P2溶于10mL水中，第三次用35mL甲醇萃取，产生上清液S3和沉淀物P3。上清液S1至S3中的总萃取产率为91.3％。合并上清液S1至S3，将混合物的等分试样直接上样到HPLC***上，然后进行离线放射性检测。单独运行中测定的放射活性的HPLC回收(粪便汇集物0-48h)为100.3％，因此被认为是完全的。

代谢物描绘和鉴别的HPLC方法

LC仪器

HPLC***1100型(Agilent Technologies)，装配有二元毛细管泵G1376A型、脱气器G1379A型和UV/VIS二极管阵列检测器G1315B型，具有标准13μL流动池G1315-60012型。在200-800nm范围监测UV谱。HPLC***的运行软件是Agilent ChemStation for LC 3D,Rev.B.04.02。

Guard柱

ACE 3C18Guard Cartridge,15mm x 4.6mm i.d.,Art.ACE-111-0103GD(ACT,Aberdeen,苏格兰)。

分析柱

ACE 3C18,3μm,150mm x 4.6mm i.d.,Art.ACE-111-1546(ACT)

柱条件

40℃恒温箱,在柱冷却器7955型中(Jones Chromatography Ltd.,Hengoed,Mid.Glamorgan,U.K.)

进样体积

采用HTS PAL自动进样器(CTC,Zwingen,瑞士)将一直到250μL的体积进样到500μL样品环中。

具有UV检测的HPLC分析

色谱法后，将流出物分为约1:20的比例。将较小的量直接进行电雾化LC-MS界面。较大的量用于UV检测，然后进行在线放射活性检测。

在线放射活性检测

使用装配有Z-500-5型流动池的LB 513型HPLC放射活性监测器(BertholdTechnologies)。因此，将流出物与Rialuma液体闪烁混合物(Perkin Elmer)在3mL/min的流速混合。采用RadioStar软件(Berthold)评价色谱法。

流动相

A:10mM甲酸铵+1mL/L甲酸；pH＝3.58

B:乙腈+1mL/L甲酸

流速

1000μL/min

梯度

0-5min:10％B；5-50min:10-60％B；50-55min:60-100％B；55-60min:100％B

代谢物鉴别的MS方法

MS仪器

飞行时间(Q-Tof Premier)质谱法(Waters,Manchester,UK),在MassLynx,4.1版下操作。

锥孔电压

30V

碰撞能

对于碰撞池中的分子片段，应用15–35eV的碰撞能。

去溶剂化气体

氮气

电离模式

正离子模式电雾化,Z-雾化界面,具有LockSpray^TM选项。

精确质量测定

以5μL/min的流速在乙腈/水/甲酸50/50/0.1(v/v/v)的混合物中用亮氨酸-脑啡肽溶液(200pg/μL)操作LockSpray界面的参比通道。在从参比通道获得数据期间，将锥孔电压设置为40V，碰撞能设置为5eV。

温度

来源块:100℃；去溶剂化:200℃

N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的质量破碎说明和碎片离子命名

[¹⁴C]N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的电雾化质谱显示了质子化完整分子离子M+H⁺(m/z 446)和两种主要的关键片段离子A(m/z 255)和B(m/z 212)。N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺在很小的程度上在醚键处破碎，形成片段C(m/z 122)。其它片段较少用于结构归属。由于显著程度的标记(约50％)，在质谱中可以观察到含有¹⁴C-标记的片段离子，其与所建议的结构一致。

所建议的代谢物结构

采用正离子模式的电雾化通过LC-MS表征代谢物结构。下文描绘了质谱数据、质量片段说明和所建议的结构。代谢物结构通过准确的质量测定和/或氢氘交换实验得到支持。用D₂O替换流动相中的H₂O导致M+H⁺离子的质量增加与所建议的结构一致。所要求保护的代谢物的这种归属随后通过保留时间和质谱数据与可获得的参比化合物的比较而得到证实。

实施例5-制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲 基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(HCl盐)形式A

在装配有机械搅拌棒、氮气入口接合器、温度计、添加漏斗和冷却浴的5-L 4-颈圆底烧瓶中加入N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(76.8g,172.4mmol)和乙醇(1.5L)。将白色浆液于20℃搅拌30min，快速加入HCl,1N(157ml,157mmol)(pH＝5)。加入另外量的HCl(2g)以降低pH至4。将所得白色混悬液于23搅拌2小时，用MTBE(1.5L)稀释。将两相混合物冷却至0-5℃，在该温度下搅拌3小时。通过抽滤分离固体，用冷MTBE(2x 30mL)洗涤，于55-60℃在真空烘箱中干燥，得到N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺盐酸盐(66.9g,81％)，为黄褐色固体。

