CN105002283A - 一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物及试剂盒，该组合物包括内控检测引物对、内控检测探针，点突变检测引物对和点突变检测探针，其中内控检测引物对如SEQIDNO:9～10所示；内控检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的SEQIDNO:11所示序列；点突变检测引物对如SEQIDNO:1～2，或者SEQIDNO:3～4所示；点突变检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的SEQIDNO:5所示序列。还包括肽核酸序列和外控检测组合物。本发明的检测引物和探针可以快速、灵敏、有效地检测出人4号染色体外显子17上D816V点突变。

Description

一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于基因突变检测技术领域，特别涉及一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物及试剂盒。
背景技术
c-kit基因位于人染色体4q12-13，其编码产物是干细胞生长因子受体，属于Ⅲ型酪氨酸激酶，它的胞外区有5个或3个免疫球蛋白的结构域，能与配体SCF结合使kit发生二聚化，二聚化后kit胞内的激酶区自磷酸化从而激活下游信号传导，从而调节基因表达，控制细胞生长、增殖和分化。研究发现胃肠道间质瘤(GIST)主要是由于原癌基因c-kit突变导致酪氨酸激酶持续活化，引起突变细胞增殖失控所形成的。
瑞士诺华公司开发的药物小分子酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(格列卫)对GIST治疗明显效果，但c-kit基因突变情况与伊马替尼的治疗反应密切相关，该基因大多数位点突变的GIST患者都对伊马替尼敏感，但17外显子的D816V位点突变的患者对伊马替尼耐药，因此，GIST患者接受靶向药物伊马替尼治疗前，应先进行c-kit基因D816位点突变检测，用于辅助医生预测伊马替尼受益情况。
目前，针对c-kit基因D816V突变的检测方法主要有直接测序法和高分辨率熔解曲线法。直接测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及。北京佰康安公司开发了一种基于荧光PCR法的人c-kit基因D816V突变检测试剂盒，可以体外检测D816V位点突变情况，但由于未知的原因也仅限于科研使用，无法大面积推广。
因此，如何快速准确的检测这些与药物反应性有关的c-kit基因突变，就成为人们亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，克服现有技术检测能力的不足，本发明提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高精确度的用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物。
本发明的一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物，包括外控检测引物对和外控检测探针，内控检测引物对和内控检测探针，点突变检测引物对和点突变检测探针，其中
外控检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6～7所示；
外控检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
内控检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；
内控检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的如SEQ ID NO:11所示核苷酸序列；
点突变检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2，或者SEQ ID NO:3～4所示；
点突变检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
FAM(6-羧基荧光素)为荧光基团，BHQ1为淬灭基团，BHQ1是BiosearchTechnologies公司的黑洞淬灭基团之一。
SEQ ID NO.1：5’-TCCTTACTCATGGTCGGATCAC-3’；
SEQ ID NO.2：5’-GACGTTCACAGAGACTTGTCAGCCA-3’；
SEQ ID NO.3：5’-GGCATAATTAGAATCATTCTTGACGA-3’；
SEQ ID NO.4：5’-GCAGAGAAAGGGTACTCAC-3’；
SEQ ID NO.5：5’-FAM/CAAGACAATGAGTAGGGAGGTTATTTCT/BHQ1-3’；
SEQ ID NO.6：5’-GCGACTGTCAAGCAGAGAATGG-3’；
SEQ ID NO.7：5’-CCGTGTATTCACAGAGACTTGG-3’；
SEQ ID NO.8：5’-TTCTTGATGTCTCTGGCT-3’；
SEQ ID NO.9：TCCTTGTTGGCTTTCGGAGATATTTTG；
SEQ ID NO.10：TCCTTGTTGGCTTTCGGTTCCTTG；
SEQ ID NO.11：FAM-/CTTCTGGGATCCAGAGTCCC/-BHQ1。
