CN108913775A - 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法 - Google Patents
检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108913775A CN108913775A CN201810899679.0A CN201810899679A CN108913775A CN 108913775 A CN108913775 A CN 108913775A CN 201810899679 A CN201810899679 A CN 201810899679A CN 108913775 A CN108913775 A CN 108913775A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- wild type
- del19
- mutation
- mutated genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体而言,提供了一种检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法。本发明提供的一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物,用于检测L858R的包括第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对;用于检测Del19的包括第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对。该引物组合物可以检测样本中的L858R是否发生点突变和Del19是否外显子缺失,稳定性好,准确性高,即便是血液样本也可以达到0.01%的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种检测L858R和Del19 突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法。
背景技术
全球范围内由癌症引起的死亡案例中,肺癌占其主导原因,其中85%的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。表皮生长因子受体(EGFR)的突变,包括氨基酸L858R的替换,是评价第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在NSCLC治疗中的重要指标。因此,在决定治疗策略前,进行EGFR基因突变的检测是非常有必要的。通常,肿瘤组织作为检测的首选推荐,但是肿瘤组织并非在所有的情况下都能获取,所以对血液样本进行检测相对于肿瘤组织检测具有巨大的检测优势。通过使用血液样本中的cfDNA检测EGFR突变的情况可以实现侵入性极小的检测。血浆中 EGFR的突变丰度来源于肿瘤组织,主要为肿瘤坏死凋亡后释放到外周血中的cfDNA。由于血浆中EGFR的突变丰度与肿瘤组织中的突变丰度有关,所以,血浆中cfDNA的EGFR突变情况能够用来预测NSCLC患者使用 EGFR-TKIs的治疗情况。
市面上已有多项EGFR突变检测方法,用来预测EGFR靶向抑制剂疗法的响应率。1)荧光原位杂交(FISH)对于晚期NSCLC病人接受EGFR 抑制剂的生存获益有着良好的预测,但荧光原位杂交花费较多的时间和精力,成本昂贵。2)标准化的DNA测序只能够检测突变丰度为10%-25%的肿瘤,同时检测的质量取决于肿瘤和基因组的材料,误差较大。3)扩增阻碍突变***聚合酶链反应(ARMS-PCR)通常只能检测到1%的突变。4) 荧光定量PCR被广泛运用到EGFR基因突变评估的临床检测中,但是同样灵敏度低、准确性差。
2013年,FDA批准了罗氏EGFR基因突变组织样本检测的试剂盒。尽管基于组织的检测方法有着广泛的应用,组织样本并不是每次都能获取。组织取材均为有创操作,有时难以实施,且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响,有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。因此,众多研究都希望能找到一种可替代的方法来检测EGFR 突变。
血浆游离DNA(cfDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。因为肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血,肿瘤患者血浆中的cfDNA含量将显著高于健康人群血浆中的含量。因此,通过分离血浆中肿瘤DNA实现此项诊断检测是可行的。
EGFR突变主要发生在18-21号外显子,其中,19外显子缺失突变(exon19deletions,简称Del19)和21外显子的点突变(简称L858R)统称为EGFR 常见突变或经典突变,占EGFR总突变的90%。对EGFR Del19和L858R 进行检测对肺癌治疗和癌症的发现具有重要的参考价值,但是目前本领域还是缺乏低成本、高灵敏度和高准确性的Del19和L858R检测技术。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物,本发明的第二目的在于提供一种用于检测EGFR基因L858R 和Del19突变的试剂,本发明的第三目的在于提供一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂盒,本发明第四目的在于提供上述试剂盒的应用,本发明的第五目的在于提供一种检测EGFR基因L858R和Del19突变的方法,本发明的第六目的在于提供表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法,以缓解现有技术中检测Del19和L858R的方法需要组织样本,不能做到微创,成本过高同时灵敏度和准确性差的技术问题。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物,所述引物组合物包括:用于检测L858R的第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对;
和,用于检测Del19的第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对;
其中,所述第一野生型基因探针如SEQ ID NO.1所示;
