CN105368799A - 新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，dna序列和耐受hppd抑制剂除草剂的植物分离 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码突变的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的核酸序列、包含该序列作为编码序列的嵌合基因以及其在获得耐受HPPD抑制剂除草剂的植物中的应用。

Description

新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，DNA序列和耐受HPPD抑制剂除草剂的植物分离
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年4月10日，申请号为200980113723.X，名称为“新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，DNA序列和耐受HPPD抑制剂除草剂的植物分离”。本发明涉及编码突变的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(hydroxyphenylpyruvatedioxygenase)(HPPD)的核酸序列、包含该序列作为编码序列的嵌合基因以及其在获得耐受HPPD抑制剂除草剂的植物中的用途。
羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD；EC1.13.11.27)是一种酶，其催化酪氨酸降解产物-对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为植物中生育酚和质体醌的前体-尿黑酸(HG)的反应(CrouchN.P等,1997；Fritze等,2004)。生育酚起到膜相关抗氧化剂的作用。质体醌首先是PSII和细胞色素b6/f复合物之间的电子载体，然后是参与类胡萝卜素生物合成的八氢番茄红素去饱和酶的氧化还原辅因子。
大多数植物通过预苯氨酸(arrogenate)合成酪氨酸(Abou-Zeid等1995；Bonner等,1995；Byng等,1981；Connely和Conn1986；Gaines等,1982)。在这些植物中，HPP仅来自于酪氨酸降解。另一方面，在如酵母酿酒酵母(Sacharomycescerevisiae)或细菌大肠杆菌(Escherichiacoli)等生物体中，HPP是酪氨酸前体，由预苯酸脱氢酶(此后称为PDH)的作用合成，该酶将预苯酸转化为HPP(Lingens等,1967；Sampathkumar和Morrisson1982)。因此在这些生物体中，HPP的产生直接与芳香族氨基酸的生物合成途径(莽草酸途径)而非酪氨酸降解途径相关。
抑制HPPD导致光合作用的解偶联、辅助捕光色素缺乏，最重要的是，由于缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，紫外线辐射和活性氧中间体导致叶绿素破坏(Norris等1995)。对光合作用活性组织进行光漂白会导致生长抑制和植物死亡。
一些抑制HPPD和与所述酶特异性结合以抑制HPP转化为尿黑酸的分子已证实是非常有效的选择性除草剂。
市场上最易买到的HPPD抑制剂除草剂属于以下四个化学家族之一：
1)三酮类，例如，磺草酮(sulcotrione)(即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮)、甲基磺草酮(mesotrione)(即2-[4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-1,3-环己二酮)、特波三酮(tembotrione)(即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)-3-[(2,2,2-三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]-1,3-环己二酮)；
2)二酮腈(diketonitrile)类，例如，2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮；
3)异噁唑类，例如，异噁氟草(isoxaflutole)(即5-环丙基-4-异噁唑基[2-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮)。在植物中，异噁氟草在DKN中快速代谢，后者是一种表现出HPPD抑制剂性质的二酮腈化合物；以及
4)吡唑特(pyrazolinate)类，例如，苯吡唑草酮(topramezone)(即[3-(4,5-二氢-3-异噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮)和吡拉塞佛托(pyrasulfotole)(5-羟基-1,3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三氟甲基苯基)甲酮)。
这些HPPD抑制除草剂可用于表现出代谢耐受性的作物如玉米(Zeamays)中的草和/或阔叶杂草，这些除草剂在其中可快速降解(Schulz等,1993；Mitchell等,2001；Garcia等,2000；Pallett等,2001)。为了拓展这些HPPD抑制除草剂的范围，已作出努力以赋予植物，尤其是不具有或具有未充分发挥的代谢耐受性的植物对它们的农业水平耐受性。
除试图绕过HPPD介导的尿黑酸产生(US6,812,010)外，已进行了该敏感酶的过表达以在植物中产生大量对除草剂充足的靶酶(WO96/38567)。HPPD的过表达引起了对异噁氟草(IFT)的二酮腈衍生物(DKN)更好的萌发前耐受性，但该耐受性不足以作为萌发后处理的耐受性(Matringe等,2005)。
另一种策略是对HPPD进行突变以获得相对突变前的天然HPPD对HPPD抑制剂敏感性较低的靶酶，而同时保留其催化HPPD转化为尿黑酸的性质。
该策略已成功应用于生产耐受两种属于二酮腈家族的HPPD抑制除草剂(WO99/24585)2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟甲苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-甲磺酰基-2-三氟甲苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮的植物(EP496630)。鉴定Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Il、特别是Gly336Trp(突变氨基酸的位置根据SEQIDNO:2的假单胞菌(Pseudomonas)HPPD标出)是引起对二酮腈除草剂萌发前处理耐受性增强但并不造成酶活性改变的突变。
最近，已证实将假单胞菌HPPD基因导入烟草和大豆的质体基因组远比核转化有效，赋予对异噁氟草的萌发后使用相同的耐受性(Dufourmantel等,2007)。
在WO04/024928中，发明人设法通过增强HPP前体进入植物细胞的流量来增强植物细胞中异戊烯苯醌的生物合成(例如，质体醌和生育酚的合成)。这通过过表达PDH酶将所述前体的合成与“莽草酸”途径进行连接而完成。他们还注意到，用编码PDH酶的基因转化植物有可能增强所述植物对HPPD抑制剂的耐受性。
尽管对二酮腈除草剂表现出耐受性的植物的开发已经获得了这些成功，仍然有必要开发和/或改进对HPPD抑制剂的耐受性***，特别是对属于三酮类(例如，磺草酮、甲基磺草酮和特波三酮)和吡唑特类(例如，苯吡唑草酮和吡拉塞佛托)的HPPD抑制剂。
因此，本发明涉及新的突变HPPD酶，其保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其特征在于它们在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位(天然HPPD中为氨基酸甘氨酸)包含一个选自以下突变的突变：Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu和Gly336Asp。
在一个具体的实施方式中，SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD在第336位的突变选自以下突变：Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val，条件是突变的HPPD不是双重突变体Gly334Ala-Gly336Arg(位置根据SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD给出)。
在一个更具体的实施方式中，SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD在第336位的突变选自以下突变：Gly336His、Gly336Met、Gly336Cys和Gly336Phe。
在另一个具体的实施方式中，HPPD酶来自植物，特别是来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)，SEQIDNO:4所示拟南芥HPPD的氨基酸序列在第422位(即SEQIDNO:2的假单胞菌HPPD的第336位)的甘氨酸包含一个选自以下突变的突变：Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu和Gly336Asp。
在一个更具体的实施方式中，SEQIDNO:4所示拟南芥HPPD在第422位(即SEQIDNO:2的假单胞菌HPPD的第336位)的突变选自以下突变：Gly336His、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val，且突变的HPPD来自植物，特别是来自拟南芥。应注意，SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位是SEQIDNO:4所示拟南芥HPPD的第422位。
在一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对异噁唑类、二酮腈类、三酮类、吡唑特类的HPPD抑制剂除草剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。
在一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对选自以下的HPPD抑制剂除草剂的敏感性低于原始的未突变HPPD：异噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、磺草酮、吡拉塞佛托、苯吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮。