通过XRPD和DSC确定该形式是结晶。图1显示了形式A的XRPD。图2显示了形式A的DSC。

表5.粉末X-射线衍射峰变通形式A

实施例6-制备N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲 基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(HCl盐)形式B

采用与上述实施例5相同的操作获得了N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺HCl盐的结晶形式B。形式B是重新转化为形式A的短暂形式。

通过XRPD和DSC确定该形式是结晶。图3显示了形式B的XRPD。图4显示了形式B的DSC。

表6.粉末X-射线衍射峰变通形式B

实施例7-制备结晶N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨 基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺形式A

迄今，结晶N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的单晶多晶型物已经被发现是鉴别是形式A。该多晶型物是具有P1空间群的三斜晶体。已经从甲醇、THF、丙酮、乙醇、乙腈、亚甲基氯的溶液中通过在1mg/mL的浓度蒸发以产生多晶型物A的方法结晶出形式A。还已经通过加热/冷却循环、采用Crystal16、在>5mg/mL的浓度下、在上文列出的所有上述溶剂中制得了结晶N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺多晶型物A。

XRPD(图5)和DSC(图6)显示多晶型物A是高度结晶型的，通过～195℃处的放热事件表征了迹线。该形式具有0.6％重量的加热失重。

表7.粉末X-射线衍射峰变通形式A

实施例8–N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧 啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺的化学合成

于23℃向装配有机械搅拌棒、温度计、加热套、回流冷凝器和氮气入口的5-L 4-颈圆底烧瓶中加入5-羟基吲哚(1,257.7g,1.94mol)和乙腈(3L)。将暗色混合物搅拌15分钟。内温降低至15℃。一次性加入4-(苄基氧基甲基)-6-氯嘧啶(2,386.6g,1.65mol)。将烧瓶用乙腈冲洗(2x50mL)，将其加入批料中。将反应混合物温热至20℃，历经25分钟经由添加漏斗滴加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)(380g,～376mL,2.5mol)。反应混合物由黄褐色浆液转变为暗色溶液，以64–66℃内温加热18小时。将反应混合物以50℃的浴温浓缩以除去大部分乙腈。将残余物用甲基叔丁基醚(MTBE)(1.5L)和水(1.2L)稀释。分离各层，水层用MTBE(2x 500mL)萃取。合并有机层，用水(800mL)、0.5N氢氧化钠溶液(800mL)、饱和氯化钠溶液(500mL)与水(100mL)的混合物洗涤。将有机层以50℃的浴温浓缩，得到粗的5-(6-(苄基氧基甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚(3,707g,>100％)，为暗色粘稠液体，将其未经进一步纯化用于下一步骤。

于23℃向装配有机械搅拌棒、温度计、冷却浴、回流冷凝器、添加漏斗和氮气入口的12-L 4-颈圆底烧瓶中加入5-(6-(苄基氧基甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚(3,706g,1.65mol,对纯度而言进行校准)和二甲亚砜(DMSO)(5.1L)。将暗色混合物于23℃搅拌10分钟，一次性加入氢氧化钾片(335.5g,5.96mol)。搅拌15分钟后，将反应混合物在水浴中冷却至14-20℃，经由添加漏斗加入乙酸酐(591g,5.79mol)，同时保持温度低于25℃。保持温度低于25℃，将反应物搅拌10小时。将反应混合物用MTBE(3L)稀释，冷却至10-15℃。历经15分钟缓慢加入水(2.5L)，同时保持批料温度低于25℃。将所得黄褐色混合物于21℃搅拌1小时，静置过夜。水层用MTBE(3x 1.2L)萃取。合并的有机层(～7L)用饱和碳酸氢钠溶液(1.7L)、水(3x1.5L)和饱和氯化钠(1.5L)洗涤。于50℃在减压下浓缩，得到深棕色粘稠液体(604g)。将粗物质经硅胶柱用MTBE洗脱过滤，得到粗的1-(5-(6-(苄基氧基甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-基)乙酮(4,593g,96％)，为橙色油，将其未经进一步纯化用于下一步骤。

向装配有机械搅拌棒、温度计、回流冷凝器、加热套和氮气入口的1-L4-颈圆底烧瓶中加入1-(5-(6-(苄基氧基甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-基) 乙酮(4,100g,267.8mmol)和甲苯(40mL)。将溶液于23℃搅拌10分钟，快速加入三氟乙酸(368.4g,3.23mol)。在加入期间，批料温度增加至45℃。将混合物加热至70℃达20小时。冷却至23℃后，将反应物用甲苯(400mL)稀释，缓慢加入碳酸氢钠(280g,3.33mol)、水(1.2L)和甲苯(200mL)的混合物中。在加入期间，维持温度低于24℃。将所得黄色浆液于23℃搅拌过夜(pH＝6)。抽滤固体，用水(100mL)和甲苯(100mL)洗涤，于55-60℃在真空烘箱中干燥。将所得干燥材料(61.3g)通过在乙酸乙酯(185mL)中于50℃搅拌30分钟、然后于23℃搅拌6小时和如上干燥进行纯化，得到1-(5-(6-(羟基甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-基)乙酮(5,37.4g,58％)，为黄褐色固体。