所述第一突变型基因探针如SEQ ID NO.2所示;
所述第一引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;
所述第二野生型基因探针如SEQ ID NO.5所示;
所述第二突变型基因探针如SEQ ID NO.6所示;
所述第二引物对如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
进一步地,所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针均独立地于5’端结合荧光基团,于3’端结合淬灭基团;
所述第一野生型基因探针和所述第一突变型基因探针的荧光基团不同;
所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的荧光基团不同。
进一步地,所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的3’端均独立地3结合 MGB修饰基团后再结合淬灭基团;
优选地,所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE或HEX;
优选地,所述淬灭基团包括NFQ、TAMRA、BHQ或IABkFQ,优选为 NFQ。
进一步地,所述第一野生型基因探针和所述第二野生型基因探针的5’端均独立地结合VIC荧光基团,所述第一突变型基因探针和所述第二突变型基因探针的5’端均独立地结合FAM荧光基团。
一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂,所述试剂包括上述引物组合物。
一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂盒,包括上述引物组合物或上述试剂;
进一步地,还包括ddPCR Master Mix。
上述试剂盒在检测EGFR基因L858R和Del19突变中的应用;
或,在检测表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变中应用。
应用上述引物组合物或上述试剂或上述试剂盒检测EGFR基因L858R 和Del19突变率的方法,将从全血样本中提取的DNA样本与上述引物组合物或上述试剂进行ddPCR反应,EGFR基因L858R和Del19突变率均独立地根据突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)×100%得到。
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法,采用上述方法,根据EGFR基因L858R和Del19突变判断表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供的一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物,用于检测L858R的包括第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对;用于检测Del19的包括第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对。该引物组合物可以检测样本中的L858R是否发生点突变和Del19是否外显子缺失,稳定性好,准确性高,即便是血液样本也可以达到0.01%的灵敏度。由于该引物组合物中的探针和引物特异性好,避免了患者组织样本提取的难度和成本,做到微创对血液进行检测就可以评价 EGFR基因的突变情况,极大地降低了检测成本。
本发明提供的用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂和试剂盒,由于含有上述的引物组合物,准确性和灵敏度高,成本低。
本发明提供的检测EGFR基因L858R和Del19突变的方法,由于应用了上述引物组合物,除了具有准确性和灵敏度高的效果外,成本低,操作简便,可以做到批量检测。
本发明提供的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法为微创检测EGFR基因L858R和Del19突变提供了技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例4中ARMS-PCR法对不同浓度的L858R突变的检测分析图;
图2为本发明实施例4中ddPCR法对不同浓度的L858R突变的检测分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。
一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物,引物组合物包括:用于检测L858R的第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对;
和,用于检测Del19的第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对;
其中,第一野生型基因探针如SEQ ID NO.1所示;
L858R-WT:5'-GTTTGGCCAGCCCAA-3'(SEQ ID NO.1);
第一突变型基因探针如SEQ ID NO.2所示;
L858R-MU:5'-GTTTGGCCCGCCCAA-3'(SEQ ID NO.2);
第一引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;
L858R-F:5'-CAGCATGTCAAGATCACAGAT-3'(SEQ ID NO.3);
L858R-R:5'-CTCCTTCTGCATGGTATTCTT-3'(SEQ ID NO.4);
第二野生型基因探针如SEQ ID NO.5所示;
Del19-WT:5'-TCGAGGATTTCCTTGTTG-3'(SEQ ID NO.5);
第二突变型基因探针如SEQ ID NO.6所示;
Del19-MU:5'-GAATTAAGAGAAGCAACATC-3'(SEQ ID NO.6);
第二引物对如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示;
Del19-F:5'-GAGAAAGTTAAAATTCCCGT-3'(SEQ ID NO.7);
Del19-R:5'-CACACAGCAAAGCAGAAAC-3'(SEQ ID NO.8)。