内控信号为JOE基因，是通过内控检测引物和内控检测探针检测出来的，点突变检测引物和点突变检测探针用于检测样本中基因突变位点。通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果。
内控信号用于监测待检样本是否漏加：如果没有漏加，内控信号检测结果会出现曲线，如果漏加，内控信号检测结果就无曲线；FAM用于突变检测信号：突变检测信号用于检测待检样本是否存在突变位点。
突变信号的大小不仅受突变率的影响还会受样本量的影响，所以单独通过突变信号Ct值大小定性还不够准确。外控组合物可以检测样本量，在Ct值上体现，通过外控Ct值减去突变Ct值得到的差值。差值就是突变率的体现：突变率高差值就小，突变率小差值就大。当差值大到超过11时，样本就为阴性了。检测的差值小于11的都为阳性。
本发明利用ARMS技术(amplification refractory mutation system)，设计点突变检测引物的3’端序列与野生型片段不匹配，仅和突变型片段匹配，从而专一地扩增突变型DNA片段，同时结合荧光定量PCR技术，使得检测灵敏度和特异性都有了提高，最低可以检测到10ng基因组背景下突变含量为1％的DNA样本。
优选地，上述用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物，还包括肽核酸(PNA)，肽核酸的序列如SEQ ID NO:8所示。
PNA是一种肽核酸，与目的基因特异性结合后形成固定结构阻止核酸的扩增，本发明设计的肽核酸序列可以与野生型片段牢固结合防止野生型样本发生特异性扩增。可以进一步增加检测准确度。
本发明还提供一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR试剂盒，其包括以上任意一种所述的用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物。
优选地，上述用于检测人c-kit基因突变的QPCR试剂盒，外控QPCR组合物为单独的反应液，需要独立包装。
优选地，以上所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+和PCR反应缓冲液。
优选地，以上所述试剂盒，试剂盒中各成分的用量为：每30～35μL PCR反应体系中含有Mg2+2.0～5.0mmol，dNTPs 0.2～0.8mmol，每一条引物均为：0.1～1.0μmol，探针0.1～1.0μmol，Taq酶1～2Units。
本发明还提供了一种以上任一所述用于检测人c-kit基因突变的QPCR试剂盒的使用方法，PCR反应条件为：
第一阶段：94℃5min；
第二阶段：94℃20s，52℃30s，15个循环；
第三阶段:94℃20s，52℃40s，31个循环；收集FAM和内控信号JOE，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果；
内控信号用于监测待检样本是否漏加：如果没有漏加，内控信号检测结果会出现曲线，如果漏加，内控信号检测结果就无曲线；
FAM用于突变检测信号，也用于外控检测信号：突变检测信号是用于检测待检样本是否存在突变位点；外控检测信号是待检样本量的监测，便于样本定性分析；
在内控信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，CT值小于28，且突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值小于11为阳性；CT值大于28，且突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值大于11为阴性；当结果判定标准不能同时满足时以突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值的判断为准。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明经过大量试验、研究和分析成功地筛选出能够用于快速、灵敏、有效地检测c-kit基因基因突变的引物组合和探针组合，并利用这些引物和探针开发出具有这样优点的用于检测c-kit基因基因突变的引物组合物、探针组合、试剂盒和方法。利用这些引物和探针可以检测出人4号染色体外显子17上D816V点突变。
本发明的检测人类c-kit基因D816位点突变的QPCR组合物及检测方法，不包括对待测样品处理和模板提取的步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的段片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
本发明运用ARMS引物+Taqman探针+PNA区分野生型和突变型基因，与测序技术相比：(1)操作简单，不用做复杂的产物处理就可以直接得到结果(2)灵敏度高，1～10拷贝的目标基因即可检出；(3)特异性强，100ng野生型基因组DNA不会有非特异性信号；(4)选择性能力强，可以在50ng野生型基因组DNA背景下，检出0.5％的突变型DNA；(5)检测速度快，整个检测过程只需要87分钟。
具体实施方式
图1为实施例2中待检样品检测结果判读方法展示图；
图2为实施例2阳性对照特异性检测结果展示图；
图3为实施例2中用本发明检测方法检测待检样品的灵敏度和最低检测线结果展示图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：临床样本DNA的提取