在另一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对以下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD：三酮类(称为三酮HPPD抑制剂)，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，特别是特波三酮，或吡唑特类(称为吡唑特HPPD抑制剂)，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮。
在一个更具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对选自特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，特别是特波三酮的三酮HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。
在另一个具体的实施方式中，除SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位的氨基酸甘氨酸上的第一突变外，本发明的突变HPPD还包含第二突变。
在一个更具体的实施方式中，第二突变氨基酸选自以下SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD序列的氨基酸：Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337。
本发明还提供突变的HPPD酶，其保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对以下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD：三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，其特征在于它们在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD第336位的氨基酸甘氨酸包含突变，以及提供使用这样的酶使植物对这些HPPD抑制剂具有耐受性，即，将三酮类或吡唑特类除草剂施用于表达这样突变体酶的植物的，而植物通过在其基因组中包含编码在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位突变的某些HPPD酶的基因而对这样的三酮类或吡唑特类HPPD抑制剂具有耐受性的过程。
在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD酶对三酮类如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，突变根据选自以下突变的突变，发生在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位：Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val。
在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD酶对三酮类如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，突变根据选自以下突变的突变，发生在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位：Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe和Gly336Cys。
现有技术已对若干HPPD及其初级序列进行了描述，特别是以下HPPD：如假单胞菌等细菌(Rüetschi等,Eur.J.Biochem.,205,459-466,1992,WO96/38567)、如拟南芥(WO96/38567,GenebankAF047834)、胡萝卜(WO96/38567,Genebank87257)、燕麦(Avenasativa)(WO02/046387)、小麦(WO02/046387)、臂形草(Brachiariaplatyphylla)(WO02/046387)、蒺藜草(Cenchrusechinatus)(WO02/046387)、刚性黑麦草(Loliumrigidum)(WO02/046387)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)(WO02/046387)、大狗尾草(Setariafaberi)(WO02/046387)、牛筋草(Eleusineindica)(WO02/046387)和高粱(WO02/046387)等植物、球孢子菌(Coccicoides)(GenebankCOITRP)或如小鼠或猪等哺乳动物的。显示的参考文献中公开的相应序列通过引用纳入本文。
通过比对这些已知序列，采用本领域的惯例手段，例如，Thompson,J.D.等描述的方法(CLUSTALW:“通过序列加权、位点特异性空位罚分和加权矩阵选择来提高渐进的多序列比对的敏感性”(improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.)NucleicAcidsResearch,22；4673-4680,1994)，进入这些通过互联网可获得的序列比对的计算机程序，技术人员能够确定与参比序列的序列同源性并找到关键氨基酸或确定共有区域。
以本发明为例，参比序列是假单胞菌序列，除非特别说明，对具体氨基酸位置的定义和说明所有均根据SEQIDNO:2所示初级假单胞菌HPPD序列作出。附图1显示现有技术中描述的若干HPPD序列的比对；这些序列的比对以假单胞菌HPPD序列作为参比序列，包括以下HPPD序列：阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)(GenebankSAV11864)、胡萝卜(Daucuscarota)(GenebankDCU87257)、拟南芥(GenebankAF047834)、玉米、大麦(Hordeumvulgare)(GenebankHVAJ693)、小麦叶枯病菌(Mycosphaerellagraminicola)(GenebankAF038152)、粗球孢子菌(Coccicoidesimmitis)(GenebankCOITRP)和小鼠(Musmusculus)(GenebankMU54HD)。该图提供假单胞菌序列的氨基酸编号，还有这些序列共有的氨基酸，其中这些氨基酸由星号表示。根据这样的比对，从假单胞菌氨基酸的位置和性质的定义不难鉴定另一个HPPD序列中的相应氨基酸的位置。图1显示可通过比对不同植物、哺乳动物和细菌来源的序列做到这点，表明技术人员熟知的该比对方法通用于任何其它序列。专利申请WO97/49816中也描述了不同HPPD序列的比对。
在WO99/24585中，对假单胞菌HPPD单体三级结构的分析显示HPPD的C末端部分存在，其是酶的活性位点所在，通过保证酶稳定性及其寡聚化(假单胞菌HPPD是四聚体，植物HPPD是二聚体)的连接肽与其N末端部分连接。该结构由研究晶体X光衍射的常规方法获得。连接肽可能确定酶C末端部分的N末端，其中以假单胞菌为例，所述连接肽位于第145位和第157位的氨基酸之间(参见图1)。在附图1所示的序列比对中显示的所有序列中均会注意到假单胞菌序列中位于第161位和第162位的两个氨基酸(D＝Asp161，H＝His162)。根据假单胞菌HPPD，由此可能确定连接肽位于氨基酸Asp161上游约5到15个氨基酸之间。
根据本发明，应理解“突变的HPPD”为HPPD初级序列的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代。表述“突变氨基酸”以下用于表示被另一个氨基酸取代的氨基酸，从而表示蛋白质初级序列中的突变位点。
根据本发明，突变发生在SEQIDNO:2所示假单胞菌序列第336位的氨基酸甘氨酸上，其几乎是所有已鉴定的HPPD序列共有的。在至今已知的240个HPPD序列中，有238个在第336位包含甘氨酸，仅有聚球菌属(Synechococcussp.)JA-3-3Ab(Acc-NoQ2JX04)和聚球菌属JA-2-3B'a(2-13)(Acc-NoQ2JPN8)的HPPD序列在该位置上是丙氨酸。Gly336是发现于大多数HPPD序列的共有序列“Gly-Phe-Gly-X-Gly-Asn-Phe”的一部分，其中在各种来源的HPPD中，X可以是20种氨基酸中的任何一种，这可能通过序列比对方法鉴定任何来源HPPD中的Gly336而没有任何困难。
作为例子，假单胞菌序列的Gly336是SEQIDNO:4所示拟南芥序列的Gly422(见图1)，但本文提到的Gly是SEQIDNO:2所示假单胞菌序列的参比位置第336位的Gly(除非特别说明)，即使本发明的突变可发生在任何有用的HPPD酶中而并非必然在假单胞菌HPPD中。
HPPD的酶活性可通过任何方法测定，从而能测定HPP或O2底物量的减少、或测定任何来源于酶反应的产物即尿黑酸或CO2的积累。特别是，HPPD活性可通过Garcia等(1997)或Garcia等(1999)中描述的方法测定，二者通过引用纳入本文。
根据本发明，三酮类的HPPD抑制剂(或三酮HPPD抑制剂)指具有三酮骨架的HPPD抑制剂。这样的三酮HPPD抑制剂的一个例子是磺草酮(即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮)、甲基磺草酮(即2-[4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-1,3-环己二酮)和特波三酮(即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)-3-[2,2,2-三-氟乙氧基甲基]苯甲酰基]-1,3-环己二酮)。
根据本发明，吡唑特类的HPPD抑制剂(或吡唑特HPPD抑制剂)指具有吡唑基的HPPD抑制剂。这样的吡唑特HPPD抑制剂的一个例子是苯吡唑草酮(即[3-(4,5-二氢-3-异噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮)和吡拉塞佛托[(5-羟基-1,3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三氟甲苯基)甲酮)。
在本发明的另一个实施方式中，除Gly336的突变外，HPPD在第二氨基酸位置也发生了突变。该第二突变的存在可进一步增强对与第一突变赋予耐受性的同一HPPD抑制剂除草剂的耐受性，或可赋予对另一HPPD抑制剂除草剂的耐受性。WO99/24585描述了这些突变赋予对HPPD抑制剂特别是对二酮腈类和异噁唑类的耐受性的例子。
在本发明的一个具体的实施方式中，第二突变的氨基酸选自以下SEQIDNO:2所示假单胞菌序列的参比氨基酸：Pro215、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337，以及假单胞菌序列中的Gly298(最后这个氨基酸在其它HPPD中没有对应物，见图1)。
在本发明的一个实施方式中，第二突变的氨基酸是SEQIDNO:2所示假单胞菌序列的Pro215，该突变特别是Pro215Leu。
本发明也涉及一种核酸序列，特别是分离的DNA，其编码如上所述的突变的HPPD。