该引物组合物可以检测样本中的L858R是否发生点突变和Del19是否外显子缺失,稳定性好,准确性高,即便是血液样本也可以达到0.01%的灵敏度。由于该引物组合物中的探针和引物特异性好,避免了患者组织样本提取的难度和成本,做到微创对血液进行检测就可以评价EGFR基因的突变情况,极大地降低了检测成本。
在本发明一个优选地实施方式中,第一野生型基因探针、第一突变型基因探针、第二野生型基因探针和第二突变型基因探针均独立地于5’端结合荧光基团,于3’端结合淬灭基团;第一野生型基因探针和第一突变型基因探针的荧光基团不同;第二野生型基因探针和第二突变型基因探针的荧光基团不同。野生型基因探针和突变型基因探针的荧光基团不同,有利于基因的分型检测。
在本发明一个优选地实施方式中,第一野生型基因探针、第一突变型基因探针、第二野生型基因探针和第二突变型基因探针的3’端均独立地结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团。探针5’端至3’端的方向上,依次为荧光基团,探针序列,MGB修饰基团和淬灭基团。探针上连接的MGB(Minor Groove Binder)修饰基团,可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高。
在本发明一个优选地实施方式中,荧光基团包括FAM、VIC、JOE或 HEX。
在本发明一个优选地实施方式中,淬灭基团包括NFQ、TAMRA、BHQ 或IABkFQ,优选为NFQ。
在本发明一个优选地实施方式中,第一野生型基因探针和第二野生型基因探针的5’端均独立地结合VIC荧光基团,第一突变型基因探针和第二突变型基因探针的5’端均独立地结合FAM荧光基团。此时,野生型和突变型的区分度最好,可以准确、灵敏的得到检测结果。
用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂和试剂盒,试剂包括上述引物组合物,试剂盒包括上述引物组合物或试剂。由于含有上述的引物组合物,准确性和灵敏度高,成本低。该试剂盒为个体化的精准用药、药效评估和预后评估等提供重要的判断依据。
在本发明一些实施方式中,试剂盒还包括ddPCR Master Mix。
本发明提供上述试剂盒在检测EGFR基因L858R和Del19突变中的应用;或,在检测表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变中应用。
由于血液中EGFR基因的突变丰度与肿瘤组织中的突变丰度有关,所以,血液中DNA的EGFR基因突变情况能够用来预测NSCLC患者使用皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的治疗情况。在给药前,给药中和给药后做到实时监控和对治疗策略给出参考依据。
应用上述引物组合物或试剂或试剂盒检测EGFR基因L858R和Del19 突变率的方法,将从全血样本中提取的DNA样本与引物组合物或试剂进行 ddPCR反应,EGFR基因L858R和Del19突变率均独立地根据突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)×100%得到。
由于应用了上述引物组合物,除了具有准确性和灵敏度高的效果外,成本低,操作简便,可以做到批量检测。该方法仅用于分析和判断靶标基因的突变信息,并为肺癌患者治疗和用药指导提供可靠的分析依据。
ddPCR(droplet digital PCR,微滴式数字PCR)在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理,即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后,逐个对每个微滴进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。
在本发明一个优选地实施方式中,检测方法具体为:PCR混合物总体积20μL:16μL使用2×ddPCR Master Mix(Bio-Rad)和定制的40×TaqMan 探针和引物配置的TaqMan PCR反应混合物,再加入4μL模板DNA。混合好的样品加入到Droplet generator cartridge(Bio-Rad),每个反应通道加入 70μL的反应油(Bio-Rad),待反应液滴产生后,将样品转移至96孔PCR 反应板,在传统的PCR仪中进行扩增反应。
用于检测L858R的ddPCR反应程序为:95℃10min;94℃30s,57℃ 1min,45cycle;10℃保温。
用于检测Del19的ddPCR反应程序为:95℃10min;94℃30s,54℃ 1min,45cycle;10℃保温。
该方法采用ddPCR检测方法,以血液中提取的DNA为模板,通过对循环数和退火温度的优化,可以在检测出低DNA模板量时的超低频突变,为肺癌患者的用药治疗或预测提供了更好的方法和参考依据。
本发明最后提供一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法,采用上述方法,根据EGFR基因L858R和Del19突变判断表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变,为微创检测EGFR基因 L858R和Del19突变提供了技术支持。
为了有助于进一步理解本发明,现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1组织样本
样本的对照实验使用石蜡包埋的组织样本进行ARMS-PCR检测。
组织样本细胞在二甲苯中保存过夜,使用MagPure FFPE DNA LQ Kit(Magen)提取DNA,操作流程请见该试剂盒说明书。使用人EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(雅康博)对组织样本提取的模板DNA进行检测,操作流程及反应条件请见该试剂盒说明书。
将含有EGFR基因突变的模板稀释成5%,1%,0.5%和0.1%的梯度,参与ARMS-PCR反应及ddPCR反应。
实施例2血液样本
6-10ml全血样本使用MagPure Fast Blood DNA LQ Kit(Magen)提取其中的DNA。血浆样品可在-80℃下保存,提取获得的DNA在检测于4℃条件下保存。
实施例3 ddPCR检测和分析