本实施例是从非小细胞肺癌患者肺部石蜡包埋组织切片中提取DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用Qiagen公司的QIAamp石蜡包埋组织提取试剂盒，具体详述如下：
1、实验前的准备
(1)将水浴锅调到56℃。
(2)将QIAamp试剂盒中的Buffer ATL和Buffer AL于56℃放置，直到沉淀溶解。
2、样本的处理
(1)将石蜡切片上多余的石蜡切去，将切片切成合适的尺寸，装在石蜡切片机上。
(2)将卡尺调到10μm，然后切蜡块，直到切下的切片上明显的看到均匀的组织。
(3)去掉最初的5片，从第6片开始，装入1.5mL的EP管中，每管4片，然后编号。
3、DNA提取
(1)在样本中加入1mL二甲苯，盖上盖子，轻柔的旋转颠倒混匀，室温下14000rpm离心3min。
(2)用移液器吸去上清，加入1mL无水乙醇，盖上盖子，轻柔的旋转颠倒混匀，室温下14000rpm离心3min。
(3)用移液器吸尽上清，将盖子打开，在56℃放置10min。
(4)加入180μL Buffer ATL和20μL蛋白酶K，盖上盖子，旋涡混匀，于56℃水浴1h。
(5)从水浴锅中拿出样本，轻柔的旋转颠倒混匀，在干式恒温仪上90℃放置1h。
(6)用迷你离心机离心1min，使管盖上的液滴落下。
(7)加入100mg/mL的RNase A 2μL，旋涡混匀后室温放置2min。
(8)加入200μL Buffer AL和200μL无水乙醇，立即旋涡混匀。
(9)用迷你离心机离心1min，使管盖上的液滴落下。
(10)将离心管中的液体加入到吸附柱中，注意不要吸到沉淀。盖上盖子，12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2mL的收集管上。
(11)加入500μL Buffer AW 1，盖上盖子，12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2mL的收集管上。
(12)加入500μL Buffer AW 2，盖上盖子12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2mL的收集管上。
(13)再12000rpm离心2min，彻底去除乙醇。
(14)将吸附柱套入一个干净的1.5mL的EP管中，打开盖子，在膜中央加入50μL Buffer ATE。
(15)盖上盖子，在56℃水浴10min。然后12000rpm离心2min。流出物即为提取的DNA。
4、定量
将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，调整DNA浓度到10ng/μL。
实施例2：实时荧光PCR法扩增临床样本DNA
本实施例为采用本发明所提供的引物、探针按照表1的配方配制突变检测反应液和外控检测反应液。反应液配好混匀后分装到8联PCR反应条中，奇数孔分装突变检测反应液，偶数孔分装外控检测反应液。将实施例1所提取的DNA样品作为反应样本。
表1 PCR检测反应液配制
检测方法如下：
(1)提取好的DNA样本用紫外分光光度计检测浓度，然后将样本稀释到5ng/μL～20ng/μL之间混匀，取15μLDNA样本稀释液与1.5μL Taq聚合酶混匀。
(2)取15μL的纯水(空白·对照)与1.5μL Taq聚合酶混匀。
(3)取阳性对照(阳性质粒模板，购于南京金斯瑞生物科技有限公司)15μL与1.5μL Taq聚合酶混匀。
(4)将上述混有Taq聚合酶的模板加入到8联PCR反应条中，每个模板要加入到一个奇数孔和与奇数孔连续的一个偶数孔，每一个突变检测孔和一个外控检测孔为一个样本检测组，每孔加入5μL。每次实验要加入空白对照和阳性对照。
(5)将加好模板的8联PCR反应条放入实时定量PCR仪中。
(6)设置PCR程序：
第一阶段：94℃4min；
第二阶段：94℃20s，52℃30s，15个循环；
第三阶段：94℃20s，52℃40s，31个循环；
信号收集：第三阶段52℃时收集FAM和JOE信号。
(7)PCR反应程序运行完后，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测上样的DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(CT值大于18)；突变检测信号和外控检测信号都是FAM，用于检测样本C-KIT基因是否存在D816V突变。存在突变是阳性样本，不存在是阴性样本；在内控信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，CT值小于28，且突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值小于11为阳性；CT值大于28，且突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值大于11为阴性，当结果判定标准不能同时满足时以突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值的判断为准。
检测结果参见图1和图2，图1中显示，突变信号Ct值为16.5，外控信号Ct值为14.5，二者差值为2，小于11，表明检测样本为阳性样本。图2为阳性对照检测结果，阳性对照是强阳性样本，Ct值很小，阴性对照是水，无信号值。表明本发明的方法检测结果准确性高。
图3是灵敏度和最低检测限结果，图中显示，最低检测限可达1％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  武汉海吉力生物科技有限公司
 