本发明也涉及一种编码突变的HPPD酶的核酸序列，其中突变的HPPD酶保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对以下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD：三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，其特征在于其在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位氨基酸甘氨酸包含突变。
在一个更具体的实施方式中，本发明的核酸序列编码突变的HPPD酶，其对三酮类的HPPD抑制剂如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的敏感性低于原始的未突变HPPD，且其中HPPD根据选自以下的突变，在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位发生突变：Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val。
在一个更为具体的实施方式中，本发明的核酸序列编码突变的HPPD酶，其对三酮类的HPPD抑制剂如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的敏感性低于原始的未突变HPPD，且其中HPPD根据选自以下的突变，在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位发生突变：Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe和Gly336Cys。
根据本发明，“核酸序列”应理解为DNA或RNA型的核苷酸序列，优选DNA型，特别是双链，无论是天然或合成来源，特别是其中编码本发明突变HPPD的密码子已根据要在其中表达的宿主生物体进行了优化(例如，通过采用相比原始宿主在该宿主生物体或该宿主生物体所属组的密码子使用表中更优选或最优选的密码子进行密码子取代)，这些优化方法为本领域技术人员所熟知。
本文使用的“分离的DNA”指非天然产生或不再存在于其原始存在的天然环境中的DNA，例如，嵌合基因中与其它调控元件相关的DNA编码序列、转移到另一个宿主细胞如植物细胞中的DNA、或相比任何已知天然产生的DNA具有不同核苷酸序列的人工合成的DNA。
编码根据本发明将发生突变的原始未突变HPPD的序列可来自任何来源。其特别可来自细菌来源。有利例子是假单胞菌属的细菌，例如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，或集胞藻(Synechocystis)属的蓝藻(cyanobacteria)。所述序列也可来自植物来源，特别是来自双子叶植物、伞状花科植物或单子叶植物。有利例子是植物，如烟草、拟南芥、胡萝卜、玉米、小麦、大麦、燕麦、小麦、臂形草、蒺藜草、刚性黑麦草、苇状羊茅、大狗尾草、牛筋草和高粱。之前引用的参考文献中描述了所述编码序列以及分离和克隆所述编码序列的方法，这些参考文献的内容通过引用纳入本文。
在本发明一个具体的实施方式中，所述HPPD来自细菌来源，特别是来自假单胞菌属，更特别的是来自荧光假单胞菌，或来自植物来源，特别是来自拟南芥。
为本发明目的而突变的HPPD可为任何天然产生的HPPD，或其任何活性片段或其任何变体，其中一些氨基酸(1-10个氨基酸)为克隆目的而被取代、添加或缺失，以形成转运肽融合等，其保留HPPD活性，即催化对羟基苯基丙酮酸转化为尿黑酸的性质。
根据本发明，所述HPPD可为嵌合HPPD。术语“嵌合HPPD”是表示包含来自各种HPPD的元件的HPPD。专利申请WO99/24586中特别描述了这样的嵌合HPPD。
所述突变可发生在编码原始的未突变HPPD的核酸序列中，可采用任何适当的手段在所述序列中以对应于用于取代的氨基酸的密码子取代编码突变氨基酸的密码子，其中所述密码子在文献中有广泛描述，且为本领域技术人员熟知。
若干分子生物学方法可用于获得该突变。
一种制备本发明突变核酸序列和相应蛋白质的优选方法，包括在编码一个或多个预先选择的氨基酸的密码子上实施定点突变，包括SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD序列的参比位置Gly336的密码子。获得这些定点突变的方法为本领域技术人员熟知，在文献中有广泛描述(特别是在《定点突变：一种实用方法》(DirectedMutagenesis:APracticalApproach),1991,M.J.McPHERSON编,IRL出版社)，或为可能运用商业试剂盒的方法(例如法玛西亚公司(PHARMACIA)的U.S.E.突变试剂盒)。定点突变后，通过采用适当的筛选辅助方法，选择包含对HPPD抑制剂具有较低敏感性的突变HPPD的细胞是有用的。一种易于实施的筛选方法是测定完全抑制原始的未突变HPPD且对表达该未突变HPPD的细胞致死的HPPD抑制剂的剂量，并对突变细胞施加该预定剂量，然后分离耐受该致死剂量的突变细胞，接着分离并克隆编码该突变HPPD的基因。基于本发明一个具体的实施方式和广泛流行的解决方法，即对三酮或吡唑特HPPD抑制剂具有较低敏感性的HPPD，可如上所述进行筛选，采用三酮或吡唑特HPPD抑制剂，特别是选自特波三酮、甲基磺草酮、吡拉塞佛托、苯吡唑草酮和磺草酮的HPPD抑制剂。
基于本发明的另一个实施方式，即除SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD序列的第336位的参比氨基酸上的第一突变外，在第二氨基酸上又发生突变的HPPD，可通过与第一突变同时或相继进行定点突变获得第二突变。
作为上述定点突变的替代方法，可采用与适当筛选辅助方法相关的随机突变方法(如EMS或辐射处理)获得第二突变。这样的突变方法为本领域技术人员熟知，在文献中有充分描述(特别是Sambrook等,1989)。可如上所述实施筛选方法。
本文中通用的术语“包含”某个序列X的DNA或蛋白质指至少包括或包含序列X的DNA或蛋白质，以使其它核苷酸或氨基酸序列可包括于5'(或N末端)和/或3'(或C末端)端，例如，选择性标记蛋白质(的核苷酸序列)、转运肽(的核苷酸序列)和/或5'前导序列或3'尾随序列。类似地，本申请全文和权利要求书中使用的术语“包含”应理解为意指包括所述的整数或步骤或一组整数或步骤，而不排除任何其它整数或步骤或其它组整数或步骤。
因此本发明也涉及一种制备编码本发明突变HPPD的核酸序列的方法，所述方法如上定义。
本发明也涉及编码本发明突变HPPD的核酸作为标记基因或可能赋予植物对HPPD抑制剂除草剂耐受性的编码序列在转化植物方法中的用途，以及HPPD抑制剂在包含编码本发明突变HPPD的核酸序列的植物上的用途。在本发明的一个实施方式中，在这样的用途中，HPPD抑制剂为三酮类或吡唑特类，优选特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。当然应理解，该序列也可与其它(另一)基因标记和/或编码一个或多个具有有用农业性质的蛋白质的序列结合使用。
在编码赋予转化植物有用农艺性质的蛋白质的基因中有编码赋予对某些除草剂耐受性、赋予对某些昆虫耐受性、赋予对某些疾病耐受性等的蛋白质的DNA序列。专利申请WO91/02071和WO95/06128特别描述了这样的基因。在编码赋予转化植物细胞和植物对某些除草剂耐受性的DNA序列中有赋予对草丁膦除草剂耐受性的bar基因、编码赋予对具有EPSPS靶的除草剂如草甘膦及其盐的耐受性的合适EPSPS的基因(US4,535,060、US4,769,061、US5,094,945、US4,940,835、US5,188,642、US4,971,908、US5,145,783、US5,310,667、US5,312,910、US5,627,061、US5,633,435)、编码草甘膦氧化还原酶的基因(US5,463,175)。
在编码赋予对具有EPSPS靶的除草剂耐受性的合适EPSPS的DNA序列中，特别有编码植物EPSPS，特别是玉米EPSPS的基因，其具有102和106两个突变，在专利申请FR2736926中有描述，此后称为EPSPS双突变体，或编码从农杆菌分离的EPSPS的基因，由美国专利5,633,435的序列IDNo.2和序列IDNo.3描述，此后称为CP4。
在编码EPSPS、更特别是编码以上基因的DNA序列的情况中，编码这些酶的序列之前最好存在编码转运肽的序列，特别是美国专利5,510,471或5,633,448描述的编码“优化转运肽”的序列。
在编码赋予对昆虫耐受性的新性质的感兴趣蛋白质的DNA序列中，更特别有文献中广泛描述且为本领域技术人员熟知的Bt蛋白质。还有从细菌如发光杆菌(WO97/17432和WO98/08932)中提取的蛋白质。
本发明也涉及一种嵌合基因(或表达盒)，在5’和/或3’位置，至少在5’位置包含编码序列以及异源调控元件，它们能够在宿主生物体特别是植物细胞或植物中发挥作用，其中编码序列包含至少一个如前定义的编码突变HPPD的核酸序列。
因此本发明涉及一种嵌合基因(或表达盒)，在5’和/或3’位置，至少在5’位置包含编码序列以及异源调控元件，它们能够在宿主生物体特别是植物细胞或植物中发挥作用，其中编码序列包含至少一个如前定义的核酸序列。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种如前所述的嵌合基因，其中宿主生物体选自细菌、酵母、毕赤酵母(Pichia)、真菌、杆状病毒、植物细胞和植物。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种如前所述的嵌合基因，其中该嵌合基因在编码突变HPPD核酸序列的5’位置包含编码植物转运肽的核酸序列，其中该序列位于启动子区域和编码突变HPPD的序列之间，以允许转运肽/突变HPPD融合蛋白的表达。
作为植物细胞和植物中的启动子调控序列，可使用植物中天然表达的基因的任何启动子序列，特别是特别在植物叶子中表达的启动子，例如，细菌、病毒或植物来源的“组成型”启动子，或“光依赖型”启动子，如植物核酮糖二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因的启动子，或任何合适的已知可使用的启动子。在植物来源的启动子中，可提到如专利申请EP0507698所述的组蛋白启动子，或水稻肌动蛋白启动子(US5,641,876)。在植物病毒基因的启动子中，有花椰菜花叶病毒(CAMV19S或35S)的启动子，或环病毒启动子(AU689311)。
也可使用植物特定区域或组织的特异性调控启动子序列，如种子特异性启动子(Datla,R.等,1997)，特别是napin启动子(EP255378)、菜豆蛋白(phaseolin)启动子、麦谷蛋白(glutenin)启动子、向日葵蛋白(helianthinin)启动子(WO92/17580)、白蛋白启动子(WO98/45460)、油质蛋白(oleosin)启动子(WO98/45461)、SAT1启动子或SAT3启动子(PCT/US98/06978)。
诱导型启动子也宜选自苯丙氨酸解氨酶(PAL)、HMG-CoA还原酶(HMG)、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂(PI)、PR1家族基因、胭脂碱合成酶(nos)和vspB启动子(US5670349,表3)、HMG2启动子(US5670349)、苹果β-半乳糖苷酶(ABG1)启动子或苹果氨基环丙烷羧酸合成酶(ACC合成酶)启动子(WO98/45445)。
根据本发明，可联用启动子与位于启动子和编码序列之间的其它调控序列，如转录激活剂(“增强子”)，例如专利申请WO87/07644描述的烟草花叶病毒(TMV)的翻译激活剂，或Carrington和Freed1990描述的烟草蚀纹病毒(TEV)，例如，或内含子，如玉米的adh1内含子或水稻肌动蛋白的内含子1。
作为调控终止子或多聚腺苷酸化序列，可使用细菌来源的任何相应序列，如例如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的nos终止子，病毒来源的相应序列，如CaMV35S终止子，或植物来源的相应序列，如例如专利申请EP0633317描述的组蛋白终止子。
“宿主生物体”应理解为可为产生突变HPPD而将本发明嵌合基因引入其中的任何单细胞或多细胞生物。这些生物，特别是细菌例如大肠杆菌、酵母特别是酿酒酵母属(Saccharomyces)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属、真菌特别是曲霉(Aspergillus)、杆状病毒或优选植物细胞和植物。
根据本发明，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成以下或为其一部分：未分化组织如愈伤组织、分化组织如胚胎、植物的组成部分、植物或种子。
根据本发明，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶生物，更特别地为用于或非用于动物或人营养的栽培植物，如玉米、小麦、芸苔属(Brassica)植物如甘蓝型油菜(Brassicanapus)或芥菜型油菜(Brassicajuncea)、大豆、水稻、甘蔗、甜菜根、烟草、棉花、蔬菜植物如黄瓜、韭菜、胡萝卜、番茄、莴苣、胡椒、甜瓜、西瓜等。
在一个实施方式中，本发明涉及植物的转化。在植物中天然表达的基因的任何启动子序列，或在植物中天然表达的基因的任何杂合或组合的启动子元件，包括农杆菌或植物病毒启动子，或适合控制除草剂耐受性基因转录的任何启动子均可用作本发明植物中的启动子调控序列。以上描述了这样合适的启动子的例子。
根据本发明，也可能联用启动子调控序列与其它位于启动子和编码序列之间的调控序列，如内含子序列，或转录激活剂(增强子)。以上描述了这样合适的调控序列的例子。
细菌来源的任何相应序列，如根癌农杆菌的nos终止子，或植物来源的任何相应序列，如专利申请EP0633317描述的组蛋白终止子，均可用作转录终止(和多聚腺苷酸化)调控元件。
在本发明一个具体的实施方式中，在编码突变HPPD的核酸序列的5’采用编码转运肽的核酸序列，其中该转运肽序列位于启动子区域和编码突变HPPD的序列之间，以允许转运肽/突变HPPD融合蛋白的表达，其中所述突变HPPD如前所述。转运肽可能引导突变的HPPD进入质体，更具体说是叶绿体，突变HPPD进入质体时在转运肽和突变HPPD之间切割融合蛋白。所述转运肽可为单个肽，如EPSPS转运肽(美国专利5,188,642描述的)或植物核酮糖二羧化酶/加氧酶小亚基(RuBisCOssu)的转运肽，适当时包括成熟RuBisCOssu的N末端部分的几个氨基酸(EP189707)，或可为若干转运肽的融合如包含与具有质***置的成熟蛋白质N末端序列的一部分融合的第一植物转运肽的转运肽，其中该部分又与如专利EP508909描述的第二植物转运肽融合，更具体地说，包含与玉米RuBisCOssuN末端的22个氨基酸融合的向日葵RuBisCOssu的转运肽的优化转运肽又与专利EP508909描述其编码序列的玉米RuBisCOssu的转运肽融合。
本发明也涉及所述转运肽/突变HPPD融合蛋白和编码这样融合蛋白的核酸或植物可表达的嵌合基因，其中该融合蛋白的两个元件如上所述。
本发明也涉及转化宿主生物体的克隆和/或表达载体，该载体包含至少一个如上所述的嵌合基因。除以上嵌合基因外，该载体还包含至少一个复制起点。该载体可为通过引入本发明嵌合基因已被转化的质粒、粘粒、噬菌体或病毒。这样的转化载体依赖于转化的宿主生物体，为本领域技术人员熟知，在文献中有广泛描述。使用的转化载体特别是转化植物细胞或植物的载体可为病毒，可用于转化发育的植物，还包含其本身的复制和表达元件。根据本发明，转化植物细胞或植物的载体优选为质粒，如卸甲的(disarmed)农杆菌Ti质粒。
本发明也涉及所述宿主生物体，特别是植物细胞或植物，其是转化的，且包含如上定义的含有编码突变HPPD序列的嵌合基因，以及本发明的植物用于田地生产作物并收获植物产品例如大豆或玉米谷物的用途，其中在一个实施方式中，所述用途包括将HPPD抑制剂除草剂用于这样的植物以控制杂草。在本发明的一个实施方式中，在这样的使用中，所述HPPD抑制剂为三酮类或吡唑特类，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。
因此，本发明涉及一种宿主生物体，特别是植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个如上所述的嵌合基因，或至少一个如上所述的核酸序列。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码突变HPPD酶的核酸序列，其中突变的HPPD酶保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其特征在于其在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位(天然HPPD中为氨基酸甘氨酸)包含选自以下的突变：Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val，条件是突变的HPPD不是双重突变体Gly334Ala-Gly336Arg(位置根据SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD给出)。
在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码如上所述的突变HPPD的核酸序列，其中SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位的突变选自以下突变：Gly336His、Gly336Met、Gly336Cys和Gly336Phe，特别是Gly336His。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码突变HPPD的核酸序列，其中突变的HPPD保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其中所述HPPD酶来自植物，特别是来自拟南芥，并且在SEQIDNO:4所示拟南芥HPPD的氨基酸序列第422位(即SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的氨基酸序列的第336位)的甘氨酸上包含一个选自以下的突变：Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu和Gly336Asp。
在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位的突变选自以下突变：Gly336His、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val，所述突变HPPD是植物来源，特别是拟南芥。应注意，SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位是SEQIDNO:4所示拟南芥HPPD的第422位。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中本发明的突变HPPD对异噁唑类、二酮腈类、三酮类或吡唑特类的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。
在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述突变HPPD对选自以下的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD：异噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、磺草酮、吡拉塞佛托、苯吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述突变HPPD对选自以下的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD：三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，特别是特波三酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述突变HPPD对选自特波三酮、磺草酮或甲基磺草酮，特别是特波三酮的三酮HPPD抑制剂的敏感性较低。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中除SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位氨基酸甘氨酸上的第一突变外，本发明的突变HPPD还包含第二突变。
在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述第二突变氨基酸选自以下氨基酸：SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD序列的Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337。
本发明还涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码突变HPPD酶的核酸序列，其中突变的HPPD酶保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对选自以下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD：三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，其特征在于SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位氨基酸甘氨酸包含突变。
