TWI786303B

TWI786303B - 抑制ｃｄｋ4/6活性化合物的晶型及其應用

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Publication number: TWI786303B
Application number: TW108121799A
Authority: TW
Inventors: 王義乾; 張春輝; 家炳王; 丁列明
Original assignee: 大陸商貝達藥業股份有限公司
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2022-12-11
Also published as: EA202190036A1; IL279579B; CN113861191B; IL279579A; AU2019290722B2; CA3104365A1; JP7430656B2; TW202016114A; US20210261546A1; SG11202012858QA; JP2021529175A; CN112424202A; AU2019290722A1; BR112020026052A2; KR20210024004A; MX2020013847A; CN113861191A; PH12020552236A1; EP3812386A1; IL279579B2

Abstract

本發明係關於結構式I所示之(R)-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氫苯並[4,5]咪唑並[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺(化合物I)之鹽型或其晶型，本發明亦關於化合物I的鹽型及/或其晶型之製備方法，含有前述鹽型及/或晶型之藥物組合物，以及其等在製備治療疾病、病症或病狀之藥物中之應用或用於治療疾病、病症或病狀之治療方法。

Description

抑制CDK4/6活性化合物的晶型及其應用

本發明係關於一種化合物(R)-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氫苯並[4,5]咪唑並[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺之鹽型及其晶型；本發明亦關於前述化合物及晶型之製備方法以及相關之中間體化合物，含有前述化合物之藥物組合物，以及其等在抑制CDK4/6之活性中之應用。本發明亦關於應用至少上述之一之化合物或晶型及藥物組合物治療與CDK4/6調節相關之疾病、病症或病狀之方法。

細胞週期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDKs)，係一類絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶，在細胞週期、轉錄起始及某些特定代謝級聯反應控制等過程中皆參與調控。不同的CDK及細胞週期素(cyclin)形成CDK-cyclin複合物，若CDK活性失調會直接或間接引起細胞增殖失控、基因組不穩定(DNA突變增加，染色體缺失等)及染色體不穩定(染色體數目變化)等。

CDKs家族目前已經確認20多個亞型，CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等參與細胞週期調控；CDK7、CDK8、CDK9、CDK11等參與轉錄調節；以及其他激酶包含CDK3、CDK5等。其中CDK4/6(細胞週期蛋白依賴性激酶4及6)係調節細胞週期的關鍵因子，與癌症有關的細胞週期突變主要存在於G1期及G1/S期轉化過程中，CDK4/6與CyclinD結合形成有激酶活性的複合物，藉由抑癌基因Rb產物pRb磷酸化，釋放結合的轉錄因子E2F，啟動與S期有關的基因轉錄，促使細胞通過檢驗點，並從G1期向S期轉移。CDK4/6特異性的活化與部分腫瘤的增殖密切相關，大約80%的人類腫瘤中有cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb通路的異常。CDK4/6抑制劑將細胞週期阻滯於G1期，從而起到抑制腫瘤增殖的作用。

標靶CDK4/6激酶藥物的研發是意義重大的領域，其抗腫瘤靶點的優勢在於：(1)大多數增殖的細胞依賴CDK2或者CDK4/6增殖，但CDK4/6的抑制劑不表現出「pan-CDK抑制劑」的細胞毒性，如骨髓抑制及腸道反應；(2)臨床前實驗表明，如果細胞cyclin D水準升高或者P16INK4a失活，能夠增加細胞對藥物的敏感性，由於腫瘤細胞相對於正常細胞存在上述現象，故一定程度上增加藥物的標靶性。

PCT國際申請PCT/CN2017/117950描述一類用作CDK4/6蛋白激酶抑制劑的苯並咪唑衍生物，此等化合物中的大部分有效地抑制CDK4及CDK6。因為在激酶介導疾病的治療選擇方面仍有未滿足的需求，在此本發明人進一步篩選苯並咪唑衍生物的鹽型及其晶型以滿足患者的醫療需求。

CDK4/6係調節細胞週期的關鍵因子，其特異性的活化與部分腫瘤的增殖密切相關，而CDK4/6抑制劑將細胞週期阻滯於G1期，從而起到抑制腫瘤增殖的作用。一類用作CDK4/6蛋白激酶抑制劑的苯並咪唑衍生物已被揭露，此等化合物中的大部分有效地抑制CDK4及CDK6，然而在激酶介導疾病的治療選擇方面仍有未滿足的需求，故仍需進一步之開發。

本發明的目的在於提供一種如下結構式I所示化合物(R)-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氫苯並[4,5]咪唑並[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺的鹽型及其晶型：

結構式I的鹽型

在部分實施方案中，一種酸及化合物I形成相應的鹽。此等鹽型化合物可以以各種物理形式存在。例如，可以是溶液、懸浮液或固體形式。在部分實施方式中，鹽型化合物為固體形式。為固體形式時，前述化合物可以是無定形物，結晶物或其混合物。以下示範性列舉了化合物I與兩種酸所形成的鹽型。分別是酒石酸鹽化合物及甲磺酸鹽化合物。在部分實施方式中，前述酒石酸鹽係指L-酒石酸鹽。化合物I的L-酒石酸鹽及甲磺酸鹽的結構如下結構式II及結構式III所示：

化合物I的L-酒石酸鹽(結構式II所示化合物，化合物II)

化合物I的甲磺酸鹽(結構式III所示化合物，化合物III)

本發明亦提供上述化合物II及化合物III的多種晶型。例如，

化合物II的晶型A

本發明提供化合物II的晶型A。

在部分實施方式中，化合物II的晶型A可以藉由X射線粉末衍射進行鑑別。在部分實施方式中，化合物II的晶型A的X射線粉末衍射譜圖具有衍射角2θ為4.4±0.2°、23.6±0.2°及26.9±0.2°的特徵峰。為方便，本發明稱之為晶型A。

在部分實施方式中，上述晶型A的X射線粉末衍射譜圖具有衍射角2θ為4.4±0.2°、8.7±0.2°、10.8±0.2°、18.4±0.2°、23.6±0.2°及26.9±0.2°的特徵峰。

