CN105463115B - 用于检测人类ret基因7种突变的探针、引物及试剂盒 - Google Patents

用于检测人类ret基因7种突变的探针、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测人类RET基因7种突变的探针、引物及试剂盒，其中RM1～RM7的7组引物和探针，每组中突变上游ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合，扩增突变序列，突变下游引物能与RET基因保守序列结合；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术，可准确检测RET基因7种突变类型；建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对RET基因突变的快速检测，操作简单，结果易读；检测方法灵敏度高，50拷贝突变能稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

Description

用于检测人类RET基因7种突变的探针、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类RET基因7种突变的探针、引物及试剂盒。
背景技术
甲状腺髓样癌(medμLlary thyroid carcinoma)实际上并非甲状腺癌，它来源于分泌降钙素的甲状腺滤泡旁细胞(又称C细胞)，是神经内分泌细胞，和甲状腺滤泡细胞无关。1959年由Hazand等首先提出作为一个独立临床病理类型，它只占甲状腺肿瘤一小部分(约占3～12％)，其发病、诊断和治疗都独具特点。根据是否具有遗传性，MTC可分为散发性和遗传性两大类：1.散发性MTC：临床上最多见，约占MTC的75～80％，多为中老年，女性稍多；2.遗传性MTC(MEN2)：临床上较少见，约占MTC的20～25％(1～10/10万)，发病年龄较散发性MTC提前10～20年左右，男女发病率无差异，一个家族中可以同时或先后有多人患病。又细分为以下3种类型：
1、多发性内分泌腺瘤2A(MEN2A)：占所有遗传性MTC 80％，此型会同时发生MTC、嗜铬细胞瘤和甲状旁腺增生；2、多发性内分泌腺瘤2B(MEN2B)：无甲状旁腺疾病，以粘膜多发性神经瘤伴MTC和(或)肾上腺嗜铬细胞瘤为特点，是遗传性MTC中恶性程度最高的类型(常在5岁前即出现；5％ofMEN2)；3、家族非多发性内分泌腺瘤性MTC(FMTC)：此型被认为是MEN2A的一种变异类型，MTC是其唯一的特征，是遗传性MTC中恶性程度最低的类型。
多发性内分泌肿瘤2型(MEN2)，又称Sipple综合征，由美国临床医生Sipple于1961年首先描述，为常染色体显性遗传性疾病，外显率高，发病率约1/30000，根据不同的临床表现，临床将MEN2分为3种亚型：MEN2A、MEN2B及家族性甲状腺髓样癌(FMTC，Familiar MedμLlary Thyroid Carcinoma)。其中最为多见的是MEN2A，约占MEN2的75％，以甲状腺髓样癌(MTC)为主要临床表现，约90％的MEN2A携带者出现甲状腺髓样癌，约50％伴有嗜铬细胞瘤(PCC，Pheochromocytoma)，20％～30％出现甲状旁腺增生或腺瘤；MEN2B是MEN2的三种类型中恶性度最高且最少见的类型，MEN2B不发生PHPT，但是有特殊的发育缺陷：如肌肉骨骼畸形(马凡体型，高弓足，漏斗胸，近端肌无力)、***部粘膜神经瘤、胃肠道表现如呕吐、脱水，喂养困难，肠梗阻等。
MEN2的发病机制系ret原癌基因(RET)发生突变所致。RET为一单链穿膜含酪氨酸激酶的蛋白，在许多起源于神经嵴的细胞(如甲状腺、肾上腺、肠内部神经系等)中表达，在机体的发育上起重要作用。RET结构上的特征是在其细胞外部分近细胞膜处聚集有多个半胱氨酸，在细胞内部分则含有一酪氨酸激酶区段。
MEN 2A患者RET基因有突变存在，主要位于细胞外近膜处半胱氨酸，可为错义性突变，或小的DNA片段的缺失或***，皆累及前述的半胱氨酸。家族性甲状腺髓样癌患者往往可检出MEN 2A中半胱氨酸突变，此外还有其他一些氨基酸突变。MEN 2B患者的RET基因突变不涉及MEN 2A中的半胱氨酸及家族性甲状腺髓样癌中的氨基酸，其突变的95％以上为甲硫氨酸Met 918变为苏氨酸(M918T)。
为更早的检出遗传型患者，美国甲状腺协会(ATA)推荐对于所有甲状腺髓样癌患者进行RET基因检测，以区分遗传性或散发性患者，使遗传性MTC患者能提早发现，早期治疗，以使患者得到更多的获益。
目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20～30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。
发明内容
为了解决现有的RET基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确性差、区分度困难等问题，本发明提供了用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针。本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒，实现不限场地的快速准确检测。
本发明提供的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：
RM1：M918T突变
突变上游ARMS引物RM1-F：SEQ ID NO:1，
突变下游引物RW1-R：SEQ ID NO:2，
检测探针RW1-P：SEQ ID NO:3，
阻断探针RW1-B：SEQ ID NO:4；
RM2：C634R突变
突变上游ARMS引物RM2-F：SEQ ID NO:5，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM3：C634G突变
突变上游ARMS引物RM3-F：SEQ ID NO:6，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM4：C634S突变
突变上游ARMS引物RM4-F：SEQ ID NO:7，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM5：C634F突变
突变上游ARMS引物RM5-F：SEQ ID NO:8，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM6：C634Y突变
突变上游ARMS引物RM6-F：SEQ ID NO:9，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM7：C634W突变
突变上游ARMS引物RM7-F：SEQ ID NO:10，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
其中，所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。
优选地，上述用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。MGB(Minor Groove Binder)基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
表1人类RET基因7种热点突变
上述引物是针对表1所列的7种突变进行检测的特异性引物，其中，突变上游ARMS引物，能够与其相应的突变位点序列特异性结合，选择性扩增突变序列；突变下游引物能够与RET基因保守序列结合；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。
本发明提供的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，包括以上任一所述的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针。