在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码突变HPPD酶的核酸序列，其中突变的HPPD酶对三酮类或吡唑特类的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，根据选自以下的突变，HPPD在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位发生突变：Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个上述核酸序列，还有在植物中发挥作用的基因，从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达。
本发明也涉及包含转化细胞的植物，特别是从转化细胞再生的植物。再生可通过适当的方法获得，例如以上参考文献所述，其中所述方法依赖于物种的性质。可引用以下专利和专利申请，特别是关于转化植物细胞和植物再生的方法：US4,459,355、US4,536,475、US5,464,763、US5,177,010、US5,187,073、EP267,159、EP604662、EP672752、US4,945,050、US5,036,006、US5,100,792、US5,371,014、US5,478,744、US5,179,022、US5,565,346、US5,484,956、US5,508,468、US5,538,877、US5,554,798、US5,489,520、US5,510,318、US5,204,253、US5,405,765、EP442174、EP486233、EP486234、EP539563、EP674725、WO91/02071和WO95/06128。
本发明也涉及转化植物或其部分，其通过栽培和/或杂交以上再生植物得到，还涉及转化植物的种子。
本发明也涉及从本发明的植物、其部分或种子获得的终产物如粗碾谷物或油。
根据本发明可获得的转化植物可为单子叶型，如谷物、甘蔗、水稻和玉米，或为双子叶型，如烟草、大豆、芸苔属植物如油菜、棉花、甜菜根、三叶草等。
本发明涉及转化宿主生物体特别是植物细胞或植物的方法，所述方法将上述至少一个核酸序列或一个嵌合基因整合入这样的生物体中，其中可通过任何适当的已知手段获得转化，所述手段在专门的文献中有充足描述，特别是在本发明引用的参考文献中，更具体地说是采用本发明的载体。
一系列方法包括用DNA序列附着的粒子轰击细胞、原生质体或组织。另一系列方法包括采用***到根癌农杆菌Ti质粒或毛根农杆菌Ri质粒的嵌合基因作为转移入植物的手段。可采用其它方法，如微注射或电穿孔或用PEG引导沉淀。技术人员可选择任何适当的方法转化所选宿主生物体，特别是植物细胞或植物。例如，大豆转化的技术在通过引用纳入本文的EP1186666的实施例1-3中有广泛描述。对于水稻，可进行农杆菌介导的转化(Hiei等,1994,和Hiei等,1997,通过引用纳入本文)、电穿孔(美国专利5,641,664和美国专利5,679,558，通过引用纳入本文)或轰击(Christou等,1991，通过引用纳入本文)。通过引用纳入本文的WO92/09696中描述了单子叶植物特别是水稻转化的合适技术。对于棉花，已描述了农杆菌介导的转化(GouldJ.H.和Magallanes-CedenoM.,1998和ZapataC.,1999，通过引用纳入本文)、聚凝胺(polybrene)和/或处理介导的转化(SawahelW.A.,2001，通过引用纳入本文)。
在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD靶向叶绿体。可通过整合上述编码转运肽/突变HPPD融合蛋白的核酸序列来进行。
或者，可采用转化叶绿体基因组将突变的HPPD直接在叶绿体中表达。一个合适的方法包括用DNA包被的粒子轰击树叶部分，并通过同源重组整合编码本发明蛋白质的引入基因。合适的载体和选择***为本领域技术人员已知。可用于这种整合入烟草品系叶绿体基因组的手段和方法的一个例子在WO06/108830中给出，其内容通过引用纳入本文。在采用叶绿体基因组转化将多肽直接靶向入叶绿体时，通常不需要转运肽序列。
本发明也涉及获得耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述植物用上述嵌合基因进行转化。
因此，本发明也涉及一种获得耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述植物用在5'且任选地在3'位置包含编码序列以及异源调控元件的嵌合基因进行转化，所述编码序列以及异源调控元件能够在宿主生物体中发挥作用，其特征在于所述编码序列包含至少一个如上所述的核酸序列。
在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。
在另一个实施方式中，本发明涉及获得上述耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述植物还同时或相继用在该植物中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的基因进行转化。
本发明也涉及借助HPPD抑制剂特别是上述除草剂为植物特别是作物选择性除草的方法，该方法的特征在于在作物播种前、作物萌发前或作物萌发后施用将该除草剂施用于根据本发明进行转化的植物。
在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。
本发明也涉及在包含如本专利申请之前所述的转化种子的区域或田地里控制杂草的方法，该方法包括对所述田地区域施用对所述杂草有毒剂量的HPPD抑制剂除草剂，而不显著影响包含如本专利申请之前所述的核酸序列或嵌合基因的种子或植物。
在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。
本发明也涉及一种栽培用本发明嵌合基因转化的植物的方法，该方法包括将包含本发明嵌合基因的种子种植在适合栽培所述植物的田地区域里，如果存在杂草，将对杂草有毒剂量的、以上述HPPD为靶标的除草剂施用于所述田地的所述区域，而不显著影响所述转化种子或所述转化植物，然后在栽培植物或植物部分达到所需成熟阶段时收获所述栽培植物或植物部分，适当时从收获的植物中分离种子。
在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。
在以上方法中，可根据本发明，在作物播种前、作物萌发前或作物萌发后施用以所述HPPD为靶标的除草剂。
本发明也涉及一种获得油，特别是大豆油或粗碾谷物的过程，包括在田地里种植表达本发明突变HPPD的作物，特别是大豆作物，任选用HPPD抑制剂除草剂处理这样的作物，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并提取油。包含本发明嵌合基因的整个、破碎或碾碎的植物种子或谷物也是本发明的一部分。
因此，本发明涉及获得油或粗碾谷物的方法，包括种植上述的转化植物，任选地用HPPD抑制剂除草剂处理这样的植物，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并提取油。
在具体的实施方式中，本发明的以上方法包括选自以下的HPPD抑制剂除草剂：异噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、吡拉塞佛托、磺草酮、苯吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮。
在其它具体的实施方式中，本发明的以上方法包括选自以下的HPPD抑制剂除草剂：三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，特别选自特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，更特别地为特波三酮。
在本发明的含义中，“除草剂”应理解为本身具有除草剂活性的物质或与改变其功效的添加剂如例如增强其活性(增效剂)或限制其活性(安全剂)的试剂结合的物质。当然应理解，就其在实践中的应用来说，以上除草剂以本身已知的方式与农业化学中惯常使用的配方佐剂结合。
在根据本发明转化的植物包含一个或多个其它对其它除草剂耐受性的基因(如例如，编码赋予植物对草甘膦除草剂耐受性的突变或未突变EPSPS的基因，或赋予对草丁膦除草剂耐受性的pat或bar基因)时，或在转化植物对另一个除草剂具有天然敏感性(如磺酰脲耐受性)时，本发明的方法可包括结合所述除草剂或除草剂的组合，例如草甘膦和/或草丁膦和/或磺酰脲除草剂，同时或按顺序交错施用HPPD抑制剂。
本发明也涉及基于对上述HPPD抑制剂除草剂的选择，编码本发明突变HPPD的嵌合基因作为某种植物转化期间标记基因的用途。
本发明也涉及获得耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述植物用在植物中表达HPPD的嵌合基因进行转化，所述HPPD在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基酸甘氨酸发生突变。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述获得耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述HPPD突变选自Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336trp、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及所述获得耐受选自特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮的三酮HPPD抑制剂的植物的方法。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及所述获得耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述植物还同时或相继用在该植物中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的基因进行转化。
本发明也涉及在控制区域或田地中杂草的方法，该方法包括在该区域或田地种植根据上述方法获得的耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的转化植物或来源于其的转化种子，施用对杂草有毒剂量的所述三酮或吡唑特HPPD抑制剂，而不显著影响所述转化种子或所述转化植物。
本发明也涉及获得油或粗碾谷物的方法，包括种植根据上述方法获得的耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的转化植物或来源于这样植物的转化种子，任选用三酮或吡唑特HPPD抑制剂处理这样的植物或种子，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并提取油。
本发明也涉及在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基酸甘氨酸发生突变的HPPD以使植物耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的用途。