向装配有机械搅拌棒、温度计、冷却浴、添加漏斗和氮气入口的5-L 4-颈圆底烧瓶中加入1-(5-(6-(羟基甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-基)乙酮(5,134.2g,473.7mmol)(93％纯度)、THF(2.4L)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(6g,49mmol)。搅拌15分钟后，一次性加入三乙胺(98g,968.4mmol)，将所得浆液冷却低于5℃。历经25分钟加入甲磺酸氯(89g,777mmol)，同时维持温度低于7℃。将黄褐色混悬液于0-5℃搅拌1.5小时。加入水(250mL)，将批料温热至23℃。将反应混合物在减压下浓缩(浴温＝38℃)，残余物用乙酸乙酯(500mL)稀释。将混合物再次浓缩，残余物用乙酸乙酯(1L)和水(300mL)稀释。于23℃搅拌5小时后，将所得固体抽滤，用乙酸乙酯和水的1:1混合物(2x60mL)洗涤，于40-50℃在减压下干燥至恒重，得到甲磺酸6-(1-乙酰基-1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基酯(6,142.2g,83％)，为黄褐色固体。通过于23℃在乙酸乙酯中搅拌18小时可以将甲磺酸酯(7)进行进一步纯化。

于23℃向装配有机械搅拌棒、温度计、水浴和氮气入口接合器的5-L 4-颈圆底烧瓶中加入甲磺酸6-(1-乙酰基-1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基酯(6,118.5g,328.2mmol)(95％纯度)和甲基胺在THF中的2M溶液(7,2.04L,4mol)。将澄清橙色溶液于23℃搅拌8小时。将反应混合物于40℃在减压下浓缩，将残余物用乙酸乙酯(1.2L)稀释。于20℃加入碳酸钠(90g)在水(500mL)中的溶液。分离有机层，用水(400mL)和饱和氯化钠(400mL)洗涤。将有机层于40℃在减压下浓缩，将所得固体在乙酸异丙酯(250mL)中于40℃搅拌1小时，然后于23℃搅拌6小时。通过抽滤分离固体，用乙酸异丙酯(2x 15mL)洗涤，于45℃减压干燥，得到1-(6-(1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)-N-甲基甲胺(8,66.4g,80％)，为黄褐色固体。

于室温向装配有温度计、加热套、氮气入口、回流冷凝器和添加漏斗的3-L 4-颈圆底烧瓶中加入1-(6-(1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)-N-甲基甲胺(8,33.2g,130.561mmol)和二氯甲烷(1.125L)。将浑浊黄色溶液于23℃搅拌10分钟。向该混合物中一次性加入作为固体的焦碳酸二叔丁基酯(28.210g,129.255mmol)，将溶液于23℃搅拌12小时。将浑浊橙色溶液通过滤纸过滤，浓缩(38℃/300mm)为橙色胶状(62.9g)。加入乙酸乙酯(0.4L)，将溶液用15％ 氨水(125mL)和饱和氯化钠(125mL)洗涤，经硫酸钠干燥。过滤后，将溶液在旋转蒸发器上于40℃/100mm浓缩为深橙色油(46.3g)。将油在1:1MTBE/庚烷(80mL)搅拌12小时，过滤所得黄色固体，用2:1庚烷/MTBE(2x 55mL)洗涤，在真空烘箱中于50℃干燥过夜，得到(6-(1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨甲酸叔丁基酯(9,33.8g,71％)。

向装配有机械搅拌棒、氮气入口、回流冷凝器和温度计的5-L 4-颈圆底烧瓶中加入氯甲酸苯基酯(9c,94ml,0.75mol,117.5g)和THF(2000mL)。将溶液回流(80℃内温)加热，历经30分钟滴加1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-胺(9b,82.5g,499.649mmol)在THF(500mL)中的溶液。将澄清橙色溶液回流加热16小时，在旋转蒸发器(40℃,120mm)上浓缩。将所得白色固体在庚烷(500mL)中搅拌30分钟，过滤，用庚烷洗涤，于50℃在真空烘箱中干燥，得到1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基氨甲酸苯基酯(9a,121.9g,85％)，为白色固体。

