CN106404929A - 一种刺五加注射液的成分分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种刺五加注射液的成分分析方法。所述的成分分析方法利用UPLC指纹图谱检测方法，包括以下步骤：(1)、样品制备；(2)、超高效液相色谱检测。本发明提供的刺五加注射液的成分分析方法具有相对更高的灵敏度、稳定性、重复性、特异性；能够识别出刺五加注射液中的更多成分；缩短了常规分析方法的采集时间；峰与峰之间具有更高的分离度；确定了图谱中个个成分峰所对应的具体化合物，为刺五加注射液的标准化检测分析提供的了可靠的参照。本发明提供的刺五加注射液的成分分析方法为刺五加注射液的生产质量控制和临床应用安全提供了可靠保障。

Description

一种刺五加注射液的成分分析方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种刺五加注射液的成分分析方法。

背景技术

刺五加注射液为刺五加经提取加工而制成的灭菌水溶液，有平补肝肾，益精壮骨之功能，主治肝肾不足所致的短暂性脑缺血发作，脑动脉硬化，脑血栓形成，脑栓塞等。刺五加的化学成分主要包括苯丙酸类、香豆素类、木脂素类、含氮碱基类、糖、氨基酸等。

由于刺五加注射液中成分种类较多，目前还没有一种检测分析方法能够较为全面的检测刺五加注射液中的多种成分，而市售刺五加注射液种类规格和生产厂家各不相同，缺乏统一全面的检测方法将使其质量控制面临严峻考验。另一方面，随着近年来刺五加注射液的广泛应用，其不良反应的报道也逐年增多，众所周知，中药注射液成分复杂，其中任何一种成分及其含量的变化均有可能成为致敏原因，因此对注射液成分及其含量的监测尤为重要。

由于刺五加注射液中成分种类较多，单一指纹图谱无法全面反映化合物的信息。目前建立起的刺五加注射液指纹图谱检测方法分辨率相对较弱，仅能识别15个左右的成分；谱图中各成分峰的区分度较差，相互之间存在明显干扰，直接影响检测分析结果的准确性；背景杂峰相对较多，对注射液中的活性成分峰存在影响，也会直接影响到检测分析结果的准确性；耗时相对较长，识别出15个左右的成分峰通常需要50分钟以上；流动相成分和浓度选择不合理，可能导致许多成分峰无法被识别到，进而无法监测注射液中的相应成分含量；并未对识别出的成分峰进行鉴定，因此无法得知识别出的所有成分峰对应的具体成分。

例如，中国专利申请200410044162公开了一种刺五加指纹图谱检测方法，采用0.1％的磷酸溶液作为A相，30％的乙腈70％水的水溶液作为B相进行梯度洗脱，采集70min之内数据。其附图公开的指纹图谱中，仅识别出14个成分峰，且除紫丁香苷外其他成分未知，背景杂峰相对较多，基线相对不平稳，区分度相对较小。

又例如，中国专利申请201210049755公开了一种刺五加组合物，含其制剂及其检测方法。其中还包括指纹图谱的检测方法，其特征在于，该指纹图谱的检测方法采用高效液相色谱法，应用Agilent的ZorboxEclipse XDB-C18色谱柱，柱温为20℃，流速为每分钟0.8ml，检测波长为270nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于6000，且与其相邻的色谱峰的分离度应达到1.5以上，梯度洗脱程序如下：流动相A为0.5％的甲酸溶液，流动相B为乙腈和水，其体积比为30∶70，0分钟时为100％的流动相A；15分钟时为88％的流动相A和12％的流动相B；21分钟时为82％的流动相A和18％的流动相B；60分钟时为31％的流动相A和69％的流动相B；65分钟时为100％的流动相B；70-75分钟时为100％的流动相A。该方法仅能识别出14中成分峰，且基线相对不平稳，背景杂峰较多，严重影响对成分峰的判定。

中药注射液由于其成分相对较为复杂，因此质量控制的难度也相对较大，然而日渐增多的不良反应发生案例使得我们不得不面对如何提高其质量控制这一难题。就刺五加注射液而言，含有多种主要活性成分，除此之外还含有各种微量活性成分，无可避免的还含有一些杂质成分。如何一次就能将刺五加注射液中的各种成分尽可能多地识别出来，对其生产制造以及临床使用中的质量监控非常重要。

