CN105463115B - 用于检测人类ret基因7种突变的探针、引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测人类RET基因7种突变的探针、引物及试剂盒,其中RM1~RM7的7组引物和探针,每组中突变上游ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合,扩增突变序列,突变下游引物能与RET基因保守序列结合;检测探针能够与扩增片段结合,阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术,可准确检测RET基因7种突变类型;建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对RET基因突变的快速检测,操作简单,结果易读;检测方法灵敏度高,50拷贝突变能稳定检出;特异性好,20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增,检测能力高达1%。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种用于检测人类RET基因7种突变的探针、引物及试剂盒。
背景技术
甲状腺髓样癌(medμLlary thyroid carcinoma)实际上并非甲状腺癌,它来源于分泌降钙素的甲状腺滤泡旁细胞(又称C细胞),是神经内分泌细胞,和甲状腺滤泡细胞无关。1959年由Hazand等首先提出作为一个独立临床病理类型,它只占甲状腺肿瘤一小部分(约占3~12%),其发病、诊断和治疗都独具特点。根据是否具有遗传性,MTC可分为散发性和遗传性两大类:1.散发性MTC:临床上最多见,约占MTC的75~80%,多为中老年,女性稍多;2.遗传性MTC(MEN2):临床上较少见,约占MTC的20~25%(1~10/10万),发病年龄较散发性MTC提前10~20年左右,男女发病率无差异,一个家族中可以同时或先后有多人患病。又细分为以下3种类型:
1、多发性内分泌腺瘤2A(MEN2A):占所有遗传性MTC 80%,此型会同时发生MTC、嗜铬细胞瘤和甲状旁腺增生;2、多发性内分泌腺瘤2B(MEN2B):无甲状旁腺疾病,以粘膜多发性神经瘤伴MTC和(或)肾上腺嗜铬细胞瘤为特点,是遗传性MTC中恶性程度最高的类型(常在5岁前即出现;5%ofMEN2);3、家族非多发性内分泌腺瘤性MTC(FMTC):此型被认为是MEN2A的一种变异类型,MTC是其唯一的特征,是遗传性MTC中恶性程度最低的类型。
多发性内分泌肿瘤2型(MEN2),又称Sipple综合征,由美国临床医生Sipple于1961年首先描述,为常染色体显性遗传性疾病,外显率高,发病率约1/30000,根据不同的临床表现,临床将MEN2分为3种亚型:MEN2A、MEN2B及家族性甲状腺髓样癌(FMTC,Familiar MedμLlary Thyroid Carcinoma)。其中最为多见的是MEN2A,约占MEN2的75%,以甲状腺髓样癌(MTC)为主要临床表现,约90%的MEN2A携带者出现甲状腺髓样癌,约50%伴有嗜铬细胞瘤(PCC,Pheochromocytoma),20%~30%出现甲状旁腺增生或腺瘤;MEN2B是MEN2的三种类型中恶性度最高且最少见的类型,MEN2B不发生PHPT,但是有特殊的发育缺陷:如肌肉骨骼畸形(马凡体型,高弓足,漏斗胸,近端肌无力)、***部粘膜神经瘤、胃肠道表现如呕吐、脱水,喂养困难,肠梗阻等。
MEN2的发病机制系ret原癌基因(RET)发生突变所致。RET为一单链穿膜含酪氨酸激酶的蛋白,在许多起源于神经嵴的细胞(如甲状腺、肾上腺、肠内部神经系等)中表达,在机体的发育上起重要作用。RET结构上的特征是在其细胞外部分近细胞膜处聚集有多个半胱氨酸,在细胞内部分则含有一酪氨酸激酶区段。
MEN 2A患者RET基因有突变存在,主要位于细胞外近膜处半胱氨酸,可为错义性突变,或小的DNA片段的缺失或***,皆累及前述的半胱氨酸。家族性甲状腺髓样癌患者往往可检出MEN 2A中半胱氨酸突变,此外还有其他一些氨基酸突变。MEN 2B患者的RET基因突变不涉及MEN 2A中的半胱氨酸及家族性甲状腺髓样癌中的氨基酸,其突变的95%以上为甲硫氨酸Met 918变为苏氨酸(M918T)。
为更早的检出遗传型患者,美国甲状腺协会(ATA)推荐对于所有甲状腺髓样癌患者进行RET基因检测,以区分遗传性或散发性患者,使遗传性MTC患者能提早发现,早期治疗,以使患者得到更多的获益。
目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低,检测灵敏度只有20~30%;实验操作复杂,检测效率低、样品易污染,通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测,直接测序的方法几乎无法实现其准确检测,会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法,都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂,且容易污染,假阳性率高。
发明内容
为了解决现有的RET基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确性差、区分度困难等问题,本发明提供了用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针。本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒,实现不限场地的快速准确检测。
本发明提供的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针,其核苷酸序列如下:
RM1:M918T突变
突变上游ARMS引物RM1-F:SEQ ID NO:1,
突变下游引物RW1-R:SEQ ID NO:2,
检测探针RW1-P:SEQ ID NO:3,
阻断探针RW1-B:SEQ ID NO:4;
RM2:C634R突变
突变上游ARMS引物RM2-F:SEQ ID NO:5,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM3:C634G突变
突变上游ARMS引物RM3-F:SEQ ID NO:6,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM4:C634S突变
突变上游ARMS引物RM4-F:SEQ ID NO:7,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM5:C634F突变
突变上游ARMS引物RM5-F:SEQ ID NO:8,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM6:C634Y突变
突变上游ARMS引物RM6-F:SEQ ID NO:9,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM7:C634W突变
突变上游ARMS引物RM7-F:SEQ ID NO:10,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
其中,所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团,3’端标记有淬灭基团;阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰,3’端标记有淬灭基团。