本发明也涉及上述突变HPPD的用途，其特征在于所述HPPD突变选自：Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336trp、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val。
本发明也涉及上述突变HPPD的用途，其特征在于所述HPPD抑制剂是选自特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮的三酮HPPD抑制剂。
本发明也涉及宿主生物体，特别是植物细胞或植物，其包含含有编码本发明突变HPPD的序列的嵌合基因，还包含在该宿主生物体中发挥作用从而允许预苯酸脱氢酶(本文缩写为PDH)过表达的基因。
在表述“在植物中发挥作用从而允许PDH酶过表达的基因”中，术语“PDH”应解释为表现出将预苯酸转化为HPP的PDH活性的任何天然或突变的PDH酶。特别地，所述PDH酶可来源于任何类型的生物。可通过任何可能测定预苯酸底物量的减少或测定来自酶反应的产物即HPP或辅因子NADH或NADPH之一的积累的方法鉴定具有PDH活性的酶。具体地说，可通过实施例4中描述的方法测定PDH活性。
文献中描述了很多编码PDH酶的基因，其序列可在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/进行鉴定。特别熟知的是编码以下的PDH酶的基因：如Mannhaupt等(1989)中所述的酿酒酵母(登录号S46037)、杆状菌属(Bacillus)细菌特别是如Henner等(1986)中所述的枯草杆菌(B.subtilis)(登录号P20692)、埃希氏菌属(Escherichia)细菌特别是如Hudson等(1984)中所述的大肠杆菌(登录号KMECTD)、欧文氏菌属(Erwinia)的细菌特别是如Xia等(1992)中所述的草生欧文氏菌(E.herbicola)(登录号S29934)。
本发明还涉及获得耐受HPPD抑制剂的宿主生物体特别是植物细胞或植物的方法，通过在这样的生物体中整合入上述至少一个核酸序列或一个嵌合基因，再同时或相继用在该宿主生物体中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的基因对其进行转化。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及获得宿主生物体特别是植物细胞或植物的方法，其对三酮或吡唑特HPPD抑制剂，特别是特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮具有耐受性。
可用于获得用允许HPPD酶过表达的基因和允许PDH酶过表达的基因二者转化的宿主生物体特别是植物细胞或植物的手段和方法在WO04/024928中有广泛描述，其内容通过引用纳入本文。
本说明书中引用的任何在前出版物(或来源于其的信息)或任何已知事项不是也不应看作承认、认可或是任何形式的暗示该在前出版物(或信息)或已知事项形成本发明领域公知常识的一部分。
附图
图1：阿维链霉菌、胡萝卜、拟南芥、玉米、大麦、小麦叶枯病菌、粗球孢子菌、小鼠和荧光假单胞菌的HPPD序列比对。氨基酸根据假单胞菌序列编号，星号表示这些序列共有的氨基酸。
序列表
SEQIDNO1：编码荧光假单胞菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO2：荧光假单胞菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO3：编码拟南芥HPPD的核酸序列
SEQIDNO4：拟南芥HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO5：编码小鼠HPPD的核酸序列
SEQIDNO6：小鼠HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO7：编码粗球孢子菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO8：粗球孢子菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO9：编码小麦叶枯病菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO10：小麦叶枯病菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO11：编码大麦HPPD的核酸序列
SEQIDNO12：大麦HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO13：编码玉米HPPD的核酸序列
SEQIDNO14：玉米HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO15：编码胡萝卜HPPD的核酸序列
SEQIDNO16：胡萝卜HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO17：编码阿维链霉菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO18：阿维链霉菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO19：引物序列kerfi001
SEQIDNO20：引物序列kerfi002
SEQIDNO21：引物序列kerfi003
SEQIDNO22：引物序列kerfi004
SEQIDNO23：引物序列kerfi007
SEQIDNO24：引物序列kerfi008
SEQIDNO25：引物序列kerfi011
SEQIDNO26：引物序列kerfi012
SEQIDNO27：引物序列kerfi014
SEQIDNO28：引物序列kerfi016
SEQIDNO29：引物序列kerfi019
SEQIDNO30：引物序列kerfi020
SEQIDNO31：引物序列kerfi015
SEQIDNO32：引物序列kerfi018
实施例
在以下实施例的辅助下将会更好的理解本发明的各方面。以下在这些实施例中描述的所有方法和操作通过举例的方式给出，对应于从可达到相同或相似结果的不同方法中作出的选择。该选择对结果的质量没有影响，因此技术人员可使用任何合适的方法以达到相同或相似的结果。DNA片段操作的大多数方法在《现代分子生物学实验技术》("CurrentProtocolsinMolecularBiology")，第1卷和第2卷，AusubelF.M.等，格林出版公司(GreenePublishingAssociates)和WI公司(WileyInterscience)(1989)、《分子克隆》(Molecularcloning)，T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,1982或SambrookJ.和RussellD.,2001,《分子克隆：实验手册》(MolecularCloning:alaboratorymanual)(第三版)中有描述。
实施例1：突变HPPD的制备
概述
首先将拟南芥AtHPPD编码序列(1335bp)(GenebankAF047834；WO96/38567)克隆入表达载体pQE-30(QIAGEN)的限制性位点BamHI和HindIII之间。
首先将荧光假单胞菌PfHPPD编码序列(1174bp)(Rüetschi等,Eur.J.Biochem.,205,459-466,1992,WO96/38567)克隆入提供起始密码子的表达载体pKK233-2(法玛西亚公司)独特的NcoI位点。
载体pQE-30-AtHPPD和pKK233-2-PfHPPD用于PCR介导的NcoI限制性位点和编码N末端His6-标签的序列连接于AtHPPD和PfHPPD的5’端，以及XbaI限制性位点连接于AtHPPD和PfHPPD的3’段。
从琼脂糖凝胶中分离AtHPPD基因的PCR产物，用限制酶NcoI和XbaI切割，用MinEluteTMPCR纯化试剂盒(恰根公司(Qiagen))纯化，克隆入用相同限制酶切割的pSE420(RI)NX载体。
对于PfHPPD基因，从琼脂糖凝胶中分离PCR产物，克隆入载体。用限制酶NcoI和XbaI将其从该载体上切离，从琼脂糖凝胶中分离，并克隆入用相同限制酶切割的pSE420(RI)NX载体。
然后对pSE420(RI)NX-AtHPPD和-PfHPPD二者进行PCR介导的定点突变，以在两个基因的相应位点改变指定的密码子。所述密码子分别在WTPfHPPD中编码Gly336和在WTAtHPPD中编码Gly422。
采用焦磷酸测序技术分析编码序列中的突变密码子。
PCR介导的编码N末端His6-标签的序列与NcoI和XbaI限制性位点的连接：
在96孔PCR板的24孔上分别进行各基因(AtHPPD和PfHPPD)的PCR反应。由于该反应的正向和反向引物在大小上有18(AtHPPD)和22bp(PfHPPD)的差异，因此实施40.9℃-64.5℃的退火温度梯度，各孔置于该范围内的另一个退火温度下。在引物与单链模板进行第一次退火时，在新链中产生了5'突出端，直到合成出其互补链，由第一引物的5'区域形成的该突出端成为模板的一部分。由此编码序列在两端延伸，在两端引入编码N末端His6-标签的序列和限制性位点。
该反应混合物包含500ngpQE-30-AtHPPD(1μL来自质粒大量抽提)或1μgpKK233-2-PfHPPDDNA(0.75μL来自质粒大量抽提)、用于AtHPPD的kerfi001和kerfi002分别1μl、或用于PfHPPD的kerfi003和kerfi004分别1μl(所有引物溶液均具有10pmol*μL-1的浓度)、25μlHotStarTaqMasterMix(恰根公司)和分子生物学级超纯水(HyPureTMMolecularBiologyGradeWater)至终体积50μL。PCR程序设置如下：
1.95℃15分钟
2.94℃30秒
40.9℃-60.4℃30秒
72℃3分钟
步骤2重复20次。
3.72℃10分钟
对PCR反应进行琼脂糖凝胶电泳，所有均产生对应于约1500bp(AtHPPD)或1100bp(PfHPPD)片段的清晰条带。将所述条带从凝胶中切离，用凝胶回收试剂盒(GelExtractionKit)(恰根公司)纯化DNA。
克隆入载体(英杰公司(Invitrogen))
载体(3931bp)用于展现出3’-腺苷(A)突出端的Taq聚合酶-扩增PCR产物的一步法克隆。所述载体又经线性化在其末端展现出单个3’-胸苷(T)突出端。拓扑异构酶I与用来将载体共价连接到PCR产物的这些3’-胸苷共价连接。就选择携带载体的细菌细胞来说，可使用氨苄青霉素或卡那霉素。所述载体在其多克隆位点内包含XbaI限制性位点，在KanR基因内包含NcoI限制性位点。
从各凝胶提取获得的DNA溶液分别用于TOPOTA克隆。转化大肠杆菌TOP10细胞后，各反应产生出三个白色菌落(A1-A3,P1-P3)，用于接种到5mLLB/amp培养基上。