综上所述，提供一种刺五加注射液的成分分析方法，能够尽可能多的识别出其中的各种成分是其生产制造和临床应用中亟待解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种刺五加注射液的成分分析方法。

所述的成分分析方法利用超高效液相色谱指纹图谱检测方法。

所述的指纹图谱检测方法包括以下步骤：

(1)、样品制备：精密量取待检测刺五加注射液1-5mL，加入与其等体积的稀释试剂，摇匀后，用0.22μm的微孔滤膜滤过，收集滤液，即为测试样品；

(2)、超高效液相色谱检测：将步骤(1)得到的测试样品进行超高效液相色谱检测，应用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱、Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18色谱柱或Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱，柱温为25-45℃，流速为每分钟0.2-0.35mL，采用体积浓度为0.1-0.7％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.1-0.7％的甲酸水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱液经紫外检测器采集60分钟之内的数据，所述的紫外检测的检测波长为250-340nm。

所述的指纹图谱检测方法中步骤(1)样品制备中的稀释试剂为超纯水、20％甲醇水溶液或40％甲醇水溶液；优选为20％甲醇水溶液或40％甲醇水溶液；进一步优选为20％甲醇水溶液。

所述的指纹图谱检测方法中步骤(2)超高效液相色谱检测中，梯度洗脱的程序为：在开始时，也就是0分钟时，流动相B为100％；到8分钟时，流动相A为4％，流动相B为96％；到13分钟时，流动相A为12％，流动相B为88％；到19分钟时，流动相A为15％，流动相B为85％；到25分钟时，流动相A为22％，流动相B为78％；到40分钟时，流动相A为28％，流动相B为72％；到50分钟时，流动相A为43％，流动相B为57％；到60分钟时，流动相A为75％，流动相B为25％。

所述的指纹图谱检测方法中步骤(2)超高效液相色谱检测中，应用的色谱柱优选为用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱或Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱；进一步优选为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。

所述的指纹图谱检测方法中步骤(2)超高效液相色谱检测中，柱温优选为30-40℃；进一步优选为35℃。

所述的指纹图谱检测方法中步骤(2)超高效液相色谱检测中，流速优选为每分钟0.22-0.30mL；进一步优选为每分钟0.25mL。

在本发明较佳的实施方案中，所述的指纹图谱检测方法中步骤(2)超高效液相色谱检测中，采用体积浓度为0.3-0.6％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.3-0.6％的甲酸水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱。

在本发明更佳的实施方案中，所述的指纹图谱检测方法中步骤(2)超高效液相色谱检测中，采用体积浓度为0.5％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.5％的甲酸水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱。

所述的指纹图谱检测方法中步骤(2)超高效液相色谱检测中，检测波长优选为260-300nm；进一步优选为270nm。

所述的指纹图谱检测方法获得的刺五加注射液指纹图谱中共有35个成分峰，其中有32个成分峰对应的成分得到鉴定。上述35个成分峰对应的成分如下所示：

上述35个成分峰在指纹图谱上对应的保留时间分别为：

如无特别说明，本发明中涉及到的水为超纯水。

如无特殊说明，本发明中涉及到的百分比指体积比。

和现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的刺五加注射液的成分分析方法采用超高效液相色谱法指纹图谱检测方法，对刺五加注射液中的成分识别能力明显提高，现有技术仅能识别约15种左右成分，而本发明提供的分析方法能够识别35种成分，且各个成分峰分离度好。

本发明提供的分析方法中洗脱体系中的流动相A和流动相B以及梯度洗脱程序使得各种成分的峰之间分离度好，各个峰之间几乎无重叠，能够获得更加准确的检测结果。

本发明提供的分析方法对识别出的35种成分进行了分离鉴定，获知了其中32种成分的具体化合物名称，可以作为刺五加注射液检测的标准参照。

本发明提供的分析方法灵敏度高、重复性好、特异性强，仅需1μL的进样量，即可获得清晰的指纹图谱。

本发明提供的分析方法在检测时用时短，在保证了分离度的基础上，将现有技术中采集时间由70分钟缩短到60分钟。

本发明提供的分析方法获得的UPLC指纹图谱背景干扰小，杂峰少，基线平稳，使得分析结果更加清晰准确。

综上所述，本发明提供的刺五加注射液的成分分析方法具有相对更高的灵敏度、稳定性、重复性、特异性；能够识别出刺五加注射液中的更多成分；缩短了常规分析方法的采集时间；峰与峰之间具有更高的分离度；确定了图谱中个个成分峰所对应的具体化合物，为刺五加注射液的标准化检测分析提供的了可靠的参照。本发明提供的刺五加注射液的成分分析方法为刺五加注射液的生产质量控制和临床应用安全提供了可靠保障。