优选地,上述用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针,所述荧光基团为FAM,所述淬灭基团为MGB。MGB(Minor Groove Binder)基团可与DNA螺旋小沟结合,进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针,MGB探针序列可设计得更短,特异性更强。
表1人类RET基因7种热点突变
上述引物是针对表1所列的7种突变进行检测的特异性引物,其中,突变上游ARMS引物,能够与其相应的突变位点序列特异性结合,选择性扩增突变序列;突变下游引物能够与RET基因保守序列结合;检测探针能够与扩增片段结合,阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异性扩增。
本发明提供的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,包括以上任一所述的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针。
优选地,上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,还包括外控引物和探针,核苷酸序列如下:
外控上游引物RR-F:SEQ ID NO:14,
外控下游引物RR-R:SEQ ID NO:15,
外控检测探针RR-P:SEQ ID NO:16,外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM,3’端标记有MGB。其中,RR-F和RR-R用于扩增RET基因的保守序列(此段保守序列碱基段为>gi|568815588:43128101-43128500);RR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合。
优选地,上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,还包括内控引物和探针,核苷酸序列如下:
内控上游引物IC-F:SEQ ID NO:17,
内控下游引物IC-R:SEQ ID NO:18,
内控检测探针IC-P:SEQ ID NO:19,内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE,3’端标记有BHQ1。
其中,IC-F和IC-R为内控上下游引物,扩增matK基因保守序列;IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针,能与扩增片段结合。
优选地,上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,还包括阳性对照品和内控品,阳性对照品包括含有7种突变序列基因的质粒RM1质粒~RM7质粒、含有RET基因保守序列>gi|568815588:43128101-43128500段碱基的外控质粒和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒,其中RM1质粒含有RET基因>gi|568815588:43121771-43122170段碱基序列,RM2质粒~RM7质粒均含有RET基因>gi|568815588:43114301-43114700段碱基序列;内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
RM1质粒中的RET基因>gi|568815588:43121771-43122170段碱基序列含有突变位点c.2753T>C;RM2质粒~RM7质粒中的RET基因>gi|568815588:43114301-43114700段碱基序列含有各自突变位点的突变碱基(依次为:c.1900T>C,c.1900T>G,c.1900T>A,c.1901G>T,c.1901G>A,c.1902C>G)。
优选地,上述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,试剂盒中的反应体系分为8个:
7个检测反应体系,每1个检测反应体系中包括用于检测人类RET基因一种突变的引物和探针,内控引物和探针,AB premix,10×buffer和ddH2O;
质控反应体系:包括外控引物和探针、内控引物和探针,AB premix,10×buffer和ddH2O;
所述AB premix为美国应用生物***公司产品Fast Advanced MasterMix;所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液,缓冲液中含有Mg2+。
本发明还提供了以上所述用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒的使用方法,首先提取待检样品的基因组DNA,分别加入到各检测反应体系和质控反应体系,进行荧光定量PCR反应;另外设置非模板对照和各突变相应的阳性对照,与待检样品的基因组DNA进行同样的操作;根据Ct值分析检测结果;
首先需要满足JOE信号Ct值≤25,非模板对照的FAM信号不起线,阳性对照的FAM信号Ct值≤22;9<Ct质控≤18;然后按照△Ct=Ct检测-Ct质控判定:
含有RM1:M918T(c.2753T>C)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型,小于等于9为M918T(c.2753T>C)突变型阳性;
含有RM2:C634R(c.1900T>C)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型,小于等于9为C634R(c.1900T>C)突变型阳性;
含有RM3:C634G(c.1900T>G)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型,小于等于9为C634G(c.1900T>G)突变型阳性;
含有RM4:C634S(c.1900T>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型,小于等于9为C634S(c.1900T>A)突变型阳性;
含有RM5:C634F(c.1901G>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型,小于等于9为C634F(c.1901G>T)突变型阳性;
含有RM6:C634Y(c.1901G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型,小于等于9为C634Y(c.1901G>A)突变型阳性;
含有RM7:C634W(c.1902C>G)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型,小于等于7为C634W(c.1902C>G)突变型阳性;
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在上述7种检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值,所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
优选地,以上所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒的使用方法,荧光定量PCR反应的条件为:
95℃10min;
92℃15sec,58℃1min,共15个循环;