在部分實施方式中，上述晶型A的X射線粉末衍射譜圖具有衍射角2θ為4.4±0.2°、8.7±0.2°、10.8±0.2°、15.9±0.2°、18.4±0.2°、23.6±0.2°及26.9±0.2°的特徵峰。

在部分實施方式中，本發明所述化合物II晶型A可用差式掃描量熱分析進行鑑定。在部分實施方式中，晶型A具有如圖11所示的差式掃描量熱分析曲線。在DSC圖譜中，晶型A的吸熱峰約在230.1~233.1℃。差式掃描量熱分析測定係藉由NETZSCH公司的DSC 200F3 240-20-0954-L(吹掃氣體：氮氣；流速：60mL/min；升溫速度：10℃/分鐘，測定範圍：30℃-300℃)測定。

在部分實施方式中，本發明所述化合物II的晶型A可以利用離子色譜法，電導檢測器，採用外標法計算主成分含量，測得L-酒石酸含量約為12.01%-13.27%。

在部分實施方式中，本發明所述化合物II的晶型A可以利用¹HNMR進行鑑定，¹HNMR的數據如下：¹HNMR(500MHz,CDCl3)δppm：1.01-1.04(t,3H,CH3,J=5.3Hz)，1.50-1.52(d,3H,CH3,J=6.5Hz)，1.93-1.95(m,2H,CH2)，2.03-2.06(m,1H,CH2)，2.16-2.19(m,1H,CH2)，2.50(s,8H,CH2)，2.57(s,2H,CH2)，2.93-3.09(m,2H,CH2)，3.47(s,1H,CH2)，4.02(s,1H，CH)，4.79(s,1H,CH)，7.68-7.70(d,1H,CH,J=10.5)，7.71-7.73(d,1H,Ar-H,J=12.5)，8.12(s,1H,Ar-H)，8.20(s,1H,Ar-H)，8.21(s,1H,Ar-H)，8.68-8.69(d,1H,Ar-H,J=3.5)，10.03(s,1H,NH)。

作為理想，該晶型A純度

85%。

作為理想，該晶型A純度

95%。

作為理想，該晶型A純度

99%。

作為理想，該晶型A純度

99.5%。

作為理想，該晶型A為無水物。

本發明提供的化合物II晶型A具有結晶性佳、弱吸濕性、穩定性佳的特性，而且具有可接受的口服生物利用度。

化合物II的晶型B

本發明亦提供化合物II的另一晶型，為方便，本發明稱之為晶型B。該晶型B的X射線粉末衍射譜圖有約如圖2所示之X-射線粉末衍射圖。

作為理想，該晶型B純度

85%。

作為理想，該晶型B純度

95%。

作為理想，該晶型B純度

99%。

作為理想，該晶型B純度

99.5%。

作為理想，該晶型B為無水物。

化合物II的晶型C

本發明亦提供化合物II的另一晶型，為方便，本發明稱之為晶型C。該晶型C的X射線粉末衍射譜圖有約如圖3所示之X-射線粉末衍射圖。

作為理想，該晶型C純度

85%。

作為理想，該晶型C純度

95%。

作為理想，該晶型C純度

99%。

作為理想，該晶型C純度

99.5%。

本發明進一步提供化合物II或其溶劑化物的無定型物，該無定型物具有約如圖4所示之X-射線粉末衍射圖。

本發明亦進一步提供含有治療有效量的化合物II的晶型A、晶型B及/或晶型C的藥物組合物。

本發明亦提供上述藥物組合物的理想實施方式：

作為理想，前述藥物組合物含有治療有效量的化合物II的晶型A、晶型B及/或晶型C，及藥學上可接受的輔料、輔助劑或載體。

作為理想，前述藥物組合物含有治療有效量的化合物II的晶型A，及藥學上可接受的輔料、輔助劑或載體。

作為理想，前述藥物組合物含有治療有效量的化合物II的晶型A、晶型B及/或晶型C，並聯用至少一種其他有效成分。

作為理想，前述藥物組合物含有治療有效量的化合物II的晶型A，並聯用至少一種其他有效成分。

作為理想，前述藥物組合物為口服製劑。

作為理想，前述藥物組合物為片劑或膠囊。

本發明亦提供前述化合物II的晶型A、晶型B及/或晶型C在製備治療患者的疾病、病症或病狀的藥物中的用途，其中，前述的疾病、病症或病狀由CDK，如CDK4及/或CDK6介導。

本發明亦提供前述化合物II的晶型A、晶型B及/或晶型C上述用途的理想實施方式。

作為理想，前述疾病、病症或病狀係癌症及/或增殖性疾病。

作為理想，前述的疾病、病症或病狀係結腸癌、直腸癌、套細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、乳腺癌、***癌、膠質母細胞瘤、鱗狀細胞食管癌、脂肪肉瘤、T細胞淋巴瘤、黑素瘤、胰腺癌、腦癌或肺癌。