附图说明

图1为实验例1中的刺五加注射液指纹图谱。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

术语：超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography)在本发明中简称UPLC。

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(配脱气机)、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器购自Waters公司；Mill-Q超纯水器购自Millipore公司；Mettler XS105型电子天平购自Mettler公司。

乙腈、甲醇为色谱纯，购自Merck公；甲酸为色谱纯购自ROC Scientific公司及Merck公司；其余试剂均为分析纯，购自西格玛奥德里奇公司；水为Milli-Q超纯水。

标准品：胞苷(批号：36641，HPLC纯度：99.0％)、尿苷(批号31313，纯度：99.5％)、腺苷(批号：D1303032，纯度：99.5％)、鸟苷(批号32979，纯度：99.5％)、咖啡酸(批号：A1309017)和腺嘌呤(批号：1132692)购自上海晶纯实业有限公司；5-羟甲基糠醛(批号：130607，HPLC纯度：99.64％)、原儿茶酸(批号：130509，HPLC纯度：99.34％)、新绿原酸(批号：130426，HPLC纯度：99.20％)、绿原酸(批号130602，HPLC纯度：99.53％)、刺五加苷B(批号：130504，HPLC纯度：99.25％)、隐绿原酸(批号：130405，HPLC纯度：99.37％)、异嗪皮啶(批号：130427，HPLC纯度：99.69％)和刺五加苷E(批号：130623，HPLC纯度：99.42％)均购自上海融禾医药科技发展有限公司；刺五加苷E、5-甲氧基落叶松醇-4-O-β-D-葡萄糖苷和3,5二咖啡酰奎宁酸由浙江大学药物信息学研究所自制。

实施例1一种刺五加注射液的成分分析方法

采用超高效液相色谱指纹图谱法检测供试样品。

供试样品：共21个不同批次的刺五加注射液，由哈尔滨珍宝制药有限公司生产，批号分别为BS20120801、BS20120803、AS20121101、AS20121102、AS20121103、AS20121104、A20120907、A20120908、A20120909、A20120910、C20120503、C20120507、C20120511、C20120515、C20120521、20120402、20120405、20120411、S20130801、S20130803和S20130702。

检测步骤：

(1)、样品制备：精密量供试样品2.5mL，置5mL容量瓶中，加20％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀后用用0.22μm的微孔滤膜滤过，收集滤液，即为测试样品；

(2)、超高效液相色谱检测：将步骤(1)得到的测试样品进行超高效液相色谱检测，

色谱条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱配Waters在线过滤柱；

流动相：以0.5％甲酸和40％乙腈水溶液(V/V)为流动相A，以0.5％甲酸溶液为流动相B，按以下程序进行现行梯度洗脱：在开始时，流动相B为100％；到8分钟时，流动相A为4％，流动相B为96％；到13分钟时，流动相A为12％，流动相B为88％；到19分钟时，流动相A为15％，流动相B为85％；到25分钟时，流动相A为22％，流动相B为78％；到40分钟时，流动相A为28％，流动相B为72％；到50分钟时，流动相A为43％，流动相B为57％；到60分钟时，流动相A为75％，流动相B为25％；

柱温为：35℃；

流速为：每分钟0.25mL；

检测波长为：270nm；

进样量为：3μl；

数据采集时间为：60分钟。

在上述色谱条件下获取的刺五加注射液UPLC指纹图谱见图1，刺五加注射液UPLC指纹图谱中共识别出35个成分峰，利用标准品鉴定，其中有32个成分得到鉴定，鉴定结果为：

