CN105441573A - 用于检测人类jak2基因v617f突变的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

用于检测人类jak2基因v617f突变的引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物、探针及试剂盒，其中引物及探针包括突变上游引物JW1-F，与JAK2基因保守序列结合；突变下游ARMS引物JM1-R，与V617F(1849G>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针JW1-P，能与扩增片段结合；以及5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针JW1-B，能与V617F位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。本发明的引物及探针特异性高、灵敏度好，检测能力高达1％。由其制备的试剂盒检测结果准确易读，操作简单快速，适用范围广。

Description

用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物、探针及试剂盒。
背景技术
骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasms，MPN)的单病种发病率大多在1/10万以下，属于罕见疾病。近10年来，随着人们生活水平的提高及医疗条件的改善，已发现的MPN患者总数增加了三倍左右。JAK2基因在PV、ET、IMF中具有较高的突变几率(依次为～90％、～50％、～50％)。
JAK2是一类酪氨酸蛋白激酶，与造血生长因子受体结合后，通过信号转导子和转录激活子(STAT)来影响基因的转录调节(JAK-STAT途径)。JAK2基因V617F是在第14外显子617位点发生的点突变(G1849T)，缬氨酸(valine，V)被苯丙氨酸(phenylalanine，F)取代。Val617位于JH2(假激酶区)，JH2与JH1(激酶区)结合并抑制其活性；V617F突变使JH2失去了对JH1激酶活性的抑制作用，导致了JAK2的持续活化，在无需配体和造血生长因子受体结合的情况下，导致造血细胞的异常增生。
骨髓增殖性疾病(MPD)的遗传学基础长期不明，直到2005年研究人员在本类疾病中发现存在JAK2点突变(V617F)，才使MPD的诊治进入了一个新纪元。除在体检中发现外周血异常而跟踪复查并确诊的患者外，本病的漏诊、误诊率很高。因此，JAK2基因是否存在突变对患者的诊断具有重要的意义。2008年，随着对MPD的肿瘤本质得到确认，WHO将MPD改名为MPN，并在修订的2008WHO分类***中，将是否存在JAK2基因V617F突变列入MPN(包括PV、ET、IMF)的诊断标准。
目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20～30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1～2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。
近年来，随着核酸扩增技术的不断优化，国外开始报道采用外周血标本检测游离DNA中基因突变的方法。外周血取样不仅取材简便，且检测准确度与组织标本的结果符合率较高。这不仅极大的促进了靶向药物基因突变检测方法的研究进展，也使以游离DNA为靶分子对临床药物疗效及预后进行实时检测成为研究的热点。但外周血中癌细胞突变DNA存在于大量野生型基因背景中，其比例较低。因此，需要高性能的检测技术来实现低突变含量的检出。
发明内容
为了解决现有检测技术出现的灵敏度低、检测时间长、检测效率低、样本易污染、假阳性率高等问题，本发明提供了用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，灵敏度高，特异性强，有效避免假阳性。本发明还提供了包括上述引物和探针的试剂盒，检测方便快速，操作简单，结果易读，适用范围广。
本发明提供的用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：
突变上游引物JW1-F：SEQIDNO:1，
突变下游ARMS引物JM1-R：SEQIDNO:2，
检测探针JW1-P：SEQIDNO:3，
阻断探针JW1-B：SEQIDNO:4；
其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。
表1：JAK2基因V617F热点突变
突变名称 氨基酸变化 碱基变化 CosmicID
JM1 V617F 1849G>T 12600
上述引物和探针是针对表1中位点突变设计的特异性检测引物，其中，JW1-F为突变上游引物，与JAK2基因保守序列结合；JM1-R为突变下游ARMS引物，与V617F(1849G>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；JW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；JW1-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与V617F位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
优选地，上述用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。MGB(MinorGrooveBinder)基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
本发明提供的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，包括以上任一所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针。
优选地，所述用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：
外控上游引物JW1-F：SEQIDNO:1，
外控下游引物JW1-R：SEQIDNO:5，
外控检测探针JW1-P：SEQIDNO:3，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。
其中，JW1-F和JW1-R为外控上下游引物，扩增JAK2基因上一段包含V617F位点的序列；JW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，所述用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQIDNO:6，
内控下游引物IC-R：SEQIDNO:7，
内控检测探针IC-P：SEQIDNO:8，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，所述用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有发生1849G>T碱基变化的CKIT基因片段>gi|568815589:5073601-5074000的阳性质粒，含有JAK2基因保守序列>gi|568815589:5054501-5054900段碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
优选地，所述用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分为两种：
检测反应体系：包括用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
质控反应体系：包括外控引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
所述ABpremix为美国应用生物***公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
本发明还提供上述用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒的使用方法，是首先提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：
首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤20；9<Ct质控≤18；然后按照△Ct＝Ct检测-Ct质控判定，△Ct≤8为阳性，△Ct>8为阴性；
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
优选地，上述用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒的使用方法中，荧光定量PCR反应的条件为：
95℃10min；
92℃15sec，58℃1min，共15个循环；
92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术，可以特异性的检测人类JAK2基因V617F突变。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。
(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。在本发明试剂盒的内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。检测快速，且操作简单，结果易读。
(3)本方法灵敏度高，可实现50拷贝突变基因的稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。
附图说明
图1为实施例1中IC实验结果；
图2为实施例1中非模板对照(NTC)实验结果；
图3为实施例1中阳性对照(STD)实验结果；
图4为实施例1中灵敏度实验结果；
图5为实施例1中精密度实验结果；
图6为实施例2阴性样本实验结果；
图7为实施例2中阳性样本实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、突变检测引物及探针，质控引物及探针序列设计：
根据NCBI数据库公布的JAK2基因(NCBIReferenceSequence:NM_004972.3)野生型序列，以14号外显子V617F突变位点(见表1)为参考，设计特异性突变引物和探针(见表2)。以基因工程构建的突变质粒(***基因片段>gi|568815589:5073601-5074000，且发生V617F碱基变化)和野生型质粒(***基因片段>gi|568815589:5073601-5074000)为模板，建立实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系，实现对JAK2基因V617F突变的高灵敏度和高特异性检测。
表2：用于人类JAK2基因V617F突变检测的特异性引物和探针组合
SEQ ID NO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
1 JW1-F TCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGAG 无
2 JM1-R GTTTTACTGACTCTCGTCTCCACATAA 无
3 JW1-P CCAAATGCTTGTGAGAAA 5’端FAM，3’端MGB
4 JW1-B TCTCCACAGACACATACT 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
根据NCBI数据库公布的JAK2基因(NCBIReferenceSequence:NM_004972.3)野生型序列，以14号外显子V617F突变位点(见表1)为参考，设计外控引物和探针(见表3)。以基因工程构建的外控质粒(***基因片段>gi|568815589:5054501-5054900)为模板，建立实时荧光PCR外控(ExternalControl)检测体系，对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行质控。
表3：用于JAK2基因突变检测样本质控的外控引物和探针组合
SEQ ID NO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
1 JW1-F TCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGAG 无
5 JW1-R TAGTTTTACTCACTCTCGTCTCCACAG 无4 -->
3 JW1-P CCAAATGCTTGTGAGAAA 5’端FAM，3’端MGB
根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBIReferenceSequence:NC_001666.2)保守序列(non-humanDNA)，设计内控引物和探针(见表4)。以基因工程构建的内控质粒(***基因片段>gi|11994090:c2400-2001)为模板，建立了实时荧光PCR内控(InternalControl)检测体系，对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。
表4：用于PCR扩增反应内部质控的内控引物和探针组合
SEQ ID NO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
6 IC-F TCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG 无
7 IC-R CAACGGGTTTACTAATAGGATGCC 无
8 IC-P TCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC 5’端JOE，3’端BHQ1
2、检测人类JAK2基因V617F突变的检测试剂盒组成
表5：试剂盒组成成分
名称 成份
JAK2-8联PCR反应条 反应体系1～2(每个反应体系独立一管)
JAK2-阳性对照 含JM1和JR质粒各8.3×102拷贝/μL；含IC质粒5×102拷贝/μL
IC-内控模板 含IC质粒3×103拷贝/μL
各反应体系组成如下：
表6：实时荧光PCR扩增反应体系组成
注：ABpremix全称FastAdvancedMasterMix，购自美国应用生物***公司；10×buffer(Mg2+Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。
PCR反应总体积25μL，含19μL的反应体系，1μL的IC模板和5μL的检测模板(阳性对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA)，IC模板和检测模板可预混。
其中，反应体系1用于人类JAK2基因V617F突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表4)。
其中，反应体系2用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表4)。
3、实时荧光PCR扩增反应体系设置：用2孔实时荧光PCR扩增反应进行JAK2基因V617F突变的检测。其中，反应体系1(见表6)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系，反应体系2(见表6)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
实时荧光PCR扩增反应基本原理：上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE)，3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前，检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近，由于荧光共振能量转移的作用，荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行，检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解，5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离，进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB(MinorGrooveBinder)基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
该试剂盒的优势：(1)在本发明实时荧光PCR突变检测体系中，对目的基因突变区域进行PCR扩增。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。(3)在本发明实时荧光PCR内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。
4、实时荧光PCR扩增反应：
将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为模板，加入到实时荧光PCR扩增反应体系中(见表6)进行扩增。
实时荧光PCR扩增反应条件设置：
表7：实时荧光PCR扩增反应条件
最优的，在Stage2阶段(15个循环)，58℃的退火延伸温度，有利于突变模板的富集。在Stage3阶段(30个循环)，60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。
5、检测结果分析
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值≤20，体系性能良好，结果有效)；以外控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准(9<Ct质控≤18，Ct质控≤9，说明加入的基因组DNA浓度过高，应稀释后重新检测该样本；Ct质控>18或无扩增曲线，说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解，建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测)；以待测样本突变检测孔与外控检测孔FAM信号的△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(△Ct≤8为阳性，△Ct>8为阴性)。
6、用本发明的人类JAK2基因V617F突变检测试剂盒进行性能分析实验。
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。图1为IC检测结果，Ct质控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～2FAM均不起线，符合要求；图3为STD检测结果，反应体系1～2FAM信号均起线且Ct≤20，符合要求。
(1)灵敏度实验
将以现有基因工程技术合成的含有JAK2基因V617F突变序列的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。取1×103拷贝/μL突变质粒DNA分别进行10倍稀释，稀释2个梯度，然后以3种浓度梯度(1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL和1×101拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10拷贝/μL突变基因即可检出。
(2)精密度实验
将以现有基因工程技术合成的含有JAK2基因V617F突变序列的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。以5×101拷贝/μL突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。
实施例2
用本发明中人类JAK2基因V617F突变检测试剂盒来检测临床采集的血液样本。
本实施例中收集临床病理诊断为骨髓增殖性肿瘤(MPN)的患者血液样本，并从中提取基因组DNA。用人类JAK2基因V617F突变检测试剂盒检测待测样本中是否存在JAK2基因V617F突变。具体步骤如下：
(1)样本基因组DNA提取
血液样本的提取使用宁波有成血液基因组DNA提取试剂盒(KR008F)。按说明书提取待测样本基因组DNA，将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。将符合要求的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为PCR模板，进行实时荧光PCR扩增反应。
(2)实时荧光PCR扩增反应
实时荧光PCR扩增反应条件见表7，按照人类JAK2基因V617F突变检测试剂盒说明书进行样本检测。
(3)结果判定
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值Ct≤20，体系性能良好，结果有效)；以待测样本突变检测孔和外控检测孔FAM信号△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(△Ct≤8为阳性，△Ct>8为阴性)。
图6中，Ct质控＝13.1，符合要求；突变检测孔FAM信号均未起线，显示样本检测结果为阴性。
图7中，Ct质控＝13.2，符合要求；JM1突变检测孔FAM信号起线，且Ct检测(JM1)＝17.0，△Ct＝3.8，显示样本检测结果为JM1(V617F)阳性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCELISTING
<110>武汉海吉力生物科技有限公司
<120>用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物、探针及试剂盒
<130>
<160>8
<170>PatentInversion3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<210>2
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<213>人工序列
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<212>DNA
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<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
tcgataccacagtccttgcaactcccc27