将氢化钠(60％油分散液)(38.145g,953.717mmol)混悬于THF(1375mL)中，在冰浴中冷却至0℃。历经90分钟滴加(6-(1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨甲酸叔丁基酯(9,130.000g,366.814mmol)在THF(1375mL)中的溶液，同时保持温度低于5℃。混悬液由灰色转变为橙色。 于0℃搅拌0.5小时后，历经60分钟滴加1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基氨甲酸苯基酯(9a,115.086g,403.495mmol)在THF(500mL)中的溶液。将混合物于0℃搅拌1小时，此时其变为深棕色混悬液(存在一些固体)。于0℃加入乙酸乙酯(3500mL)和饱和氯化铵(1000mL)。搅拌数分钟后，分离各层，将有机层用饱和氯化钠(1500mL)洗涤，经硫酸钠干燥。将乙酸乙酯溶液通过Silica Gel 60(230-400筛目)和Celite在布氏漏斗上过滤，滤液浓缩为湿的浅褐色固体(来自NaH的油)。加入MTBE(625mL)，将混合物搅拌60分钟。过滤所得固体，用MTBE(2x 250mL)洗涤，在真空烘箱中于50℃干燥，得到甲基((6-(1-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基氨甲酰基)-1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基)氨甲酸叔丁基酯(10)(150.7g,75％)，为灰白色固体。

在装配有机械搅拌棒、氮气入口接合器、温度计和添加漏斗的5-L 4-颈圆底烧瓶中加入甲基((6-(1-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基氨甲酰基)-1H-吲哚-5-基氧基)嘧啶-4-基)甲基)氨甲酸叔丁基酯(10)(180g,330mmol)和二氯甲烷(2880mL)。将固体溶解以形成澄清橙色溶液，将其冷却至低于5℃。此时，滴加2,2,2-三氟乙酸(396ml,5.34mol)，同时保持温度低于5℃。滴加时间为～1.5小时。移去冷却浴，将溶液温热至22℃并搅拌5.5小时。将溶液缓慢添加至碳酸钠(792g)在水(3600mL)中的溶液中(T＝10-15℃)。观察到轻微放热，形成白色混悬液。使其搅拌过夜。将混悬液过滤，将固体用水洗涤(2x 1500mL)。在漏斗中风干数小时后，将固体在真空烘箱中于50℃干燥过夜。将干燥的固体(356.7g)在水(3600mL)中搅拌过夜，过滤，用水(3x 500mL)洗涤，如上所述干燥，得到N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑 -3-基)-5-(6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺(11,120g,80％)，为灰白色固体。

实施例9：通过LanthaScreen TR-FRET方法测定的KDR蛋白激酶活性

于室温在液体操作机器人上运行了非专属分析设置。向含有50nL化合物或对照溶液的分析板中每孔加入4.5μL ATP mix(20mM Tris-HCl pH7.4,1mM DTT,0.025％吐温20,0.01mM Na₃VO₄,10mM MgCl₂,1mM MnCl₂和4μM ATP)。随后，加入4.5μL酶底物混合物(20mMTris-HCl pH7.4,1mM DTT,0.025％吐温20,0.01mM Na₃VO₄,10mM MgCl₂,1mM MnCl₂,0.5％BSA,100nM荧光素标记的聚(EAY)和0.76nM KDR(GST-KDR(807-1356),内部产生的重组蛋白质)。

最终反应物体积为9.05μL，最终试剂浓度为20mM Tris-HCl pH7.4,1mM DTT,0.025％吐温20,0.01mM Na₃VO₄,10mM MgCl₂,1mM MnCl₂,包括非专属浓度的2μM ATP,50nM底物荧光素标记的聚(EAY)和0.38nM酶。

孵育1小时后，通过加入4.5μL终止溶液(20mM Tris-HCl pH7.4,1mM DTT,0.025％吐温20,0.01mM Na₃VO₄,50mM EDTA)、随后立即加入4.5μL抗体溶液(20mM Tris-HCl pH7.4,1mM DTT,0.025％吐温20,0.01mM Na₃VO₄,1.72μg/ml Tb-PY20)终止激酶反应。

在暗处孵育45分钟后，将板转移至荧光读数器，以时间分辨荧光模式计数(按照试剂供应商的推荐设置)。由终点测定获得了化合物对酶活性的作用。

表4.实施例的IC⁵⁰值

实施例	IC50
		1	<1nm
2	20nm
		3	<1nm

Claims (4)

1.N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基-1H-吲哚-1-甲酰胺的代谢物或其盐：

2.药物制剂，包含权利要求1的代谢物或其盐和至少一种可药用赋形剂。

3.权利要求1的代谢物在制备用于治疗个体的以VEGF-R受体活性异常为特征的障碍或疾病的药物中的用途。

4.权利要求3的用途，其中所述疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病性视网膜病。