PCR混合物总体积20μL:16μL使用2×ddPCR Master Mix(Bio-Rad) 和定制的40×TaqMan探针和引物配置的TaqMan PCR反应混合物,再加入 4μL模板DNA。混合好的样品加入到Droplet generator cartridge(Bio-Rad),每个反应通道加入70μL的反应油(Bio-Rad),待反应液滴产生后,将样品转移至96孔PCR反应板,在传统的PCR仪中进行扩增反应。
所用引物组合物的信息如下:
序列(5'-3') | 序列号 | |
L858R-WT | GTTTGGCCAGCCCAA | SEQ ID NO.1 |
L858R-MU | GTTTGGCCCGCCCAA | SEQ ID NO.2 |
L858R-F | CAGCATGTCAAGATCACAGAT | SEQ ID NO.3 |
L858R-R | CTCCTTCTGCATGGTATTCTT | SEQ ID NO.4 |
Del19-WT | TCGAGGATTTCCTTGTTG | SEQ ID NO.5 |
Del19-MU | GAATTAAGAGAAGCAACATC | SEQ ID NO.6 |
Del19-F | GAGAAAGTTAAAATTCCCGT | SEQ ID NO.7 |
Del19-R | CACACAGCAAAGCAGAAAC | SEQ ID NO.8 |
其中L858R-WT探针为:5'-VIC-GTTTGGCCAGCCCAA-MGB-NFQ-3';
L858R-MU探针为:5'-FAM-GTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQ-3';
Del19-WT探针为:5'-VIC-TCGAGGATTTCCTTGTTG-MGB-NFQ-3';
Del19-MU探针为:5'-FAM-GAATTAAGAGAAGCAACATC-MGB-NFQ -3'。
用于检测L858R的ddPCR反应程序为:95℃10min;94℃30s,57℃ 1min,45cycle;10℃保温。
用于检测Del19的ddPCR反应程序为:95℃10min;94℃30s,54℃ 1min,45cycle;10℃保温。
数据分析:使用QX-100droplet reader(Bio-Rad)和QuantaSoft analysissoftware(Bio-Rad)进行数据分析。
检测结果如下表所示:
使用ddPCR技术检测L858R和Del19突变,血液样本和组织样本的结果没有基本一致。其中针对L858R的突变检测,准确度在阳性88%和阴性96%;针对Del19的突变检测,准确度在阳性95%和阴性100%。说明使用血浆游离DNA的检测能够有效正确地检测到L858R的突变和Del19的突变。说明采用本发明提供的引物组合物和无创的检测方法,可以准确鉴定 EGFR基因的突变情况,同时在确保检测准确度的前提下,减少了病患的痛苦。
实施例4 ARMS-PCR法和ddPCR法灵敏度分析
针对上述试验结果,将L858R和Del19的ARMS-PCR法和本发明提供的ddPCR法检测的数据进行进一步的分析可知:
1)对于L858R:如图1所示,ARMS-PCR法可在5%以及1%突变率的情况下检出突变,在0.5%及0.1%时不能准确检测出突变;
2)对于L858R:如图2所示,总样本数为6000例,其中结果高于8000 丰度的判定为突变型,可以看到本发明提供的ddPCR法的检测下限到 0.01%;
3)对于Del19:ARMS-PCR法可在5%以及1%突变率的情况下检出突变,在0.5%及0.1%时不能准确检测出突变;
4)对于Del19:总样本数为6000例,其中结果高于8000丰度的判定为突变型,结果显示,本发明提供的ddPCR法的检测下限到0.01%。
上述结果说明采用本发明提供的引物组合物和方法检测人EGFR基因 L858R突变及19外显子缺失,准确率高,灵敏度高(0.01%),相比较 ARMS-PCR法(灵敏度1%)提高了很多,且大大的降低了检测的假阴性率,具有重要的应用价值。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京求臻基因科技有限公司
<120> 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtttggccag cccaa 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtttggcccg cccaa 15
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagcatgtca agatcacaga t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctccttctgc atggtattct t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgaggattt ccttgttg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaattaagag aagcaacatc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagaaagtta aaattcccgt 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacacagcaa agcagaaac 19
Claims (10)
1.一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物,其特征在于,所述引物组合物包括:用于检测L858R的第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对;
和,用于检测Del19的第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对;
其中,所述第一野生型基因探针如SEQ ID NO.1所示;
所述第一突变型基因探针如SEQ ID NO.2所示;
所述第一引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;
所述第二野生型基因探针如SEQ ID NO.5所示;
所述第二突变型基因探针如SEQ ID NO.6所示;
所述第二引物对如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合物,其特征在于,所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针均独立地于5’端结合荧光基团,于3’端结合淬灭基团;