优选地，上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：
外控上游引物RR-F：SEQ ID NO:14，
外控下游引物RR-R：SEQ ID NO:15，
外控检测探针RR-P：SEQ ID NO:16，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。其中，RR-F和RR-R用于扩增RET基因的保守序列(此段保守序列碱基段为>gi|568815588:43128101-43128500)；RR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQ ID NO:17，
内控下游引物IC-R：SEQ ID NO:18，
内控检测探针IC-P：SEQ ID NO:19，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有7种突变序列基因的质粒RM1质粒～RM7质粒、含有RET基因保守序列>gi|568815588:43128101-43128500段碱基的外控质粒和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒，其中RM1质粒含有RET基因>gi|568815588:43121771-43122170段碱基序列，RM2质粒～RM7质粒均含有RET基因>gi|568815588:43114301-43114700段碱基序列；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
RM1质粒中的RET基因>gi|568815588:43121771-43122170段碱基序列含有突变位点c.2753T>C；RM2质粒～RM7质粒中的RET基因>gi|568815588:43114301-43114700段碱基序列含有各自突变位点的突变碱基(依次为：c.1900T>C，c.1900T>G，c.1900T>A，c.1901G>T，c.1901G>A，c.1902C>G)。
优选地，上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分为8个：
7个检测反应体系，每1个检测反应体系中包括用于检测人类RET基因一种突变的引物和探针，内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
质控反应体系：包括外控引物和探针、内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
所述AB premix为美国应用生物***公司产品Fast Advanced MasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
本发明还提供了以上所述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒的使用方法，首先提取待检样品的基因组DNA，分别加入到各检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和各突变相应的阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果；
首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤22；9<Ct质控≤18；然后按照△Ct＝Ct检测-Ct质控判定：
含有RM1：M918T(c.2753T>C)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为M918T(c.2753T>C)突变型阳性；
含有RM2：C634R(c.1900T>C)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为C634R(c.1900T>C)突变型阳性；
含有RM3：C634G(c.1900T>G)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为C634G(c.1900T>G)突变型阳性；
含有RM4：C634S(c.1900T>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为C634S(c.1900T>A)突变型阳性；
含有RM5：C634F(c.1901G>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为C634F(c.1901G>T)突变型阳性；
含有RM6：C634Y(c.1901G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为C634Y(c.1901G>A)突变型阳性；
含有RM7：C634W(c.1902C>G)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为C634W(c.1902C>G)突变型阳性；
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在上述7种检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
优选地，以上所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒的使用方法，荧光定量PCR反应的条件为：
95℃10min；
92℃15sec，58℃1min，共15个循环；
92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术，可以检测人类RET基因7种突变类型。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。
(2)本发明建立了实时荧光PCR扩增反应体系实现对RET基因突变的快速检测；且操作简单，结果易读。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。
(3)本方法灵敏度高，可实现50拷贝突变基因的稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。
附图说明
图1为实施例1中内控(IC)实验结果；
图2为实施例1中非模板对照(NTC)实验结果；
图3为实施例1中阳性对照(STD)样本结果；
图4为实施例1中灵敏度(M918T检测孔)实验结果；
图5为实施例1中精密度(外控检测孔)实验结果；
图6为实施例2中阴性(野生型)样本实验结果；
图7为实施例2中阳性(C634W突变)样本实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、用于检测人类RET基因7种突变的检测试剂盒的引物和探针：
根据NCBI数据库公布的RET基因(NCBI Reference Sequence:NM_020975.4)野生型序列，以16号外显子M918T(RM1)突变位点，11号外显子C634R(RM2)、C634G(RM3)、C634S(RM4)、C634F(RM5)、C634Y(RM6)和C634W(RM7)突变位点为参考，设计特异性M918T突变引物和探针(见表2)、C634R突变引物和探针(见表3)、C634G突变引物和探针(见表4)、C634S突变引物和探针(见表5)、C634F突变引物和探针(见表6)、C634Y突变引物和探针(见表7)和C634W突变引物和探针(见表8)。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系，实现对RET基因突变的高灵敏度和高特异性检测。
(1)用于人类RET基因M918T(RM1)突变检测的特异性引物和探针序列：
表2用于检测M918T(RM1)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
1 RM1-F CGTCGGATTCCAGTTAGATGAAC 无
2 RW1-R CCACCCCAAGAGAGCAACAC 无
3 RW1-P TCCCTTTTTGATCATATCT 5’端FAM，3’端MGB
4 RW1-B AGTTAAATGGATGGCAATTG 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，RM1-F为突变上游ARMS引物，与M918T(c.2753T>C)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；RW1-R为突变下游引物，与RET基因保守序列结合；RW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；RW1-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与M918T位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(2)用于人类RET基因C634R(RM2)突变检测的特异性引物和探针序列：
表3用于检测C634R(RM2)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
5 RM2-F TTCACTGTGCGACGAGATGC 无
11 RW2-R TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC 无
12 RW2-P CTGTCCTCTTCTCCTTC 5’端FAM，3’端MGB
13 RW2-B ACGAGCTGTGCCGCA 3’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，RM2-F为突变上游ARMS引物，与C634R(c.1900T>C)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；RW2-R为突变下游引物，与RET基因保守序列结合；RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与C634R位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(3)用于人类RET基因C634G(RM3)突变检测的特异性引物和探针序列：
表4用于检测C634G(RM3)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
6 RM3-F TTACTGTGCGACGGGTTGG 无
11 RW2-R TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC 无
12 RW2-P CTGTCCTCTTCTCCTTC 5’端FAM，3’端MGB
13 RW2-B ACGAGCTGTGCCGCA 3’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，RM3-F为突变上游ARMS引物，与C634G(c.1900T>G)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；RW2-R为突变下游引物，与RET基因保守序列结合；RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与C634G位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(4)用于人类RET基因C634S(RM4)突变检测的特异性引物和探针序列：
表5用于检测C634S(RM4)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
7 RM4-F TCCAATGTGCGACGATCTGA 无
11 RW2-R TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC 无
12 RW2-P CTGTCCTCTTCTCCTTC 5’端FAM，3’端MGB
13 RW2-B ACGAGCTGTGCCGCA 3’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，RM4-F为突变上游ARMS引物，与C634S(c.1900T>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；RW2-R为突变下游引物，与RET基因保守序列结合；RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与C634S位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(5)用于人类RET基因C634F(RM5)突变检测的特异性引物和探针序列：
表6用于检测C634F(RM5)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
8 RM5-F AATGTGCGACGAGCGGTT 无
11 RW2-R TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC 无
12 RW2-P CTGTCCTCTTCTCCTTC 5’端FAM，3’端MGB
13 RW2-B ACGAGCTGTGCCGCA 3’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，RM5-F为突变上游ARMS引物，与C634F(c.1901G>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；RW2-R为突变下游引物，与RET基因保守序列结合；RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与C634F位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(6)用于人类RET基因C634Y(RM6)突变检测的特异性引物和探针序列：
表7用于检测C634Y(RM6)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
9 RM6-F TAACTGTGCGACGGGCTCTA 无
11 RW2-R TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC 无
12 RW2-P CTGTCCTCTTCTCCTTC 5’端FAM，3’端MGB
13 RW2-B ACGAGCTGTGCCGCA 3’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，RM6-F为突变上游ARMS引物，与C634Y(c.1901G>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；RW2-R为突变下游引物，与RET基因保守序列结合；RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与C634Y位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(7)用于人类RET基因C634W(RM7)突变检测的特异性引物和探针序列：
表8用于检测C634W(RM7)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
10 RM7-F ATGTGCGACGAACTGGGG 无
11 RW2-R TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC 无
12 RW2-P CTGTCCTCTTCTCCTTC 5’端FAM，3’端MGB
13 RW2-B ACGAGCTGTGCCGCA 3’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，RM7-F为突变上游ARMS引物，与C634W(c.1902C>G)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；RW2-R为突变下游引物，与RET基因保守序列结合；RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与C634W位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
2、质控引物(外控和内控)引物和探针
(1)用于人类RET基因突变检测样本质控的外控引物和探针序列：
根据NCBI数据库公布的RET基因(NCBI Reference Sequence:NM_020975.4)20号外显子保守序列，用Primer Premier 5和Primer Express 3.0生物信息学软件设计外控引物和探针(见表9)。以基因工程构建的外控质粒为模板，建立了实时荧光PCR外控(ExternalControl)检测体系，对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行监测。
表9用于样本质控的外控引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
14 RR-F CAGGTTTGTTCTCAGGAGGGTAAG 无
15 RR-R CGCAGGAGTAGACCATTAGGTTATT 无
16 RR-P CCAGTGATGGGGAATT 5’端FAM，3’端MGB
其中，RR-F和RR-R为外控上下游引物，扩增RET基因保守序列(>gi|568815588:43128101-43128500)；RR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
(2)用于实时荧光PCR扩增反应体系内部质控的内控引物和探针序列：
根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBI Reference Sequence:NC_001666.2)保守序列(non-human DNA)，用Primer Premier 5和Primer Express 3.0生物信息学软件设计内控引物和探针(见表10)。以基因工程构建的内控质粒为模板，建立了实时荧光PCR内控(Internal Control)检测体系，对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。
表10用于内部质控的内控引物、探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
17 IC-F TCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG 无
18 IC-R CAACGGGTTTACTAATAGGATGCC 无
19 IC-P TCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC 5’端JOE，3’端BHQ1
其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列(位于>gi|11994090:c2400-2001)；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
3、本发明的检测人类RET基因7种突变的检测试剂盒
实时荧光PCR扩增反应体系设置：本发明方法用8孔实时荧光PCR扩增反应进行RET基因7种突变的检测。反应体系1～7(见表12)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系，反应体系8(见表12)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
试剂盒各管内组成成分如下：
表11试剂盒组成成分
其中，RM1质粒含有发生M918T(c.2753T>C)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43121771-43122170)，RM2质粒含有发生C634R(c.1900T>C)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700)，RM3质粒含有发生C634G(c.1900T>G)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700)，RM4质粒含有发生C634S(c.1900T>A)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700)，RM5质粒含有发生C634F(c.1901G>T)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700)，RM6质粒含有发生C634Y(c.1901G>A)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700)，RM7质粒含有发生C634W(c.1902C>G)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700)；RR质粒(即外控质粒)含有RET基因保守序列(>gi|568815588:43128101-43128500)；IC质粒(即内控质粒)含有matK基因保守序列(>gi|11994090:c2400-2001)。
反应体系组成如下：
表12实时荧光PCR扩增反应体系组成
注：AB premix全称Fast Advanced Master Mix，购自美国应用生物***公司；10×buffer(Mg2+Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。
PCR反应总体积25μL，含19μL的反应体系，1μL的IC模板和5μL的检测模板(阳性对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA)，IC模板和检测模板可预混。
反应体系1用于人类RET基因M918T(RM1)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系2用于人类RET基因C634R(RM2)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系3用于人类RET基因C634G(RM3)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表4)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系4用于人类RET基因C634S(RM4)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表5)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系5用于人类RET基因C634F(RM5)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表6)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系6用于人类RET基因C634Y(RM6)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表7)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系7用于人类RET基因C634W(RM7)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表8)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系8用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合(见表9)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