作為理想，前述疾病、病症或病狀係乳腺癌。

本發明亦提供藉由對患者施用化合物II的晶型A、晶型B及/或晶型C治療患者的疾病、病症或病狀的方法。

本發明進一步提供上述利用化合物II的晶型A、晶型B及/或晶型C治療患者的疾病、病症或病狀的方法的理想實施方式：

作為理想，前述的疾病、病症或病狀係由CDK，如CDK4及/或CDK6介導。

作為理想，前述的疾病、病症或病狀係癌症及/或增殖性疾病。

作為理想，前述疾病、病症或病狀係乳腺癌。

化合物III的晶型D

本發明提供化合物III及/或其溶劑化物的一種晶型，為方便，本發明稱之為晶型D。該晶型D具有約如圖5所示的X-射線粉末衍射圖。

作為理想，該晶型D純度

85%。

作為理想，該晶型D純度

95%。

作為理想，該晶型D純度

99%。

作為理想，該晶型D純度

99.5%。

作為理想，該晶型D為無水物。

化合物III的晶型E

本發明提供化合物III及/或其溶劑化物的一種晶型，為方便，本發明稱之為晶型E。該晶型E具有約如圖6所示的X-射線粉末衍射圖。

作為理想，該晶型E純度

85%。

作為理想，該晶型E純度

95%。

作為理想，該晶型E純度

99%。

作為理想，該晶型E純度

99.5%。

作為理想，該晶型E為二水合物。

化合物III的晶型F

本發明提供化合物III及/或其溶劑化物的一種晶型，為方便，本發明稱之為晶型F。該晶型F具有約如圖7所示的X-射線粉末衍射圖。

作為理想，該晶型F純度

85%。

作為理想，該晶型F純度

95%。

作為理想，該晶型F純度

99%。

作為理想，該晶型F純度

99.5%。

作為理想，該晶型F為1.5水合物。

化合物III的晶型G

本發明首先提供化合物III及/或其溶劑化物的一種晶型，為方便，本發明稱之為晶型G。該晶型G具有約如圖8所示之X-射線粉末衍射圖。

作為理想，該晶型G純度

85%。

作為理想，該晶型G純度

95%。

作為理想，該晶型G純度

99%。

作為理想，該晶型G純度

99.5%。

作為理想，該晶型G為2.5水合物。

本發明進一步提供化合物III及/或其溶劑化物的無定型物，該無定型物具有約如圖9所示之X-射線粉末衍射圖。

本發明亦進一步提供含有治療有效量的化合物III的晶型D、晶型E、晶型F及/或晶型G的藥物組合物。

本發明亦提供上述藥物組合物的理想實施方式：

作為理想，前述藥物組合物含有治療有效量的化合物III的晶型D、晶型E、晶型F及晶型G，及藥學上可接受的輔料、輔助劑或載體。

作為理想，前述藥物組合物含有治療有效量的化合物III的晶型D、晶型E、晶型F及晶型G，並聯用至少一種其他有效成分。

作為理想，前述藥物組合物為口服製劑。

作為理想，前述藥物組合物為片劑或膠囊。

本發明亦提供化合物III的晶型D、晶型E、晶型F及/或晶型G在製備治療患者的疾病、病症或病狀的藥物中的用途，其中，前述的疾病、病症或病狀由CDK，如CDK4及/或CDK6介導。

本發明亦提供化合物III的晶型D、晶型E、晶型F及/或晶型G的上述用途的理想實施方式：

作為理想，前述疾病、病症或病狀係癌症及/或增殖性疾病。

作為理想，前述疾病、病症或病狀係結腸癌、直腸癌、套細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、乳腺癌、***癌、膠質母細胞瘤、鱗狀細胞食管癌、脂肪肉瘤、T細胞淋巴瘤、黑素瘤、胰腺癌、腦癌或肺癌。

作為理想，前述疾病、病症或病狀係乳腺癌。

本發明亦提供藉由對患者施用化合物III的晶型D、晶型E、晶型F及/或晶型G治療患者的疾病、病症或病狀的方法。

本發明進一步提供上述利用化合物III的晶型D、晶型E、晶型F及/或晶型G治療患者的疾病、病症或病狀的方法的理想實施方式：

作為理想，前述疾病、病症或病狀係乳腺癌。

在部分實施方式中，本發明提供的化合物I的鹽的晶型，前述晶型係由如下方法製備得到：(1)將(R)-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氫苯並[4,5]咪唑並[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺(化合物I)混懸於水及/或水溶性有機溶劑中，得到混懸物；(2)將上述混懸物加熱至50℃以上；(3)在保持50℃以上的溫度條件下，在上述混懸物中加入相應的酸，進行酸化處理，得到澄清溶液；(4)降至室溫後，攪拌過濾，濾餅經乾燥後得到化合物I的鹽的晶型。

例如，前述步驟(3)中加入的酸為L-酒石酸，步驟(4)得到的就是化合物I的L-酒石酸鹽的晶型。

又例如，前述步驟(3)中加入的酸為甲磺酸，步驟(4)得到的就是化合物I的甲磺酸鹽的晶型。

在部分實施方式中，化合物II的晶型A的製備方法如下：

50-70℃條件下將化合物I在甲醇中形成清液，將L-酒石酸溶解在甲醇中，將L-酒石酸的甲醇溶液滴加至化合物I的甲醇溶液中，攪拌後過濾，濾餅置於40-70℃乾燥，即得到化合物II的晶型A。

在部分實施方式中，化合物II的晶型B的製備方法如下：

取化合物II的晶型A，加入水及丙酮溶清，過濾攪拌，轉至0-20℃攪拌，析出固體，離心後乾燥，得到化合物II的晶型B。

在部分實施方式中，化合物II的晶型C的製備方法如下：

攪拌狀態下，取1-03(100g)、無水甲醇(1L)，依次加入到2L反應釜中，加熱至65℃，待反應體系澄清0.5小時後滴加L-酒石酸的甲醇溶液(30.09g酒石酸溶於100mL無水甲醇)，控制滴加時間在45至60分鐘，滴加完畢，65℃保溫反應4小時，繼續滴加L-酒石酸的甲醇溶液(7.48g酒石酸溶於100mL無水甲醇)，控制滴加時間在30至45分鐘，滴加完畢，65℃保溫反應1.5小時，繼續滴加L-酒石酸的甲醇溶液(8.55g酒石酸溶於100mL無水甲醇)，控制滴加時間在30至45分鐘，滴加完畢，65℃保溫反應1.5小時，停止加熱，降溫至10℃以下，過濾，濾餅用甲醇(100mL×2)淋洗，45℃真空乾燥36小時，得淡黃色結晶性粉末109.4g，即為化合物II的L-酒石酸鹽，藉由X射線粉末衍射進行鑑定，顯示該晶型為化合物II的L-酒石酸鹽的晶型C。

在部分實施方式中，化合物II的無定形物的製備方法如下：

取化合物II的晶型A，加入三氟乙醇溶清，減壓濃縮，得到化合物II的無定型物。

化合物II的無定型物在室溫環境中受水分影響容易形成化合物II的晶型B。

本發明亦示例性地列舉(R)-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氫苯並[4,5]咪唑並[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺的L-酒石酸鹽(化合物II)的製備方法，其包含如下步驟：

在部分實施方式中，化合物III的晶型D的製備方法如下：

50-70℃條件下將化合物I在甲醇中溶清，將甲磺酸溶解在甲醇中，取甲磺酸的甲醇溶液滴加至化合物I的甲醇溶液中，攪拌後滴加異丙醚，緩慢析出固體，攪拌後過濾，濾餅置於40-70℃乾燥得到固體。母液中再滴加異丙醚攪拌後過濾，濾餅置於40-70℃乾燥得到固體。將得到的固體繼續乾燥後得到化合物III的晶型D。

在部分實施方式中，化合物III的晶型E的製備方法如下：

取化合物III的晶型D室溫置於52%RH濕度條件下1-4天，得到化合物III的晶型E。

在部分實施方式中，化合物III的晶型F的製備方法如下：

取化合物III的晶型E在室溫44%RH濕度放置1-14天，得到化合物III的晶型F。

在部分實施方式中，化合物III的晶型G的製備方法如下：

取化合物III的晶型D，置於室溫97%RH條件下敞口放置1-4天，即得到化合物III的晶型G。

在部分實施方式中，化合物III的無定形物的製備方法如下：

取化合物III的晶型D，加入水溶清，減壓濃縮乾成黏稠狀固體，得到化合物III的無定型物。

化合物III的無定型物放大到50mg時不穩定，得到結晶態。

本發明的所有晶型都是基本上純的。

本發明所用的術語「基本上純的」係指至少85重量%，理想為至少95重量%，更理想為至少99重量%，最理想為至少99.5重量%的結構式I所示的化合物存在於本發明的晶型中，尤其是在晶型A、晶型B及/或晶型C中。

如本說明書所述，新晶型可以藉由粉末X-射線衍射譜進行鑑定。然而，所屬技術領域中具有通常知識者知道，粉末X-射線衍射的峰強度及/或峰情況可能會因為實驗條件的不同而不同，如不同的衍射測試條件及/或取向優先等。同時由於不同儀器的精準度不同，測得的2θ值會有約±0.2°的誤差。然而，已知的是峰的相對強度值比峰的位置更依賴於所測定樣品的某些性質，例如樣品中晶體的尺寸、結晶的取向作用及被分析的材料的純度，因此所顯示的峰強度偏差在約±20%或更大範圍是可能出現的。但是，儘管存在試驗誤差、儀器誤差及取向優先等，所屬技術領域中具有通常知識者依然可以從本發明提供的XRD數據獲取足夠的鑑別晶型的訊息。

本發明中，「具有約如圖1所示的X-射線粉末衍射圖」或「具有約如圖2所示的X-射線粉末衍射圖」，係指X-射線粉末衍射圖示出的主要的峰如圖1或圖2所示，其中主要的峰係指與圖1或圖2中最高的峰(其相對強度指定為100%)相比，相對強度數值超過10%，理想為超過30%的該等峰。

本發明中，晶型的製備方法中所關於之「加入甲醇/丙酮」等，係指在該製備方法中，先加入甲醇，再加入丙酮。類似地，「乙醇/水」係指先加入乙醇，再加入水；而「三氟乙醇/乙酸乙酯」，係指先加入三氟乙醇，再加入乙酸乙酯。同理，類似地如「溶劑1/溶劑2」係指先加入溶劑1，再加入溶劑2；而「溶劑2/溶劑1」係指先加入溶劑2，再加入溶劑1。

本發明中，術語「治療有效量」係指一個化合物/晶型施用於治療對象時對於治療一種疾病、或一種疾病或病症的至少一種臨床症狀時，足以影響對疾病、病症或症狀的該種治療的量。「治療有效量」可以隨著化合物，疾病、病症及/或疾病或病症的症狀，疾病、病症及/或疾病或病症的症狀的嚴重程度，被治療的患者的年齡，及/或被治療的患者的體重等變化。在任意特定的情況下，一個合適的量對所屬技術領域中具有通常知識者可以是顯而易見的，也可以是用常規實驗確定的。在聯合治療的情況下，「治療有效量」係指有效治療疾病、病症或病狀的聯用對象的總量。

本發明的藥物組合物的所有劑型都可以藉由藥學領域的常規方法製備。例如，將活性成分與一種或多種輔料混合，接著製成所需的劑型。

「藥學上可接受的載體」係指適合於期望藥物製劑的常規的藥用載體，例如：諸如水、各種有機溶劑等的稀釋劑、賦形劑；諸如澱粉、蔗糖等的填充劑；諸如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的黏合劑；諸如甘油的濕潤劑；諸如瓊脂、碳酸鈣及碳酸氫鈉的崩解劑；諸如季銨化合物的吸收促進劑；諸如十六烷醇的界面活性劑；諸如高嶺土及膨潤土的吸收載體；諸如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂及聚乙二醇等的潤滑劑。另外亦能在藥物組合物中加入其他藥學上可接受的輔料，如分散劑、穩定劑、增稠劑、絡合劑、緩衝劑、滲透促進劑、聚合物、芳香劑、甜味劑及染料。理想為使用適合期望劑型及期望給藥方式的輔料。

術語「疾病」、「病症」或「病狀」係指任意的疾病、不適、病、症狀或者適應症。

【圖1】化合物II晶型A(小試樣品，批號：1072P04-A14S01)的XRD圖譜。

【圖2】化合物II晶型B的XRD圖譜。

【圖3】化合物II晶型C的XRD圖譜。

【圖4】化合物II無定形物的XRD圖譜。

【圖5】化合物III晶型D的XRD圖譜。

【圖6】化合物III晶型E的XRD圖譜。

【圖7】化合物III晶型F的XRD圖譜。

【圖8】化合物III晶型G的XRD圖譜。

【圖9】化合物III無定形物的XRD圖譜。

【圖10】化合物II晶型A(小試樣品，批號：1072P04-A14S01)不同穩定性條件下的XRD對比圖譜。由下往上，線條①至線條④分別代表的含義如下：①化合物II晶型A在0天進行XRD測試所得XRD圖譜；②化合物II晶型A在溫度為25℃，濕度為60%條件下放置10天後進行XRD測試所得XRD圖譜；③化合物II晶型A在溫度為40℃，濕度為75%條件下放置10天後進行XRD測試所得XRD圖譜；④化合物II晶型A在溫度為80℃，乾燥條件下放置24小時後進行XRD測試所得XRD圖譜。

【圖11】化合物II晶型A的DSC圖譜。橫坐標(X-軸)表示溫度，單位：℃；縱坐標(Y-軸)表示熱流，單位：瓦/克。

【圖12】化合物II晶型A(中試樣品，批號：20170903)的XRD圖譜。

以上【圖1】至【圖10】及【圖12】中，橫坐標(X-軸)均表示衍射角2θ，單位為「°」；縱坐標(Y-軸)均表示衍射強度，單位為「計數」。

以下藉由提供的實施例對本發明作出進一步說明，但前述實施例並不對本發明要求保護的範圍構成任何限制。在本發明的具體實施例中，除非特別說明，前述技術或方法為本領域的常規技術或方法等。

縮略語：

Cbz-Cl：氯甲酸芐酯；DCM：二氯甲烷；DMF：N,N-二甲基甲醯胺；DMSO：二甲基亞碸；DSC：差式掃描量熱法；DVS：動態蒸汽吸附；EtOH：乙醇；EtOAc：乙酸乙酯；KOAc：醋酸鉀；KO-t-Bu：叔丁醇鉀；MeOH：甲醇；P(Cy)₃：三環己基膦；Pd(OAc)₂：乙酸鈀； Pd(dppf)Cl₂：[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀；RT：室溫；RH：相對濕度；TGA：熱解重量分析；TEA：三乙醇胺；THF：四氫呋喃；Xantphos：4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽；XRD：X-射線粉末衍射圖。

實施例1 化合物II晶型A的合成

1-A1-01的合成(步驟一)

在50L反應釜中加入20L二氯甲烷(DCM)、1-A1-S1(300g)、三乙胺(390g)，攪拌狀態下，降溫至-5℃以下，滴加氯甲酸芐酯/Cbz-Cl(570g)，5小時滴加完畢，自然升至室溫，TLC(乙酸乙酯：正己烷=1：3)監控至反應結束。加入水(1.5L)，緩慢滴加濃鹽酸(80mL)，控制pH為1-2，靜置分液，有機相用15L水洗，無水硫酸鈉乾燥0.5小時後，過濾除去乾燥劑，收集濾液並濃縮，得到730g淡黃色油狀液體，即為1-A1-01粗品，收率95.4%。

1-A1-02的合成(步驟二)

在20L反應瓶中加入720mL的DCM，N,N-二甲基亞碸(90g)，氮氣保護，攪拌狀態下，降溫-65℃以下，滴加草醯氯(106g)，2小時滴加完畢，保溫攪拌20分鐘；滴加1-A1-01的二氯甲烷溶液(143g/500mL DCM)，40分鐘滴加完畢，保溫反應15分鐘。控制在該溫度下，滴加TEA，2小時滴加完畢後，自然升溫至-20℃，體系加入250L水，用鹽酸調節體系pH至1-2，靜置、分液，有機相用水(1L×2)洗滌、無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，收集濾液並濃縮，得到432g黃色油狀液體，即為產品1-A1-02的粗品，直接用於下一步反應。

1-A1-03的合成(步驟三)

攪拌狀態下，依次將400mL四氫呋喃(THF)、叔丁醇鉀(215g)加入1L反應釜中，降溫至5-15℃，滴加磷醯基乙酸三乙酯(430g)，50分鐘滴加完畢。控制溫度在15℃下，滴加1-A1-02的四氫呋喃溶液(431g/100mLTHF)，1小時滴加完畢，TLC(乙酸乙酯：正己烷=1：3)監測至反應完全，體系加入飽和氯化鈉水溶液(1.5L)，靜置、分液，收集四氫呋喃相；水相再用二氯甲烷(2L)萃取，合併有機相後用無水硫酸鈉乾燥0.5小時，過濾除去乾燥劑，收集濾液並濃縮，濃縮物經柱層析純化後得390g淡黃色油狀液體，即為1-A1-03產品。

1-A1-041的合成(步驟四)

在5L反應釜中，將氫氧化鈉的水溶液(301g/1.5L水)加至1-A1-03的四氫呋喃(601g/2.3L THF)溶液中，加熱迴流，反應3-4小時，停止反應。溫度降至40-50℃，靜置分層，收集有機相(THF)後濃縮至出現大量固體；固體加入水(20L)溶解，水相依次用甲基叔丁基醚(2L)、乙酸乙酯(2L)、甲基叔丁基醚(2L)洗滌；水相用濃鹽酸調pH至1-2，用乙酸乙酯(1.5L、3L)萃取兩次，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥0.5小時；過濾除去乾燥劑，收集濾液並濃縮至出現大量固體，固體加入異丙醚(3L)打漿2小時，過濾，收集固體，固體用異丙醚(1L)淋洗。固體在50℃下鼓風乾燥3-4小時，得331g淺黃色固體，即為1-A1-041產品，收率52.7%。

1-051的合成(步驟五)

攪拌狀態下，依次將1-A1-041(600g)、甲醇(25L)、濃硫酸加入50L反應釜中，加熱迴流反應3-4小時，反應完畢，降至室溫；體系濃縮至無溶劑旋出，濃縮物加二氯甲烷(15L)，用碳酸鉀水溶液調節pH=9-10，攪拌、靜置、分液，收集有機相，並用無水硫酸鈉乾燥0.5小時，過濾除去乾燥劑，收集濾液並濃縮，得6.37kg類白色固體，即為1-A1-051產品，收率97.3%。

1-A1的合成(步驟六)

