CN114395627B - 一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒 - Google Patents

一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒，本发明提供了一种可以帮助临床医生根据结直肠癌患者肿瘤组织中PEX3基因mRNA的检测情况，确定结直肠癌患者是否适用氟尿嘧啶类药物治疗的试剂盒，为制定个性化治疗方案提供依据，本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，且价格低廉，主要应用于PEX3基因的检测，可以指导临床医生用于结直肠癌患者的阿帕替尼用药。

Description

一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球发病率排名第三的常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率与病死率均保持逐年上升的趋势。针对中国癌症的最新研究数据显示，每年约37.6万人被诊断为CRC，其发病率在所有的恶性肿瘤中排名第5位；每年约19.1万人死于CRC，其病死率在所有的恶性肿瘤中排名也是第5位。
目前，针对结直肠癌治疗的化学药物种类繁多，有研究发现，阿帕替尼对晚期癌有较好临床疗效。阿帕替尼可高度选择性竞争细胞内血管内皮生长因子受体2的ATP结合位点，阻断下游信号转导，抑制肿瘤组织新生血管生成。阿帕替尼抑制肿瘤新生血管，被批准用于晚期胃癌或胃食管结合部腺癌三线及以上的治疗，该药物在其他多种肿瘤中也显示出较好的抗肿瘤活性，其在结直肠癌中的应用尚处于初步探索阶段。
发明内容
本研究团队在前期研究中发现，结肠癌及正常结肠组织中PEX3的mRNA表达情况不同，Peroxisomal Biogenesis Factor 3(PEX3)的mRNA低表达可能在结肠癌的发生发展中起重要作用。PEX3基因的表达量与阿帕替尼药物敏感性和/或耐药性有很高的关联性，PEX3基因表达量高，则结直肠癌患者对阿帕替尼药物敏感性低，PEX3基因表达量低，则对阿帕替尼药物敏感性高。因此，PEX3基因有望成为结直肠癌诊断和治疗的新靶点。
本发明采用的是ΔCt法，即通过样本的PEX3基因和内参基因mRNA的Ct比较，来对PEX3基因表达量进行检测。Ct值的大小与检测物质的浓度成相关性，Ct值越小其检测物的浓度越高，Ct值越大则该检测物的浓度越小，所以Ct值的大小在上也可以体现出被检测样本的表达多少情况。一般情况下内参基因的表达量在各组织和细胞中是相对稳定的，常用作基因检测的参照物，可以矫正上样误差及操作误差，提升结果的准确性。本发明的内参基因的表达量是恒定的，而PEX3基因表达量则存在个体差异，通过比较二者的表达量的差值即可反应出样本中PEX3基因表达量的高低。
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒，开发用于PEX3基因检测的试剂盒有重要的临床意义。
本发明的发明目的是提供检测Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因的产品在制备评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
检测Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因的产品在制备评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因GAPDH的mRNA产品。
优选地，所述试剂盒检测Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因的mRNA和内参基因GAPDH的mRNA。
优选地，所述试剂盒为荧光定量试剂，检测Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因的mRNA的Ct值和内参基因GAPDH的mRNA的Ct值。
当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)≤3时说明该样本对阿帕替尼药物敏感性低；当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)>3时则说明该样本对阿帕替尼药物敏感性高，其中Ct(PEX3)为Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因的mRNA的Ct值，Ct(内参)为内参基因GAPDH的mRNA的Ct值。
优选地，所示评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性为评估阿帕替尼治疗结直肠癌的敏感性和/或耐药性。
优选地，所述检测Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因的产品为PeroxisomalBiogenesis Factor 3基因mRNA的检测试剂盒。
更优选地，所述Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因mRNA的检测试剂盒含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3的探针。
更优选地，所述Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因mRNA的检测试剂盒还含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6的探针。
更优选地，所述探针的5’端标记FAM、VIC、HEX、或CY5荧光基团中的任何一种；
更优选地，所述探针的3’标记有淬灭基团BHQ1、BHQ2的任何一种。