为确定这些菌落的载体是否携带正确的***片段，采用质粒小量抽提试剂盒(SpinMiniprepKit)(恰根公司)从4mL-AtHPPD培养物A1-A3和-PfHPPD培养物P1-P3制备质粒DNA。将从这些质粒制备物获得的DNA溶液用HindIII和XhoI进行限制性消化，然后置于1％琼脂糖凝胶上分析。HindIII和XhoI各自分别在-AtHPPD/-PfHPPD载体中包含单个限制性位点。限制性消化克隆A1的DNA产生了表示1461bp片段(AtHPPD编码序列)和3831bp载体片段的预期条带；限制性消化P3在琼脂糖凝胶上产生了表示1206bp片段(PfHPPD编码序列)和3831bp载体片段的预期条带。
从采用QIAfilterTM大量抽提试剂盒(MaxiKit)(恰根公司)的质粒大量抽提和随后的从100mLA1(AtHPPD)或P3(PfHPPD)液体LB/amp培养基的NaAc/EtOH沉淀获得的DNA用来测定载体中各个***HPPD基因的DNA序列。采用EMWG股份有限公司(EurofinsMWGGmbH)的引物M13uni(-21)和M13rev(-29)进行DNA测序。测序证实了载体中正确的AtHPPD和PfHPPD的DNA序列，包括编码序列两端的限制性位点。
克隆入pSE420(RI)NX
克隆和表达载体pSE420(RI)NX(5261bp)基于英杰公司的质粒pSE420。该载体的修饰包括添加卡那霉素耐受性基因和去除大部分超级连接(superlinker)区域(多克隆位点)。
该质粒包含trp-lac(trc)启动子和在每个大肠杆菌宿主菌株中提供lac阻遏物的lacIq基因。所述lac阻遏物与lac操纵基因(lacO)结合，限制靶基因的表达；可通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导减轻该抑制作用。
将基因AtHPPD和PfHPPD克隆入载体pSE420(RI)NX中限制性位点NcoI和XbaI之间。
基于PCR的定点突变：
通过质粒小量抽提从大肠杆菌TOP10液体培养物分离模板DNA(pSE420(RI)NX-AtHPPD和pSE420(RI)NX-PfHPPD)。将从这些小量抽提物获得的DNA溶液稀释到0.05μg*μL-1的浓度。
基于PCR的定点突变需要与相同DNA区域互补的两个化学合成的DNA引物(正向和反向引物)，两个引物各与双链DNA模板的一条链互补。这些引物在其中心包含所需的突变，覆盖约20-30个模板核苷酸的区域，包括突变位点和两侧各10-15个碱基。所述突变位点覆盖在引物中独立变化的三个核苷酸，以在所选位点获得各可能的密码子。
在循环PCR突变中，通过从整合入生成链的引物3’OH端开始的滚环复制对质粒模板进行完全复制。各新DNA分子携带一个或多个包含于引物中的改变的核苷酸。采用高保真DNA聚合酶以降低出现另外不需要的突变的可能性。
将寡核苷酸引物对kerfi007/kerfi008(AtHPPD)和kerfi011/kerfi012(PfHPPD)溶解于水中至10pmol*μL-1的浓度。对于突变PCR反应，采用50ng来自pSE420(RI)NX-AtHPPD或pSE420(RI)NX-PfHPPD小量抽提的模板质粒，稀释至0.05μg*μL-1的浓度。反应混合物的组成如下：
1μL模板质粒(0.05μg*μL-1)
1.5μL引物kerfi007(或kerfi011)(10pmol*μL-1)
1.5μL引物kerfi008(或kerfi012)(10pmol*μL-1)
5μL10x反应缓冲液
1μLdNTPmix
40μLHyPureTM分子生物学级用水
1μL高保真DNA聚合酶(2.5U*μL-1)
PCR程序与AtHPPD和PfHPPD突变的程序相同，延伸时间设为7分钟，假设1分钟复制1kb质粒DNA。
步骤2重复18次。
PCR反应后，将反应置于冰上冷却至室温。
引物名称 引物序列
kerfi007 5’-GGTGGTTTTGGCAAANNNAATTTCTCTGAGCTC-3’
kerfi008 5’-GAGCTCAGAGAAATTNNNTTTGCCAAAACCACC-3’
kerfi011 5’-CAGCGCCTTGAAGTTNNNCTCGCCAAACCCATC-3’
kerfi012 5’-GATGGGTTTGGCGAGNNNAACTTCAAGGCGCTG-3’
PCR反应后，采用DpnI限制性内切酶对突变质粒进行选择。仅有dam-甲基化DNA被限制性酶DpnI降解，其限制性位点GMe6ATC相对充足。细菌产生的模板质粒发生了甲基化，因此降解。然而PCR-扩增的DNA仍保持原样。
将1μLDpnI限制性酶(10U*μL-1)加入到PCR反应中，通过上下抽吸混合溶液。离心(13,200rpm)1分钟后，将反应置于37℃温育1小时。
突变质粒在各引物的5'端包含交错的缺口，可直接转化入感受态细胞。
为浓缩突变质粒，进行NaAc/EtOH沉淀，在10μLHyPureTM分子生物学级用水中重悬DNA。稍后用3μL这些质粒溶液转化电转感受态大肠杆菌K-12MG1655细胞，在AtHPPD的情况中，用1μL转化电转感受态大肠杆菌TOP10细胞。
对于AtHPPD来说，一共获得62个大肠杆菌K-12MG1655克隆，对其进行培养用于随后在孔2mL深孔板中分析突变密码子。为获得更多数量的克隆，将大肠杆菌TOP10用作克隆突变质粒的替代宿主。用突变质粒转化大肠杆菌TOP10细胞产生了几百个克隆。
对于PfHPPD，一共获得252个大肠杆菌K-12MG1655克隆，对其进行培养用于所述对AtHPPD质粒转化克隆的分析。
实施例2：反应证实点突变
采用技术通过测定一段短的限定DNA的核酸序列证实点突变。首先进行PCR反应扩增包含待测序段的短DNA片段。PCR扩增模板需为单链，与生物素分子在其5’端共价结合。生物素用于将模板非共价附着于与交联琼脂糖固定相连接的链霉亲和素。
生物素化DNA片段的扩增：在96孔PCR板上进行PCR反应。反应混合物包含1μL正向引物溶液(用于AtHPPD的kerfi016，用于PfHPPD的kerfi020；10pmol*μL-1)、1μL反向引物溶液(包含在其5’端的生物素修饰；用于AtHPPD的kerfi019，用于PfHPPD的kerfi014；10pmol*μL-1)、2μL在深孔板中培养克隆的液体细菌培养物、25μLMasterMix和21μLHyPureTM分子生物学级用水。
用于AtHPPD和PfHPPD的PCR程序在退火温度方面存在差异，分别设为55℃和60℃。
1.95℃15分钟
2.94℃30秒
55℃/60℃30秒
72℃30秒
步骤2重复32次。
3.72℃10分钟
反应：在96孔板上进行反应(拜尔塔格公司(Biotage))。对于每45μLPCR反应，加入40μL结合缓冲液(10mMTris-HCl；2MNaCl；1mMEDTA；0.1％吐温20)、3μL链霉亲和素琼脂糖珠(组成所有权-GE医疗集团生物科学部门(GEHealthcareBioScienceAB))和12μLddH2O。在96孔板中将这些混合物摇动10分钟。
然后采用“真空预装工具”，将各溶液拉穿过连接于小金属管的小过滤器，而此时与生物素化PCR产物结合的链霉亲和素珠通过抽吸保留在过滤器上。根据该原理，然后将过滤器浸于70％乙醇5秒钟，以洗涤DNA并去除引物、dNTP和其它PCR反应组分。采用0.2MNaOH重复该步骤，以使dsDNA变性，仅使生物素化DNA链与链霉亲和素珠结合。在洗涤缓冲液中对DNA进行最终洗涤后，将所述“真空预装工具”置于每孔包含40μL退火缓冲液和引物溶液(100pmol*μL*；用于AtHPPD的kerfi018/用于PfHPPD的kerfi015)的PSQTM96孔板上。然后关闭真空，将各过滤器浸入其相应的孔中，以溶解过滤器保留的DNA。然后将孔板置于80℃温育2分钟，以拆分DNA模板内最终形成的二级结构。在溶液冷却至室温时，引物与其模板上的结合位点发生杂交。
将反应的剩余组分(620μL酶混合物、620μL底物混合物和130μL各dNTP溶液)填充入筒的各个孔中。然后将该筒和PSQTM板置于PyroMarkTMID内。
设备在测序反应由加入第一dNTP启动前自动将酶和底物加入到反应混合物中。为测定引物下游的DNA序列，进行SQA运行程序。预先定义向反应混合物中加入核苷酸的顺序。可采用PyroMarkTMID软件翻译进入DNA序列的曲线。
结果：
AtHPPD的PCR扩增片段大小为239bp，生物素附着于非编码链；PfHPPD片段包含142bp，生物素附着于编码链。
AtHPPD中的突变密码子位于kerfi018引物序列下游三个碱基。测序的第一组三个碱基是腺嘌呤，后面是突变的密码子。AtHPPD片段的编码链由DNA聚合酶合成，因此该序列可直接翻译为氨基酸序列。
对438个AtHPPD菌落进行筛选得到146个突变基因、181个野生型基因(第422位的密码子GGC)和111个失败的测序反应或模糊结果。
因此在大肠杆菌K-12MG1655或大肠杆菌TOP10中转化突变质粒产生突变克隆在所有例子的33％中取得了成功。可获得编码除赖氨酸外所有氨基酸的密码子。包含谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸的密码子的基因存在于大肠杆菌TOP10克隆中，由其制备DNA并转化入大肠杆菌K-12MG1655细胞中。如果可能，可考虑大肠杆菌K-12中的密码子使用选择同义密码子。使用频率低于10％的密码子不予选择，选择最多的密码子使用频率高于35％(密码子使用数据库；大肠杆菌K-12：http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝83333)。
从引物kerfi015开始，PfHPPD片段的非编码链由DNA聚合酶合成，因此该核苷酸序列在可翻译为氨基酸序列前需要翻译为反向互补物。所述突变密码子紧接在引物之后，因此由反应中测序的第一组三个碱基表示。
对252个PfHPPD菌落进行筛选得到119个突变基因、73个未改变基因(第336位的密码子TGG)和60个失败的测序反应或模糊结果。
因此在大肠杆菌K-12MG1655细胞中转化突变质粒产生突变克隆在所有例子的47％中取得了成功。可获得编码除丙氨酸外所有氨基酸的密码子。如果可能，可考虑如上所述AtHPPD密码子情况的大肠杆菌K-12中的密码子使用选择同义密码子。
引物名称 引物序列
kerfi015 5’-GACTCGAACAGCGCCTTGAAGTT-3’
kerfi018 5’-GGATGTGGTGGTTTTGGC-3’
实施例3：HPPD活性试验
HPPD从4-HPP和O2产生尿黑酸和CO2。该酶在有或没有抑制剂存在下与其底物4-HPP温育。L-抗坏血酸作为还原剂存在以将活性中心铁保持为亚铁形式，过氧化氢酶存在以降解有毒的H2O2。在温育1小时后，加入2,4-二硝基苯肼(DNP)停止反应。DNP与碱性pH下呈琥珀褐色的试验混合物中的剩余4-HPP分子形成腙衍生物。未消耗的4-HPP量在405nm进行光度测定。
对于抑制剂储备溶液的制备，将特波三酮(Mw＝440.82)和DKN(Mw＝359.3)溶解于DMSO至10mM的浓度。首先将该储备溶液在25％DMSO中稀释20倍至0.5mM的浓度。用ddH2O进一步稀释以获得用于试验的抑制剂溶液(5μM、10μM和20μM)。各抑制剂溶液分别占试验混合物体积的一半，即，其活性浓度再次降低2倍。这导致产生2.5μM、5μM和10μM的抑制剂浓度。2％DMSO溶液提供未抑制反应中一半的检测混合物以标准化DMSO可能的抑制作用。