4、试剂盒检测方法：
(1)获取待测样本基因组DNA
血液样本的提取使用宁波有成血液基因组DNA提取试剂盒(KR008F)。按说明书提取甲状腺髓样癌和多发性内分泌腺瘤2型患者全血基因组DNA，操作步骤简述如下：
取血液样本200μL到离心管，加入50μLProteinase K，涡旋震荡混匀(2s每次，震荡5次)；加入250μL裂解液BL，涡旋震荡混匀，室温静置10min充***解细胞；加入200μL无水乙醇，涡旋振荡混匀；将上述溶液全部转移到DNA吸附柱中，13000rpm离心1min，弃收集管；将吸附柱置于新的2mL收集管中并加入500μL的洗涤液BWB1，13000rpm离心1min，弃滤液；加入500μL洗涤液BWB2，13000rpm离心1min，弃收集管；将吸附柱置于1.5mL的核酸酶污染的离心管中，室温静置10min或超净工作台中风干5min使乙醇彻底挥发；向吸附膜中央小心加入50-100μL洗脱液BE，室温静置5min；13000rpm离心1min，收集滤液，-20℃保存。
将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。定量后，母液-20℃保存。
(2)实时荧光PCR扩增反应：
实时荧光PCR扩增反应体系设置：本发明方法用8孔实时荧光PCR扩增反应进行RET基因7种突变的检测。体系1-7(见表12)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系，体系8(见表12)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
实时荧光PCR扩增反应基本原理：上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE)，3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前，检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近，由于荧光共振能量转移的作用，荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行，检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解，5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离，进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB(Minor GrooveBinder)基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
(1)在本发明实时荧光PCR突变检测体系中，对目的基因突变区域进行PCR扩增。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。(3)在本发明实时荧光PCR内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。
实时荧光PCR扩增反应：
将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为模板，加入到实时荧光PCR扩增反应体系中(见表12)进行扩增。
实时荧光PCR扩增反应条件设置：
表13实时荧光PCR扩增反应条件
最优的，在Stage2阶段(15个循环)，58℃的退火延伸温度，有利于突变模板的富集。在Stage3阶段(30个循环)，60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。
(3)检测结果分析
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值≤22，体系性能良好，结果有效)；以外控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准(9<Ct质控≤18，Ct质控≤9，说明加入的基因组DNA浓度过高，应稀释后重新检测该样本；Ct质控>18或无扩增曲线，说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解，建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测)，以待测样本突变检测孔与外控检测孔FAM信号的△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表14)。
表14样本检测结果判定
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。
(4)试剂盒性能分析实验(灵敏度和精密度)
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。图1为IC检测结果，Ct内控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～8FAM均不起线，符合要求；图3为STD检测结果，反应体系1～8FAM信号均起线且Ct≤22，符合要求。
(1)灵敏度实验
将以现有基因工程技术合成的含有RET基因突变序列的7种重组质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。取1×103拷贝/μL的7种突变质粒DNA分别进行10倍稀释，稀释2个梯度，然后以3种浓度梯度(1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL和1×101拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10拷贝/μL突变基因即可检出。
(2)精密度实验
将以现有基因工程技术合成的含有RET基因突变序列的7种重组质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。以5×101拷贝/μL的7种突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。
实施例2
用本发明中人类RET基因7种突变检测试剂盒来检测临床采集的组织样本。
本实施例中收集临床病理诊断为甲状腺髓样癌和多发性内分泌腺瘤2型的患者血液样本，并从中提取基因组DNA。用RET基因7种突变检测试剂盒检测待测样本中RET基因突变状态。具体步骤如下：
(1)样本基因组DNA提取
血液样本的提取使用宁波有成血液基因组DNA提取试剂盒(KR008F)，按说明书提取待测样本基因组DNA，将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。将符合要求的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为PCR模板，进行实时荧光PCR扩增反应。
(2)实时荧光PCR扩增反应
实时荧光PCR扩增反应条件见表13，按照人类RET基因7种突变检测试剂盒说明书进行样本检测。
(3)结果判定
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值Ct≤22，体系性能良好，结果有效)；以待测样本突变检测孔和外控检测孔FAM信号△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表14)。
图6中，Ct质控＝13.9，符合要求；突变检测孔FAM信号均未起线，显示样本检测结果为阴性。
图7中，Ct质控＝12.9，符合要求；RM7突变检测孔FAM信号起线而RM1～RM6突变检测孔FAM信号均未起线，且Ct检测(RM7)＝18.1，△Ct＝5.2，显示样本检测结果为RM7(C634W)阳性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海吉力生物科技有限公司
<120> 用于检测人类RET基因7种突变的探针、引物及试剂盒
<130>
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtcggattc cagttagatg aac 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaccccaag agagcaacac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccctttttg atcatatct 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agttaaatgg atggcaattg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttcactgtgc gacgagatgc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttactgtgcg acgggttgg 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tccaatgtgc gacgatctga 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aatgtgcgac gagcggtt 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
taactgtgcg acgggctcta 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgtgcgacg aactgggg 18
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtgggcaaa cttgtggtag c 21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctgtcctctt ctccttc 17
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgagctgtg ccgca 15
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caggtttgtt ctcaggaggg taag 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgcaggagta gaccattagg ttatt 25
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccagtgatgg ggaatt 16
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcgtaaggaa tcaaatgctg gag 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caacgggttt actaatagga tgcc 24
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcgataccac agtccttgca actcccc 27

Claims (7)

1.用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针，其特征在于，核苷酸序列如下：
RM1：M918T突变
突变上游ARMS引物RM1-F：SEQ ID NO:1，
突变下游引物RW1-R：SEQ ID NO:2，
检测探针RW1-P：SEQ ID NO:3，
阻断探针RW1-B：SEQ ID NO:4；
RM2：C634R突变
突变上游ARMS引物RM2-F：SEQ ID NO:5，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM3：C634G突变
突变上游ARMS引物RM3-F：SEQ ID NO:6，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM4：C634S突变
突变上游ARMS引物RM4-F：SEQ ID NO:7，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM5：C634F突变
突变上游ARMS引物RM5-F：SEQ ID NO:8，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM6：C634Y突变
突变上游ARMS引物RM6-F：SEQ ID NO:9，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
RM7：C634W突变
突变上游ARMS引物RM7-F：SEQ ID NO:10，
突变下游引物RW2-R：SEQ ID NO:11，
检测探针RW2-P：SEQ ID NO:12，
阻断探针RW2-B：SEQ ID NO:13；
其中，所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。
3.用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，其特征在于，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：
外控上游引物RR-F：SEQ ID NO:14，
外控下游引物RR-R：SEQ ID NO:15，
外控检测探针RR-P：SEQ ID NO:16，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。
5.根据权利要求4所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，其特征在于，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQ ID NO:17，
内控下游引物IC-R：SEQ ID NO:18，
内控检测探针IC-P：SEQ ID NO:19，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
6.根据权利要求5所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有7种突变序列基因的质粒RM1质粒～RM7质粒、含有RET基因保守序列>gi|568815588:43128101-43128500段碱基的外控质粒和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒，其中RM1质粒含有RET基因>gi|568815588:43121771-43122170段碱基序列，RM2质粒～RM7质粒均含有RET基因>gi|568815588:43114301-43114700段碱基序列；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
7.根据权利要求5所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的反应体系分为8个：
7个检测反应体系：每1个检测反应体系中包括用于检测人类RET基因一种突变的引物和探针，内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
1个质控反应体系：包括外控引物和探针、内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
所述AB premix为美国应用生物***公司产品Fast Advanced Master Mix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
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