<120>  一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物及试剂盒
 
<130> 
 
<160>  11   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
tccttactca tggtcggatc ac                                              22
 
 
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gacgttcaca gagacttgtc agcca                                           25
 
 
<210>  3
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
ggcataatta gaatcattct tgacga                                          26
 
 
<210>  4
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gcagagaaag ggtactcac                                                  19
 
 
<210>  5
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
caagacaatg agtagggagg ttatttct                                        28
 
 
<210>  6
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
gcgactgtca agcagagaat gg                                              22
 
 
<210>  7
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
ccgtgtattc acagagactt gg                                              22
 
 
<210>  8
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
ttcttgatgt ctctggct                                                   18
 
 
<210>  9
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
tccttgttgg ctttcggaga tattttg                                         27
 
 
<210>  10
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  10
tccttgttgg ctttcggttc cttg                                            24
 
 
<210>  11
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  11
cttctgggat ccagagtccc                                                 20
 

Claims (6)

1.一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物，其特征在于，包括外控检测引物对和外控检测探针，内控检测引物对和内控检测探针，点突变检测引物对和点突变检测探针，其中
外控检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6～7所示；
外控检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
内控检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；
内控检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的如SEQ ID NO:11所示核苷酸序列；
点突变检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2，或者SEQ ID NO:3～4所示；
点突变检测探针为5’端连接FAM并且3’端连接BHQ1的如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物，其特征在于，还包括肽核酸，肽核酸的序列如SEQ ID NO:8所示。
3.一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的QPCR组合物。
4.根据权利要求3所述的用于检测人c-kit基因突变的QPCR试剂盒，其特征在于，还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求4所述的用于检测人c-kit基因突变的QPCR试剂盒，其特征在于，试剂盒中各成分的用量为：每30～35μL PCR反应体系中含有Mg2+2.0～5.0mmol，dNTPs 0.2～0.8mmol，每一条引物均为：0.1～1.0μmol，探针0.1～1.0μmol，Taq酶1～2Units。
6.权利要求3～5任一所述用于检测人c-kit基因突变的QPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，PCR反应条件为：
第一阶段：94℃5min；
第二阶段：94℃20s，52℃30s，15个循环；
第三阶段:94℃20s，52℃40s，31个循环；收集FAM和内控信号JOE，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果；
内控信号用于监测待检样本是否漏加：如果没有漏加，内控信号会检测结果会出现曲线，如果漏加，内控信号检测结果就无曲线；
FAM用于突变检测信号，也用于外控检测信号：突变检测信号是用于检测待检样本是否存在突变位点；外控检测信号是待检样本量的监测，便于样本定性分析；
在内控信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，CT值小于28，且突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值小于11为阳性；CT值大于28，且突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值大于11为阴性；当结果判定标准不能同时满足时以突变检测信号Ct值与外控检测信号Ct值的差值的判断为准。
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