试验设计用于基于单体的HPPD浓度为444nM和4-HPP浓度为500μM。这对应于100μL试验混合物中的44.4pmolHPPD和50nmol4-HPP，导致底物相对于酶约过量1000倍。AtHPPD亚基的计算的理论分子量为49.515kD，导致每份试验混合物2.2μgHPPD。PfHPPD亚基的计算的理论分子量为41.205kD，导致每份试验混合物1.8μgHPPD。该酶溶液提供1/4的试验混合物体积，因此通过用50mMTRIS缓冲液将AtHPPD溶液稀释至88μg*mL-1制备酶储备溶液；将PfHPPD溶液稀释至72μg*mL-1。
抑制剂浓度(2.5μM、5μM和10μM)提供相比酶量的5倍、10倍和20倍的过量抑制剂。制备提供1/4试验混合物的缓冲液/底物溶液。2.5mL缓冲液/底物溶液包含1mL1MTRIS缓冲液、500μL10mM4-HPP溶液、500μL200mML-抗坏血酸溶液、13μL过氧化氢酶溶液和487μLddH2O。
在GreinerF底96孔微板上进行试验，一式三份进行所有反应。每板进行六重对照，包含25μL50mMTRIS替代HPPD溶液(对应于4-HPP的0％消耗)或含500μL1MTRIS替代500μL10mM4-HPP(对应于HPP的100％消耗)的缓冲液/底物溶液。向50μL各抑制剂溶液或50μL2％DMSO和25μL缓冲液/底物溶液的混合物中加入25μLHPPD溶液启动反应。允许反应在室温下进行1小时。停止反应，通过加入50μL0.04％DNP/3.8NHCl溶液诱导4-HPP的显色。15分钟后加入100μL5NKOH，引起腙衍生物的颜色转移。紧接着用BMGFLUOstarGalaxy微板分析仪在405nm进行光度测定，获得的数据用于分析有和没有抑制剂存在时的HPPD活性。
结果：
在HPPD活性试验中检测SEQIDNO4所示拟南芥HPPD的氨基酸序列第422位发生突变的AtHPPD突变体(即Gly422Ala、-Arg、-Asn、-Asp、-Cys、-Glu、-His、-Leu、-Met、-Phe、-Pro、-Ser、-Tyr和-Val)和野生型(WT)酶(应注意，SEQIDNO4所示拟南芥HPPD的氨基酸序列的Gly422对应于SEQIDNO:2所示假单胞菌参考序列的Gly336)。所有酶均具有活性，但仅突变体Gly422Ala、-Asn、-Asp、-Cys、-His、-Met、-Phe、-Tyr和-Val的活性在野生型酶的范围之内或之上(≥70％)。野生型酶在2.5μM特波三酮存在下保持其35％的活性；仅突变体Gly422Asn、-Cys、-His和-Val保持较高活性，分别是39、44、51和43％。活性在更高的特波三酮浓度下进一步降低。仅突变体Gly422His在5和10μM特波三酮存在下表现出约40％的残余活性，其它所有酶在这些抑制剂浓度下均表现出可与野生型酶相当的活性，分别在约20和10％(表1)。
测试PfHPPD突变体Gly336Arg、-Asp、-Gln、-Glu、-His、-Leu、-Lys、-Met、-Phe、Thr、Trp和-Pro和野生型酶。除未抑制活性处于70％野生型活性以下的Gly336Pro突变体外，Gly336突变体的活性在野生型酶的范围之内或之上(≥75％)。野生型酶在2.5μM特波三酮存在下仅保持了其5％的活性，而突变体Gly336Asp、-Arg,-Gln、-Glu、-His、-Met、-Phe和-Trp保持了高于14％的活性。最高的残余活性来自Gly336His(26％)和Gly336Phe(33％)。有趣的是，Gly336His突变体在5和10μM特波三酮存在下分别表现出13和11.2％的残余活性，而Gly336Phe的活性分别降低至12.4和2.5％。Gly336Met突变体在这些抑制剂浓度下分别表现出7和10％的残余活性，而野生型酶的活性降低至0(表1)。
表1：有和没有特波三酮存在时PfHPPD和AtHPPD突变体的相对活性(百分比)；通过将未抑制酶活性设为100％对活性进行标准化
荧光假单胞菌HPPD
拟南芥HPPD
*SEQIDNO4所示拟南芥HPPD的氨基酸序列第422位gly处的突变(对应于SEQIDNO2所示假单胞菌HPPD的氨基酸序列的Gly336)
实施例4：PDH活性试验
在25℃下，在包含50mMtris-HCl、pH8.6、300μM预苯酸和1mMNAD或NADP总体积为200μl的溶液中，通过在340nm用分光光度法监测NADH或NADPH的形成对预苯酸脱氢酶活性进行测定。
实施例3：构建嵌合基因以便评价烟草中未突变和突变的PfHPPD。
A)所述嵌合基因的构建：
为制备在PBD6型烟草植物中表达的HPPD(野生型或突变体)的构建体采用的载体指定为pRP-RD224。起初设计该载体用于仅通过取代KpnI和BstEII位点之间该载体的截短HPPD基因来克隆所有的假单胞菌HPPD突变体。从双元载体pBI121(克隆技术公司(Clontech))对其进行构建在WO99/24585中有广泛描述。
因此克隆pRP-RD224具有以下结构：
RB/Nos启动子/NPTII/Nos终止子/双组蛋白启动子/tev/otp/截短的HPPD/Nos终止子/LB
其中“截短的HPPD”指截短了约500个碱基对的编码PfHPPD的序列，以随后促进筛选整合了突变HPPD的转化菌落(WO99/24585)。
pRP-RD224突变体：用KpnI和BstEII消化携带突变和未突变HPPD的载体DNA，纯化，然后连接入已用KpnI和BstEII消化并纯化的载体pRP-RD224。通过用KpnI和BstEII消化来选择对整合了突变HPPD基因的转化体的***体大小。所得克隆指定为pRP-RD224，向其加入发生于HPPD上的突变类型；以该方式创建了以下克隆：pRPRD224Pf(未突变酶)、pRPRD224PfH336(在第336位具有组氨酸的酶)、pRPRD224PfM336(在第336位具有甲硫氨酸的酶)和pRPRD224PfF336(在第336位具有苯丙氨酸的酶)。
实施例4：过表达PDH嵌合基因的构建
构建过表达PDH的嵌合基因包括在转录方向上装配如专利申请EP0507698所述的“双组蛋白”启动子(PdH4)、Carrington和Freed(1990)中描述的烟草蚀纹病毒翻译增强子(TEV)序列、如专利申请EP0508909所述的编码优化转运肽(OTP)的序列、Mannhaupt等(1989)中描述的酵母PDH基因的编码部分和Bevan等(1983)中描述的胭脂碱合成酶基因的nos终止子。然后将该装配物克隆入包含卡那霉素耐受性基因(NPTII)的双元载体pRD224，以提供载体pRD224-PDH。
然后该双元载体用于转化农杆菌菌株EHA105以提供农杆菌菌株EHA105-pRD224-PDH。该农杆菌菌株用于转化用如实施例3所述的嵌合基因转化的烟草植物。
用卡那霉素选择转化植物。
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Claims (18)

1.突变的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，其保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对三酮HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其特征在于其在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的氨基酸序列第336位的氨基酸甘氨酸上包含选自下组的突变：Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe和Gly336Cys。
2.如权利要求1所述的突变HPPD，其特征在于，所述突变HPPD包含第二突变。
3.如权利要求2所述的突变HPPD，其特征在于，所述第二突变氨基酸选自以下氨基酸：SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD序列的Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337。
4.如权利要求1-3中任一项所述的突变HPPD，所述三酮HPPD抑制剂选自：特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。
5.如权利要求4所述的突变HPPD，所述三酮HPPD抑制剂是特波三酮。
6.编码如权利要求1-5中任一项所述的突变HPPD的核酸序列。
7.在5’和任选在3’位置包含编码序列以及异源调控元件的嵌合基因，其能在宿主生物体中发挥作用，其特征在于所述编码序列包含至少一个如权利要求6所述的核酸序列。
8.如权利要求7所述的嵌合基因，其特征在于，其在编码突变HPPD的核酸序列的5’位置包含编码植物转运肽的核酸序列，其中该序列位于启动子区域和编码突变HPPD的序列之间，从而允许转运肽/突变HPPD融合蛋白的表达。
9.转运肽/突变HPPD融合蛋白，其中所述突变HPPD如权利要求1-5中任一项定义。
10.用于转化宿主生物体的克隆和/或表达载体，其特征在于其包含至少一个如权利要求7-8中任一项所述的嵌合基因。
11.获得耐受三酮HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于用如权利要求7-8中任一项所述的嵌合基因转化所述植物。
12.如权利要求11所述的获得耐受三酮HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于，用在该植物中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的第二基因同时或相继进一步转化所述植物。
13.在包含至少含有如权利要求6所述核酸序列或如权利要求7-8中任一项所述嵌合基因的种子或植物的区域或田地中控制杂草的方法，该方法包括对所述区域或田地施用对所述杂草有毒剂量的三酮HPPD抑制剂除草剂，而不显著影响包含如权利要求6所述核酸序列或权利要求7-8中任一项所述嵌合基因的种子或植物。
14.获得油或粗碾谷物的方法，包括种植至少包含如权利要求6所述核酸序列或如权利要求7-8中任一项所述嵌合基因的转化植物，任选用三酮HPPD抑制剂除草剂处理该植物，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并任选提取油。
15.如权利要求11-14任一项所述的方法，其中所述三酮HPPD抑制剂选自：特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述三酮HPPD抑制剂为特波三酮。
17.在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的氨基酸序列第336位的氨基酸甘氨酸上发生突变的HPPD在赋予植物耐受三酮HPPD抑制剂中的应用，其特征在于所述HPPD突变选自：Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe和Gly336Cys。
18.如权利要求17所述突变HPPD的应用，其特征在于，所述HPPD抑制剂选自特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。
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