更优选地，所述Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因mRNA的检测试剂盒还含有阴性质控品和/或阳性质控品。
更优选地，所述Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因mRNA的检测试剂盒还含有PCR buffer、逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动Taq酶、和/或dNTPs。
进一步本发明提供一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒，该试剂盒是基于CT值比较法对Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因和内参基因GAPDH的mRNA进行检测的荧光定量PCR试剂盒，含有Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因和内参基因GAPDH的mRNA的Ct值。
优选地，其含有以下检测Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因和内参基因GAPDH的mRNA引物和探针。
更优选地，含有以下引物和探针
PEX3基因上游引物：5’-GACCTGCAACATGGTAACTCT-3’(SEQ ID NO.1)
PEX3基因下游引物：5’-CACTTGCTCCATTGTCAACA-3’(SEQ ID NO.2)
PEX3基因探针：5’-FAM-ACTGCAAACTGAATGGATCTGTCCG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)
GAPDH内参基因上游引物：5’-AAAACCTGCCAAATATGATGACA-3’(SEQ ID NO.4)，
GAPDH内参基因下游引物：5’-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3’(SEQ ID NO.5)，
GAPDH内参基因探针：5’-VIC-CAGTGTAGCCCAGGATGCCCTT-BHQ1-3’(SEQ ID NO.6)；
还含有PCR buffer、逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动Taq酶、dNTPs、阴性质控品、阳性质控品，
其中，阳性质控品为Ct(目的)-Ct(内参)≤3的结直肠癌组织样本RNA；
阴性质控品为Ct(目的)-Ct(内参)>3的结直肠癌组织样本RNA。
其使用方法为：(1)试剂准备：PCR反应液18μl、酶混合液2μl，充分混匀后备用，
其中PCR反应液由表1中的引物(SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.4～5)、探针(SEQID NO.3和SEQ ID NO.6)和PCR buffer组成，其中引物的扩增体系终浓度为0.2μmol/L，探针的扩增体系终浓度为0.1μmol/L，PCR buffer终浓度为1×；
酶混合液由逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动Taq酶和dNTPs组成，其中逆转录酶的反应终浓度为2.0U，RNA酶抑制剂的反应终浓度为0.5U，热启动Taq酶的反应终浓度为2.0U，dNTPs的反应终浓度为0.4mM。
(2)加样：向PCR反应管中，分别加入阴性质控品5μl、阳性质控品5μl和待测样品(结直肠癌组织样本)RNA 5μl，盖紧管盖，放入仪器样品槽，
(3)PCR检测：将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，设置反应程序：
注：*表示收集荧光信号
3、结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amplification Plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：2-6e+3。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
4、结果判读
当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)≤3时说明该样本对阿帕替尼药物敏感性低；当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)>3时则说明该样本对阿帕替尼药物敏感性高。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种可以帮助临床医生根据结直肠癌患者肿瘤组织中PEX3基因mRNA的检测情况，确定结直肠癌患者是否适用氟尿嘧啶类药物治疗的试剂盒，为制定个性化治疗方案提供依据，本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，且价格低廉，主要应用于PEX3基因的检测，可以指导临床医生用于结直肠癌患者的阿帕替尼用药。
附图说明
图1为实施例1的阴性质控品扩增曲线图。
图2为实施例1的阳性质控品扩增曲线图。
图3为实施例3的PEX3基因标准品的扩增曲线图。
图4为实施例3的内参基因标准品的扩增曲线图。
图5为实施例3的PEX3基因标准曲线图。
图6为实施例3的内参基因标准曲线图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种检测的PEX3基因的方法
1、引物设计
根据GenBank中登录的Peroxisomal Biogenesis Factor 3(PEX3，NCBI：NM_003630.3)基因和内参基因(GAPDH，NCBI：NM_001256799.3)序列，设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定，引物探针序列见表1。
表1：
2、PEX3基因的实时荧光定量PCR扩增及检测
(1)试剂准备：PCR反应液18μl、酶混合液2μl，充分混匀后备用，
其中PCR反应液由表1中的引物(SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.4～5)、探针(SEQID NO.3和SEQ ID NO.6)和PCR buffer组成，其中引物的扩增体系终浓度为0.2μmol/L，探针的扩增体系终浓度为0.1μmol/L，PCR buffer终浓度为1×；
酶混合液由逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动Taq酶和dNTPs组成，其中逆转录酶的反应终浓度为2.0U，RNA酶抑制剂的反应终浓度为0.5U，热启动Taq酶的反应终浓度为2.0U，dNTPs的反应终浓度为0.4mM。
(2)加样：向PCR反应管中，分别加入阴性质控品和阳性质控品各5μl，盖紧管盖，放入仪器样品槽，
阳性质控品为Ct(目的)-Ct(内参)>3的结直肠癌组织样本RNA，
阴性质控品为Ct(目的)-Ct(内参)≤3的结直肠癌组织样本RNA。
(3)PCR检测：将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，设置反应程序：
注：*表示收集荧光信号
3、结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amplification Plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：2-6e+3。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
4、实验结果
阴性质控品的FAM和VIC通道的扩增曲线均为明显S型曲线(见图1)，且阴性质控品的Ct(PEX3)-Ct(内参)≤3；阳性质控品的FAM和VIC通道的扩增曲线均为明显S型曲线(见附图2)，且阳性质控品的Ct(PEX3)-Ct(内参)>3。
当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)≤3时说明该样本对阿帕替尼药物敏感性低；当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)>3时则说明该样本对阿帕替尼药物敏感性高。
实施例2一种检测的PEX3基因的试剂盒
一、组成
PEX3 PCR反应液1管，由引物、探针和PCR buffer组成，其中引物的扩增体系终浓度为0.2μmol/L，探针的扩增体系终浓度为0.1μmol/L，PCR buffer终浓度为1×，具体引物探针如下：
PEX3基因上游引物：5’-GACCTGCAACATGGTAACTCT-3’(SEQ ID NO.1)
PEX3基因下游引物：5’-CACTTGCTCCATTGTCAACA-3’(SEQ ID NO.2)
PEX3基因探针：5’-FAM-ACTGCAAACTGAATGGATCTGTCCG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)
内参基因上游引物：5’-AAAACCTGCCAAATATGATGACA-3’(SEQ ID NO.4)，
内参基因下游引物：5’-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3’(SEQ ID NO.5)，
内参基因探针：5’-VIC-CAGTGTAGCCCAGGATGCCCTT-BHQ1-3’(SEQ ID NO.6)；
PEX3酶混合液1管，由逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动Taq酶和dNTPs组成，其中逆转录酶的反应终浓度为2.0U，RNA酶抑制剂的反应终浓度为0.5U，热启动Taq酶的反应终浓度为2.0U，dNTPs的反应终浓度为0.4mM。
阳性质控品1管：为Ct(目的)-Ct(内参)>3的结直肠癌组织样本RNA；
阴性质控品1管：为Ct(目的)-Ct(内参)≤3的结直肠癌组织样本RNA。
二、使用方法
(1)试剂准备：PCR反应液18μl、酶混合液2μl，充分混匀后备用，
(2)加样：向PCR反应管中，分别加入阴性质控品5μl、阳性质控品各5μl和待测样品(结直肠癌组织)RNA 5μl盖紧管盖，放入仪器样品槽。
(3)PCR检测：将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，设置反应程序：
注：*表示收集荧光信号
3、结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amplification Plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：2-6e+3。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
4、结果判读
当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)≤3时说明该样本对阿帕替尼药物敏感性低；当样本的检测值Ct(PEX3)-Ct(内参)>3时则说明该样本对阿帕替尼药物敏感性高。
实施例3检测的PEX3基因的试剂盒对PEX3基因和内参基因扩增效率检测
一、实验方法
分别选取PEX3基因和内参基因浓度较高的结直肠癌组织样本的RNA，分别10倍梯度稀释成5个梯度制备成定量标准品作为模板，使用实施例2的试剂盒进行检测，同时用阴，阳性质控品进行质量控制。
二、实验结果
阴性质控品的FAM和VIC通道的扩增曲线均为明显S型曲线，且阴性质控品的Ct(目的)-Ct(内参)≤3；阳性质控品的FAM和VIC通道的扩增曲线均为明显S型曲线，且阳性质控品的Ct(目的)-Ct(内参)>3。阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。
PEX3基因定量标准品的FAM检测通道扩增曲线成S型(见附图3)，其标准曲线的相关系数分别为0.999，斜率为-3.47(见附图5)，经计算PEX3基因扩增效率为0.94，内参基因定量标准品的VIC检测通道扩增曲线成S型(见附图4)，其标准曲线的相关系数为0.998，斜率为-3.57(见附图6)，经计算内参的扩增效率为0.91。
本试剂盒中PEX3基因和内参基因的扩增效率基本一致，且扩增曲线的相关系数均大于0.98，说明可以用Ct值比较法(ΔCt法)，本试剂盒的设计是可靠的。
实施例4阿帕替尼治疗耐药性样本检测
一、实验方法
选取临床上阿帕替尼耐药的结直肠癌组织样本13例，对所有样本进行RNA提取，使用实施例2的试剂盒进行检测，同时用阴、阳性质控品进行质量控制。
二、实验结果
阴性质控品的FAM和VIC通道的扩增曲线均为明显S型曲线，且阴性质控品的Ct(PEX3)-Ct(内参)≤3；阳性质控品的FAM和VIC通道的扩增曲线均为明显S型曲线，且阳性质控品的Ct(PEX3)-Ct(内参)>3。阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。
由13例待检标本的检测结果可知，所有阿帕替尼治疗耐药的样本检测的Ct(目的)-Ct(内参)≤3，详细结果见表2。表2
结果显示，13例阿帕替尼治疗耐药标本的Ct(PEX3)-Ct(内参)均小于3，检测结果与临床结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测特异性是可行的，具有良好的特异性。Ct(PEX3)-Ct(内参)均小于3表示PEX3基因mRNA的检测Ct较小，样本中的PEX3 mRNA浓度较高，已接近或高于内参mRNA的表达量，进一步说明此13例样本的PEX3 mRNA表达量相对较高。
实施例5阿帕替尼治疗敏感性样本检测
一、实验方法
选取临床上阿帕替尼治疗敏感的结直肠癌组织样本15例，对所有样本进行RNA提取，使用实施例2的试剂盒进行检测，同时用阴、阳性质控品进行质量控制。
二、实验结果
阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。15例阿帕替尼治疗敏感的结直肠癌阳性组织样本Ct(PEX3)-Ct(内参)均大于3，其检测结果如表3，检测结果与临床结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测特异性是可行的，具有良好的特异性。
表3
结果显示，15例阿帕替尼治疗敏感标本的Ct(PEX3)-Ct(内参)均大于3，检测结果与临床结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测特异性是可行的，具有良好的灵敏度。
Ct(PEX3)-Ct(内参)均大于3表示PEX3基因mRNA的检测Ct较大，样本中的PEX3mRNA浓度较低，已远低于内参mRNA的表达量，说明此15例样本的PEX3 mRNA表达量相对较低。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 一种评估阿帕替尼治疗敏感性和/或耐药性的试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacctgcaac atggtaactc t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacttgctcc attgtcaaca 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actgcaaact gaatggatct gtccg 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaacctgcc aaatatgatg aca 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaagtcaga ggagaccacc 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtgtagcc caggatgccc tt 22

Claims (5)

1.定量检测Peroxisomal Biogenesis Factor 3基因mRNA的表达水平的产品在制备评估阿帕替尼治疗结直肠癌的敏感性和/或耐药性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因GAPDH的mRNA产品，所述试剂盒含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3的探针，还含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6的探针。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述探针的5’端标记FAM、VIC、HEX或CY5荧光基团中的任何一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述探针的3’端标记有淬灭基团BHQ1或BHQ2的任何一种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还含有阴性质控品和/或阳性质控品。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还含有PCR buffer、逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动Taq酶和/或dNTPs。
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