92℃15sec,60℃1min,共30个循环;在60℃时收集信号。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术,可以检测人类RET基因7种突变类型。其中,特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列;在此基础上,阻断探针与野生型序列特异性结合,有效抑制了野生型的非特异性扩增,进一步提高体系的特异性水平,从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。
(2)本发明建立了实时荧光PCR扩增反应体系实现对RET基因突变的快速检测;且操作简单,结果易读。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常,操作过程是否准确)。
(3)本方法灵敏度高,可实现50拷贝突变基因的稳定检出;特异性好,20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增,检测能力高达1%。
附图说明
图1为实施例1中内控(IC)实验结果;
图2为实施例1中非模板对照(NTC)实验结果;
图3为实施例1中阳性对照(STD)样本结果;
图4为实施例1中灵敏度(M918T检测孔)实验结果;
图5为实施例1中精密度(外控检测孔)实验结果;
图6为实施例2中阴性(野生型)样本实验结果;
图7为实施例2中阳性(C634W突变)样本实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、用于检测人类RET基因7种突变的检测试剂盒的引物和探针:
根据NCBI数据库公布的RET基因(NCBI Reference Sequence:NM_020975.4)野生型序列,以16号外显子M918T(RM1)突变位点,11号外显子C634R(RM2)、C634G(RM3)、C634S(RM4)、C634F(RM5)、C634Y(RM6)和C634W(RM7)突变位点为参考,设计特异性M918T突变引物和探针(见表2)、C634R突变引物和探针(见表3)、C634G突变引物和探针(见表4)、C634S突变引物和探针(见表5)、C634F突变引物和探针(见表6)、C634Y突变引物和探针(见表7)和C634W突变引物和探针(见表8)。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板,建立了实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系,实现对RET基因突变的高灵敏度和高特异性检测。
(1)用于人类RET基因M918T(RM1)突变检测的特异性引物和探针序列:
表2用于检测M918T(RM1)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
1 | RM1-F | CGTCGGATTCCAGTTAGATGAAC | 无 |
2 | RW1-R | CCACCCCAAGAGAGCAACAC | 无 |
3 | RW1-P | TCCCTTTTTGATCATATCT | 5’端FAM,3’端MGB |
4 | RW1-B | AGTTAAATGGATGGCAATTG | 5’端双脱氧修饰,3’端MGB |
其中,RM1-F为突变上游ARMS引物,与M918T(c.2753T>C)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;RW1-R为突变下游引物,与RET基因保守序列结合;RW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合;RW1-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针,能与M918T位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
(2)用于人类RET基因C634R(RM2)突变检测的特异性引物和探针序列:
表3用于检测C634R(RM2)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
5 | RM2-F | TTCACTGTGCGACGAGATGC | 无 |
11 | RW2-R | TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC | 无 |
12 | RW2-P | CTGTCCTCTTCTCCTTC | 5’端FAM,3’端MGB |
13 | RW2-B | ACGAGCTGTGCCGCA | 3’端双脱氧修饰,3’端MGB |
其中,RM2-F为突变上游ARMS引物,与C634R(c.1900T>C)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;RW2-R为突变下游引物,与RET基因保守序列结合;RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合;RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针,能与C634R位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
(3)用于人类RET基因C634G(RM3)突变检测的特异性引物和探针序列:
表4用于检测C634G(RM3)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
6 | RM3-F | TTACTGTGCGACGGGTTGG | 无 |
11 | RW2-R | TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC | 无 |
12 | RW2-P | CTGTCCTCTTCTCCTTC | 5’端FAM,3’端MGB |
13 | RW2-B | ACGAGCTGTGCCGCA | 3’端双脱氧修饰,3’端MGB |
其中,RM3-F为突变上游ARMS引物,与C634G(c.1900T>G)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;RW2-R为突变下游引物,与RET基因保守序列结合;RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合;RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针,能与C634G位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
(4)用于人类RET基因C634S(RM4)突变检测的特异性引物和探针序列:
表5用于检测C634S(RM4)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
7 | RM4-F | TCCAATGTGCGACGATCTGA | 无 |
11 | RW2-R | TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC | 无 |
12 | RW2-P | CTGTCCTCTTCTCCTTC | 5’端FAM,3’端MGB |
13 | RW2-B | ACGAGCTGTGCCGCA | 3’端双脱氧修饰,3’端MGB |
其中,RM4-F为突变上游ARMS引物,与C634S(c.1900T>A)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;RW2-R为突变下游引物,与RET基因保守序列结合;RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合;RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针,能与C634S位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
(5)用于人类RET基因C634F(RM5)突变检测的特异性引物和探针序列:
表6用于检测C634F(RM5)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
8 | RM5-F | AATGTGCGACGAGCGGTT | 无 |
11 | RW2-R | TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC | 无 |
12 | RW2-P | CTGTCCTCTTCTCCTTC | 5’端FAM,3’端MGB |
13 | RW2-B | ACGAGCTGTGCCGCA | 3’端双脱氧修饰,3’端MGB |
其中,RM5-F为突变上游ARMS引物,与C634F(c.1901G>T)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;RW2-R为突变下游引物,与RET基因保守序列结合;RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合;RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针,能与C634F位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
(6)用于人类RET基因C634Y(RM6)突变检测的特异性引物和探针序列:
表7用于检测C634Y(RM6)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
9 | RM6-F | TAACTGTGCGACGGGCTCTA | 无 |
11 | RW2-R | TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC | 无 |
12 | RW2-P | CTGTCCTCTTCTCCTTC | 5’端FAM,3’端MGB |
13 | RW2-B | ACGAGCTGTGCCGCA | 3’端双脱氧修饰,3’端MGB |
其中,RM6-F为突变上游ARMS引物,与C634Y(c.1901G>A)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;RW2-R为突变下游引物,与RET基因保守序列结合;RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合;RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针,能与C634Y位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
(7)用于人类RET基因C634W(RM7)突变检测的特异性引物和探针序列:
表8用于检测C634W(RM7)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
10 | RM7-F | ATGTGCGACGAACTGGGG | 无 |
11 | RW2-R | TGTGGGCAAACTTGTGGTAGC | 无 |
12 | RW2-P | CTGTCCTCTTCTCCTTC | 5’端FAM,3’端MGB |
13 | RW2-B | ACGAGCTGTGCCGCA | 3’端双脱氧修饰,3’端MGB |
其中,RM7-F为突变上游ARMS引物,与C634W(c.1902C>G)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;RW2-R为突变下游引物,与RET基因保守序列结合;RW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合;RW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针,能与C634W位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
2、质控引物(外控和内控)引物和探针
(1)用于人类RET基因突变检测样本质控的外控引物和探针序列:
根据NCBI数据库公布的RET基因(NCBI Reference Sequence:NM_020975.4)20号外显子保守序列,用Primer Premier 5和Primer Express 3.0生物信息学软件设计外控引物和探针(见表9)。以基因工程构建的外控质粒为模板,建立了实时荧光PCR外控(ExternalControl)检测体系,对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行监测。
表9用于样本质控的外控引物和探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
14 | RR-F | CAGGTTTGTTCTCAGGAGGGTAAG | 无 |
15 | RR-R | CGCAGGAGTAGACCATTAGGTTATT | 无 |
16 | RR-P | CCAGTGATGGGGAATT | 5’端FAM,3’端MGB |
其中,RR-F和RR-R为外控上下游引物,扩增RET基因保守序列(>gi|568815588:43128101-43128500);RR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合。
(2)用于实时荧光PCR扩增反应体系内部质控的内控引物和探针序列:
根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBI Reference Sequence:NC_001666.2)保守序列(non-human DNA),用Primer Premier 5和Primer Express 3.0生物信息学软件设计内控引物和探针(见表10)。以基因工程构建的内控质粒为模板,建立了实时荧光PCR内控(Internal Control)检测体系,对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。
表10用于内部质控的内控引物、探针组合
SEQIDNO: | 名称 | 序列(5’→3’) | 末端修饰 |
17 | IC-F | TCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG | 无 |
18 | IC-R | CAACGGGTTTACTAATAGGATGCC | 无 |
19 | IC-P | TCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC | 5’端JOE,3’端BHQ1 |
其中,IC-F和IC-R为内控上下游引物,扩增matK基因保守序列(位于>gi|11994090:c2400-2001);IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针,能与扩增片段结合。
3、本发明的检测人类RET基因7种突变的检测试剂盒
实时荧光PCR扩增反应体系设置:本发明方法用8孔实时荧光PCR扩增反应进行RET基因7种突变的检测。反应体系1~7(见表12)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系,反应体系8(见表12)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
试剂盒各管内组成成分如下:
表11试剂盒组成成分
其中,RM1质粒含有发生M918T(c.2753T>C)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43121771-43122170),RM2质粒含有发生C634R(c.1900T>C)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700),RM3质粒含有发生C634G(c.1900T>G)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700),RM4质粒含有发生C634S(c.1900T>A)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700),RM5质粒含有发生C634F(c.1901G>T)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700),RM6质粒含有发生C634Y(c.1901G>A)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700),RM7质粒含有发生C634W(c.1902C>G)碱基变化的RET基因片段(>gi|568815588:43114301-43114700);RR质粒(即外控质粒)含有RET基因保守序列(>gi|568815588:43128101-43128500);IC质粒(即内控质粒)含有matK基因保守序列(>gi|11994090:c2400-2001)。
反应体系组成如下:
表12实时荧光PCR扩增反应体系组成
注:AB premix全称Fast Advanced Master Mix,购自美国应用生物***公司;10×buffer(Mg2+Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。
PCR反应总体积25μL,含19μL的反应体系,1μL的IC模板和5μL的检测模板(阳性对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA),IC模板和检测模板可预混。
反应体系1用于人类RET基因M918T(RM1)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系2用于人类RET基因C634R(RM2)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系3用于人类RET基因C634G(RM3)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表4)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系4用于人类RET基因C634S(RM4)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表5)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系5用于人类RET基因C634F(RM5)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表6)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系6用于人类RET基因C634Y(RM6)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表7)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系7用于人类RET基因C634W(RM7)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表8)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系8用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合(见表9)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
4、试剂盒检测方法:
(1)获取待测样本基因组DNA
血液样本的提取使用宁波有成血液基因组DNA提取试剂盒(KR008F)。按说明书提取甲状腺髓样癌和多发性内分泌腺瘤2型患者全血基因组DNA,操作步骤简述如下:
取血液样本200μL到离心管,加入50μLProteinase K,涡旋震荡混匀(2s每次,震荡5次);加入250μL裂解液BL,涡旋震荡混匀,室温静置10min充***解细胞;加入200μL无水乙醇,涡旋振荡混匀;将上述溶液全部转移到DNA吸附柱中,13000rpm离心1min,弃收集管;将吸附柱置于新的2mL收集管中并加入500μL的洗涤液BWB1,13000rpm离心1min,弃滤液;加入500μL洗涤液BWB2,13000rpm离心1min,弃收集管;将吸附柱置于1.5mL的核酸酶污染的离心管中,室温静置10min或超净工作台中风干5min使乙醇彻底挥发;向吸附膜中央小心加入50-100μL洗脱液BE,室温静置5min;13000rpm离心1min,收集滤液,-20℃保存。
将抽提好的DNA样本,用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量,DNA的浓度要求≥10ng/μL,DNA的质量OD260/280在1.8~2.0之间。定量后,母液-20℃保存。
(2)实时荧光PCR扩增反应:
实时荧光PCR扩增反应体系设置:本发明方法用8孔实时荧光PCR扩增反应进行RET基因7种突变的检测。体系1-7(见表12)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系,体系8(见表12)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
实时荧光PCR扩增反应基本原理:上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE),3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前,检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近,由于荧光共振能量转移的作用,荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行,检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解,5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离,进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB(Minor GrooveBinder)基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合,进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针,MGB探针序列可设计得更短,特异性更强。
(1)在本发明实时荧光PCR突变检测体系中,对目的基因突变区域进行PCR扩增。其中,特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列;在此基础上,阻断探针与野生型序列特异性结合,有效抑制了野生型的非特异性扩增,进一步提高体系的特异性水平,从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中,对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。(3)在本发明实时荧光PCR内控检测体系中,对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常,操作过程是否准确)。
实时荧光PCR扩增反应:
将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L,pH8.0)稀释到2~10ng/μL作为模板,加入到实时荧光PCR扩增反应体系中(见表12)进行扩增。
实时荧光PCR扩增反应条件设置:
表13实时荧光PCR扩增反应条件
最优的,在Stage2阶段(15个循环),58℃的退火延伸温度,有利于突变模板的富集。在Stage3阶段(30个循环),60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。
(3)检测结果分析
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果:以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25,扩增正常),以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线,阳性对照FAM信号Ct值≤22,体系性能良好,结果有效);以外控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准(9<Ct质控≤18,Ct质控≤9,说明加入的基因组DNA浓度过高,应稀释后重新检测该样本;Ct质控>18或无扩增曲线,说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解,建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测),以待测样本突变检测孔与外控检测孔FAM信号的△Ct值(△Ct=Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表14)。
表14样本检测结果判定
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。
(4)试剂盒性能分析实验(灵敏度和精密度)
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。图1为IC检测结果,Ct内控≤25,符合要求;图2为NTC检测结果,反应体系1~8FAM均不起线,符合要求;图3为STD检测结果,反应体系1~8FAM信号均起线且Ct≤22,符合要求。
(1)灵敏度实验
将以现有基因工程技术合成的含有RET基因突变序列的7种重组质粒DNA干粉用TE(10mmol/L,pH8.0)复溶,定量后稀释。取1×103拷贝/μL的7种突变质粒DNA分别进行10倍稀释,稀释2个梯度,然后以3种浓度梯度(1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL和1×101拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板,进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高,10拷贝/μL突变基因即可检出。
(2)精密度实验
将以现有基因工程技术合成的含有RET基因突变序列的7种重组质粒DNA干粉用TE(10mmol/L,pH8.0)复溶,定量后稀释。以5×101拷贝/μL的7种突变质粒DNA为模板,进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定,CV<5%)。
实施例2
用本发明中人类RET基因7种突变检测试剂盒来检测临床采集的组织样本。
本实施例中收集临床病理诊断为甲状腺髓样癌和多发性内分泌腺瘤2型的患者血液样本,并从中提取基因组DNA。用RET基因7种突变检测试剂盒检测待测样本中RET基因突变状态。具体步骤如下:
(1)样本基因组DNA提取
血液样本的提取使用宁波有成血液基因组DNA提取试剂盒(KR008F),按说明书提取待测样本基因组DNA,将抽提好的DNA样本,用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量,DNA的浓度要求≥10ng/μL,DNA的质量OD260/280在1.8~2.0之间。将符合要求的基因组DNA用TE(10mmol/L,pH8.0)稀释到2~10ng/μL作为PCR模板,进行实时荧光PCR扩增反应。
(2)实时荧光PCR扩增反应
实时荧光PCR扩增反应条件见表13,按照人类RET基因7种突变检测试剂盒说明书进行样本检测。
(3)结果判定
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果:以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25,扩增正常),以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线,阳性对照FAM信号Ct值Ct≤22,体系性能良好,结果有效);以待测样本突变检测孔和外控检测孔FAM信号△Ct值(△Ct=Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表14)。
图6中,Ct质控=13.9,符合要求;突变检测孔FAM信号均未起线,显示样本检测结果为阴性。
图7中,Ct质控=12.9,符合要求;RM7突变检测孔FAM信号起线而RM1~RM6突变检测孔FAM信号均未起线,且Ct检测(RM7)=18.1,△Ct=5.2,显示样本检测结果为RM7(C634W)阳性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海吉力生物科技有限公司
<120> 用于检测人类RET基因7种突变的探针、引物及试剂盒
<130>
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtcggattc cagttagatg aac 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaccccaag agagcaacac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccctttttg atcatatct 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agttaaatgg atggcaattg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttcactgtgc gacgagatgc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttactgtgcg acgggttgg 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tccaatgtgc gacgatctga 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aatgtgcgac gagcggtt 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
taactgtgcg acgggctcta 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgtgcgacg aactgggg 18
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtgggcaaa cttgtggtag c 21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctgtcctctt ctccttc 17
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgagctgtg ccgca 15
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caggtttgtt ctcaggaggg taag 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgcaggagta gaccattagg ttatt 25
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccagtgatgg ggaatt 16
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcgtaaggaa tcaaatgctg gag 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caacgggttt actaatagga tgcc 24
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcgataccac agtccttgca actcccc 27
Claims (7)
1.用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针,其特征在于,核苷酸序列如下:
RM1:M918T突变
突变上游ARMS引物RM1-F:SEQ ID NO:1,
突变下游引物RW1-R:SEQ ID NO:2,
检测探针RW1-P:SEQ ID NO:3,
阻断探针RW1-B:SEQ ID NO:4;
RM2:C634R突变
突变上游ARMS引物RM2-F:SEQ ID NO:5,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM3:C634G突变
突变上游ARMS引物RM3-F:SEQ ID NO:6,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM4:C634S突变
突变上游ARMS引物RM4-F:SEQ ID NO:7,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM5:C634F突变
突变上游ARMS引物RM5-F:SEQ ID NO:8,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM6:C634Y突变
突变上游ARMS引物RM6-F:SEQ ID NO:9,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
RM7:C634W突变
突变上游ARMS引物RM7-F:SEQ ID NO:10,
突变下游引物RW2-R:SEQ ID NO:11,
检测探针RW2-P:SEQ ID NO:12,
阻断探针RW2-B:SEQ ID NO:13;
其中,所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团,3’端标记有淬灭基团;阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰,3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针,其特征在于,所述荧光基团为FAM,所述淬灭基团为MGB。
3.用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的用于检测人类RET基因7种突变的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,其特征在于,还包括外控引物和探针,核苷酸序列如下:
外控上游引物RR-F:SEQ ID NO:14,
外控下游引物RR-R:SEQ ID NO:15,
外控检测探针RR-P:SEQ ID NO:16,外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM,3’端标记有MGB。
5.根据权利要求4所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,其特征在于,还包括内控引物和探针,核苷酸序列如下:
内控上游引物IC-F:SEQ ID NO:17,
内控下游引物IC-R:SEQ ID NO:18,
内控检测探针IC-P:SEQ ID NO:19,内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE,3’端标记有BHQ1。
6.根据权利要求5所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,其特征在于,还包括阳性对照品和内控品,阳性对照品包括含有7种突变序列基因的质粒RM1质粒~RM7质粒、含有RET基因保守序列>gi|568815588:43128101-43128500段碱基的外控质粒和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒,其中RM1质粒含有RET基因>gi|568815588:43121771-43122170段碱基序列,RM2质粒~RM7质粒均含有RET基因>gi|568815588:43114301-43114700段碱基序列;内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
7.根据权利要求5所述的用于检测人类RET基因7种突变的试剂盒,其特征在于,试剂盒中的反应体系分为8个:
7个检测反应体系:每1个检测反应体系中包括用于检测人类RET基因一种突变的引物和探针,内控引物和探针,AB premix,10×buffer和ddH2O;
1个质控反应体系:包括外控引物和探针、内控引物和探针,AB premix,10×buffer和ddH2O;
所述AB premix为美国应用生物***公司产品Fast Advanced Master Mix;所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液,缓冲液中含有Mg2+。
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