在2L加氫釜中，分別加入1-A1-051(500g)、甲醇(1.8L)、鈀碳，體系依次置換3次氮氣及3次氫氣；體系保持氫氣環境，升溫至85℃、壓力3.0Mpa下反應3小時，反應完畢。降至室溫，過濾除去鈀碳，收集有機相，並濃縮至有大量淺黃色固體出現，加入異丙醚(3L)冷凍(-20℃)析晶1小時，過濾收集固體產物，固體用異丙醚(500mL)淋洗，得到234g淺黃色固體，即為1-A1產品，收率90.5%。

1-A2的合成(步驟七)

攪拌狀態下，依次將1-A1(200g)、4-溴-2,6-二氟苯胺(410g)、甲苯(1.2L)加入50L反應釜中，體系滴加三氯氧磷(413g)，1小時滴加完畢。冰浴下，滴加三乙胺，1小時滴加完畢。升溫至110℃，反應1小時。將體系降溫至2-10℃，加入1L水，並用飽和碳酸鉀水溶液調pH=9-10，用乙酸乙酯(1.5L、1L)萃取兩次，合併有機相後用2L飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥0.5小時，過濾除去乾燥劑，收集濾液並濃縮至出現固體產物，固體加入異丙醚(1L)打漿10分鐘，過濾，收集黃色固體460g，為1-A2產品。

1-A3的合成(步驟八)

攪拌狀態下，依次將1-A2(450g)、N,N-二甲基甲醯胺(2L)、碳酸銫(700g)加入反應釜中，加熱至110℃保溫反應24小時，TLC檢測至反應完全，體系加入乙酸乙酯(3L)，過濾除去固體雜質，濾液用飽和氯化鈉水溶液(1L×5)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥0.5小時，濃縮至出現大量固體，用甲基叔丁基醚(1L×2)打漿30分鐘，過濾得到淡黃色固體產物382g，即為1-A3，收率90.10%。

1-01的合成(步驟九)

攪拌狀態下，依次將1-A3(380g)、聯硼酸頻那醇酯(400g)、醋酸鉀(340g)、醋酸鈀(6g)、三環己基磷(7g)、1,4-二氧六環加入到反應釜中，氮氣保護，升溫至90℃反應2小時。TLC監控至反應完全。降至室溫，過濾，濾液濃縮至除去大量1,4-二氧六環，濃縮物經正己烷及二氯甲烷柱層析純化、正己烷(1.2L)打漿1小時，得334g的灰色固體，即為1-01，收率70.10%。

1-02的合成(步驟十)

攪拌狀態下，取1-01(128g)、1,4-二氧六環(1L)、1-S3(85g)、碳酸鉀(110g)、純化水依次加入到2L三口瓶中，氮氣保護，加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡合物(Pd(dppf)Cl₂.DCM)。加熱升溫至60℃。反應4小時後，反應完全。將反應液冷卻至室溫，減壓濃縮至除去大部分1,4-二氧六環，加入二氯甲烷(1.5L)及純化水(1.1L)，攪拌，靜置分層，分液，水相用二氯甲烷(10L)萃取，合併有機相，用0.5%的稀鹽酸洗滌(1L×2)，飽和氯化鈉水溶液(1L)洗滌，分液。有機相用無水硫酸鈉(500g)乾燥，過濾除去乾燥劑，濾液減壓濃縮。濃縮物加入乙酸乙酯(0.5L)攪拌30分鐘析出固體，過濾後，所得固體用乙酸乙酯(0.5L)淋洗，45℃真空乾燥3小時，得黃色固體120g。

1-03的合成(步驟十一)

攪拌狀態下，取1-02(100g)、1,4-二氧六環(1L)、1-C2(80g)、碳酸銫(163g)依次加入2L三口瓶中，氮氣保護，加入醋酸鈀(2g)及4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽(Xantphos)(4g)，加熱至85℃，直到反應完全。將反應液冷卻至室溫，過濾得固體產物，固體用乙酸乙酯淋洗後，加入至二氯甲烷(1.5L)及純化水(1.1L)的混合體系中，攪拌，靜置，分層。水相用二氯甲烷(700mL)萃取。合併有機相，用純化水(700mL×2)洗滌。有機相加入無水硫酸鈉(700g)乾燥，過濾除去乾燥劑，濾液濃縮，加入甲醇(0.5L)，加熱至55~65℃攪拌0.5小時，降至室溫，過濾。過濾得固體產物，用乙酸乙酯500mL淋洗。固體在45℃真空下乾燥8小時，得淡黃色固體1-03共111.79g。

化合物II的合成(步驟十二)

攪拌狀態下，取1-03(500g)、無水甲醇(3.8L)，依次加入到10L反應釜中，加熱至65℃，待反應體系澄清0.5小時後滴加L-酒石酸的甲醇溶液(150.89g酒石酸溶於500mL無水甲醇)，控制滴加時間在45至60分鐘，滴加完畢，65℃保溫反應4小時，繼續滴加L-酒石酸的甲醇溶液(35.58g酒石酸溶於250mL無水甲醇)，控制滴加時間在30至45分鐘，滴加完畢，65℃保溫反應1小時，繼續滴加L-酒石酸的甲醇溶液(36.55g酒石酸溶於250mL無水甲醇)，控制滴加時間在30至45分鐘，滴加完畢，65℃保溫反應1.5小時，停止加熱，自然降溫至20-30℃，過濾，濾餅用甲醇(400mL×2)淋洗，45℃真空乾燥36小時，得淡黃色結晶性粉末530.64g，即為化合物II，藉由X射線粉末衍射進行鑑定，顯示該晶型為化合物II的晶型A。

實施例2 XRD分析結果

按實施例1的合成方法分別製備得到化合物II的小試樣品(批號：1072P04-A14S01)及化合物II的中試樣品(批號：20170903)，接著採用XRD對其分別進行表徵。

本發明的一個具體手段中，小試樣品(批號：1072P04-A14S01)由杭州領業醫藥科技有限公司使用Bruker D8 Advance Diffractometer進行XRD分析，使用的儀器及檢測參數見表1，XRD譜圖解析數據見表2。

表1 小試樣品XRD分析儀器及檢測方法參數

在另一具體實施方案中，中試樣品(批號：20170903)由北京市理化分析測試中心使用D8-Advance型X射線衍射儀進行XRD分析，參考的方法為JY/T 009-1996《轉靶多晶體X射線衍射方法通則》。使用的儀器及檢測參數見表3，XRD譜圖解析數據見表4。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，XRD譜圖的獲取過程中，為減少誤差可以將相關數據經過適當科學處理，如基線校正處理等。所屬技術領域中具有通常知識者也可以理解，在不同實驗室條件下操作，所得XRD譜圖的2θ角或分離度等會存在少許差異。應當理解，本發明提供的化合物II晶型A的XRD譜圖不限於圖1或圖12所示的X射線粉末衍射圖譜，與圖1或圖12所示基本相同的X射線粉末衍射圖的晶體都落在本發明的範圍內。

實施例3 晶型穩定性的測定

本發明的X-射線粉末衍射圖譜檢測設備及方法如表1所示。將化合物II晶型A、化合物III晶型D及化合物III晶型F樣品在80℃乾燥放置24小時、25℃，60%RH放置10天、40℃，75%RH放置10天，檢測XRD譜圖見圖10，結果見表5。

化合物II晶型A在不同穩定性條件下的XRD對比如圖10所示，由圖可見，化合物II晶型A樣品在80℃乾燥放置24小時、25℃，60%RH放置10天、40℃，75%RH放置10天，晶型均不變，化合物II晶型A穩定性良好。

此外，化合物II晶型B為亞穩晶型，晶態較差且升溫至180℃會轉晶為晶型A。

實施例4 晶型長期穩定性測定

將化合物I及化合物II晶型A樣品分別在溫度25℃±2℃，相對濕度60%±10%條件下放置18個月，並分別於0個月、3個月及18個月時取樣進行HPLC測定，檢測結果見表6。

由表6數據可知，在18個月後化合物I的最大單雜含量及總雜含量均為化合物II晶型A的3倍以上，化合物II晶型A在放置18個月後未產生含量大於0.1%的雜質，而化合物I產生4個含量大於0.1%的雜質。相較於化合物I，化合物II晶型A的穩定性具有顯著提升。

實施例5 動態水分吸附(DVS)測定

本發明的動態水分吸附儀檢測設備及方法如表7所示，動態水分吸附測定結果如表8所示。

化合物II晶型A及晶型B：0%RH至80%RH範圍內重量變化約為5.3%及5.5%，而化合物III晶型D及晶型F：0%RH至80%RH範圍內重量變化約為17.2%及16.6%。由此可見，相較於化合物III晶型，化合物II晶型的吸濕性較弱，更加適合於固體製劑的製備。

實施例6 溶解度測定

對化合物II晶型A、化合物III晶型D及化合物I進行溶解度測試，室溫時在水中溶解度結果如表9。由此可見，化合物II不同晶型對其溶解性改善程度不同，化合物II晶型A表現出優異的溶解性能。

實施例7 藥代動力學測試

SD大鼠12隻，分為兩組，每組6隻，雌雄各半，分別單次灌胃30mg/kg給藥化合物II晶型A及化合物I；分別在指定的時間點通過眼底靜脈叢採血，分離血漿，放入-80℃冰箱保存。

上述血漿樣品，以乙腈沉澱蛋白，取上清用水稀釋3倍，取5uL至LC-MS/MS檢測，試驗數據如表10所示：表10 藥代動力學測試結果

由以上結果顯示，相較於化合物I，化合物II的晶型A在體內吸收更好。

實施例8 化合物I的CDK4/6抑制活性測定

為了證明化合物對CDK激酶(CDK4/CycD3，CDK6/cycD3)表現出親和力，進行CDK激酶的測定。

反應緩衝液製備如下：CDK6的激酶鹼緩衝液(50mM HEPES，pH7.5；0.0015%Brij-35；10mM MgCl₂；2mM DTT)；CDK4的激酶鹼基緩衝液(20mM HEPES，pH7.5；0.01% Triton X-100；10mM MgCl₂；2mM DTT)；停止緩衝液(100mM HEPES，pH7.5；0.015%Brij-35：0.2%塗層試劑#3；50mM EDTA)。

酶反應方案：

(1)採用100%DMSO將化合物稀釋到反應最終所需的最高濃度的50倍。將100μL該化合物的稀釋液轉移至96孔板的孔中。接著，在下一個孔中，按30μL的上述稀釋液用60μL的100%DMSO稀釋的比例依次稀釋化合物共10個濃度。在相同的96孔板上，將100μL 100%DMSO溶液加入到兩個空孔中，作為無化合物對照及無酶對照。此張板記為源板。

(2)分別將10μL各濃度化合物從源板中轉移到包含90μL激酶緩衝液之新的96孔板中以製備中間板。

(3)從96孔板之中間板中對應孔轉移5μL化合物溶液到對應的384孔板中。

(4)將10μL 2.5×酶溶液加入到384孔實驗板的每個孔中。

(5)室溫孵育10分鐘。

(6)加入10μl 2.5×底物溶液，該底物溶液藉由在激酶基緩衝液中加入螢光素標記肽及ATP製備。酶及底物的反應濃度如下表所示(表11)：

(7)在28℃孵育特定的時間。

(8)加入25μL終止緩衝液終止反應。

(9)收集Caliper上的數據。接著將轉換值轉換為抑制值。

抑制率=(最大值-轉換值)/(最大值-最小值)*100

「最大值」為DMSO對照值；「最小值」為無激酶對照孔值。

(10)使用XLFit優化版本4.3.1中的百分比抑制曲線擬合以獲得IC₅₀值。方程式為：Y=底+(高-底)/(1+(IC₅₀/X)^斜率)。

其結果以IC₅₀值表示，如表12所示。

實施例9 在分子水準對CDK激酶其他亞型的抑制活性以及選擇性試驗

以化合物I為受試化合物，並與陽性對照藥LY2835219(Abemaciclib)比較兩者在分子水準對CDK激酶的抑制活性以及選擇特異性的高低。

本方法之作用機制如式(IV)所示，激酶催化蛋白質底物磷酸化，使反應體系中放射性同位素³³P標記之ATP(γ-³³P-ATP)上的³³P標記到蛋白質底物上，將反應體系點在P81離子交換濾膜上，用0.75%磷酸緩衝液充分洗滌濾膜，則有放射活性的磷酸化底物留在濾膜上，藉由記錄底物蛋白質放射性標記的強度反映激酶的活性。

以Prism4 Software(GraphPad)處理數據，曲線擬合公式為：Y=最小抑制率+(最大抑制率-最小抑制率)/(1+10^((LogIC₅₀-X)*斜率))；其中，Y表示抑制百分數(%)；X表示待測化合物濃度之對數。

結果：藉由對多種CDK激酶的篩選，發現化合物I抑制CDK1/2/7/9的IC₅₀大於0.4μM，係CDK4/6的幾十甚至上千倍(見表13)。

結論：在分子水準上，本發明化合物I對CDK4/6表現出極強之抑制作用，對CDK1/2/7/9抑制作用極弱，顯示化合物I是一個具有極佳選擇性之CDK4/6激酶抑制劑。此外，化合物I在CDK1/2/9及CDK4/6之間的選擇性均明顯高於LY2835219(Abcmaciclib)。

實施例10 JeKo-1異種移植瘤動物模型之腫瘤抑制實驗

JeKo-1細胞培養在含20%胎牛血清之RPMI 1640培養液中。收集指數生長期之JeKo-1細胞，PBS重懸至適合濃度用於NOD/SCID小鼠皮下腫瘤接種。70隻雌性小鼠右側皮下接種5×10⁶個JeKo-1細胞，細胞重懸在PBS及matrigel(1：1)中。待腫瘤平均體積134mm³時，根據腫瘤大小隨機分組開始給藥。其中48隻分入實驗組內，其餘22隻為分組剩餘小鼠。腫瘤體積計算公式為：長徑×短徑²/2。實驗分為溶劑對照組、測試藥代表性化合物I(10mg/kg)、測試藥代表性化合物I(25mg/kg)、測試藥代表性化合物I(50mg/kg)、測試藥代表性化合物I(100mg/kg)，共6組，每組8隻小鼠，均為口服灌胃給藥，分組後每天給藥一次，連續給藥19天。根據相對腫瘤增長抑制率TGI進行療效評價，其結果見表14。

計算公式如下：TGI(%)=(C-T)/C×100%(C及T分別為溶劑對照組平均腫瘤重量及治療組平均腫瘤重量)。TGI(%)值越大，說明藥效越好；反之亦然。

結果：化合物I顯示出良好的抗腫瘤活性。

Claims

一種化合物鹽型之晶型，其特徵係，如結構式II所示：
其中，前述結構式II所示化合物之晶型之X射線粉末衍射譜圖具有衍射角2θ為4.4±0.2°、23.6±0.2°及26.9±0.2°的特徵峰。
如請求項1所記載之化合物鹽型之晶型，其中，前述結構式II所示化合物之晶型之X射線粉末衍射譜圖具有衍射角2θ為4.4±0.2°、8.7±0.2°、10.8±0.2°、18.4±0.2°、23.6±0.2°及26.9±0.2°的特徵峰。
如請求項2所記載之化合物鹽型之晶型，其中，前述結構式II所示化合物之晶型之X射線粉末衍射譜圖具有衍射角2θ為4.4±0.2°、8.7±0.2°、10.8±0.2°、15.9±0.2°、18.4±0.2°、23.6±0.2°及26.9±0.2°的特徵峰。
如請求項3所記載之化合物鹽型之晶型，其中，前述結構式II所示化合物之晶型具有約如圖1所示之X-射線粉末衍射圖。
如請求項3所記載之化合物鹽型之晶型，其中，前述結構式II所示化合物之晶型具有約如圖12所示之X-射線粉末衍射圖。
如請求項1所記載之化合物鹽型之晶型，其中，前述結構式II所示化合物之晶型係藉由如下方法製備得到：(1)將(R)-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氫苯並[4,5]咪唑並[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺(化合物I) 混懸於水及/或水溶性有機溶劑中，得到混懸物；(2)將前述混懸物加熱至50℃以上；(3)在保持50℃以上的溫度條件下，在前述混懸物中加入L-酒石酸，進行酸化處理，得到澄清溶液；(4)降至室溫後，攪拌過濾，濾餅經乾燥後得到前述結構式II所示化合物之晶型。
如請求項1至6中任一項所記載之化合物鹽型之晶型，其中，前述結構式II所示化合物之晶型係藉由如下方法製備得到：在50-70℃條件下將化合物I在甲醇中形成清液，將L-酒石酸溶解在甲醇中，將L-酒石酸的甲醇溶液滴加至化合物I的甲醇溶液中，攪拌後過濾，濾餅置於40-70℃乾燥，即得到前述結構式II所示化合物之晶型。
一種藥物組合物，其特徵係，其含有治療有效量之請求項1至7中任一項所記載之化合物鹽型之晶型；及藥學上可接受之輔料、輔助劑及/或載體。
一種請求項1至7中任一項所記載之化合物鹽型之晶型或請求項8所記載之藥物組合物在製備治療患者的疾病、病症或病狀的藥物中之用途，其特徵係，前述疾病、病症或病狀由CDK4及/或CDK6介導。
如請求項9所記載之用途，其中，前述疾病、病症或病狀係癌症及/或增殖性疾病。
如請求項9或10所記載之用途，其中，前述疾病、病症或病狀係乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、結腸癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、神經膠質瘤、淋巴瘤、神經母細胞瘤及/或頭頸部鱗狀細胞癌。
如請求項11所記載之用途，其中，前述肝癌係肝細胞癌，前述腎癌係乳頭狀腎細胞癌。