CN107177682A - 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于BRAF V600E基因突变的试剂盒,试剂盒包括PCR反应缓冲液、引物探针混合液、酶系1、阳性对照、阴性对照。引物探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针、质控基因和内控检测引物探针,突变和质控探针5’端标记FAM荧光素,3’端标记MGB荧光素;内控5’端标记HEX荧光素,3’端标记BHQ1荧光素。质控基因选择是人类BRAF V600E基因相对保守的区段,内控选择的是人β‑aCtin保守基因,双控体系共同用于监控血浆样本DNA质量和PCR反应过程。与现有技术相比:利用本发明所提供的引物、探针和扩增体系的试剂盒检测灵敏度高,可检测突变含量低至0.1%的标本;检测准确率高,采用双控检测体系,保证检测结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域,尤其涉及的是用于BRAF V600E基因突变的试剂盒及检测方法。
背景技术
目前,肺癌己成为全球癌症死亡的首要原因,全球每年新发病例150万,严重威胁人类健康。在肺癌患者中,非小细胞肺癌约(NSCLC)占80%,且就诊时80%己失去手术或放射治疗最佳机会,致使其长期生存率低,疗效令人堪忧。IIIB/IV期非小细胞肺癌2年生存率仅10%-20%,中位生存时间仅10-12月。因此,人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率,其中以分子靶向治疗为代表的新治疗方法,为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望。
甲状腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。2010年甲状腺癌的发病率均居所有女性恶性肿瘤的前十位。随着人们生活方式、饮食结构的改变,平均寿命的提高,甲状腺癌的发病率可能还将进一步上升。在常规健康体验中,有很多人会被查出甲状腺结节,“良性还是恶性?”是大家最关心的问题。目前,B超引导下穿刺涂片检查是鉴别结节良恶性的主要手段。但受多种因素的影响,不少结节依靠穿刺涂片检查仍无法定性。
有一种叫做BRAF的原癌基因,该基因的突变与多种肿瘤的发生有关,最常见于甲状腺***状癌和皮肤黑色素瘤。***状癌约占所有甲状腺癌的85%以上。发现并鉴定BRAF突变是近年来甲状腺癌研究领域的重大进展。一般认为,与没有BRAF突变的甲状腺癌相比,检出BRAF突变的甲状腺癌恶性程度更高,转移和复发的风险也更大。
突变扩增阻滞***(amplification refraCtory mutation system,ARMS)也叫等位基因特异性PCR,该法是在PCR基础上发展而成的,是一种直接用于点突变分析的PCR技术。其依据的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′外切酶活性,因此对于3′末端错配的引物以低于正常末端配对引物的速度延伸,当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时,扩增反应终止。
BRAF基因是EGFR信号传导通路重要成员,参与和调控细胞的增值分化和增长全过程。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变,突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起。因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA,所以对体细胞突变检测需要较高的特异性,而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限,不能完全满足临床需要。特异性探针法如以ScorpionsARMS为代表的英国DxS和中国厦门Adx的BRAF V600E检测试剂盒虽然检测灵敏度高,但其检测费用较高,不适合国内NSCLC患者的常规检测和筛查,因此,临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、灵敏度高的检测BRAF V600E基因突变的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的检测BRAF V600E基因突变的试剂盒成本过高的不足,提供了一种用于BRAF V600E基因突变的试剂盒,本发明的另一目的在于,提供一种用于BRAF V600E基因突变的检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
用于BRAF V600E基因突变的试剂盒,其特征在于:包括BRAF V600E基因突变检测的特异引物和探针,其特异引物与探针包括如下序列:
优选的,所述的探针5’端FAM荧光素,3’端标记MGB猝灭荧光素。
优选的,所述的试剂盒还包括BRAF V600E突变及BRAF野生型PCR反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和DEPC水。
优选的,还应包括可用于血清游离DNA样本、组织样本或穿刺样本的BRAF V600E基因突变的检测。
作为优选,还应包括如下扩增体系:
一种BRAF V600E基因突变的检测方法,所述的方法包含以下步骤:
(1)样本DNA的提取
血清游离DNA提取:推荐使用Sigma公司的GenEluteTMPlasma/Serum Cell-FreeCirculating DNA Purification Midi Kit。
组织样本DNA提取:推荐使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(货号:56404)
(2)PCR反应体系的配制
在试剂配制室按照试剂盒说明书要求进行配制,PCR反应液16ul,酶系1
2ul、引物探针混合液2ul,模板DNA5ul,阴性对照和质控视为样本,作相同处理。
(3)结果判读:
根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果:利用特异性引物和荧光探针进行PCR检测,突变和质控由FAM指示,内控由HEX信号指示,通过计算ΔCt的大小进行判断,反应管的ΔCt值<ΔCt Cut-off值时,则样品为该反应管对应信号突变阳性,反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。
表CutoffΔCt值
检测靶点 | CutoffΔCt值 |
V600E | 10 |