Claims (9)

1.用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，其特征在于，核苷酸序列如下：
突变上游引物JW1-F：SEQIDNO:1，
突变下游ARMS引物JM1-R：SEQIDNO:2，
检测探针JW1-P：SEQIDNO:3，
阻断探针JW1-B：SEQIDNO:4；
其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。
3.用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：
外控上游引物JW1-F：SEQIDNO:1，
外控下游引物JW1-R：SEQIDNO:5，
外控检测探针JW1-P：SEQIDNO:3，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。
5.根据权利要求4所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQIDNO:6，
内控下游引物IC-R：SEQIDNO:7，
内控检测探针IC-P：SEQIDNO:8，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
6.根据权利要求5所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有发生1849G>T碱基变化的CKIT基因片段>gi|568815589:5073601-5074000的阳性质粒，含有JAK2基因保守序列>gi|568815589:5054501-5054900段碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
7.根据权利要求5所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的反应体系分为两种：
检测反应体系：包括用于检测人类JAK2基因V617F突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
质控反应体系：包括外控引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
所述ABpremix为美国应用生物***公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
8.权利要求7所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：
首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤20；9<Ct质控≤18；然后按照△Ct＝Ct检测-Ct质控判定，△Ct≤8为阳性，△Ct>8为阴性；
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
9.根据权利要求8所述的用于检测人类JAK2基因V617F突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，荧光定量PCR反应的条件为：
95℃10min；
92℃15sec，58℃1min，共15个循环；
92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。
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