所述第一野生型基因探针和所述第一突变型基因探针的荧光基团不同;
所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的荧光基团不同。
3.根据权利要求2所述的引物组合物,其特征在于,所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的3’端均独立地结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团;
优选地,所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE或HEX;
优选地,所述淬灭基团包括NFQ、TAMRA、BHQ或IABkFQ,优选为NFQ。
4.根据权利要求1-3任一项所述的引物组合物,其特征在于,所述第一野生型基因探针和所述第二野生型基因探针的5’端均独立地结合VIC荧光基团,所述第一突变型基因探针和所述第二突变型基因探针的5’端均独立地结合FAM荧光基团。
5.一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂,其特征在于,所述试剂包括权利要求1-4任一项所述的引物组合物。
6.一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-4任一项所述的引物组合物或权利要求5所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,还包括ddPCR Master Mix。
8.权利要求6或7所述的试剂盒在检测EGFR基因L858R和Del19突变中的应用;
或,在检测表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变中应用。
9.应用权利要求1-4任一项所述引物组合物或权利要求5所述试剂或权利要求6或7所述试剂盒检测EGFR基因L858R和Del19突变率的方法,其特征在于,将从全血样本中提取的DNA样本与权利要求1-3任一项所述的引物组合物或权利要求4所述的试剂进行ddPCR反应,EGFR基因L858R和Del19突变率均独立地根据突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)×100%得到。
10.表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法,其特征在于,采用权利要求9所述的方法,根据EGFR基因L858R和Del19突变率判断表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810899679.0A CN108913775A (zh) | 2018-08-08 | 2018-08-08 | 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810899679.0A CN108913775A (zh) | 2018-08-08 | 2018-08-08 | 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108913775A true CN108913775A (zh) | 2018-11-30 |
Family
ID=64394644
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810899679.0A Pending CN108913775A (zh) | 2018-08-08 | 2018-08-08 | 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108913775A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109880904A (zh) * | 2019-03-05 | 2019-06-14 | 铭时基因科技(上海)有限公司 | 外周血浆中egfr基因外显子19缺失突变的检测方法及应用 |
CN110129437A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-16 | 施明耀 | 一种基于微滴数字pcr技术的egfr检测方法和应用 |
CN113088573A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-09 | 人和未来生物科技(长沙)有限公司 | 一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂及其应用 |
CN113373205A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-09-10 | 远辰生物科技(苏州)有限公司 | 一种利用数字PCR定量检测EGFR基因19del和L858R位点突变的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101586151A (zh) * | 2008-05-21 | 2009-11-25 | 北京华安佛医药研究中心有限公司 | 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒 |
CN101586153A (zh) * | 2008-05-21 | 2009-11-25 | 北京华安佛医药研究中心有限公司 | 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒 |
CN107075730A (zh) * | 2014-09-12 | 2017-08-18 | 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 | 循环核酸的鉴定及用途 |
-
2018
- 2018-08-08 CN CN201810899679.0A patent/CN108913775A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101586151A (zh) * | 2008-05-21 | 2009-11-25 | 北京华安佛医药研究中心有限公司 | 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒 |
CN101586153A (zh) * | 2008-05-21 | 2009-11-25 | 北京华安佛医药研究中心有限公司 | 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒 |
CN107075730A (zh) * | 2014-09-12 | 2017-08-18 | 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 | 循环核酸的鉴定及用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ELEONORA ZONTA ET AL.: "Multiplex Detection of Rare Mutations by Picoliter Droplet Based Digital PCR: Sensitivity and Specificity Considerations", 《PLOS ONE》 * |
兰敏等: "AZD9291治疗非小细胞肺癌的临床转化研究", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109880904A (zh) * | 2019-03-05 | 2019-06-14 | 铭时基因科技(上海)有限公司 | 外周血浆中egfr基因外显子19缺失突变的检测方法及应用 |
CN110129437A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-16 | 施明耀 | 一种基于微滴数字pcr技术的egfr检测方法和应用 |
WO2020200185A1 (zh) * | 2019-04-03 | 2020-10-08 | 善觅有限公司 | 一种基于微滴数字pcr技术的egfr检测方法和应用 |
CN113088573A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-09 | 人和未来生物科技(长沙)有限公司 | 一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂及其应用 |
CN113373205A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-09-10 | 远辰生物科技(苏州)有限公司 | 一种利用数字PCR定量检测EGFR基因19del和L858R位点突变的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106520931B (zh) | Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
CN108913775A (zh) | 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法 | |
CN108949990B (zh) | 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法 | |
CN103710460B (zh) | 定量检测egfr基因突变的试剂盒及其用途 | |
CN101092644B (zh) | 非小细胞肺癌疗效相关的egfr基因突变的快速检测 | |
CN105349654B (zh) | 一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒 | |
CN107663533A (zh) | 一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法及应用 | |
CN107083438A (zh) | 检测egfr基因20外显子t790m和c797s突变的引物、探针及方法 | |
WO2017210372A1 (en) | Molecular tagging methods and sequencing libraries | |
WO2020048518A1 (zh) | 一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因及其应用 | |
CN108998536A (zh) | 一种人类微卫星不稳定性状态msi检测试剂盒及其检测方法 | |
CN107937496A (zh) | 一种利用数字pcr技术检测egfr g719x基因变异的方法 | |
CN109097478A (zh) | 一种人类微卫星不稳定性状态msi检测试剂盒及其检测方法 | |
CN108342461A (zh) | ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法 | |
CN109182529B (zh) | 检测egfr基因t790m、c797s及l798i位点的特异性探针及试剂盒 | |
CN110863054A (zh) | 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法 | |
CN110863053A (zh) | 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法 | |
CN110004229A (zh) | 多基因作为egfr单克隆抗体类药物耐药标志物的应用 | |
CN112481384A (zh) | 一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用 | |
CN107937524A (zh) | 人类kras基因突变检测试剂盒及检测方法 | |
CN108728538B (zh) | Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
CN109295225A (zh) | Egfr基因l858r突变数字pcr检测体系的优化方法及检测产品 | |
CN110964818A (zh) | 一种人类braf基因v600e突变的检测试剂盒及检测方法 | |
CN107029238B (zh) | Linc01094在诊治缺血性脑卒中的应用 | |
CN109811041A (zh) | 一种检测pik3ca基因h1047r位点的特异性引物对、探针及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181130 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |