CN105311075A - 一种刺五加提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药提取物制备方法，具体涉及一种刺五加药材的提取物制备方法。本发明创造为将刺五加药材经40-70％乙醇逆流提取、醇沉、树脂纯化、灭菌浓缩等工序制备得刺五加提取物。本发明创造提供的方法，能够显著降低刺五加提取物中的杂质，提高刺五加提取物中有效成分的纯度及刺五加提取物的安全性和稳定性，同时又能缩短提取周期节能高效，特别适合工业化生产。

Description

一种刺五加提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物制备方法，具体涉及一种刺五加提取物的制备方法。

背景技术

刺五加(Acanthopanaxsenticosus)为五加科植物，其干燥根和茎具有舒筋活血、益气健脾及补肾安神的药用功效。现代中医药制剂学中将刺五加经提取加工制成注射液，主要功效为平补肝肾，益精壮骨，用于治疗肝肾不足所致的短暂性脑缺血发作，脑动脉硬化，脑血栓形成及脑栓塞等病症；同时也用于治疗冠心病，心绞痛合并神经衰弱和更年期综合症等。

刺五加中的主要活性成分为黄酮、皂苷类及多糖，苷类含量最高的是刺五加苷B(紫丁香苷)和刺五加苷E，也含有多种氨基酸、脂肪酸、维生素及矿物质。近年来，有较多关于刺五加活性物质提取分离的技术研究被报道或推广应用，主要目的是提高刺五加中总黄酮、紫丁香苷及刺五加苷E的含量或纯度，降低其杂质成分的含量，以提高刺五加制剂的有效性、稳定性及用药安全性。

如中国专利申请CN101084953A一种制备刺五加提取液/物的方法；CN101810656A一种刺五加提取物及其药物组合物；CN102579532A一种刺五加组合物、含其制剂及其检测方法等，均是以水溶液提取刺五加药材，再经过醇沉或大孔树脂过滤等方法制备刺五加提取物。这些现有技术方法中均存在提取速率缓慢，提取周期长，有效成分提取率低，溶剂使用量大，导致后处理过程复杂，相应产生的的杂质增加，不经增加了生产成本，还大大影响了刺五加提取物在药物制剂中的质量，不利于产业化生产和刺五加制剂的药用安全。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种提取速率快、有效成分提取率高的刺五加提取物制备方法。

本发明采用的技术方案为将刺五加药材经乙醇提取、醇沉、树脂纯化、灭菌、超滤浓缩等工序制备而成。

具体包括以下步骤：

1)用3～8体积倍量的乙醇逆流提取刺五加药材，合并提取液，浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃测)；

2)加入高浓度乙醇使药液乙醇浓度达到75％～85％，充分搅拌，静置12～24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.11～1.25(80℃测)；

3)用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至4.0～6.0，搅拌均匀，药液经微孔滤膜过滤澄清后，上大孔树脂柱，然后用纯化水洗脱；再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至80℃下相对密度为1.10～1.20；

4)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，高温灭菌处理后冷冻10～24小时，调节pH值为酸性，经微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃测)，得刺五加提取物。

上述方法，所述步骤1)中乙醇为40％～70％的乙醇，优选为55％的乙醇；逆流提取流速为25～35min/罐，提取温度为30～80℃，提取时间为0.5～2小时；优选提取流速为30min/罐，提取温度为50℃，提取时间为1小时；

步骤2)中高浓度乙醇为浓度大于或等于93％的乙醇，优选为95％的乙醇；

步骤3)中微孔滤膜孔径为0.45μm；上大孔树脂柱流速为0.5～2.5BV/h，然后以同样的流速用1～3倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用3～5体积倍量的30％～70％乙醇洗脱，优选为4体积倍的50％乙醇洗脱；

所述大孔树脂型号为DM1180、ADS-F8、ADS-17、HPD750、D101、HPD100、HPD450、AB-8或DM130，优选为DM1180、ADS-F8或HPD100。

步骤4)中高温灭菌处理为115～121℃下40～60分钟；调节pH值酸性至4.0～6.5，微孔滤膜过滤中膜孔径为0.45μm；一万级超滤过程中，所用超滤膜的单位为截留分子量。

上述步骤中所涉及的“％”含量均为体积百分比。

优选地，所述刺五加提取物由以下方法制备：

1)用3～8体积倍量的40％～70％乙醇逆流提取刺五加药材，逆流提取流速为25～35min/罐，提取温度为30～80℃，提取时间为0.5～2小时，合并提取液，浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃测)；

2)加入93％以上乙醇使药液乙醇浓度达到75％～85％，充分搅拌，静置12～24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.11～1.25(80℃测)；

3)用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至4.0～6.0，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以0.5～2.5BV/h流速上大孔树脂柱，然后以同样的流速用1-3倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用3～5体积倍量的30％～70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃测)，

所述大孔树脂型号为DM1180、ADS-F8、ADS-17、HPD750、D101、HPD100、HPD450、AB-8或DM130；

4)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，115～121℃灭菌40～60分钟，冷冻10～24小时，调节pH值至4.0～6.5，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃测)，得刺五加提取物。

更优选地，所述刺五加提取物由以下方法制备：

1)用6体积倍量的55％乙醇逆流提取刺五加药材，逆流提取流速为30min/罐，提取温度为50℃，提取时间为1小时，合并提取液，浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃测)；

2)加入95％的乙醇使药液乙醇浓度达到75％～85％，充分搅拌，静置12～24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.11～1.25(80℃测)；

3)用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至4.0～6.0，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以0.5～2.5BV/h流速上DM1180大孔树脂柱，然后以同样的流速用1-3倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用4体积倍量的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃测)；

4)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，115～121℃灭菌50分钟，冷冻16小时，调节pH值至4.0～6.5，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃测)，得刺五加提取物。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明所提供的方法中刺五加药材经乙醇逆流提取和现有技术中水加热提取或水回流提取相比具有显著的优势，不仅减少了溶剂的使用节省能耗，而且在逆流提取过程中药材和提取溶剂保持一定速率的逆向运动(发明人研究发现尤其在50℃下，流速为30min/罐，提取1小时，提取率最佳)，使药材中的有效成分物质提取更加充分，提高有效物质的提取率，提取速率更快，缩短提取周期；其次提取过程中溶剂的使用量减少，也避免引入更多的杂质，使浓缩后处理更为简便。

其次，提取后经过醇沉、大孔树脂纯化有效除去大分子蛋白质等物质，减少提取液中杂质残留，提高提取物纯度，高温灭菌后进一步使用超滤，提高包含所得刺五加提取物制剂的安全性，同时也最大程度减少有效成分的损失，有效控制刺五加提取物中总黄酮、紫丁香苷及刺五加苷E有效成分的含量。

本发明提供的方法还具有操作简单，节省生产周期，安全高效的优点特别适合工业化生产。

具体实施方式

除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域公知的或常用的，若未特别指明，本发明实施例中所用的试验材料。试剂盒仪器等均可市售获得。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。

实施例1：刺五加提取物的制备

1)用3体积倍量(15L)的40％乙醇逆流提取5kg刺五加药材，逆流提取流速为25min/罐，提取温度为30℃，提取时间为2小时，合并提取液，浓缩至相对密度为1.20(80℃测)；

2)加入93％的乙醇使药液乙醇浓度达到75％，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.11(80℃测)；

3)用注射用水稀释至含总黄酮约5.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至4.0，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以0.5BV/h流速上ADS-F8大孔树脂柱，然后以同样的流速用1倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用3体积倍量的30％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至相对密度为1.10(80℃测)；

4)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约5.0mg/ml，115灭菌60分钟，冷冻10小时，调节pH值至4.0，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至相对密度为1.20(80℃测)，得刺五加提取物。

实施例2：刺五加提取物的制备

1)用8体积倍量(32L)的70％乙醇逆流提取4kg刺五加药材，逆流提取流速为35min/罐，提取温度为80℃，提取时间为0.5小时，合并提取液，浓缩至相对密度为1.25(80℃测)；

2)加入98％的乙醇使药液乙醇浓度达到85％，充分搅拌，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.25(80℃测)；

3)用注射用水稀释至含总黄酮约20.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至6.0，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以2.5BV/h流速上ADS-17大孔树脂柱，然后以同样的流速用3倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用5体积倍量的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至相对密度为1.20(80℃测)；

4)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约20.0mg/ml，121℃灭菌40分钟，冷冻24小时，调节pH值至6.5，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至相对密度为1.25(80℃测)，得刺五加提取物。

实施例3：刺五加提取物的制备

1)用6体积倍量(30L)的55％乙醇逆流提取5kg刺五加药材，逆流提取流速为30min/罐，提取温度为50℃，提取时间为1小时，合并提取液，浓缩至相对密度为1.25(80℃测)；

2)加入95％的乙醇使药液乙醇浓度达到80％，充分搅拌，静置10小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.20(80℃测)；

3)用注射用水稀释至含总黄酮约15mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至5.0，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以1.5BV/h流速上DM1180大孔树脂柱，然后以同样的流速用2倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用4体积倍量的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至相对密度为1.15(80℃测)；

4)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约10.0mg/ml，120℃灭菌50分钟，冷冻16小时，调节pH值至5.0，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至相对密度为1.25(80℃测)，得刺五加提取物。

实施例4：刺五加提取物浸膏的制备

1)用7体积倍量(42L)的60％乙醇逆流提取6kg刺五加药材，逆流提取流速为32min/罐，提取温度为60℃，提取时间为1.5小时，合并提取液，浓缩至相对密度为1.20(80℃测)；

2)加入96％的乙醇使药液乙醇浓度达到80％，充分搅拌，静置15小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.11(80℃测)；

3)用注射用水稀释至含总黄酮约12.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至4.5，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以2.0BV/h流速上HPD750大孔树脂柱，然后以同样的流速用3倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用4体积倍量的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至相对密度为1.20(80℃测)；

4)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约12.0mg/ml，118℃灭菌55分钟，冷冻18小时，调节pH值至6.0，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至相对密度为1.25(80℃测)，得刺五加提取物。

实施例5：刺五加提取物有效成分及钾离子含量检测

检测例：本发明实施例1-4所述方法制备获得刺五加提取物

1)总黄酮测定方法：

对照品溶液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置100ml量瓶中，加60％乙醇适量，置80℃水浴中加热，使溶解，放冷，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含无水芦丁0.1mg)。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置10ml量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，再加氢氧化钠溶液(1mol/L)4ml，用30％乙醇稀释至刻度，放置10分钟，按照分光光度法，在510nm波长处测定吸收度，同时作空白，以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取本发明实施例1-4所得提取物，用30％乙醇制成每1ml约含总黄酮0.3mg的溶液，每组2份，作为供试品溶液，精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加5％亚硝酸钠溶液0.3ml”起，依法测定吸收度，计算即得。

2)紫丁香苷和刺五加苷E测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010版附录VID)测定。

色谱条件与***适用性试验：在超高效液相色谱(UPLC)上分析；应用ACQUITYUPLCBEHC18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液(V/V)为流动相B，按下表(表1)中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长为220nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于30000；刺五加苷E峰的分离度应达到1.5。

表1：梯度洗脱

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0-3.2	5-9.2	95-90.8
3.2-10	9.2-22	90.8-78
			10.0-12.0	100	0
12.0-15.0	5	95

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品适量，精密称定，分别加50％甲醇制成每1ml各含紫丁香苷40μg、刺五加苷E20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本发明实施例1-4所得提取物，每组2份，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定即得。

检测结果：检测物中各成分含量

上述结果表明本发明提供的方法所制备的刺五加提取物单位量中有效成分的含量均较高，使产品更适合用于刺五加制剂产业化生产。

应当说明的是，虽然本发明以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种刺五加提取物的制备方法，其特征在于将刺五加药材经40％～70％的乙醇逆流提取，再用浓度大于或等于93％的乙醇进行醇沉，然后上大孔树脂柱进行纯化，高温灭菌后进行超滤，最后浓缩制得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的乙醇逆流提取流速为25～35min/罐，提取温度为30～80℃，提取时间为0.5～2小时。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的乙醇逆流提取流速为30min/罐，提取温度为50℃，提取时间为1小时。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的醇沉使用浓度为95％的乙醇。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的上大孔树脂柱流速为0.5～2.5BV/h；大孔树脂型号为DM1180、ADS-F8、ADS-17、HPD750、D101、HPD100、HPD450、AB-8或DM130，优选为DM1180、ADS-F8或HPD100。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂柱洗脱先用与上柱同样的流速1～3倍柱体积纯化水洗脱；再用3～5体积倍量的30％～70％乙醇洗脱。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的高温灭菌处理为115～121℃下40～60分钟。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的超滤为一万级超滤，所用超滤膜的单位为截留分子量。

9.如权利要求1-8所述的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：

a)用3～8体积倍量的40％～70％乙醇逆流提取刺五加药材，逆流提取流速为25～35min/罐，提取温度为30～80℃，提取时间为0.5～2小时，合并提取液，浓缩至80℃下相对密度为1.20～1.25；

b)加入93％以上乙醇使药液乙醇浓度达到75％～85％，充分搅拌，静置12～24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至80℃下相对密度为1.11～1.25；

c)用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至4.0～6.0，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以0.5～2.5BV/h流速上大孔树脂柱，然后以同样的流速用1～3倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用3～5体积倍量的30％～70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至80℃下相对密度为1.10～1.20，大孔树脂型号为DM1180、ADS-F8、ADS-17、HPD750、D101、HPD100、HPD450、AB-8或DM130；

d)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，115～121℃灭菌40～60分钟，冷冻10～24小时，调节pH值至4.0～6.5，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至80℃下相对密度为1.20～1.25，得刺五加提取物。

10.如权利要求1-8所述的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：

a)用6体积倍量的55％乙醇逆流提取刺五加药材，逆流提取流速为30min/罐，提取温度为50℃，提取时间为1小时，合并提取液，浓缩至80℃下相对密度为1.20～1.25；

b)加入95％的乙醇使药液乙醇浓度达到75％～85％，充分搅拌，静置12～24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相80℃下对密度为1.11～1.25；

c)用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，搅拌均匀后，过滤，调节滤液pH值至4.0～6.0，搅拌均匀，药液经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，以0.5～2.5BV/h流速上DM1180大孔树脂柱，然后以同样的流速用1～3倍柱体积纯化水洗脱，弃去；再用4体积倍量的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至80℃下相对密度为1.10～1.20；

d)将浓缩后的洗脱液用注射用水稀释至含总黄酮约5.0～20.0mg/ml，115～121℃灭菌50分钟，冷冻16小时，调节pH值至4.0～6.5，经0.45μm微孔滤膜过滤澄清后，再经一万级超滤；滤液浓缩至80℃下相对密度为1.20～1.25，得刺五加提取物。