CN109010504A - 一种黑枸杞总黄酮的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物与新医药中轻工和化工生物技术的天然产物有效成份的分离提取技术，涉及植物提取物领域，具体为一种黑枸杞总黄酮的提取方法。该方法首先采用超微粉碎技术制备得到黑枸杞微粉后，利用微波对微粉进行处理；然后利用超声辅助的离子液体‑盐双水相体系对黑枸杞微粉中的总黄酮进行萃取；最后依次采用超滤，柱层析谱以及超临界流体萃取对黑枸杞总黄酮进行纯化。该方法制备的黑枸杞总黄酮纯度高，抗菌作用明显，可以直接作为食品保健品的功能添加剂。

Description

一种黑枸杞总黄酮的提取方法
技术领域
本发明属于生物与新医药中轻工和化工生物技术的天然产物有效成份的分离提取技术，涉及植物提取物领域具体为一种黑枸杞总黄酮的提取方法。
背景技术
黑枸杞为茄科枸杞属的一个物种，具棘刺，浆果球形，皮薄，皮熟后紫黑色。黑枸杞味甜多汁，含有丰富的维生素、有机酸及糖类，果实中含花色苷和黄酮类化合物。黄酮作为黑枸杞的主要成分之一具有抗氧化、延缓衰老、抗动脉粥样硬化、降血脂、抗疲劳、降血糖和增强非特异性免疫功能等作用。目前食品中使用的枸杞多为全枸杞和枸杞粉末，消费者食用后难以对其中的活性成分进行完全的吸收，使得枸杞产品保健效果不明显。因此开发一种黑枸杞总黄酮的提取方法并将得到提取物应用于食品中对提高枸杞产品的保健效果具有重要的意义。
目前关于黑枸杞的文献报道较为少见，且传统的植物中总黄酮的提取方法多为有机溶剂浸提法或者超声波辅助提取法，但是得到的产物提取效率不高且纯化时多使用传统的液液萃取进行纯化，有机溶剂消耗大且费时费力，因此开发高效环保地黑枸杞总黄酮提取方法对加速枸杞提取物在食品保健品中的应用具有重要的意义。
发明内容
为了提供可食用的黑枸杞总黄酮提取物且解决黄酮提取技术中提取效率低，有机溶剂消耗大的问题，本发明提供了一种绿色高效的黑枸杞总黄酮的提取方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过40目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎5-10min后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理10-15 min后，与离子液体-盐双水相体系按1：15-20的质量体积比混合均匀后，在40-60℃条件下超声提取30-60min后过滤得滤液，残渣再用双水相提取2-3次后，合并滤液后将滤液混合均匀后静置分相，过分液漏斗后收集上相，将上相过超滤膜除去大分子杂质后将滤液减压浓缩后得黑枸杞总黄酮提取液；
（3）将总黄酮提取液上样到层析柱中，然后依次利用水、25%乙醇-水混合溶液、乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液、85%的乙酸乙酯-乙醇混合溶液进行洗脱后，收集乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液洗脱时的洗脱液；
（4）将收集的洗脱液减压蒸干后置于超临界流体装置中，将超临界流体萃取纯化后，制备得到黑枸杞总黄酮。
优选的，步骤（1）中所述的黑枸杞微粉的粒径不大于5μm。
优选的，步骤（2）中所述的离子液体-盐双水相体系的制备方法为：将离子液体与盐溶液按1：3-4的体积比混合后，超声305min后，静置既得离子液体-盐双水相体系；
优选的，离子液体-盐双水相体系制备方法中所述的离子液体为六氟磷酸1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim][PF6])、六氟磷酸1-己基-3-甲基咪唑([C6mim][PF6])和六氟磷酸1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim][PF6])中的一种；所述的盐为NaCl、KH2PO4、NaH2PO4中的一种；所述的盐溶液的浓度为0.2-0.35g/mL。
优选的，步骤（2）中所述的超滤膜的截留分子量为10000；所述的减压浓缩后的黑枸杞总黄酮提取液密度为1.15-1.25g/mL。
优选的，步骤（3）中所述的层析柱中的填料为AB-8型大孔吸附树脂；所述的乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液中乙酸乙酯、乙醇、水的体积比为35：50：15。
优选的，步骤（4）中所述的超临界流体萃取条件为：萃取压力为 15-20Mpa，CO2流速为15-18L/h，萃取时间为25-30min。
优选的，步骤（4）中所述的黑枸杞总黄酮含量不低于90%。
与现有技术相比，本发明所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法具有以下有益效果：本发明采用超微粉碎制备微粉后联合微波处理破坏黑枸杞中植物细胞壁，使得总黄酮化合物能快速浸出，提高提取效率；本发明联合超滤，柱层析以及超临界流体萃取对黑枸杞总黄酮进行纯化，使得制备的黑枸杞总黄酮纯度高，抗菌作用明显；采用离子液体作为绿色溶剂对植物中的总黄酮进行萃取，显著了减少了有机溶剂的消耗。经本发明制备的黑枸杞总黄酮可以直接作为食品保健品的功能添加剂。
具体实施方式
【实施例1】
一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过40目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎8min后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理12 min后，与六氟磷酸1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim][PF6])-0.3g/mL NaCl双水相体系按1：12的质量体积比混合均匀后，在45℃，200W条件下超声提取45min后过滤得滤液，残渣再用双水相提取2-3次后，合并滤液后将滤液混合均匀后静置分相，过分液漏斗后收集上相，将上相过截留分子量为10000的超滤膜后滤除去大分子杂质后将滤液减压浓缩至密度为1.15-1.25g/mL后得黑枸杞总黄酮提取液；
（3）将总黄酮提取液上样到AB-8型大孔吸附树脂层析柱中，然后依次利用水、25%乙醇-水混合溶液、乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液、85%的乙酸乙酯-乙醇混合溶液进行洗脱后，收集乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液洗脱时的洗脱液；
（4）将收集的液体减压蒸干后置于超临界流体装置中，在萃取压力为 15Mpa，CO2流速为15L/h，萃取时间为25min条件下纯化后，制备得到黑枸杞总黄酮。
【实施例2】
一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过40目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎8min后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理12 min后，与六氟磷酸1-己基-3-甲基咪唑([C6mim][PF6])-0.3g/mL Na2HPO4双水相体系按1：17的质量体积比混合均匀后，在45℃，200W条件下超声提取45min后过滤得滤液，残渣再用双水相提取2-3次后，合并滤液后将滤液混合均匀后静置分相，过分液漏斗后收集上相，将上相过截留分子量为10000的超滤膜后滤除去大分子杂质后将滤液减压浓缩至密度为1.15-1.25g/mL后得黑枸杞总黄酮提取液；
（3）将总黄酮提取液上样到AB-8型大孔吸附树脂层析柱中，然后依次利用水、25%乙醇-水混合溶液、乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液、85%的乙酸乙酯-乙醇混合溶液进行洗脱后，收集乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液洗脱时的洗脱液；
（4）将收集的液体减压蒸干后置于超临界流体装置中，在萃取压力为 17Mpa，CO2流速为15L/h，萃取时间为30min条件下纯化后，制备得到黑枸杞总黄酮。
【实施例3】
一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过40目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎10min后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理12 min后，与六氟磷酸1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim][PF6])-0.25g/mL K2HPO4双水相体系按1：18的质量体积比混合均匀后，在45℃，200W条件下超声提取45min后过滤得滤液，残渣再用双水相提取2-3次后，合并滤液后将滤液混合均匀后静置分相，过分液漏斗后收集上相，将上相过截留分子量为10000的超滤膜后滤除去大分子杂质后将滤液减压浓缩至密度为1.15-1.25g/mL后得黑枸杞总黄酮提取液；
（3）将总黄酮提取液上样到AB-8型大孔吸附树脂层析柱中，然后依次利用水、25%乙醇-水混合溶液、乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液、85%的乙酸乙酯-乙醇混合溶液进行洗脱后，收集乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液洗脱时的洗脱液；
（4）将收集的液体减压蒸干后置于超临界流体装置中，在萃取压力为 15Mpa，CO2流速为17L/h，萃取时间为25min条件下纯化后，制备得到黑枸杞总黄酮。
黑枸杞总黄酮含量的测定：
标准曲线绘制：取6支10ml容量瓶，分别加入1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml芦丁标液（0.2mg/mL），加80％的乙醇至5mL，加5％NaN02溶液0.5ml，摇匀放置6min，再加入1O％Al(N03)3溶液0.5ml摇匀，再放置6min，加入4％NaOH溶液4ml，摇匀，放置10min，用紫外可见分光光度计在510nm处测定其吸光度，以不加黑枸杞总黄酮提取液为空白对照。以芦丁标样的浓度(mg／m1)为横坐标X，吸光度值A为纵坐标Y，绘制标准曲线，得到回归方程Y=1.312X-0.101,R=0.999。
黑枸杞总黄酮含量的测定：
将实施例1-3制得的黑枸杞总黄酮配置成0.2mg/mL 的溶液, 取1 mL溶液于10mL容量瓶中， 加80％的乙醇至5mL，加5％NaN02溶液0.5ml，摇匀放置6min，再加入1O％Al(N03)3溶液0.5ml摇匀，再放置6min，加入4％NaOH溶液4ml，摇匀，放10min，用紫外可见分光光度计在510nm处测定其吸光度，并按标准曲线测量其浓度并计算其含量，计算总黄酮收率，结果见表1。从表 1中可以看出经本发明制备的黑枸杞总黄酮纯度高达90%以上。
表1. 实施例1-3中所得黑枸杞总黄酮的含量及其收率
实施例1 实施例2 实施例3
黑枸杞总黄酮含量（&） 91.5 92.2 91.8
收率（%） 2.7 2.8 2.6
黑枸杞总黄酮抑菌活性测试：
在超净工作台上，用无菌镊子将灭完菌的牛津杯竖直放置于无菌培养皿中，每个培养皿放置 3 个。将配制好的各菌种培养基湿热灭菌待其冷却至 50 ℃～55 ℃后，在无菌操作下，按照菌悬液与培养基体积之比为 1 ∶ 100 的比例，吸取已校正浓度的菌悬液分别加入于各相应培养基中，震荡混匀后，缓慢倒入已放置牛津杯的无菌培养皿中。待培养基凝固后，用已灭菌的镊子将牛津杯拔出。接着，分别吸取 100 μL的实施例1-3的总黄酮配置的溶液（0.5mg/mL）于3个孔中，并用加有 20 %乙醇的培养基作为空白对照。最后将培养基放入恒温培养箱（细菌 35 ℃～37 ℃，霉菌、酵母菌 28 ℃）中培养，一段时间（细菌 24 h，霉菌、酵母菌 72 h）后观察菌体的生长情况并测定其抑菌圈直径，所得结果见表2。由表 2 可知，黑枸杞总黄酮的乙醇提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有较明显的抑制作用。
表2. 黑枸杞总黄酮提取液的抑菌圈直径
供试菌 实施例1 实施例2 实施例3 空白
大肠杆菌 1.4cm 1.3cm 1.3cm -
金黄色葡萄球菌 1.02cm 1.03cm 1.01cm -
青霉 1.18cm 1.22cm 1.25cm -
注：3 种测试菌菌悬液初始浓度均为106 cfu/mL～107 cfu/mL；-表示没有抑菌圈产生。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过40目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎5-10min后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理10-15 min后，与离子液体-盐双水相体系按1：15-20的质量体积比混合均匀后，在40-60℃条件下超声提取30-60min后过滤得滤液，残渣再用双水相提取2-3次后，合并滤液后将滤液混合均匀后静置分相，过分液漏斗后收集上相，将上相过超滤膜除去大分子杂质后将滤液减压浓缩后得黑枸杞总黄酮提取液；
（3）将总黄酮提取液上样到层析柱中，然后依次利用水、25%乙醇-水混合溶液、乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液、85%的乙酸乙酯-乙醇混合溶液进行洗脱后，收集乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液洗脱时的洗脱液；
（4）将收集的洗脱液减压蒸干后置于超临界流体装置中，将超临界流体萃取纯化后，制备得到黑枸杞总黄酮。
2.根据权利要求1所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于步骤（1）中所述的黑枸杞微粉的粒径不大于5μm。
3.根据权利要求1所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于步骤（2）中所述的离子液体-盐双水相体系的制备方法为：将离子液体与盐溶液按1：3-4的体积比混合后，超声305min后，静置既得离子液体-盐双水相体系。
4.根据权利要求3所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于所述的离子液体为六氟磷酸1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim][PF6])、六氟磷酸1-己基-3-甲基咪唑([C6mim][PF6])和六氟磷酸1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim][PF6])中的一种；所述的盐为NaCl、KH2PO4、NaH2PO4中的一种；所述的盐溶液的浓度为0.2-0.35g/mL。
5.根据权利要求1所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于步骤（2）中所述的超滤膜的截留分子量为10000；所述的减压浓缩后的黑枸杞总黄酮提取液密度为1.15-1.25g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于步骤（3）中所述的层析柱中的填料为AB-8型大孔吸附树脂；所述的乙酸乙酯-乙醇-水混合溶液中乙酸乙酯、乙醇、水的体积比为35：50：15。
7.根据权利要求1所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于步骤（4）中所述的超临界流体萃取条件为：萃取压力为 15-20Mpa，CO2流速为15-18L/h，萃取时间为25-30min。
8.根据权利要求1所述的一种黑枸杞总黄酮的提取方法，其特征在于步骤（4）中所述的黑枸杞总黄酮含量不低于90%。
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