本发明提供了用于BRAF V600E基因突变的试剂盒,所述试剂盒包括PCR反应缓冲液、引物探针混合液、酶系1、阳性对照、阴性对照和说明书。引物探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针,质控基因和内控检测引物探针,突变和质控探针5’端标记FAM荧光素,3’端标记MGB荧光素;内控5’端标记HEX荧光素,3’端标记BHQ1荧光素,质控及内控均作为结果判读的一部分。质控基因选择是人类BRAF V600E基因相对保守的区段,内控选择的是人β-aCtin保守基因,双控体系共同用于监控血浆样本DNA质量和PCR反应过程。与现有技术相比:1)高灵敏度:可在100ng野生型人类基因组背景下检测出1%微量突变模板,减少了假阴性结果的出现;2)全封闭反应,避免假阳性结果的发生;3)双控反应体系,质控及内源对照,有效检测PCR扩增及核酸提取。
附图说明
图1为V600E灵敏度结果图;
图2为临床阳性样本用V600E检测结果图;
图3位V600E试剂盒扩增野生型样本结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
利用本发明实时荧光PCR检测BRAF V600E 7种基因突变的方法包括如下步骤:
1、核酸提取
以石蜡包埋组织为例,按照推荐的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit说明书进行石蜡包埋组织基因组DNA的提取。
2、PCR反应体系的配制(25ul)
试剂名称 | 加入量 |
PCR反应液 | 16ul |
酶系1 | 2ul |
引物探针混合液 | 2ul |
模板DNA | 5ul |
所述的模板DNA包含样本DNA和阴性、阳性对照DNA。
3、PCR扩增
实时PCR扩增条件为:50℃2min,1个循环;95℃5min;95℃10s,55℃15s,72℃30s,5个循环;95℃10s,60℃45s(收集FAM和HEX荧光信号),40个循环。
4、结果判定
1)检测结果除阴性对照外,突变反应管的内控信号HEX应有扩增曲线,且Ct≤33;若Ct>33,则提示样本DNA模板量偏低或存在PCR抑制剂,需重新提取或者增加PCR模板量再做,但是如果管内FAM有信号,可能是由于突变的扩增抑制了内控序列的扩增,结果仍然可信。
2)质控管FAM信号Ct<21,提示样品加入量过高,需减少样本加入量再实验;质控管FAM信号Ct>26或阴性,提示该样本加入量过低或提取失败,需要增加样本量再实验或重新提取。
3)质控管FAM信号21≤Ct≤26
A:ARMS引物管Ct<30,样本结果判读为阳性。
B:ARMS引物管>阴性临界值或无扩增曲线,样本结果判读为阴性。
C:相应ARMS引物管30≤Ct值<阴性临界值(如下表),且其与质控管FAM信号的ΔCt≤△Ct Cut-off值,该样本结果判读为阳性;反之则判读为阴性。
实施例2
利用本发明检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织样本10例,并与测序结果进行对照,结果:检测出V600E阳性2例,与测序法符合率100%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.用于BRAF V600E基因突变的试剂盒,其特征在于:包括BRAF V600E基因突变检测的特异引物和探针,其特异引物与探针包括如下序列:
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括引物探针混合液,引物探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针、质控基因和内控检测引物探针;突变和质控探针5’端标记FAM荧光素,3’端标记MGB荧光素;内控5’端标记HEX荧光素,3’端标记BHQ1荧光素。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒还包括BRAF V600E突变及BRAF野生型PCR反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和DEPC水。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:还应包括可用于血清游离DNA样本、组织样本或穿刺样本的BRAF V600E基因突变的检测。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:还应包括如下扩增体系:
6.一种BRAF V600E基因突变的检测方法,所述的方法包含以下步骤:
(1)样本DNA的提取
血清游离DNA提取:推荐使用Sigma公司的GenEluteTMPlasma/Serum Cell-FreeCirculating DNA Purification Midi Kit。
组织样本DNA提取:推荐使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(货号:56404)
(2)PCR反应体系的配制
在试剂配制室按照试剂盒说明书要求进行配制,PCR反应液16ul,酶系1
2ul、引物探针混合液2ul,模板DNA5ul,阴性对照和质控视为样本,作相同处理。
(3)结果判读:
根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果:利用特异性引物和荧光探针进行PCR检测,突变和质控由FAM指示,内控由HEX信号指示,通过计算ΔCt的大小进行判断,反应管的ΔCt值<ΔCt Cut-off值时,则样品为该反应管对应信号突变阳性,反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。
表CutoffΔCt值
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---|---|---|---|---|
CN108753961A (zh) * | 2018-05-07 | 2018-11-06 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | Braf v600e基因突变检测引物、方法及试剂盒 |
CN110964818A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-04-07 | 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 | 一种人类braf基因v600e突变的检测试剂盒及检测方法 |
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CN104099425A (zh) * | 2014-08-01 | 2014-10-15 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒 |
CN104846106A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-08-19 | 沈阳优吉诺生物科技有限公司 | 检测braf基因v600e突变位点的引物、试剂盒及其pcr方法 |
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2017
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