成分峰1-35分别为：腺嘌呤、胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酰葡萄糖苷、原儿茶酸、butane-2,3-diol-2-O-β-D-apiofuranosyl-(1->6)-β-D-glucopyranoside或其构体、胸苷、1-咖啡酰奎宁酸、香草酸葡萄糖苷、新绿原酸、紫丁香酸葡萄糖苷、5-(4-O-β-D-葡萄糖基阿魏酰)-奎宁酸、香豆酰奎宁酸、刺五加苷B葡萄糖苷或其异构体、4-(4-O-β-D-葡萄糖基阿魏酰)-奎宁酸、阿魏酰葡萄糖苷、绿原酸、刺五加苷B葡萄糖苷或其异构体、咖啡酸、刺五加苷B、隐绿原酸、未知成分、阿魏酰奎宁酸、4-葡萄糖基芥子酸苷、阿魏酰葡萄糖苷、未知成分、右旋松脂醇二葡萄糖苷或其异构体、未知成分、右旋松脂醇二葡萄糖苷或其异构体、刺五加苷E、5-甲氧基落叶松醇-4-O-β-D-葡萄糖苷、3,5二咖啡酰奎宁酸。

实验例1方法重复性实验

取同一批次刺五加注射液(批号：AS20121102)6份，按照实施例1的成分分析方法进行分析，统计6份注射液的中的峰面积和保留时间，统计结果如下所示：

峰面积：

成分峰	第1份	第2份	第3份	第4份	第5份	第6份	平均值	RSD(％)
									1	587618	582373	583881	573354	579457	579879	581094	0.83
2	463579	475467	477613	473024	464585	474018	471381	1.25
									3	738657	759049	761706	712832	752994	725277	741753	2.66
4	341691	348829	351267	340787	347927	348087	346431	1.21
									8	947755	971714	973486	951477	964742	968205	962897	1.12
13	1351283	1381212	1386772	1354889	1369705	1377027	1370148	1.05
									14	468575	480361	480211	470476	472362	478353	475056	1.10
16	327235	336451	336369	329646	332248	332778	332455	1.10
									20	1127591	1142974	1146208	1128944	1132649	1139638	1136334	0.68
24	1001184	1017790	1031845	1006818	1021331	1022435	1016901	1.10

保留时间：

由统计结果可见：各峰保留时间RSD小于0.5％，单峰面积大于总峰面积2％的峰的峰面积RSD小于3.0％，表明本方法具良好重复性。

以上所述仅为本发明的部分较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种刺五加注射液的成分分析方法，其特征在于：所述分析方法采用超高效液相色谱指纹图谱法。

2.如权利要求1所述的刺五加注射液的成分分析方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱指纹图谱法包括以下步骤：

(1)、样品制备：精密量取待检测刺五加注射液1-5mL，加入与其等体积的稀释试剂，摇匀后，用0.22μm的微孔滤膜滤过，收集滤液，即为测试样品；

(2)、超高效液相色谱检测：将步骤(1)得到的测试样品进行超高效液相色谱检测，应用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱、Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18色谱柱或Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱，柱温为25-45℃，流速为每分钟0.2-0.35mL，采用体积浓度为0.1-0.7％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.1-0.7％的甲酸水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱液经紫外检测器采集60分钟之内的数据，所述的紫外检测的检测波长为250-340nm。

3.如权利要求2所述的刺五加注射液的成分分析方法，其特征在于：所述的步骤(1)样品制备中的稀释试剂为超纯水、20％甲醇水溶液或40％甲醇水溶液；优选为20％甲醇水溶液或40％甲醇水溶液；进一步优选为20％甲醇水溶液。

4.如权利要求2所述的刺五加注射液的成分分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)超高效液相色谱检测中，梯度洗脱的程序为：在开始时，也就是0分钟时，流动相B为100％；到8分钟时，流动相A为4％，流动相B为96％；到13分钟时，流动相A为12％，流动相B为88％；到19分钟时，流动相A为15％，流动相B为85％；到25分钟时，流动相A为22％，流动相B为78％；到40分钟时，流动相A为28％，流动相B为72％；到50分钟时，流动相A为43％，流动相B为57％；到60分钟时，流动相A为75％，流动相B为25％。

5.如权利要求2所述的刺五加注射液的成分分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)超高效液相色谱检测中，应用的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。

6.如权利要求2所述的刺五加注射液的成分分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)超高效液相色谱检测中，采用体积浓度为0.5％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.5％的甲酸水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱。