PT2129396E - Anticorpos contra erbb3 e suas utilizações - Google Patents

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PT2129396E
PT2129396E PT87257226T PT08725722T PT2129396E PT 2129396 E PT2129396 E PT 2129396E PT 87257226 T PT87257226 T PT 87257226T PT 08725722 T PT08725722 T PT 08725722T PT 2129396 E PT2129396 E PT 2129396E
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erbb3
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antigen binding
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PT87257226T
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Birgit Schoeberl
Ulrik Nielsen
Michael Feldhaus
David Buckler
Arumugam Muruganandam
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Merrimack Pharmaceuticals Inc
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Description

ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Anticorpos contra ErbB3 e suas utilizações" Antecedentes do invento A subfamília ErbB/HER de receptores de factor de crescimento polipeptídicos inclui o receptor de factor de crescimento epidérmico (EGF) (EGFR, ErbBl/HERl), o produto do oncogene neu (ErbB2/HER2) e as proteínas mais recentemente identificadas receptoras ErbB3/HER3 e ErbB4/HER4 (consultar, e.g., Hynes et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta Rev. Câncer 1198, 165-184). Prevê-se que cada um destes receptores consista de um domínio extracelular de ligação de ligando, um domínio transmembranar, um domínio de proteína citosólica tirosina cinase (PTK) e um domínio de fosforilação C-terminal (consultar, e.g., Kim et al., (1998) Biochem. J. 334, 189- 195) .
As experiências in vitro indicaram que a actividade de proteína tirosina cinase da proteína ErbB3 é atenuada significativamente relativamente à de outros membros da família ErbB/HER e esta atenuação foi atribuída, em parte, à ocorrência de substituições não conservativas de aminoácidos no domínio catalítico previsto de ErbB3 (consultar, e.g., Guy et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 91, 8132-8136; Sierke et al. (1997) Biochem. J. 322, 757-763). Contudo, mostrou-se que a proteína ErbB3 era fosforilada em vários contextos celulares. Por exemplo, ErbB3 é fosforilada constitutivamente nos resíduos de tirosina num subconjunto de linhas celulares de cancro de mama humano que sobrexpressam esta proteína (consultar, e.g., Kraus et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90, 2900-2904; e Kim et al. anteriormente; consultar, também, Schaefer et al. (2006)
Neoplasia 8(7):613-22 e Schaefer et al. Câncer Res (2004) 64(10):3395-405).
Apesar do papel de ErbB3 em cancro ter sido explorado (consultar, e.g., Horst et al. (2005) 115, 519-527; Xue et al. (2006) Câncer Res. 66, 1418-1426), ErbB3 permanece largamente pouco considerado como um alvo para intervenção clínica. As imunoterapias actuais convergem principalmente na 2 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ inibição da acção de ErbB2 e em particular heterodimerização de complexos ErbB2/ErbB3 (consultar, e.g., Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994)). Assim, é um objecto do presente invento proporcionar imunoterapias melhoradas que inibem eficazmente sinalização ErbB3 e podem ser utilizadas para tratar e diagnosticar uma variedade de cancros. EP-A-1283053 descreve a utilização de um inibidor de actividade ErbB3, particularmente um anticorpo anti-ErbB3 para o diagnóstico, prevenção ou tratamento de doenças hiperproliferativas. WO 2006/091209 descreve métodos para melhorar a capacidade de ligação especifica de composições de ligação biespecificas. Numa concretização a molécula alvo é ErbB3. WO 97/35885 descreve anticorpos que se ligam à proteína ErbB3 e apresentam adicionalmente uma capacidade de reduzir formação induzida por herregulina de um complexo de proteína ErbB2-ErbB3, para aumentar a afinidade de ligação de à proteína ErbB3 e/ou para reduzir activação de ErbB2 induzida por herregulina numa célula que expressa ErbB2 e ErbB3.
Lee e Maihle (Oncogene (1998) 16:3243-3252) descrevem o isolamento e caracterização de quatro produtos de transcrição c-erbB3 alternativos expressos em linhas celulares derivadas de carcinoma de ovário e de tecidos humanos normais.
Pinkas-Kramarski et al (Oncogene (1998) 16: 1249-1258) divulga que o heterodímero oncogénico ErbB2/ErbB3 é um receptor alternativo de factor de crescimento epidérmico e betacelulina.
Sumário do invento 0 presente invento proporciona uma nova classe de anticorpos monoclonais que se ligam ao receptor de ErbB3 e inibem várias funções de ErbB3. O invento proporciona um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio que se liga a ErbB3 humano e compreende: 3 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ (a) uma região variável de cadeia pesada, em que a CDR1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, a CDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e a CDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e uma região variável de cadeia leve, em que a CDRl compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, a CDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e a CDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; ou (b) uma região variável de cadeia pesada, em que as CDRl, CDR2 e CDR3 compreendem sequências de aminoácidos que são pelo menos 90% idênticos às sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 definidas em (a) ; e uma região variável de cadeia leve, em que as CDRl, CDR2 e CDR3 compreendem sequências de aminoácidos que são pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 definidas em (a) e em que o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é capaz de inibir fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF.
Tal como aqui descrito, os ligandos do tipo EGF incluem EGF, TGF-α, betacelulina, factor de crescimento epidérmico de ligação de heparina, birregulina e anfirregulina, que se ligam a EGFR e induzem dimerização de EGFR com ErbB3. Esta dimerização, por sua vez, causa fosforilação de ErbB3 e activa sinalização através do receptor. Assim, os anticorpos monoclonais do presente invento são úteis para tratar e diagnosticar vários cancros associados a sinalização celular mediada por ErbB3.
Noutra concretização, os anticorpos são adicionalmente caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades: (i) inibição de sinalização mediada por ligando ErbB3, incluindo sinalização mediada por ligação de ligandos ErbB3, tais como herregulina, epirregulina, epigénio e BIR, a ErbB3; (ii) inibição da proliferação de células que expressam ErbB3; (iii) capacidade de diminuir os níveis de ErbB3 nas superfícies celulares (e.g., induzindo internalização de ErbB3); (iv) inibição da excreção de VEGF por células que expressam ErbB3; (v) inibição da migração de células que expressam ErbB3; (vi) inibição de crescimento de esferóides de células que expressam ErbB3; e/ou (vii) ligação a um 4 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ epítopo localizado no domínio I (resíduos 20-209) de ErbB3, por exemplo, um epítopo envolvendo ou abrangendo os resíduos 20-202 da sequência de aminoácidos de ErbB3.
Os anticorpos monoclonais e suas partes de ligação de antigénio específicos do presente invento apresentam uma KD de 50 nM ou inferior, tal como medido por um ensaio de ressonância plasmónica de superfície ou um ensaio de ligação de células.
Os anticorpos monoclonais e suas partes de ligação de antigénio específicos do presente invento incluem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% (e.g., 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:35 ou SEQ ID NO:37. Outros anticorpos monoclonais e suas partes de ligação de antigénio específicos do presente invento incluem uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% (e.g., 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO:38. Os anticorpos podem também incluir ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve anteriormente mencionadas. O pedido também descreve anticorpos e suas partes de ligação de antigénio que incluem uma ou mais sequências CDR seleccionadas de uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:13; de uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:14; de uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:15; de uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 16; de uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:17; de uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:18; e suas combinações.
Ainda outros anticorpos e suas partes de ligação de antigénio aqui descritos incluem; uma ou mais sequências CDR seleccionadas de uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:19; de uma CDR2 de região variável de 5 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 20; de uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:21; de uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 22; de uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:23; de uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:24; e suas combinações.
Ainda outros anticorpos e suas partes de ligação de antigénio descritos incluem; uma ou mais sequências CDR seleccionadas de uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:39; de uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:40; de uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:41; de uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 42; de uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:43; de uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:44; e suas combinações.
Ainda outros anticorpos e suas partes de ligação de antigénio descritos incluem; uma ou mais sequências CDR seleccionadas de uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:45; de uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:46; de uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:47; de uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 48; de uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:49; de uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:50; e suas combinações.
Numa concretização, os anticorpos e suas partes de anticorpo são completamente humanos (i.e., contêm sequências de CDR e esqueleto humanas). Os anticorpos humanos específicos do presente invento incluem os que apresentam uma região variável de cadeia pesada que é de um gene de linha germinal VH3 humano e/ou uma região variável de cadeia leve que é de um gene de linha germinal VL2 humano.
Também estão abrangidos pelo presente invento anticorpos monoclonais e suas partes que se ligam ao mesmo epítopo ou a epítopos sobrepostos ligados por qualquer dos anticorpos ou de suas partes aqui descritas (e.g., um epítopo localizado no domínio I de ErbB3, tal como um epítopo envolvendo ou 6 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ abrangendo os resíduos 20-202 da sequência de aminoácidos de ErbB3). Os anticorpos que têm a mesma actividade dos anticorpos aqui descritos, e.g., anticorpos com a mesma sequência que o Ab n°6, são também abrangidos pelo presente invento. Nomeadamente, o invento proporciona o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do invento, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
Os anticorpos do presente invento incluem todas as formas conhecidas de anticorpos e outros esqueletos de proteína com propriedades do tipo anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico ou um esqueleto de proteína com propriedades do tipo anticorpo, tal como repetições de fibronectina ou anquirina. O anticorpo pode também ser um Fab, Fab'2, ScFv ou um domínio de anticorpo. 0 anticorpo pode também apresentar qualquer um dos seguintes isotipos: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD e IgE.
Ainda noutra concretização, o presente invento proporciona adicionalmente composições compreendendo combinações de anticorpos ou partes de ligação de antigénio aqui descritas, formuladas com um transportador e/ou adjuvante aceitável. Numa concretização particular, a composição compreende dois ou mais anticorpos que ligam epítopos diferentes em ErbB3 ou anticorpos aqui descritos combinados com anticorpos anti-cancro que não ligam ErbB3.
Ainda noutra concretização, o presente invento proporciona uma composição de ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo humano que liga ErbB3 humano, compreendendo a composição um ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 25 ou é uma sequência que híbrida sob condições de rigor elevado com SEQ ID NO:25 e um ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO:26 7 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ ou é uma sequência que híbrida sob condições de rigor elevado com SEQ ID NO:26. Os ácidos nucleicos podem estar compreendidos em vectores de expressão. 0 presente invento proporciona adicionalmente células hospedeiras, mamíferos não humanos transgénicos, hibridomas e plantas transgénicas que expressam e/ou produzem os anticorpos e partes de ligação de antigénio aqui descritos. 0 invento também proporciona kits compreendendo um ou mais anticorpos monoclonais ou suas partes de ligação de antigénio isolados aqui descritos e instruções para utilização no tratamento ou diagnóstico de uma doença associada com sinalização dependente de ErbB3, tal como cancros. Os anticorpos e suas partes de ligação de antigénio do presente invento podem ser utilizados numa grande variedade de aplicações terapêuticas e de diagnóstico, nomeadamente aplicações oncológicas. Assim, noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do invento para uso num método para inibir fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF ou para tratar cancro num indivíduo humano opcionalmente em que o cancro é melanoma, cancro de mama, cancro dos ovários, carcinoma renal, cancro gastrointestinal/cólon, cancro de pulmão, sarcoma de células claras ou cancro da próstata. Os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos, tal como agentes anti-cancro, e.g., outros anticorpos, agentes quimioterapêuticos e/ou radiação.
Numa concretização, o invento proporciona um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do invento para uso de acordo com o invento, em que o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é administrado intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente ao indivíduo; e/ou é administrado em combinação com um segundo anticorpo anti-cancro, tal como um anticorpo anti-IGFlR, um anticorpo anti-EGFR ou um anticorpo anti-cMet ou uma molécula pequena anti-cancro, tal como um antimetabolito, um agente alquilante, um inibidor de topoisomerase, um agente de direcção a alvos de microtúbulos, um inibidor de cinase, um inibidor de síntese de proteína, um imuno-terapêutico, uma hormona ou seu 8 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ análogo, um análogo de somatostatina, um glucocorticóide, um inibidor de aromatase, um inibidor mTOR, uma molécula pequena que tem como alvo IGF1R ou uma molécula pequena que tem como alvo EGFR.
Ainda noutras concretizações, o invento proporciona um anticorpo ou parte de ligação de antigénio do invento para uso num método de diagnosticar um cancro associado a ErbB3 num indivíduo, compreendendo (a) por em contacto ex vivo ou in vivo células de um indivíduo com o referido anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio e (b) medir o nível de ligação do referido anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio a ErbB3 nas células, em que níveis anomalamente elevados de ligação do referido anticorpo ou parte de ligação de antigénio a ErbB3 indicam que o indivíduo tem um cancro associado a ErbB3.
Outras caracteristicas e vantagens do invento serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e a partir das reivindicações.
Descrição sucinta dos esquemas
As figuras IA e 1B são gráficos de barras que representam a ligação de vários anticorpos anti-ErbB3 candidatos (Fabs, referidos aqui como Abs) a ErbB3 expresso em células de melanoma MALME-3M utilizando um anticorpo secundário de cabra anti-humano Alexa 647.
As figuras 2A-2D são gráficos que representam os valores de KD dos diferentes anticorpos anti-ErbB3 candidatos. As figuras 2A e 2B são gráficos que representam o valor de KD do anticorpo n° 6 (referido como Ab n° 6) e anticorpo n° 3 (referido como Ab n° 3), respectivamente, tal como medido usando tecnologia de ressonância plasmónica de superfície (SPR) . As figuras 2C e 2D são gráficos que representam os valores de KD de Ab n° 6 e Ab n° 3, respectivamente, tal como medido usando um ensaio de ligação de células usando células de melanoma MALME-3M. 9 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ A figura 3 é um gráfico que representa a especificidade de ligação de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) a ErbB3 usando ELISA. Utilizaram-se EGFR, BSA e TGF-α como controlos. A figura 4 é um gráfico que representa a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) diminuir os níveis totais de ErbB3 em células de melanoma MALME-3M in vitro, tal como medido usando ELISA.
As figuras 5A e 5B são gráficos que representam a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) regular negativamente receptores ErbB3 em células MALME-3M, medido usando análise FACS. A figura 5A apresenta os resultados usando um isotipo IgGl do anticorpo. A figura 5B apresenta os resultados usando um isotipo IgG2 do anticorpo.
As figuras 6A-6D são gráficos que representam o decurso temporal de regulação negativa de ErbB3 mediada por anticorpo (Ab n° 6), tal como medido usando análise de FACS. A figura 7 é um gráfico de barras que representa a capacidade de diferentes anticorpos anti-ErbB3 regularem negativamente ErbB3 em células de melanoma in vivo. A figura 8 é um gráfico de barras que representa a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) regular negativamente ErbB3 em xeno-enxertos ADRr in vivo. A figura 9 é um gráfico que representa a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) inibir proliferação de células MALME-3M num ensaio de brilho de titulação de células. A figura 10 é um gráfico que representa a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) inibir proliferação celular numa linha de células de ovário, ADRr. A figura 11 é um gráfico que representa a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) inibir proliferação de células ACHN. 10 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ A figura 12 é um gráfico de barras que representa a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) inibir fosforilação de ErbB3 em xeno-enxertos de ADRr in vivo.
As figuras 13A-13C são gráficos que representam a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) inibir fosforilação de ErbB3 mediada por betacelulina e herregulina em células ADRr.
As figuras 14A-14B são gráficos que representam a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6 isotipo IgG2) inibir fosforilação de ErbB3 em linhas celulares de tumor de ovário OVCAR 5 e OVCAR 8.
As figuras 15A-15C são gráficos que representam a capacidade da betacelulina (BTC) ligar ErbBl tal como demonstrado pela ausência de ligação a células MALME-3M negativas para ErbBl (figura 17A); ligação a células ADRr positivas para ErbBl a concentrações de 10 nM (figura 17B) e 200 nM (figura 17B), respectivamente e a inibição dessa ligação por Erbitux.
As figuras 16A-16B são gráficos que representam a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6 isotipo IgG2) inibir a sinalização mediada por herregulina em células MALME-3M. A figura 16A representa a capacidade do Ab n° 6 inibir fosforilação de ErbB3 mediada por herregulina em células MALME-3M e 16B representa a capacidade de Ab n° 6 inibir fosforilação de AKT em células MALME-3M.
As figuras 17A-D são gráficos que representam a capacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) inibir crescimento de tumor (A) dos ovários (células ADRr), (B) da próstata (células Dul45), (C) dos ovários (células OvCAR8) e (D) pancreático (células Colo357) através de estudos de xeno-enxerto.
As figuras 18A e 18B são gráficos que representam a capacidade de Ab n° 6 (figura 18A) e Fab para Ab n° 3 (figura 18B) inibir ligação de herregulina a ErbB3 em células MALME-3M, tal como medido usando análise FACS. 11 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
As figuras 19Α e 19B são gráficos que representam a capacidade de Ab n° 6 inibir a ligação de epirregulina a ErbB3 em células ADRr. A figura 19A representa a ligação de epirregulina a células ADRr e a figura 19B representa a capacidade de tanto Erbitux como o Ab n° 6 inibirem ligação de epirregulina a células ADRr.
As figuras 20A e 20B são gráficos que representam a capacidade do factor de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF) ligar ErbB em células ADRr (figura 20A) e a incapacidade de um anticorpo anti-ErbB3 (Ab n° 6) inibir tal ligação (figura 20B).
As figuras 21A-21C apresentam as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos: Ab n° 6, Ab n° 3, Ab n° 14, Ab n° 17 e Ab n° 19.
As figuras 22A-22B apresentam as sequências de nucleótidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos: Ab n° 6, Ab n° 3 e Ab n° 14. A figura 23 apresenta as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve dos anticorpos: Ab n° 6, Ab n° 17 e Ab n° 19, que foram revertidas à sequência de aminoácidos da linha germinal correspondente. As alterações de resíduos de aminoácidos estão sublinhadas.
As figuras 24A-24C são gráficos que representam a capacidade de Ab n° 6 inibir excreção de VEGF por células de tumor. A figura 25 é um gráfico que representa o efeito de Ab n° 6 na migração celular.
As figuras 26A-C são gráficos que representam (A) inibição de crescimento de esferóides em células AdrR, (B) inibição de crescimento de esferóides induzido por HRG em AdrR e (C) inibição de crescimento de esferóides induzido por HRG em células Dul45.
As figuras 27 A e B são gráficos que representam o efeito de Ab n° 6 na ligação de (A) HRG e (B) BTC a células AdrR. 12 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ A figura 28 é um gráfico que representa o efeito de Ab n° 6 na fosforilação de ErbB3 induzida por HGF.
As figuras 29 A e B apresentam o efeito de Ab n° 6 na fosforilação de (A) pErbBl e pErbB3 e (B) na formação de complexo ErbB2/3 induzido por HRG. A figura 30 é um gráfico que mostra que Ab n° 6 liga os residuos de aminoácidos 20-202 de ErbB3.
Descrição detalhada do invento
De modo a que o presente invento possa ser mais facilmente entendido, definem-se primeiramente determinadas expressões. As definições adicionais são estabelecidas ao longo da descrição detalhada. I. Definições
As expressões "ErbB3", "HER3", "receptor de ErbB3" e "receptor HER3" tal como aqui utilizadas indiferentemente referem-se à proteina ErbB3 humana, tal como descrito em patente U.S. n° 5 480 968 e Plowman et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 87:4905-4909 (1990); consultar igualmente Kani et al., Biochemistry 44:15842-857 (2005), Cho e Leahy, Science 297:1330-1333 (2002)). A expressão "ligando do tipo EGF", tal como aqui utilizada, refere-se a ligandos do receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR), incluindo factor de crescimento epidérmico (EGF) e proteínas estreitamente relacionadas tal como factor-α de transformação de crescimento (TGF-α), betacelulina (BTC), factor de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF), birregulina (BIR) e anfirregulina (AR), que se ligam a EGFR à superfície de células e estimulam a actividade de proteína tirosina cinase intrínseca do receptor. Especificamente, os ligandos do tipo EGF induzem a formação de EGFR (também referida como ErbBl) e complexo de proteína ErbB3 (consultar e.g., Kim et al., (1998) Biochem J., 334:189-195), que resulta em fosforilação de resíduos de tirosina no complexo. 13 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Os anticorpos e suas partes de ligação de antigénio do presente invento inibem fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF e em determinadas concretizações exibem uma ou mais das seguintes propriedades adicionais: (i) inibição de sinalização através de ErbB3 mediada por uma ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio e birregulina (BIR); (ii) inibição da proliferação de células que expressam ErbB3; (iii) capacidade de diminuir os níveis de ErbB3 à superfície celular; (iv) inibição da excreção de VEGF de células que expressam ErbB3; (v) inibição da migração de células que expressam ErbB3; (vi) inibição do crescimento de esferóides de células que expressam ErbB3; e/ou (vii) ligação a um epítopo localizado no domínio I de ErbB3, e.g., um epítopo que envolve ou abrange os resíduos 20-202 da sequência de aminoácidos de ErbB3. A expressão "inibição" tal como aqui utilizada refere-se a qualquer diminuição estatisticamente significativa na actividade biológica, incluindo bloqueio total da actividade. Por exemplo, "inibição" pode referir-se a uma diminuição de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% da actividade biológica.
Assim, a frase "inibição da fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF", tal como aqui utilizada, refere-se à capacidade de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de diminuir de forma estatisticamente significativa a fosforilação de ErbB3 induzida por um ligando do tipo EGF, relativamente à fosforilação numa célula não tratada (de controlo). A célula que expressa ErbB3 pode ser uma célula de ocorrência natural ou uma linha celular ou pode ser produzida de forma recombinante pela introdução de ácido nucleico que codifica ErbB3 numa célula hospedeira. Numa concretização, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio inibe fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100%, tal como determinado, por exemplo, por transferência "Western" seguida de sondagem com um anticorpo anti-fosfotirosina tal 14 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ como descrito em Kim et al., (1998) Biochem J., 334:189-195 e nos exemplos que se seguem. A frase "inibição de sinalização através de ErbB3 mediada por herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina", tal como aqui utilizada, refere-se à capacidade de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio diminuir de forma estatisticamente significativa a sinalização através de ErbB3 mediada por um ligando ErbB3 (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio e birregulina) , relativamente à sinalização na ausência do anticorpo (controlo). Também se referem aqui os ligandos ErbB3 como "ligandos do tipo herregulina". Tal significa que, na presença do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio, um sinal mediado por uma ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio e birregulina numa célula que expressa ErbB3, relativamente a um controlo (sem anticorpo), diminui de forma estatisticamente significativa. Pode medir-se um sinal mediado por ligando ErbB3 por ensaio do nivel ou actividade de um substrato ErbB3 e/ou de uma proteína que está presente numa cascata celular envolvendo ErbB3. Numa concretização, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio diminui o nível ou actividade de um substrato ErbB3 e/ou o de uma proteína numa cascata celular envolvendo ErbB3 em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% relativamente ao nível ou actividade na ausência de tal anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio (controlo) . Tal sinalização mediada por ligando ErbB3 pode medir-se usando técnicas reconhecidas na especialidade que medem o nível ou actividade de um substrato de ErbB3 (e.g., SHC ou PI3K) ou uma proteína numa cascata celular envolvendo ErbB3 (e.g., AKT) utilizando ensaios de cinase para tais proteínas (consultar, e.g., Horst et al. anteriormente, Sudo et al. (2000) Methods Enzymol, 322:388-92; e Morgan et al. (1990) Eur. J. Biochem., 191:761-767).
Numa concretização particular, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio inibe a sinalização mediada pelo ligando ErbB3 através de ErbB3 (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina) por inibição da ligação a ErbB3 do ligando ErbB3 (e.g., um ou mais de 15 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina). Alguns ligandos (e.g., birregulina ou BIR) funcionam tanto como ligandos do tipo EGF (i.e., ligam EGFR/ErbBl) como ligandos do tipo ErbB3 (i.e., ligam ErbB3). A frase "inibição da ligação de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina a ErbB3", tal como aqui utilizada, refere-se à capacidade de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio de diminuir de forma estatisticamente significativa a ligação de um ligando ErbB3 (e.g., um ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina) a ErbB3, relativamente à ligação na ausência do anticorpo (controlo). Tal significa que, na presença do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio, a quantidade do ligando ErbB3 (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina) que se liga a ErbB3 relativamente a um controlo (sem anticorpo), está diminuída de forma estatisticamente significativa. A quantidade de um ligando ErbB3 que liga ErbB3 pode ser diminuída na presença de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do invento em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% relativamente à quantidade na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio (controlo) . Pode medir-se uma diminuição na ligação de ligando ErbB3 utilizando técnicas reconhecidas na especialidade que medem o nível de ligação de ligando ErbB3 marcado (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina com marcação radioactiva) a células que expressam ErbB3 na presença ou ausência (controlo) do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio. A frase "inibição da proliferação de uma célula que expressa ErbB3", tal como aqui utilizada, refere-se à capacidade de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio diminuir de forma estatisticamente significativa a proliferação de uma célula que expressa ErbB3 relativamente à proliferação na ausência do anticorpo. Numa concretização, a proliferação de uma célula que expressa ErbB3 (e.g., uma célula de cancro) pode ser diminuída em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo 16 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% quando se põem as células em contacto com o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do presente invento, relativamente à proliferação medida na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio (controlo). Pode ensaiar-se a proliferação celular utilizando técnicas reconhecidas na especialidade que medem a taxa de divisão celular, a fracção de células relativamente a uma população de células que se encontram em divisão celular e/ou taxa de perda de células de uma população celular devido a diferenciação terminal ou morte celular (e.g., usando um ensaio de brilho de titulação de células ou incorporação de timidina). A frase "a capacidade de diminuir níveis de ErbB3 à superfície celular", tal como aqui utilizada, refere-se à capacidade de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio reduzir de forma estatisticamente significativa a quantidade de ErbB3 presente à superfície de uma célula que foi exposta ao anticorpo relativamente a uma célula (de controlo) não tratada. Por exemplo, uma diminuição dos níveis de ErbB3 à superfície celular pode resultar de internalização aumentada de ErbB3 (ou aumento de endocitose de ErbB3). Numa concretização, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio diminui a expressão à superfície celular de ErbB3 em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% e/ou aumenta a internalização do receptor de ErbB3 em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% relativamente à expressão ou internalização à superfície celular na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio (controlo). Os níveis de ErbB3 à superfície celular e/ou internalização de receptor de ErbB3 na ausência e na presença de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio podem ser facilmente medidos utilizando técnicas reconhecidas na especialidade, tal como as descritas em Horst et al., anteriormente e nos exemplos aqui. A frase "inibição de excreção de VEGF de células que expressam ErbB3", tal como aqui utilizada, refere-se à 17 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ capacidade de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio de diminuir de forma estatisticamente significativa a excreção de VEGF por uma célula que expressa ErbB3 relativamente à excreção de VEGF na ausência do anticorpo. Numa concretização, a excreção de VEGF de uma célula que expressa ErbB3 (e.g., uma célula de cancro) pode ser diminuída em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% quando as células são postas em contacto com o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do presente invento, relativamente à excreção de VEGF medida na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio (controlo). A excreção de VEGF pode ser ensaiada utilizando técnicas reconhecidas na especialidade, tal como aquelas aqui descritas. A frase "inibição da migração de células que expressam ErbB3", tal como aqui utilizada, refere-se à capacidade de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio diminuir de forma estatisticamente significativa a migração de uma célula que expressa ErbB3 relativamente à migração da célula na ausência do anticorpo. Numa concretização, a migração de uma célula que expressa ErbB3 (e.g., uma célula de cancro) pode ser diminuída em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% quando as células são postas em contacto com o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do presente invento, relativamente à migração de células medida na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio (controlo). A migração celular pode ser ensaiada utilizando técnicas reconhecidas na especialidade, tal como as aqui descritas. A frase "inibição de crescimento de esferóides de células que expressam ErbB3", tal como aqui utilizada, refere-se à capacidade de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio diminuir de forma estatisticamente significativa a migração de uma célula que expressa ErbB3 relativamente à migração da célula na ausência do anticorpo. Numa concretização, a migração de uma célula que expressa ErbB3 18 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ (e.g., uma célula de cancro) pode ser diminuída em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% ou 100% quando as células são postas em contacto com o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do presente invento, relativamente à migração celular medida na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio (controlo). Pode ensaiar-se migração celular usando técnicas reconhecidas na especialidade, tal como as aqui descritas. A expressão "anticorpo" ou "imunoglobulina", tal como aqui usada indiferentemente, inclui anticorpos completos e qualquer fragmento de ligação de antigénio (i.e., "parte de ligação de antigénio") ou suas cadeias únicas. Um "anticorpo" compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfureto. Cade cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é constituída por três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes da complementaridade (CDR), intercaladas por regiões que são mais conservadas denominadas regiões de esqueleto (FR) . Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou factores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunitário (e.g., células efectoras) e um primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. Os exemplos de anticorpos do invento incluem os anticorpos n° 1, 3 e 14 e suas partes de ligação de antigénio. A expressão "parte de ligação de antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente uma "parte de anticorpo"), tal como aqui utilizada, refere-se a um ou mais fragmentos de um 19 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ anticorpo que retêm a capacidade de ligar especificamente um antigénio (e.g., ErbB3). Demonstrou-se que a função de ligação de antigénio de um anticorpo pode ser efectuada por fragmentos de um anticorpo completo. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pela expressão "parte de ligação de antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab' )2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de dobra; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo, (v) um dAb incluindo domínios VH e VL; (vi ) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546) , que consiste de um domínio VH; (vii) um dAb que consiste de um domínio VH ou um domínio VL; e (viii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR) ou (ix) uma combinação de duas ou mais CDR isoladas que podem ser opcionalmente ligadas entre si por um ligante sintético. Além disso, apesar dos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, serem codificados por dois genes independentes, este podem ser ligados entre si utilizando métodos recombinantes por um ligante sintético que permita que estes sejam uma cadeia de proteína única na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); consultar e.g., Bird et al. (1988) Science 242, 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sei. USA 85, 5879-5883). Pretende-se também que tais anticorpos de cadeia simples sejam abrangidos pela expressão "parte de ligação de antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo obtêm-se utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na especialidade e rastreiam-se os fragmentos para a sua utilidade do mesmo modo que anticorpos intactos. As partes de ligação de antigénio podem ser produzidas por técnicas de ADN recombinante ou por clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizada refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto em possíveis mutações de ocorrência natural 20 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ que possam estar presentes em quantidades minoritárias. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, contrariamente a preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que incluem tipicamente anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Podem preparar-se anticorpos monoclonais utilizando qualquer técnica reconhecida na especialidade e aquelas aqui descritas tal como, por exemplo, um método de hibridoma, tal como descrito por Kohler et al. (1975) Nature, 256:495, um animal transgénico, tal como descrito, por exemplo, (consultar e.g., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859), métodos de ADN recombinante (consultar, e.g., patente U.S. n° 4 816 567) ou usando bibliotecas de anticorpos de fagos usando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanos e anticorpos humanizados e podem ocorrer naturalmente ou podem ser produzidos de forma recombinante. A expressão "anticorpo recombinante" refere-se a anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por métodos recombinantes, tal como (a) anticorpos isolados de um animal (e.g., um ratinho) que é transgénico ou trans-cromossómico para genes de imunoglobulina (e.g., genes de imunoglobulina humana) ou um hibridoma daí preparado, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, e.g., a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos combinatorial recombinante (e.g., contendo sequências de anticorpo humano) usando disposição de fagos e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing de sequências génicas de imunoglobulina (e.g., genes de imunoglobulina humana) para outras sequências de ADN. Tais anticorpos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de uma linha germinal humana. Em determinadas concretizações, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagénese in vitro e assim a sequência de 21 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, apesar de serem derivadas e relacionadas com sequências VH e VL de linha germinal humana, podem não existir naturalmente no reportório de linha germinal de anticorpo humano in vivo. A expressão "imunoglobulina quimérica" ou anticorpo refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo cujas regiões variáveis derivam de uma primeira espécie e cujas regiões constantes derivam de uma segunda espécie. Podem construir-se imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, por exemplo por engenharia genética, a partir de segmentos de genes de imunoglobulinas pertencentes a diferentes espécies.
Pretende-se que a expressão "anticorpo humano", tal como aqui utilizada, inclua anticorpos apresentando regiões variáveis nas quais tanto a região de esqueleto como a CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana tal como descrito, por exemplo, por Kabat et al. (consultar Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of
Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, publicação NIH n° 91-3242). Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante é também derivada de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinal humana (e.g., mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo) . Não se pretende contudo que a expressão "anticorpo humano" tal como aqui utilizada inclua anticorpos nos quais as sequências CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero, tal como um ratinho, foram enxertadas em sequências de esqueleto humanas. 0 anticorpo humano pode ter pelo menos um ou mais aminoácidos substituídos por um resíduo de aminoácido, e.g., um resíduo de aminoácido que aumenta a actividade e que não é codificado pela sequência de imunoglobulina de linha germinal humana. Tipicamente, o anticorpo humano pode ter até vinte posições substituídas por resíduos de aminoácidos que não são parte da sequência de imunoglobulina de linha germinal 22 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ humana. Numa concretização particular, estas substituições estão contidas nas regiões CDR tal como descrito detalhadamente em seguida. A expressão "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humanizado" refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo que inclui pelo menos uma cadeia de imunoglobulina ou cadeia de anticorpo humanizadas (i.e., pelo menos uma cadeia leve ou pesada humanizada). A expressão "cadeia de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia de anticorpo humanizada" (i.e., uma "cadeia leve de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina humanizada") refere-se a uma cadeia de imunoglobulina ou de anticorpo (i.e., uma cadeia leve ou pesada, respectivamente) apresentando uma região variável que inclui uma região de esqueleto variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões determinantes da complementaridade (CDR) (e.g., pelo menos uma CDR, preferentemente duas CDR, mais preferentemente três CDR) substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos e inclui adicionalmente regiões constantes (e.g., pelo menos uma região constante ou uma sua parte, no caso de uma cadeia leve e preferentemente três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). A expressão "região variável humanizada" (e.g., "região variável humanizada de cadeia leve" ou "região variável humanizada de cadeia pesada") refere-se a uma região variável que inclui uma região de esqueleto variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões determinantes da complementaridade (CDR) substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos.
Um "anticorpo biespecifico" ou "bifuncional" é um anticorpo hibrido artificial apresentando dois pares diferentes de cadeia pesada/cadeia leve e dois locais de ligação diferentes. Podem produzir-se anticorpos biespecificos por vários métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Consultar, e.g., Songsivilai e Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et ai. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553. Numa concretização particular, um anticorpo biespecifico de acordo com o presente invento inclui locais de ligação para ErbB3 e IGF1-R (i.e., receptor do factor de crescimento 1 do tipo 23 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ insulina). Noutra concretização, um anticorpo biespecifico de acordo com o presente invento inclui locais de ligação para ErbB3 e C-MET. Noutras concretizações, um anticorpo biespecifico inclui um local de ligação para ErbB3 e um local de ligação para ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CAI25, antigénio de membrana especifico da próstata, PDGFR-a, PDGFR-β, C-KIT ou qualquer dos receptores FGF.
Tal como aqui utilizado, um "anticorpo heterólogo" é definido na relação com o organismo ou planta não humano transgénico que produz tal anticorpo.
Pretende-se que um "anticorpo isolado" tal como aqui utilizado se refira a um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos apresentando diferentes especificidades antigénicas (e.g., um anticorpo isolado que liga especificamente ErbB3 está substancialmente isento de anticorpos que ligam especificamente antigénios diferentes de ErbB3). Além disso, um anticorpo isolado está substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos. Numa concretização do invento combinam-se numa composição bem definida uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" com diferentes especificidades de ligação a ErbB3.
Tal como aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (e.g., IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada. Numa concretização, um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é de um isotipo seleccionado de um anticorpo de isotipo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD ou IgE. Em algumas concretizações um anticorpo monoclonal do invento é do isotipo IgGl. Noutras concretizações um anticorpo monoclonal do invento é do isotipo IgG2.
Tal como aqui utilizado, "permuta de isotipo" refere-se ao fenómeno pelo qual a classe ou isotipo de um anticorpo muda de uma classe de Ig para uma das outras classes de Ig.
Tal como aqui utilizado, "isotipo não permutado" refere-se à classe isotípica de cadeia pesada que é produzida quando não ocorreu qualquer permuta de isotipo; o gene CH que 24 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ codifica ο isotipo não permutado é tipicamente o primeiro gene CH imediatamente a jusante do gene VDJ rearranjado funcionalmente. A permuta de isotipo foi classificada como permuta de isotipo clássica ou não clássica. A permuta de isotipo clássica ocorre por eventos de recombinação que envolvem pelo menos uma permuta de regiões de sequência num gene que codifica um anticorpo. A permuta de isotipo não clássica pode ocorrer por, por exemplo, recombinação homóloga entre σμ humana e Σμ humana (deleção associada a δ) . Os mecanismos de permuta não clássicos alternativos, tais como recombinação intertransgénica e/ou intercromossómica, entre outros, podem ocorrer e provocar permuta de isotipo.
Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de permuta" refere-se às sequências de ADN responsáveis por recombinação por permuta. Uma sequência de "dador de permuta", tipicamente uma região de permuta μ, será a 5' (i.e., a montante) da região de construção a ser deletada durante a recombinação de permuta. A região de "aceitador de permuta" será entre a região de construção a ser deletada e a região constante de substituição (e.g., γ, ε, etc.). Como não há um local especifico no qual a recombinação ocorra sempre, a sequência génica final não será tipicamente previsível a partir da construção.
Um "antigénio" é uma entidade (e.g., uma entidade proteica ou péptido) à qual se liga um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio. Em várias concretizações do presente invento, um antigénio é ErbB3 ou uma molécula do tipo ErbB3. Numa concretização particular de acordo com o invento, um antigénio é ErbB3 humano. A expressão "epítopo" ou "determinante antigénico" refere-se a um local num antigénio ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se ligam especificamente. Os epítopos podem formar-se a partir de aminoácidos contíguos ou de aminoácidos não contíguos justapostos pelo enrolamento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente mantidos após exposição a solventes desnaturantes, enquanto epítopos formados pelo enrolamento terciário são tipicamente perdidos após tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo 25 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos numa conformação espacial única. Os métodos de determinar a conformação espacial de epitopos incluem técnicas na especialidade e aquelas aqui descritas, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Consultar, e.g., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, ed. (1996). O presente invento também abrange anticorpos que ligam o mesmo epítopo ou epitopos sobrepostos como os anticorpos do presente invento, i.e., anticorpos que competem para ligação a ErbB3 ou ligam epitopos que estão sobrepostos com epitopos ligados pelos anticorpos aqui descritos, i.e., um epítopo localizado no domínio I de ErbB3. Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados utilizando técnicas de rotina tal como um imuno-ensaio, por exemplo, mostrando a capacidade de um anticorpo bloquear a ligação de outro anticorpo ao antigénio alvo, i.e., um ensaio de ligação competitiva. Determina-se a ligação competitiva num ensaio no qual a imunoglobulina a ensaiar inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antigénio comum, tal como ErbB3. Conhecem-se numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva, por exemplo: radio-imuno-ensaio (RIA) em fase sólida directo ou indirecto, imuno-ensaio enzimático (EIA) em fase sólida directo ou indirecto, ensaio competitivo em sanduíche (consultar Stahli et al.r (1983) Methods in Enzymology 9:242); EIA biotina-avidina em fase sólida directo (consultar Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614); ensaio com marcação em fase sólida directo, ensaio em sanduíche com marcação em fase sólida directo (consultar Harlow e Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA com marcação em fase sólida directo usando um marcador 1-125 (consultar Morei et al., (1988) Mol. Immunol. 25(1): 7); EIA biotina-avidina em fase sólida directo (Cheung et al., (1990) Virology 176:546); e RIA com marcação directo. (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77). Tipicamente, tal ensaio envolve a utilização de antigénio purificado (e.g., ErbB3) ligado a uma superfície sólida ou células apresentando qualquer um de uma imunoglobulina de ensaio não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. Mede-se inibição competitiva por 26 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou às células na presença de uma imunoglobulina de ensaio. Habitualmente a imunoglobulina de ensaio está presente em excesso. Habitualmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, este inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antigénio comum em pelo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou mais.
Tal como aqui utilizadas, as expressões "ligação específica", "liga especificamente", "ligação selectiva" e "liga selectivamente" significam que um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio apresentam afinidade apreciável para um antigénio ou epítopo específicos e de um modo geral não apresentam reactividade cruzada significativa com outros antigénios e epítopos. Ligação "apreciável" ou preferida inclui ligação com uma afinidade de pelo menos ΙΟ6, ΙΟ7, 108, ΙΟ9 ΝΓ1 ou ΙΟ10 ΝΓ1. As afinidades superiores a ΙΟ7 M_1, preferentemente superiores a 108 M_1 são as mais preferidas. Também se pretende que os valores intermédios aos aqui apresentados também sejam abrangidos pelo âmbito do presente invento e pode indicar-se uma afinidade de ligação preferida como uma gama de afinidades, por exemplo, 106 a 1010 M_1, preferentemente 107 a 1010 M-1, com maior preferência 108 a 1010 M-1. Um anticorpo que "não apresenta reactividade cruzada significativa" é aquele que não liga apreciavelmente uma entidade indesejável (e.g., uma entidade proteica indesejável). Por exemplo, numa concretização, um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio que liga especificamente ErbB3 ligará apreciavelmente essa molécula de ErbB3 mas não reagirá apreciavelmente com outras moléculas ErbB e proteínas ou péptidos não ErbB. A ligação específica ou selectiva pode ser determinada de acordo com quaisquer meios reconhecidos na especialidade para determinar tal ligação, incluindo, por exemplo, de acordo com análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva.
Pretende-se que a expressão "KD" tal como aqui utilizada se refira à constante de equilíbrio de dissociação de uma interacção especifica anticorpo-antigénio ou à afinidade de um anticorpo por um antigénio. Numa concretização, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com o presente invento liga um antigénio (e.g., ErbB3) com uma 27 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ afinidade (KD) de 50 nM ou melhor (i.e., ou menos) (e.g., 40 nM ou 30 nM ou 2 0 nM ou 10 nM ou menos) , tal como medido usando um ensaio de ressonância plasmónica de superfície ou um ensaio de ligação celular. Numa concretização particular, um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com o presente invento liga ErbB3 com uma afinidade (KD) de 8 nM ou melhor (e.g., 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1,4 nM, 1,3 nM, 1 nM ou menos), tal como medido usando um ensaio de ressonância plasmónica de superfície ou um ensaio de ligação celular. Noutras concretizações, um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio liga um antigénio (e.g., ErbB3) com uma afinidade (KD) aproximadamente inferior a 1CT7 M, tal como aproximadamente inferior a 1CT8 Μ, 10~9 M ou 1CT10 M ou mesmo inferior quando determinado por tecnologia de ressonância plasmónica de superfície (SPR) num instrumento BIACORE 3000 usando ErbB3 recombinante como analito e o anticorpo como ligando e liga-se ao antigénio predeterminado com uma afinidade que é pelo menos duas vezes superior à sua afinidade para ligação a um antigénio não específico (e.g., BSA, caseína) diferente do antigénio predeterminado ou de um antigénio estreitamente relacionado.
Pretende-se que a expressão "Koff" tal como aqui utilizada se refira à constante de velocidade de desligamento para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antigénio. A expressão "EC50" tal como aqui utilizada, refere-se à concentração de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio que induz uma resposta, num ensaio in vitro ou num ensaio in vivo, que é 50% da resposta máxima, i.e., a meio termo entre a resposta máxima e a linha de base.
Tal como aqui utilizado, define-se "padrão de glicosilação" como o padrão de unidades de hidrato de carbono que estão ligadas covalentemente a uma proteína, mais especificamente a uma proteína imunoglobulina. A expressão "de ocorrência natural" tal como aqui utilizada tal como aplicada a um objecto refere-se ao facto desse objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipéptido ou polinucleótido que está presente num organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado 28 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório é de ocorrência natural. A expressão "rearranjada" tal como aqui utilizada refere-se a uma confiquração de um local de imunoqlobulina de cadeia pesada ou cadeia leve em que o seqmento V está numa posição imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformação que codifica essencialmente um domínio VH ou VL completo, respectivamente. Pode identificar-se um local de gene de imunoglobulina rearranjada por comparação com ADN de linha germinal; um local rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia heptâmero/nonâmero recombinado. A expressão "não rearranjado" ou "configuração de linha germinal" tal como aqui utilizada em referência a um segmento V refere-se à configuração em que o segmento V não está recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
Pretende-se que a expressão "molécula de ácido nucleico" tal como aqui utilizada inclua moléculas de ADN e moléculas de ARN. Uma molécula de ácido nucleico pode ser em cadeia simples ou em cadeia dupla, mas preferentemente é ADN em cadeia dupla.
Pretende-se que a expressão "molécula de ácido nucleico isolada" tal como aqui utilizada em referência a ácidos nucleicos que codificam anticorpos ou partes de anticorpo (e.g., VH, Vl, CDR3) que ligam ErbB3, se refira a uma molécula de ácido nucleico na qual as sequências de nucleótidos que codificam o anticorpo ou parte de anticorpo estão isentas de outras sequências de nucleótidos que codificam anticorpos que ligam antigénios diferentes de ErbB3, podendo estas outras sequências flanquear naturalmente o ácido nucleico em ADN genómico humano.
Pretende-se que a expressão "modificante" ou "modificação" tal como aqui utilizada se refira a alterar um ou mais aminoácidos nos anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio. A alteração pode ser produzida por adição, substituição ou deleção de um aminoácido em uma ou mais posições. A alteração pode ser produzida usando técnicas 29 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ conhecidas tal como mutagénese por PCR. Por exemplo, em algumas concretizações, um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio identificados usando os métodos do invento podem ser modificados para assim modificar a afinidade de ligação do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio a ErbB3. 0 presente invento também abrange "substituições de aminoácidos conservativas" nas sequências dos anticorpos do invento, i.e., modificações de sequências de nucleótidos e de aminoácidos que não impeçam a ligação do anticorpo codificado pela sequência de nucleótidos ou contendo a sequência de aminoácidos ao antigénio, i.e., ErbB3. As substituições de aminoácidos conservativas incluem a substituição de um aminoácido de uma classe por um aminoácido da mesma classe, em que uma classe se define por propriedades fisico-quimicas comuns da cadeia lateral de aminoácidos e elevadas frequências de substituição em proteínas homólogas encontradas na natureza, tal como determinado, por exemplo, por uma matriz de permuta de frequência de Dayhoff padrão ou matriz de BLOSUM. Categorizaram-se seis classes gerais de cadeias laterais de aminoácidos e incluem: classe I (Cys); classe II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly) ; classe III (Asn, Asp, Gin, Glu); classe IV (His, Arg, Lys); classe V (Ile, Leu, Vai, Met); e classe VI (Phe, Tyr, Trp) . Por exemplo, a substituição de um Asp por outro resíduo de classe III tal como Asn, Gin ou Glu, é uma substituição conservativa. Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previsto num anticorpo anti-ErbB3 é preferentemente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma classe. Os métodos de identificar substituições conservativas de nucleótidos e aminoácidos que não eliminam a ligação de antigénio são bem conhecidos na especialidade (consultar, e.g., Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad Sei. USA 94:.412-417 (1997)). A expressão "substituição de aminoácidos não conservativa" refere-se à substituição de um aminoácido de uma classe por um aminoácido de outra classe; por exemplo, substituição de uma Ala, um resíduo de classe II, por um resíduo de classe III tal como Asp, Asn, Glu ou Gin. 30 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Alternativamente, noutra concretização, podem introduzir-se mutações (conservativas ou não conservativas) aleatoriamente em toda ou em parte de uma sequência de codificação de anticorpo anti-ErbB3, tal como por mutagénese de saturação e podem rastrear-se os anticorpos anti-ErbB3 modificados resultantes para actividade de ligação.
Uma "sequência consensual" é uma sequência formada a partir dos aminoácidos (ou nucleótidos) de ocorrência mais frequente numa família de sequências relacionadas (consultar e.g., Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha 1987). Numa família de proteínas, cada posição na sequência consensual é ocupada pelo aminoácido que ocorre mais frequentemente nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrerem com igual frequência, qualquer desses pode ser incluído na sequência consensual. Um "esqueleto consensual" de uma imunoglobulina refere-se a uma região de esqueleto na sequência consensual de imunoglobulina.
De igual modo, a sequência consensual para as CDR pode ser derivada por alinhamento óptimo das sequências de aminoácidos CDR de anticorpos ErbB3 do presente invento.
Para ácidos nucleicos, a expressão "homologia substancial" indica que dois ácidos nucleicos ou suas sequências designadas, quando optimamente alinhadas e comparadas, são idênticas, com inserções ou deleções apropriadas de nucleótido, em pelo menos cerca de 80% dos nucleótidos, habitualmente pelo menos cerca de 90% a 95% e mais preferentemente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleótidos. Alternativamente, existe homologia substancial quando os segmentos hibridarem com o complementar da cadeia em condições de hibridação selectivas. A percentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (i.e., % homologia = n° de posições idênticas / n° total de posições x 100), tomando em consideração o número de falhas e o comprimento de cada falha, que devem ser introduzidas para alinhamento óptimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de 31 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ identidade entre duas sequências pode ser efectuada utilizando um algoritmo matemático, tal como descrito nos exemplos não limitativos que se seguem. A percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos pode ser determinada usando o programa GAP no utilitário GCG, usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de falha de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos ou sequências de aminoácidos pode também ser determinado usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de falha de 12 e uma penalidade de falha de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode determinar-se usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote utilitário GCG, usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de falha de 16, 14, 12, 10, 8, 6ou4e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 .
As sequências de ácidos nucleicos e de proteína do presente invento podem ser adicionalmente utilizadas com uma "sequência de interrogação" para efectuar uma busca contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Podem efectuar-se tais buscas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Podem efectuar-se buscas de nucleótidos BLAST com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleótidos homólogas às moléculas de ácido nucleico do invento. Podem efectuar-se buscas de proteínas BLAST com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína do invento. Para obter alinhamentos com falhas com objectivos de comparação, pode utilizar-se Gapped BLAST tal como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, podem usar-se os parâmetros implícitos dos respectivos programas (e.g., XBLAST e NBLAST). 32 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisado celular ou numa forma substancialmente pura ou parcialmente purificada. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, e.g., outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, estratificação com CsCl, cromatografia em coluna, electroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na especialidade. Consultar, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, New York (1987).
As composições de ácido nucleico do presente invento, apesar de estarem muitas vezes numa sequência nativa (excepto para locais de restrição modificados e semelhantes), de ADNc, genómico ou suas misturas, podem ser mutadas de acordo com técnicas padrão para proporcionar sequências génicas. Para sequências de codificação, estas mutações podem afectar a sequência de aminoácidos tal como pretendido. Em particular, abrangem-se as sequências de ADN substancialmente homólogas ou derivadas de sequências nativas V, D, J, constantes, permutadas e outras de tais sequências aqui descritas (em que "derivada" indica que essa sequência é idêntica ou modificada a partir de outra sequência).
A expressão "ligada operacionalmente" refere-se a uma sequência de ácido nucleico situada numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN da pré-sequência ou líder de excreção está ligado operacionalmente ao ADN de um polipéptido se for expresso como uma pré-proteína que participa na excreção do polipéptido; um promotor ou facilitador está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar tradução. De um modo geral, "ligado operacionalmente" significa que as sequências de ADN que estão ligadas são contíguas e no caso de um líder de excreção, contíguas e em quadro de leitura. Contudo, os facilitadores não têm que ser contíguos. A 33 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ ligação obtém-se por ligação em locais de restrição convenientes. Caso tais locais não existam, usam-se adaptadores ou ligantes de oligonucleótidos sintéticos de acordo com a prática convencional. Um ácido nucleico está "ligado operacionalmente" quando se situa numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou facilitador está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se afectar a transcrição dessa sequência. Relativamente às sequências de regulação de transcrição, ligado operacionalmente significa que as sequências de ADN ligadas são contíguas e quando é necessário juntar duas regiões de codificação de proteína, contíguas e em quadro de leitura. Para sequências de permuta, ligada operacionalmente indica que as sequências são capazes de efectuar recombinação de permuta.
Pretende-se que a expressão "vector", tal como aqui utilizada, se refira a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vector é um "plasmídeo" que se refere a um ADN em cadeia dupla em anel circular ao qual se podem ligar segmentos adicionais de ADN. Outro tipo de vector é um vector vírico, em que se podem ligar segmentos adicionais de ADN no genoma vírico. Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual foram introduzidos (e.g., vectores com uma origem de replicação bacteriana e vectores mamíferos epissómicos). Outros vectores (e.g., vectores mamíferos não epissómicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira e são assim replicados conjuntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, determinados vectores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estes estão ligados operacionalmente. Tais vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vectores de expressão"). Em geral, os vectores de expressão úteis em técnicas de ADN recombinante estão muitas vezes sob a forma de plasmídeos. As expressões, "plasmídeo" e "vector" podem ser utilizadas indiferentemente. Contudo, pretende-se que o invento inclua tais outras formas de vectores de expressão, tal como vectores víricos (e.g., retrovírus com replicação deficiente, adenovírus e vírus adeno-associados), que desempenham funções equivalentes. 34 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Pretende-se que a expressão "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como aqui utilizada, se refira a uma célula na qual se introduziu um vector de expressão recombinante. Entenda-se que tais termos pretendem referir-se não apenas à célula objecto específica mas também à descendência de tal célula. Devido a poderem ocorrer determinadas modificações em gerações sucessivas devido a mutação ou influências ambientais, tal descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula parental mas estar ainda abrangida pelo âmbito da expressão "célula hospedeira" tal como aqui utilizada.
As expressões "tratar" e "tratamento" tal como aqui utilizadas, referem-se a medidas terapêutica ou preventivas aqui descritas. Os métodos de "tratamento" utilizam administração a um indivíduo de um anticorpo ou parte de ligação de antigénio do presente invento, por exemplo, um indivíduo com uma doença ou distúrbio associada com sinalização dependente de ErbB3 ou com predisposição para ter tal doença ou distúrbio, de modo a prevenir, curar, atrasar, reduzir a gravidade ou melhorar um ou mais sintomas da doença ou distúrbio ou doença ou distúrbio recorrente ou de modo a prolongar sobrevivência de um indivíduo para além do esperado na ausência de tal tratamento. A expressão "doença associada com sinalização dependente de ErbB3" ou "distúrbio associado com sinalização dependente de ErbB3" tal como aqui utilizada, inclui estados de doença e/ou sintomas associados com um estado de doença, no qual se verificam níveis aumentados de ErbB3 e/ou activação de cascatas celulares envolvendo ErbB3. Entenda-se que o ErbB3 heterodimeriza com outras proteínas ErbB tais como EGFR e ErbB2, quando se verificam níveis aumentados de ErbB3. Assim, a expressão "doença associada a sinalização dependente de ErbB3", também inclui estados de doença e/ou sintomas associados com estados de doença nos quais se verificam níveis aumentados de heterodímeros EGFR/ErbB3 e/ou ErbB2/ErbB3. De um modo geral, a expressão "doença associada a sinalização dependente de ErbB3", refere-se a qualquer distúrbio, para o qual o arranque, progressão ou persistência dos sintomas necessita da participação de ErbB3. Os exemplos 35 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ de distúrbios mediados por ErbB3 incluem, por exemplo, cancro, não se lhe limitando.
As expressões "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular descontrolado. Os exemplos de cancro incluem carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia, não se lhe limitando. Os exemplos mais específicos de tais cancros incluem cancro de células escamosas, cancro de pulmão de pequenas células, cancro de pulmão de não pequenas células, cancro gástrico, cancro pancreático, tumores de células gliais tais como glioblastoma e neurofibromatose, cancro cervical, cancro dos ovários, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, melanoma, cancro colorrectal, carcinoma do endométrio, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, cancro renal, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e do pescoço. Numa concretização particular, um cancro tratado ou diagnosticado usando os métodos do presente invento é seleccionado de melanoma, cancro de mama, cancro dos ovários, carcinoma renal, cancro gastrointestinal/cólon, cancro do pulmão e cancro da próstata. A expressão "quantidade eficaz" tal como aqui utilizada refere-se à quantidade de um anticorpo ou uma sua parte de ligação de antigénio que liga ErbB3, que é suficiente para efectuar tratamento, prognóstico ou diagnóstico de uma doença associada com sinalização dependente de ErbB3, tal como aqui descrito, quando administrada a um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo do indivíduo e da doença ou condição a tratar, do peso e idade do indivíduo, da gravidade da doença ou condição, do modo de administração e semelhantes, que podem ser facilmente determinados pelo perito na especialidade. As dosagens para administração podem variar desde, por exemplo, cerca de 1 ng a cerca de 10 000 mg, cerca de 5 ng a cerca de 9 500 mg, cerca de 10 ng a cerca de 9 000 mg, cerca de 20 ng a cerca de 8 500 mg, cerca de 30 ng a cerca de 7 500 mg, cerca de 40 ng a cerca de 7 000 mg, cerca de 50 ng a cerca de 6 500 mg, cerca de 100 ng a cerca de 6 000 mg, cerca de 200 ng a cerca de 5 500 mg, cerca de 36 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ 300 ng a cerca de 5 000 mg, cerca de 400 ng a cerca de 4 500 mg, cerca de 500 ng a cerca de 4 000 mg, cerca de 1 pg a cerca de 3 500 mg, cerca de 5 pg a cerca de 3 000 mg, cerca de 10 pg a cerca de 2 600 mg, cerca de 20 pg a cerca de 2 575 mg, cerca de 30 pg a cerca de 2 550 mg, cerca de 40 pg a cerca de 2 500 mg, cerca de 50 pg a cerca de 2 475 mg, cerca de 100 pg a cerca de 2 450 mg, cerca de 200 pg a cerca de 2 425 mg, cerca de 300 pg a cerca de 2 000, cerca de 400 pg a cerca de 1 175 mg, cerca de 500 pg a cerca de 1 150 mg, cerca de 0,5 mg a cerca de 1 125 mg, cerca de 1 mg a cerca de 1 100 mg, cerca de 1,25 mg a cerca de 1 075 mg, cerca de 1,5 mg a cerca de 1 050 mg, cerca de 2,0 mg a cerca de 1 025 mg, cerca de 2,5 mg a cerca de 1 000 mg, cerca de 3,0 mg a cerca de 975 mg, cerca de 3,5 mg a cerca de 950 mg, cerca de 4,0 mg a cerca de 925 mg, cerca de 4,5 mg a cerca de 900 mg, cerca de 5 mg a cerca de 875 mg, cerca de 10 mg a cerca de 850 mg, cerca de 20 mg a cerca de 825 mg, cerca de 30 mg a cerca de 800 mg, cerca de 40 mg a cerca de 775 mg, cerca de 50 mg a cerca de 750 mg, cerca de 100 mg a cerca de 725 mg, cerca de 200 mg a cerca de 700 mg, cerca de 300 mg a cerca de 675 mg, cerca de 400 mg a cerca de 650 mg, cerca de 500 mg ou cerca de 525 mg a cerca de 625 mg de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com o invento. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica óptima. Uma quantidade eficaz é também aquela para a qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais (i.e., efeitos secundários) de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio são minimizados e/ou ultrapassados pelos efeitos benéficos. A expressão "doente" inclui indivíduos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profiláctico ou terapêutico.
Tal como aqui utilizada, a expressão "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, podem utilizar-se os métodos e composições do presente invento para tratar um indivíduo com cancro. Numa concretização particular, o indivíduo é um humano. A expressão "animal não humano" inclui todos os vertebrados, e.g., mamíferos e não mamíferos tal como primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc. 37 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ A expressão "amostra" refere-se a tecido, fluido corporal ou uma célula de um doente ou de um indivíduo. Normalmente, o tecido ou célula serão removidos do doente, mas abrange-se igualmente o diagnóstico in vivo. No caso de um tumor sólido pode retirar-se uma amostra de tecido de um tumor removido cirurgicamente e preparar-se para ensaiar por técnicas convencionais. No caso de linfornas e leucemias, podem obter-se linfócitos, células de leucemia ou tecidos de linfa e preparar-se apropriadamente. Outras amostras de doentes, incluindo urina, lágrimas, soro, líquido cefalorraquidiano, fezes, esputo, extractos de células etc. podem também ser úteis para tumores específicos.
As expressões "agente anti-cancro" e "agente antineoplásico" referem-se a fármacos usados para tratar malignidades, tal como crescimentos cancerosos. A terapia com fármaco pode ser usada sozinha ou em combinação com outros tratamentos tais como cirurgia ou radioterapia. Podem usar-se várias classes de fármacos em tratamento de cancro, dependendo da natureza do órgão envolvido. Por exemplo, os cancros de mama são habitualmente estimulados por estrogénios e podem ser tratados com fármacos que inactivam as hormonas sexuais. De igual modo, o cancro da próstata pode ser tratado com fármacos que inactivam androgénios, a hormona sexual masculina. Os agentes anti-cancro do presente invento incluem, entre outros, os seguintes agentes:
Agente anti-cancro Comentários Exemplos
Anticorpos Anticorpos que ligam IGF- A12 (mAb completamente (a) anticorpos diferentes de anticorpos anti-ErbB3; e IR (receptor do factor de crescimento tipo 1 do tipo insulina), que é expresso à superfície celular na maioria dos cancros humanos humanizado) 19D12 (mAb completamente humanizado) CP751-871 (mAb completamente humanizado) H7C10 (mAb humanizado) (b) anticorpos anti-ErbB3 que ligam diferentes epítopos alphaIR3 (ratinho) scFV/FC (quimera ratinho/humana) EM/164 (ratinho) 38 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Agente anti-cancro
Comentários Anticorpos que ligam EGFR (receptor de factor de crescimento epidérmico); Mutações que afectam expressão ou actividade de EGFR poderiam resultar em cancro
Moléculas pequenas que têm como alvo IGF1R
Anticorpos que ligam cMET (factor de transição epitelial-mesenquimal); um membro da familia MET de receptores tirosina cinases) Anticorpos anti-ErbB3 que ligam epitopos IGF-1R (receptor do factor de crescimento tipo 1 do tipo insulina), que é expresso à superfície celular na maioria dos cancros humanos
Exemplos Matuzumab (EMD72000) Erbitux® / Cetuximab (Imclone) Vectibix® / Panitumumab (Amgen) mAb 806 Nimotuzumab (TheraCIM) AVEO (AV299) (AVEO) AMG102 (Amgen) 5D5 (OA-5D5) (Genentech)
Moléculas pequenas que têm como alvo EGFR EGFR (receptor de factor de crescimento epidérmico); as mutações que afectam expressão ou actividade de EGFR poderiam resultar em cancro
Ab n° 14 (MM 121-14) aqu descrito Herceptin® (Trastuzumab; Genentech) 1B4C3; 2D1D12 (U3 Pharma AG) NVP-AEW541-A BMS-536 924 (1H-benzoimidazol-2-il)-1H-piridin-2-ona) BMS-554 417 Cycloligan TAE226 PQ401 Iressa® / Gefitinib (AstraZeneca) CI-1033 (PD 183805) (Pfizer) Lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKline)
Tykerb® / Ditosilato de Lapatinib (SmithKline Beecham) 39 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Agente anti-cancro
Comentários
Moléculas pequenas que têm como alvo cMET cMET (factor de transição epitelial-mesenquimal); um membro da família MET de receptores tirosina cinases)
Antimetabolitos
Um antimetabolito é um produto químico com uma estrutura semelhante a uma substância (um metabolito) necessária para reacções bioquímicas normais, contudo suficientemente diferente para interferir com as funções normais das células, incluindo divisão celular.
Exemplos Tarceva®/ Erlotinib HC1 (OSI-774) (OSI Pharma) PKI-166 (Novartis) PD-158780 EKB-569 Tirfostina AG 1478(4-(3-cloroanilino)-6,7— dimetoxiquinazolina) PHA665752 ARQ 197 Fluoruracilo (5-FU) Capecitabina / XELODA® (HLR Roche) 5-Trifluorometil-2'-desoxiuridina Metotrexato de sódio (Trexall) (Barr) Raltitrexed / Tomudex® (AstraZaneca) Pemetrexed / Alimta® (Lilly) Tegafur Citosina arabinosídeo (Citarabina, Ara-C) / Thioguanine® (GlaxoSmithKline) 5- azacitidina 6- mercaptopurina (Mercaptopurina, 6-MP) Azatioprina / Azasan® (AAIPHARMA LLC) 6-tioguanina (6-TG) / Purinethol® (TEVA) Pentostatina / Nipent® (Hospira Inc.) 40 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Agente anti-cancro Comentários Exemplos
Fosfato de fludarabina / Fludara® (Bayer Health Care)
Cladribina (2-CdA, 2-clorodesoxiadenosina) / Leustatin® (Ortho Biotech)
Inibidor de Ribonucleótido Reductase (RNR) Ciclofosfamida / Cytoxan (BMS) Neosar (TEVA) Ifosfamida /Mitoxana® (ASTA Medica) Tiotepa (Bedford, Abraxis, Teva) BCNU^ 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosoureia
Agentes alquilantes Um agente alquilante antineoplásico é um agente alquilante que liga um grupo alquilo ao ADN. Dado que as células de cancro proliferam geralmente sem restrição mais do que as células saudáveis, são mais sensíveis a danos de ADN e usam-se agentes alquilantes clinicamente para tratar vários tumores. CCNU^ 1,-(2-cloroetil)-3-ciclo-hexil-1-nitrosoureia (metil CCNU)
Hexametilmelamina (Altretamina, HMM) / Hexalen® (MGI Pharma Inc. )
Bussulfano / Myleran (GlaxoSmithKline) Procarbazina HC1 /
Matulane (Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc.)
Dacarbazina (DTIC)
Clorambucil / Leukaran® (SmithKline Beecham)
Melfalan / Alkeran® (GlaxoSmithKline)
Cisplatina (Cisplatinum, CDDP) / Platinol (Bristol Myers)
Carboplatina /
Paraplatina (BMS) 41 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Agente anti-cancro
Comentários Exemplos
Oxaliplatina / Eloxitan® (Sanofi-Aventis US)
Inibidores de topoisomerase
Agentes que têm como alvo microtúbulos
Os inibidores de topoisomerase são agentes quimioterapêuticos concebidos para interferir com a acção das enzimas topoisomerase (topoisomerase I e II), que são enzimas que controlam as alterações na estrutura do ADN por catálise do rompimento e religação do esqueleto fosfodiéster das cadeias de ADN durante o ciclo celular normal.
Os microtúbulos são um dos componentes do citoesqueleto. Têm um diâmetro de ~24 nm e comprimento variável desde alguns micrómetros até possivelmente milímetros em axónios de células nervosas. Os microtúbulos servem como componentes estruturais no interior das células e estão envolvidos em muitos processos celulares incluindo mitose, citocinese e transporte vesicular.
Doxorrubicina HC1 /
Doxil® (Alza)
Citrato de daunorrubicina / Daunoxome® (Gilead)
Mitoxantrona HCl/Novantrona (EMD Serono)
Actinomicina D
Etoposídeo / Vepesid® (BMS)/ Etopophos® (Hospira, Bedford, Teva Parenteral, Etc.)
Topotecano HC1 /
Hycamtin® (GlaxoSmithKline)
Teniposídeo (VM-26) / Vumon® (BMS)
Irinotecano HCl(CPT-ll) / Camptosar® (Pharmacia & Upjohn)
Vincristina / Oncovin® (Lilly)
Sulfato de vinblastina /Velban®)(suspenso) (Lilly)
Tartarato de vinorrelbina / Navelbine® (PierreFabre)
Sulfato de vindesina / Eldisine® (Lilly)
Paclitaxel / Taxol® (BMS)
Docetaxel / Taxotere® (Sanofi Aventis US)
Paclitaxel em nanopartículas (ABI-007) / Abraxane® (Abraxis BioScience, Inc.)
Ixabepilona / IXEMPRA™ (BMS) 42 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Agente anti-cancro Inibidores de cinase
Comentários As tirosina cinases são enzimas celulares que funcionam para ligar grupos fosfato ao aminoácido tirosina. Bloqueando a capacidade de funcionamento das proteínas tirosina cinases, estes compostos proporcionam uma ferramenta para controlar o crescimento de células cancerosas.
Exemplos Mesilato de imatinib / Gleevec (Novartis) Malato de sunitinib / Sutent® (Pfizer) Tosilato de sorafenib / Nexavar® (Bayer) Cloridrato de nilotinib mono-hidrato / Tasigna® (Novartis)
Inibidores de síntese proteica
Induz apoptose celular
Agentes imuno-terapêuticos
Induz sensibilidade imunitária em doentes de cancro
Hormonas
As terapias hormonais associadas à menopausa e envelhecimento procuram aumentar as quantidades de determinadas hormonas no corpo para compensar os declínios hormonais relacionados com idade e doença. A terapia hormonal como um tratamento de cancro reduz o nível de hormonas específicas ou altera a capacidade do cancro de usar essas hormonas para crescer e se espalhar. L-asparaginase / Elspar® (Merck & Co.) Interferão alfa Inibidor de angiogénese / Avastin® (Genentech) IL-2^ Interleucina 2 (Aldesleucina) / Proleukin ® (Chiron) IL-12^ Interleucina 12 Citrato de toremifene / Fareston® (GTX, Inc.) Fulvestrant / Faslodex® (AstraZeneca) Raloxifene HC1 / Evista® (Lilly) Anastrazole / Arimidex® (AstraZeneca) Letrozole / Femara® (Novartis) Fadrozole (CGS16949A) Exemestana / Aromasin® (Pharmacia & Upjohn) Acetato de leuprolídeo / Eligard® (QTL USA) 43 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Agente anti-cancro
Comentários
Glucocorticóides
Inibidores de aromatose Inibidores de mTOR Fármacos anti-inflamatórios usados para reduzir inchaço que provoca dor de cancro. Inclui imidazoles A via de sinalização de mTOR foi originalmente descoberta durante estudos do agente imunossupressor rapamicina. Esta via altamente conservada regula proliferação celular e metabolismo em resposta a factores
Exemplos Lupron® (TAP Pharm.) Acetato de goserelina / Zoladex® (AstraZeneca) Pamoato de triptorelina / Trelstar® (Watson Labs) Buserelina / Suprefact® (Sanofi Aventis) Nafarelina Cetrorelix / Cetrotide® (EMD Serono) Bicalutamida / Casodex® (AstraZeneca) Nilutamida / Nilandron® (Aventis Pharm.) Acetato de megestrol / Megace® (BMS) Análogos de somatostatina (Acetato de octreotideo / Sandostatin® (Novartis)) Predinsolona Dexametasona / Decadron® (Wyeth) Cetoconazole Sirolimus (Rapamicina) / Rapamune® (Wyeth) Temsirolimus (CCI-779) / Torisel® (Wyeth) Deforolimus (AP23573) (Ariad Pharm.) Everolimus (RAD001) /Certican® (Novartis) 44 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ Agente anti-cancro
Comentários
Exemplos ambientais, ligando a sinalização de receptor de factor de crescimento através de fosfoinositídeo-3-cinase (PI-3K) a crescimento celular, proliferação e angiogénese.
Agentes quimioterapêuticos
Adriamicina, 5-fluorouracilo, Citoxina, Bleomicina, Mitomicina C Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas
Podem administrar-se um ou mais agentes anti-cancro quer simultaneamente, quer antes ou depois de administração de um anticorpo ou de uma sua parte de ligação de antigénio do presente invento.
Descrevem-se mais detalhadamente vários aspectos do invento nas seguintes subsecções. II. Métodos para produzir anticorpos do invento (i) Anticorpos monoclonais
Podem produzir-se anticorpos monoclonais do invento usando várias técnicas conhecidas, tais como a técnica padrão de hibridação de células somáticas descrita por Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495, transformação vírica ou oncogénica de linfócitos B ou técnica de disposição de fagos usando bibliotecas de genes de anticorpo humano. Em concretizações particulares, os anticorpos são anticorpos monoclonais completamente humanos.
Assim, numa concretização, usa-se um método de hibridoma para produzir um anticorpo que liga ErbB3. Neste método, pode 45 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ imunizar-se um ratinho ou outro animal hospedeiro adequado com um antigénio apropriado de modo a desencadear linfócitos que produzem ou que são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao antigénio usado para imunização. Alternativamente, podem imunizar-se linfócitos in vitro. Os linfócitos podem então ser fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986)). Ensaia-se o meio de cultura no qual as células de hibridoma estão em crescimento para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. Após se identificarem células de hibridoma para produzir anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade pretendidas, podem subclonar-se os clones por procedimentos de diluição limitativa e cultivam-se por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies:Principies and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este objectivo incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascites num animal. Os anticorpos monoclonais excretados pelos subclones podem ser separados do meio de cultura, fluido de ascites ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
Noutra concretização, podem isolar-se anticorpos e partes de anticorpo que ligam ErbB3 de bibliotecas de fagos de anticorpo geradas usando as técnicas descritas, por exemplo, em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) e Hoet et al (2005) Nature Biotechnology 23, 344-348; patentes U.S. N° 5 223 409; 5 403 484; e 5 571 698 de Ladner et al.; patentes U.S. N° 5 427 908 e 5 580 717 de Dower et al.; patentes U.S. N° 5 969 108 e 6 172 197 de McCafferty et al.; e patentes U.S. N° 5 885 793; 6 521 404; 6 544 731; 6 555 313; 6 582 915 e 6 593 081 de Griffiths et al.. Adicionalmente pode utilizar-se produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (gama de nM) por permuta de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem 46 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ como infecção combinatorial e recombinação in vivo como estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)).
Numa concretização particular, o anticorpo monoclonal ou sua parte de ligação de antigénio que liga ErbB3 é produzido usando a técnica de disposição de fagos descrita por Hoet et al., anteriormente. Esta técnica envolve a geração de uma biblioteca de Fab humano com uma combinação única de sequências de imunoglobulina isoladas de dadores humanos e gera-se diversidade sintética nas CDR de cadeia pesada. A biblioteca é então rastreada para Fab que se ligam a ErbB3.
Ainda noutra concretização, podem gerar-se anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra ErbB3 usando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos contendo partes do sistema imune humano em vez do sistema de ratinho (consultar e.g., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. et al. (1994), anteriormente; revisto por Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad Sei. 764:536-546. Consultar adicionalmente patentes U.S. N° 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; 5 789 650; 5 877 397; 5 661 016; 5 814 318; 5 874 299; e 5 770 429; todas de Lonberg e Kay; patente U.S. N° 5 545 807 de Surani et al.; publicações PCT N° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas de Lonberg e Kay; e publicação PCT N° WO 01/14424 de Korman et al.).
Noutra concretização, podem desenvolver-se anticorpos humanos do invento usando um ratinho contendo sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, tal como um ratinho com um transgene de cadeia pesada humana e um transcromossoma de cadeia leve humana (consultar e.g., publicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al.).
Ainda adicionalmente estão disponíveis na especialidade sistemas de animais transgénicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina humana e podem usar-se para desenvolver anticorpos anti-ErbB3 do invento. Por exemplo, pode utilizar-se um sistema transgénico alternativo 47 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.); tais ratinhos são descritos, por exemplo, em patentes U.S. N° 5 939 598; 6 075 181; 6 114 598; 6 150 584 e 6 162 963 de Kucherlapati et al.
Além disso, estão disponíveis na especialidade sistemas de animais transcromossómicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina humana e podem ser utilizados para desenvolver anticorpos anti-ErbB3 do invento. Por exemplo, podem utilizar-se ratinhos com um transcromossoma de cadeia pesada humana e um transcromossoma de cadeia leve humana; tal como descrito em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad Sei. USA 97:722-727. Adicionalmente descreveram-se na literatura vacas com transcromossomas de cadeia pesada e de cadeia leve humanas (Kuroiwa et al. (2002) Nature Blotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para desenvolver anticorpos anti-ErbB3 do invento.
Ainda noutra concretização, podem preparar-se anticorpos do presente invento usando uma planta transgénica e/ou células de planta em cultura (tais como, por exemplo, tabaco, milho e lentilhas de água) que produzem tais anticorpos. Por exemplo, podem usar-se folhas de tabaco transgénico que expressam anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio para produzir tais anticorpos, por exemplo, usando um promotor indutível (consultar, e.g., Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95 118 (1999)). Igualmente pode usar-se milho transgénico para expressar tais anticorpos e suas partes de ligação de antigénio (consultar, e.g., Hood et al., Adv. Exp. Med Biol. 464:127 147 (1999)). Os anticorpos também podem ser produzidos em grandes quantidades a partir de sementes de plantas transgénicas incluindo partes de anticorpo, tais como anticorpos em cadeia simples (scFv), por exemplo, usando sementes de tabaco e tubérculos de batata (consultar, e.g., Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101 109 (1998) ). Também se podem encontrar métodos de produzir anticorpos ou partes de ligação de antigénio em plantas em, e.g., Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99 108 (1999) , Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522 7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341 6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940 944 (1994) e patentes U.S. N° 6 040 498 e 6 815 184. 48 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais ou suas partes que ligam ErbB3 preparados usando qualquer técnica, incluindo as aqui divulgadas, pode ser determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radio-imunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A afinidade de ligação de um anticorpo monoclonal ou sua parte também pode ser determinada pela análise de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107 : 220 (1980) .
Em determinadas concretizações, um anticorpo ErbB3 ou sua parte produzido usando qualquer dos métodos discutidos anteriormente pode ser alterado adicionalmente ou optimizado para atingir uma especificidade e/ou afinidade de ligação pretendida usando técnicas reconhecidas na especialidade, tais como as aqui descritas.
Numa concretização, podem usar-se sequências parciais de anticorpo derivadas de um anticorpo ErbB3 para produzir anticorpos relacionados estrutural e funcionalmente. Por exemplo, os anticorpos interactuam com antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que se localizam nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia leve e pesada. Por este motivo, as sequências de aminoácidos no interior das CDR são mais diversificadas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDR. Dado que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interacções anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência natural por construção de vectores que incluem sequências de CDR do anticorpo especifico de ocorrência natural enxertadas em sequências de esqueleto de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (consultar, e.g., Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332x323-321; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; e Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad See. U.S.A. 86:10029-10033). Tais sequências de esqueleto podem ser obtidas de bases de dados de ADN públicas que incluem sequências de genes de anticorpo de linha germinal.
Assim, pode usar-se uma ou mais caracterí st icas de um anticorpo anti-ErbB3 do invento, tais como as CDR, para criar 49 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ anticorpos anti-ErbB3 relacionados estruturalmente que mantêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos do invento, e.g., inibição de fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF; inibição de sinalização através de ErbB3 mediada por uma ou mais de herregulina, epirregulinas, epigénio ou birregulina; inibição de proliferação de células que expressam ErbB3; e/ou diminuição dos niveis de ErbB3 em superfícies celulares.
Numa concretização particular, combinam-se recombinantemente uma ou mais regiões CDR seleccionadas de SEQ ID NOs:7-12, SEQ ID NOs:13-18, SEQ ID NOs: 19-24, SEQ ID NOs:39-44 e SEQ ID NOs:45-50 com regiões de esqueleto e CDR humanas conhecidas para criar anticorpos anti-ErbB3 do invento adicionais, concebidos racionalmente recombinantemente. As regiões de esqueleto variáveis de cadeia pesada e leve podem ser derivadas de sequências do mesmo anticorpo ou de anticorpos diferentes. É bem conhecido na especialidade que os domínios CDR3 de cadeia pesada e leve de anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo a um antigénio (consultar, Hall et al., J. Imunol., 149:1605-1612 (1992); Polymenis et al., J. Immunol., 152:5318-5329 (1994); Jahn et al., Immunobiol., 193:400-419 (1995); Klimka et al., Brit. J. Câncer, 83:252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol, 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 95: 8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2161-2162 (1994); Ditzel et al., J. Immunol., 157:739-749 (1996)). Assim, em determinadas concretizações, geram-se anticorpos que incluem as CDR3 de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos específicos aqui descritos (e.g., SEQ ID NOs: 9, 15, 21, 41, 47 e/ou SEQ ID NOs:12, 18, 24, 44, 50). Os anticorpos podem incluir adicionalmente as CDR1 e/ou CDR2 de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos do presente invento (e.g., SEQ ID NOs:7-8 e/ou SEQ ID NOs: 10-11; SEQ ID NOs: 13-14 e/ou SEQ ID NOs:16-17; SEQ ID NOs:20-21 e/ou SEQ ID NOs:22-23; SEQ ID NOs:39-40 e/ou SEQ ID NOs:42-43; ou SEQ ID NOs:45-46 e/ou SEQ ID NOs:48-49).
As regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 dos anticorpos concebidos racionalmente anteriormente descritos podem compreender a(s) 50 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ sequência(s) exacta(s) de aminoácidos tal como as aqui divulgadas (e.g., CDR de Ab n° 6, Ab n° 3, Ab n° 14, Ab n° 17 ou Ab n° 19, apresentada em SEQ ID NOs:7-12, 13-18, 19-24, 39-44 e 45-50, respectivamente). No entanto, o perito na especialidade considerará que pode ser possivel algum desvio das sequências CDR exactas, mantendo contudo a capacidade do anticorpo ligar ErbB3 eficazmente (e.g., substituições de aminoácidos conservativas). Assim, noutra concretização, o anticorpo concebido racionalmente pode ser composto por uma ou mais CDR que são, por exemplo, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% idênticas a uma ou mais CDR de Ab n° 6, Ab n° 3 ou Ab n° 14.
Noutra concretização, pode alterar-se um ou mais resíduos de uma CDR para modificar a ligação para atingir uma velocidade de ligação mais favorável. Usando esta estratégia, pode conseguir-se um anticorpo com afinidade de ligação ultra elevada, por exemplo, de IO10 M-1 ou mais. Podem usar-se técnicas de maturação por afinidade, bem conhecidas na especialidade e as aqui descritas, para alterar a(s) região(ões) de CDR seguido por rastreio das moléculas de ligação resultantes para a alteração de ligação pretendida. Assim, as CDR são alteradas, as alterações na afinidade de ligação, bem como a imunogenicidade podem ser monitorizadas e pontuadas de modo a conseguir um anticorpo optimizado para a melhor combinação de ligação e baixa imunogenicidade.
Além das modificações no interior das CDR, ou em sua alternativa, também se podem efectuar modificações numa ou mais das regiões de esqueleto FR1, FR2, FR3 e FR4, das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo, desde que estas modificações não eliminem a afinidade de ligação do anticorpo.
Noutra concretização, o anticorpo é modificado adicionalmente relativamente à função de efector, de modo a melhorar a eficácia do anticorpo no tratamento do cancro, por exemplo. Por exemplo, podem introduzir-se resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo assim formação de ligações dissulfureto inter-cadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ser melhorado na sua capacidade de internalização e/ou aumentar a morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente 51 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ de anticorpo (ADCC) . Consultar Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Também se podem preparar anticorpos homodiméricos com actividade anti-tumor melhorada utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais, tal como descrito em Wolff et al. Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente pode conceber-se racionalmente um anticorpo que tem regiões Fc duplas e pode assim ter capacidades aumentadas de lise de complemento e ADCC. Consultar Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Também se abrangem no presente invento anticorpos biespecificos e imunoconjugados, tal como discutido seguidamente. (ii) Anticorpos biespecificos
Os anticorpos biespecificos do presente invento incluem pelo menos uma especificidade de ligação para ErbB3 e pelo menos uma especificidade de ligação para outro antigénio, tal como o produto de um oncogene. Podem preparar-se anticorpos biespecificos como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpo (e.g. anticorpos biespecificos F(ab')2)·
Os métodos para preparar anticorpos biespecificos são bem conhecidos na especialidade (consultar, e.g., WO 05117973 e WO 06091209). Por exemplo, a produção de anticorpos biespecificos completos pode basear-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (consultar, e.g., Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Podem encontrar-se detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecificos, por exemplo, em Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) e em Brennan et al., Science, 229: 81 (1985), que descrevem um processo de ligação química para preparar anticorpos biespecificos. Também foram descritas várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico directamente de culturas de células recombinantes. Por exemplo, produziram-se anticorpos biespecificos usando cremalheiras de leucina (consultar, e.g., Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)). Também se relatou outra estratégia para 52 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ preparar fragmentos de anticorpo biespecífico pela utilização de dimeros de Fv em cadeia simples (sFv) (consultar, e.g., Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)).
Numa concretização particular, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro anticorpo ou sua parte de ligação que se liga a ErbB3 e um segundo anticorpo ou sua parte de ligação que se liga a ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, IGF1-R, C-MET, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, antigénio de membrana específico de próstata, PDGFR-a, PDGFR-β, C-KIT ou qualquer dos receptores FGF. (iii) Imunoconjugados
Podem formar-se imunoconjugados do presente invento por conjugação dos anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio aqui descritos a outro agente terapêutico. Os agentes adequados incluem, por exemplo, um agente citotóxico (e.g., um agente quimioterapêutico) , uma toxina (e.g. uma toxina activa enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) e/ou um isótopo radioactivo (i.e., um radioconjugado). Descreveram-se anteriormente agentes quimioterapêuticos úteis para gerar tais imunoconjugados. As toxinas activas enzimaticamente e seus fragmentos que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos activos não ligantes de toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Encontram-se disponíveis vários radionuclídeos para a produção de anticorpos anti-ErbB3 radioconjugados. Os exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re.
Podem preparar-se imunoconjugados do invento usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetiladipimidato HC1), ésteres 53 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ activos (tal como dissuccinimidilsuberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azida (tal como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tal como tolueno-2,β-diisocianato) e compostos de fluor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode preparar-se uma imunotoxina ricina tal como descrito em Vitetta et ai., Science 238 : 1098 (1987). Um exemplo de agente quelante para conjugação de um radionucleótido ao anticorpo é ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 (consultar, e.g., WO94/11026). III. Métodos para rastreio de anticorpos do invento
Após produzir anticorpos ou partes de ligação de antigénio que ligam a ErbB3, tais anticorpos ou suas partes podem ser rastreados para várias propriedades, tais como as aqui descritas, utilizando vários ensaios bem conhecidos na especialidade.
Numa concretização, os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio são rastreados para a capacidade de inibir fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF. Tal pode ser efectuado por tratamento de células que expressam ErbB3 com um ligando do tipo EGF na presença e ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio. As células podem então ser lisadas e os lisados impuros podem ser centrifugados para remover material insolúvel. Pode medir-se fosforilação de ErbB3, por exemplo, por transferência "Western" seguida por sondagem com um anticorpo anti-f osf otirosina tal como descrito em Kim et ai., anteriormente e os exemplos seguintes.
Noutras concretizações, os anticorpos e partes de ligação de antigénio são rastreados adicionalmente para uma ou mais das seguintes características: (1) inibição de sinalização mediada por ligando de ErbB3 (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina) através de ErbB3; (2) inibição de proliferação de células que expressam ErbB3; (3) capacidade para diminuir os níveis de ErbB3 na superfície celular (e.g., induzindo internalização de ErbB3), (4) 54 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ inibição de excreção de VEGF de células que expressam ErbB3; (5) inibição da migração de células que expressam ErbB3; (6) inibição de crescimento de esferóide de células que expressam ErbB3; e/ou (7) ligação a um epitopo localizado no domínio I de ErbB3, cada uma das quais pode ser medida facilmente usando técnicas reconhecidas na especialidade e as aqui discutidas. A inibição de uma ou mais sinalizações mediadas por herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina através de ErbB3 pode ser facilmente medida usando ensaios de rotina, tal como descrito em Horst et al. anteriormente. Por exemplo, a capacidade de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio para inibir sinalização mediada por herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina através de ErbB3 pode ser medida por ensaios de cinase para substratos conhecidos de ErbB3 tais como, por exemplo, SHC e PI3K, tal como descrito em, por exemplo, Horst et al. anteriormente, Sudo et al., (2000) Methods Enzymol, 322:388-92; e Morgan et al. (1990) Eur. J. Biochem., 191 : 761-767, seguido por estimulação por uma ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina. Assim, podem estimular-se células que expressam ErbB3 com uma ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina e incubarem-se com um anticorpo candidato ou sua parte de ligação de antigénio. Os lisados celulares preparados subsequentemente a partir de tais células podem ser imunoprecipitados com um anticorpo para um substrato de ErbB3 (ou uma proteína numa via celular que envolve ErbB3) tal como, por exemplo, um anticorpo anti-JNK-1 e ensaiam-se para actividade de cinase (e.g., actividade de cinase JNK ou actividade de cinase PI3) usando técnicas reconhecidas na especialidade. Uma diminuição ou desaparecimento completo do nível ou actividade (e.g., actividade de cinase) de um substrato de ErbB3 ou proteína numa via que envolve ErbB3 na presença do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio, relativamente ao nível ou actividade na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é indicativa de um anticorpo ou parte de ligação de antigénio que inibe uma ou mais sinalizações mediadas por herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina. 55 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Em determinadas concretizações, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio inibe a sinalização mediada por ligando ErbB3 (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina) por diminuição da ligação de uma ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina a ERbB3.
De modo a seleccionar os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio que inibem a ligação de uma ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina a ErbB3, podem pôr-se células que expressam ErbB3 (e.g. células MALME-3M, tal como descritas nos exemplos seguintes) em contacto com um ligando de ErbB3 marcado (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina marcadas radioquimicamente) na ausência (controlo) ou presença do anticorpo anti-ErbB3 ou sua parte de ligação de antigénio. Caso o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio iniba a ligação de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina a ErbB3, verificar-se-á então uma diminuição estatisticamente significativa da quantidade de marcador recuperado (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina marcada radioquimicamente), relativamente à quantidade na ausência do anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio. 0 anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio pode inibir a ligação do ligando de ErbB3 (e.g., herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina) por qualquer mecanismo. Por exemplo, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio pode inibir a ligação do ligando de ErbB3 (e.g., uma ou mais de herregulina, epirregulina, epigénio ou birregulina) a ErbB3 por ligação ao mesmo local ou num local sobreposto em ErbB3 do que o ligando de ErbB3. Alternativamente, o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio pode inibir a ligação de um ligando de ErbB3 por alteração ou distorção da conformação de ErbB3, de modo a ser incapaz de se ligar ao ligando de ErbB3.
Os anticorpos e suas partes de ligação de antigénio que diminuem os níveis de ErbB3 nas superfícies celulares podem ser identificados pela sua capacidade de regular negativamente ErbB3 em células de tumor. Em determinadas concretizações, os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio diminuem a expressão de ErbB3 na superfície celular 56 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ induzindo internalização (ou aumentado a endocitose) de Erbb3. Para ensaiar isto, pode biotinilar-se ErbB3 e pode determinar-se facilmente o número de moléculas de ErbB3 na superfície celular, por exemplo, por medição da quantidade de biotina numa monocamada de células em cultura na presença ou ausência de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio, por exemplo, tal como descrito, e.g., em Waterman et al., J. Biol. Chem. (1998), 273:13819-27, seguido por imunoprecipitação de ErbB3 e sondagem com estreptavidina. Uma diminuição na detecção de ErbB3 biotinilado ao longo do tempo na presença de um anticorpo ou parte de ligação de antigénio é indicativa de um anticorpo que diminui os níveis de ErbB3 em superfícies celulares.
Também se podem ensaiar os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio do presente invento para a sua capacidade de inibir proliferação de células que expressam ErbB3, por exemplo, células de tumor, usando técnicas reconhecidas na especialidade, tal como o ensaio de brilho de titulação de células descrito nos exemplos em seguida (consultar também, e.g., Macallan et al., Proc. Natl. Acad Sei. (1998) 20;95(2):708-13; Perez et al. (1995) Câncer Research 55, 392-398).
Noutra concretização, os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio são rastreados para a capacidade de inibir excreção de VEGF de células que expressam ErbB3. Tal pode ser efectuado usando ensaios bem conhecidos, tal como o kit de ELISA de VEGF disponível de R&D Systems (Minneapolis, MN, n° de catálogo DY293B). Similarmente, os anticorpos ou partes podem ser rastreados para a capacidade de inibir a migração de células que expressam ErbB3 (e.g., células MCF-7) usando um ensaio trans-poço (Millipore Corp., Billerica, MA, n° de catálogo ECM552) tal como aqui descrito.
Noutra concretização, os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio são rastreados para a capacidade de inibir crescimento de esferóides de células que expressam ErbB3. Tal pode ser efectuado usando um ensaio que simula as condições de crescimento de um tumor em desenvolvimento (consultar, e.g., Herman et al. (2007) Journal of 57 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Biomolecular Screening - publicação electrónica) tal como aqui descrito.
Os anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio que se ligam ao mesmo epítopo ou a epítopo sobreposto de um ou mais anticorpos do presente invento podem também identificar-se usando técnicas padrão conhecidas na especialidade e aqui descritas. Por exemplo, de modo a rastrear anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo ou epítopos sobrepostos em ErbB3 ligados por um anticorpo de interesse, pode efectuar-se um ensaio de bloqueamento cruzado, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). IV. Composições farmacêuticas
Noutro aspecto, o presente invento proporciona uma composição, e.g., uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou sua(s) parte(s) de ligação de antigénio, do presente invento, formulada conjuntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, as composições incluem uma combinação de múltiplos (e.g., dois ou mais) anticorpos isolados do invento, que ligam diferentes epítopos em ErbB3.
Tal como aqui utilizada, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de atraso de absorção e semelhantes, que são compatíveis fisiologicamente. De preferência o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (e.g., por injecção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto activo, i.e., anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífica, pode ser revestido por um material para proteger o composto da acção de ácidos e outras condições naturais que podem inactivar o composto.
Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que mantém a actividade biológica pretendida do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (consultar e.g., Berge, S.M., et ai. (1977) J. 58 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Pharm. Sei. 66:1-19). Os exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos alifáticos monocarboxílicos e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos com fenilo, ácidos hidroxialcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Os sais de adição de base incluem os derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,Ν'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
As composições farmacêuticas do invento podem ser administradas sozinhas ou em terapia de combinação, i.e., combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição do presente invento com pelo menos um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como os agentes anti-cancro descritos seguidamente. As composições farmacêuticas do invento também podem ser administradas conjuntamente com radioterapia e/ou cirurgia.
Pode administrar-se uma composição do presente invento por vários métodos conhecidos na especialidade. Tal como será considerado pelo perito na especialidade, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados pretendidos. Os compostos activos podem ser preparados com transportadores que protegerão o composto contra libertação rápida, tal como formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Podem utilizar-se polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etilenovinilacetato, poli-anidridos, poli-ácido glicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Encontram-se patenteados ou são conhecidos geralmente dos peritos na especialidade muitos métodos para a preparação de tais formulações. Consultar, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978. 59 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Para administrar um composto do invento por determinadas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com um material ou co-administrá-lo com um material para evitar a sua inactivação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo com um transportador adequado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soro fisiológico e soluções tampão aquosas. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água, bem como lipossomas convencionais (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias activas farmaceuticamente é conhecida na especialidade. Abrange-se a utilização de qualquer meio ou agente convencional nas composições farmacêuticas do invento, excepto se for incompatível com o composto activo. Podem também ser incorporados compostos activos suplementares nas composições.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis nas condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, micro-emulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada a elevada concentração de fármaco. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilienoglicol líquido e semelhantes) e suas misturas adequadas. Pode manter-se uma fluidez adequada, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, para manter o tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poli-álcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Pode conseguir-se absorção prolongada das composições injectáveis incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. 60 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Podem preparar-se soluções injectáveis estéreis por incorporação do composto activo na quantidade necessária num solvente adequado com um ou uma combinação dos ingredientes mencionados anteriormente, tal como necessário, seguido por esterilização por microfiltração. Em geral, preparam-se as dispersões por incorporação do composto activo num veiculo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os mencionados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem em vácuo e secagem-congelamento (liofilização) para obter um pó do ingrediente activo com qualquer ingrediente pretendido adicional a partir da sua solução previamente filtrada para esterilidade.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta pretendida óptima (e.g., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode administrar-se um bolus único, podem administrar-se várias doses divididas ao longo do tempo ou pode reduzir-se ou aumentar-se proporcionalmente a dose tal como indicado pelas exigências da situação terapêutica. Por exemplo, os anticorpos humanos do invento podem ser administrados uma ou duas vezes por semana por injecção subcutânea ou uma ou duas vezes por mês por injecção subcutânea. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária, tal como aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico pretendido em associação com o transportador farmacêutico necessário. As especificações para as formas de dosagem unitárias são ditadas e directamente dependentes de (a) características únicas do composto activo e do efeito terapêutico específico a ser atingido e (b) limitações inerentes à especialidade de composição de tal composto activo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos. 61 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Os exemplos de antioxidantes aceitáveis farmaceuticamente incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteina, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galhato de propilo, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.
Para as composições terapêuticas, as formulações do presente invento incluem as adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), rectal, vaginal e/ou parentérica. As formulações podem ser apresentadas convenientemente em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na especialidade de farmácia. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinado com um material de transporte para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo específico de administração. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será em geral a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, em cem porcento, esta quantidade estará na gama de cerca de 0,001 porcento a cerca de noventa porcento de ingrediente activo, de preferência desde cerca 0,005 porcento a cerca de 70 porcento, com a maior preferência desde cerca de 0,01 porcento a cerca de 30 porcento.
As formulações do presente invento que são adequadas para administração vaginal também incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em aerossol contendo transportadores que se sabe na especialidade que são adequados. As formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de composições deste invento incluem pós, aerossóis, unguentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, pensos e inaladores. O composto activo pode ser misturado em condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável e com quaisquer conservantes, tampões ou propelentes que possam ser necessários. 62 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
As frases "administração parentérica" e "administrado parentericamente" tal como aqui utilizadas significam modos de administração diferentes de administração entérica e tópica, usualmente por injecção, e incluem injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóidal, intra-espinal, epidural e intra-esterno, não se lhes limitando.
Os exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas do invento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e semelhantes) e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tal como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tal como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pela utilização de tensioactivos.
Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes de molhagem, agentes emulsionantes e agentes de dispersão. Os exemplos específicos de adjuvantes que são bem conhecidos na especialidade incluem, por exemplo, adjuvantes inorgânicos (tais como sais de alumínio, e.g., fosfato de alumínio e hidróxido de alumínio), adjuvantes orgânicos (e.g., esqualeno), adjuvantes baseados em óleo, virossomas (e.g., virossomas que contêm uma hemaglutinina ligada à membrana e neuraminidase derivada do vírus influenza). A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, anteriormente citados, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir nas composições agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes. Além disso, pode conseguir-se absorção prolongada da forma 63 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ farmacêutica injectável pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tais como mono-estearato de alumínio e gelatina.
Quando os compostos do presente invento são administrados como produtos farmacêuticos a humanos e animais, eles podem ser administrados sozinhos ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,001 a 90% (com maior preferência 0,005 a 70%, tal como 0,01 a 30%) de ingrediente activo em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
Independentemente da via de administração seleccionada, os compostos do presente invento podem ser usados numa forma hidratada adequada e/ou as composições farmacêuticas do presente invento são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos dos peritos na especialidade.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas do presente invento podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente activo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica num doente, composição e modo de administração específicos, sem ser tóxico para o doente. O nível de dosagem seleccionado dependerá de uma variedade de factores farmacocinéticos incluindo a actividade das composições específicas do presente invento utilizadas, ou o seu éster, sal ou amida, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico que é utilizado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas utilizadas, a idade, sexo, peso, condição, estado de saúde geral e história médica anterior do doente a ser tratado e factores semelhantes bem conhecidos na especialidade médica. Um especialista médico ou veterinário pode determinar facilmente e receitar a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses dos compostos do invento utilizadas na composição farmacêutica a níveis inferiores aos necessários para conseguir o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até se atingir o efeito pretendido. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição do invento 64 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ será a quantidade de composto que é a menor dose eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá qeralmente dos factores descritos anteriormente. É preferível que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, de preferência administrada próximo do local alvo. Caso se pretenda, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente a intervalos adequados ao lonqo do dia, opcionalmente, em formas de dosaqem unitárias. Embora seja possível administrar um composto do presente invento sozinho, é preferível administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição).
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na especialidade. Por exemplo, numa concretização preferida, uma composição terapêutica do invento pode ser administrada com um dispositivo de injecção hipodérmica sem aqulha, tal como os dispositivos divulqados em patentes U.S. N° 5 399 163, 5 383 851, 5 312 335, 5 064 413, 4 941 880, 4 790 824 ou 4 596 556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis no presente invento incluem: patente U.S. N° 4 487 603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para administrar medicação a uma velocidade controlada; patente U.S. N° 4 486 194, que divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicações através da pele; patente U.S. N° 4 447 233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para administração de medicação a uma taxa de infusão com alta precisão; patente U.S. N° 4 447 224, que divulga um dispositivo de infusão implantável de fluxo variável para administração continua de fármaco; patente U.S. N° 4 439 196, que divulga um sistema osmótico de entrega de fármacos com compartimentos multi-câmara; e patente U.S. N° 4 475 196, que divulga um sistema osmótico de entrega de fármaco. São conhecidos na especialidade muitos outros tais implantes, sistemas de entrega e módulos.
Em determinadas concretizações, os anticorpos monoclonais do invento podem ser formulados para assegurar uma distribuição in vivo adequada. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente 65 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ hidrofίlicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos do invento atravessam a BBB (caso pretendido), estes podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabrico de lipossomas, consultar, e.g., patentes U.S. 4 522 811; 5 374 548; e 5 399 331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais partes que são transportadas selectivamente para células ou órgãos específicos, melhorando assim a entrega de fármaco no alvo (consultar, e.g., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Os exemplos de partes de direcção ao alvo incluem folato ou biotina (consultar, e.g., patente U.S. 5 416 016 de Low et al.); manosideos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteina A em tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), diferentes espécies das quais podem ser compreendidas nas formulações dos inventos, bem como componentes das moléculas inventadas; pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); consultar também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. V. Métodos de usar anticorpos do invento
Divulgam-se aqui métodos de usar anticorpos e suas partes de ligação de antigénio que ligam ErbB3 em várias aplicações de diagnóstico e terapêuticas ex vivo e In vivo. Por exemplo, podem usar-se anticorpos do invento para tratar uma doença associada a sinalização dependente de ErbB3, incluindo vários cancros.
Numa concretização, o presente pedido divulga um método para tratar uma doença associada a sinalização dependente de ErbB3 por administração de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio do invento a um indivíduo numa quantidade eficaz para tratar a doença. As doenças adequadas incluem, por exemplo, vários cancros incluindo melanoma, cancro da mama, cancro dos ovários, carcinoma renal, cancro gastrointestinal, cancro do cólon, cancro do pulmão e cancro da próstata, não se lhes limitando. 66 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ Ο anticorpo pode ser administrado sozinho ou com outro agente terapêutico que actua conjuntamente ou em sinergia com o anticorpo para tratar a doença associada a sinalização mediada por ErbB3. Tais agentes terapêuticos incluem, por exemplo, os agentes anti-cancro descritos seguidamente (e.g., citotoxinas, agentes quimioterapêuticos, moléculas pequenas e radiação).
Noutra concretização, o presente pedido divulga um método para diagnosticar uma doença (e.g., um cancro) associada a regulação positiva de ErbB3 num indivíduo, pondo em contacto anticorpos ou partes de ligação de antigénio do invento (e.g., ex vivo ou in vivo) com células do indivíduo e medindo o nível de ligação a ErbB3 nas células. Níveis anomalamente elevados de ligação a ErbB3 indicam que o indivíduo tem uma doença associada a regulação positiva de ErbB3.
Também se encontram no âmbito do presente invento kits compreendendo anticorpos e suas partes de ligação de antigénio do invento que incluem opcionalmente instruções para utilização no tratamento ou diagnóstico de uma doença associada a regulação positiva de ErbB3 e/ou sinalização dependente de ErbB3. Os kits podem incluir um rótulo indicando a utilização pretendida do conteúdo do kit. A expressão rótulo inclui quaisquer materiais escritos, de comercialização ou material registado fornecido no kit ou com o kit ou que o acompanha.
Descrevem-se outras concretizações do presente invento nos seguintes exemplos. 0 presente invento é ilustrado adicionalmente pelos seguintes exemplos.
Exemplos
Materiais e métodos
Ao longo dos exemplos utilizam-se os seguintes materiais e métodos, salvo indicação em contrário. 67 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Em geral, a prática do presente invento utiliza, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de química, biologia molecular, tecnologia de ADN recombinante, imunologia (especialmente, e.g., tecnologia de anticorpo) e técnicas padrão de preparação de polipéptido. Consultar, e.g., Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992) . Descrevem-se sistemas modelo in vitro e in vivo para ensaiar a biologia de HCV em, por exemplo, Cell culture models and animal models of virai hepatitis. Part II: hepatitis C, Lab. Anim. (NY) . ; 34 (2) : 39-47 (2005) e em The chimpanzee model of hepatitis C vírus infections, ILAR J.; 42 (2):117-26 (2001).
Linhas celulares
Todas as linhas celulares usadas nas experiências descritas seguidamente foram obtidas de National Câncer Institute ou proporcionadas por investigadores, tal como indicado.
Linhas celulares: MCF7- ATCC N° de catálogo HTB-22 T47D- ATCC N° de catálogo HTB-133
Colo357- Estas células foram obtidas de um investigador académico e são descritas por Kolb et al. (2006) Int. J. Câncer, 120:514-523.
Du 145- ATCC N° de catálogo HTB-81 0VCAR8- fonte já descrita no pedido provisório. H1975 ATCC N° de catálogo CRL-5908 68 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Pulverização de células de tumor
Utilizou-se um criopulverizador (Covaris Inc) para a pulverização de tumores. Armazenaram-se os tumores em sacos especiais (pré-pesados antes da adição do tumor) e colocaram-se em azoto liquido enquanto se manuseavam. Para tumores pequenos, adicionou-se primeiramente 200 μΐ de tampão de lise ao saco contendo o tumor, congelou-se em azoto liquido e seguidamente pulverizou-se para melhorar a recuperação do tumor do saco. Transferiram-se tumores pulverizados para tubos Eppendorf de 2 mL e colocaram-se em azoto liquido até estarem prontos para processamento adicional.
Lise de células de tumor
Lisaram-se os tumores em tampão de lise suplementado com inibidores de protease e fosfatase. Adicionou-se tampão de lise às aliquotas de tumor numa concentração final de cerca de 62,5 mg/mL. Homogeneizaram-se amostras de tumor por vortex durante 30 segundos e incubaram-se em gelo durante cerca de 30 min. Centrifugaram-se os lisados durante cerca de 10 min em colunas Qiagen Qiashredder para homogeneização adicional das amostras. Aliquotaram-se os lisados limpidos para tubos frescos para processamento adicional.
Ensaio BCA
Efectuou-se o ensaio BCA (Pierce) seguindo o protocolo do fabricante em todas as amostras de tumor. A concentração total de proteína (em mg/mL) de cada amostra de tumor foi usada mais tarde na normalização dos resultados de ELISA.
Ensaio de ELISA
Todos os reagentes de ELISA para ELISA total e de fosfo-ErbB3 foram adquiridos a R&D Systems como kits Duoset. Revestiram-se placas de 96 poços Nunc Maxisorb com 50 uL de um anticorpo e incubaram-se durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, lavaram-se as placas 3 vezes com 1000 μΐ/poço num lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). As placas foram subsequentemente bloqueadas durante cerca de 1 h à temperatura ambiente com BSA a 2% em PBS. As 69 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ placas foram lavadas 3 vezes com 1000 μΐ/poço no lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%) . Usou-se 50 pL de lisados celulares e padrões diluídos em tampão de lise a 50% e BSA a 1% em duplicado para processamento adicional. Incubaram-se as amostras durante 2 h a 4 °C num agitador de placas e lavaram-se 3 vezes com 1000 pl/poço no lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). Adicionou-se cerca de 50 μΐ de um anticorpo de detecção diluído em BSA a 2%, PBST e incubou-se durante cerca de 1 h à temperatura ambiente. Para fosfor-ErbB3, o anticorpo de detecção foi conjugado directamente a peroxidase de rábano (HRP) e incubado durante 2 h à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com 1000 μΐ/poço no lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). Adicionou-se cerca de 50 μΐ de estreptavidina-HRP e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente (excepto para pErbB3). Lavaram-se as placas 3 vezes com 1000 μΐ/poço no lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). Adicionou-se cerca de 50 pL de substrato de ELISA Supersignal Pico e leu-se a placa usando um leitor de placas Fusion. Analisaram-se os dados usando EXCEL. Calculou-se a média das amostras em duplicado e usaram-se barras de erro para representar o desvio padrão entre as duas réplicas.
Exemplo 1: Produção de anticorpos usando disposição de fagos
De modo a obter os anticorpos anti-ErbB3 humanos aqui denominados Ab n° 6, Ab n° 3, Ab n° 14, Ab n° 17 e Ab n° 19, rastreou-se inicialmente para ligantes ErbB3 uma biblioteca de Fab-fago humano incluindo uma combinação única de sequências de imunoglobulina obtida de dadores humanos (Hoet et al. anteriormente).
Usando ErbB3 purificado e uma linha de células de ovário de hamster chinês que expressam ErbB3 à superfície celular, identificaram-se 73 sequências Fab únicas na biblioteca. Estes 73 clones foram então reformatados como Fab mas sem o fago. Usando métodos de elevado rendimento, estes Fab foram expressos em pequena escala e ensaiados para ligação usando ELISA e o método Flexchip que é uma tecnologia de elevado rendimento de ressonância plasmónica de superfície (SPR). Depositaram-se manchas dos 73 Fab sem o fago na superfície de 70 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ um chip e mediu-se a cinética de ligação e bloqueamento de epitopo a uma proteína de fusão alvo de ErbB3-his ou a uma proteína ErbB3-Fc (R & D Systems). Calculou-se a constante de equilíbrio de ligação e as velocidades de ligação/desligamento para os Fab a partir dos dados obtidos.
Seguidamente analisou-se a ligação de vários Fab a células MALME-3M usando cerca de 500 nM dos Fab e uma diluição 1:750 de um anticorpo secundário de cabra anti-humano Alexa 647. Tal como apresentado nas figuras IA e 1B, vários Fab candidatos apresentaram coloração considerável de células MALME-3M.
Exemplo 2: Optimizagão de Fab anti-ErbB3
Após a identificação de Fab que bloquearam a ligação do ligando de ErbB3, herregulina, a ErbB3, optimizaram-se as sequências VH e VL dos Fab para códão, como se segue.
Especificamente reformataram-se as regiões VH e VL usando construções de expressão para a expressão de um isotipo IgGl ou IgG2. As construções incluíram um esqueleto Selexis que tem uma cassete concebida para substituição das sequências pesada e leve adequadas. Os vectores Selexis incluíram um promotor CMV e um sinal poli-A correspondente.
As sequências de ácido nucleico para as VH e VL optimizadas para códão de Ab n° 6 apresentam-se em SEQ ID NOs:25 e 26, respectivamente, e as para Ab n° 3 apresentam-se em SEQ ID NOs:27 e 28, respectivamente, tal como apresentadas na figura 22.
Exemplo 3: Afinidade de ligação a ErbB3
As constantes de dissociação dos anticorpos anti-ErbB3 foram medidas usando duas técnicas independentes, i.e., um ensaio de ressonância plasmónica de superfície e um ensaio de ligação celular usando células MALME-3M. 71 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Ensaio de ressonância plasmónica de superfície
0 ensaio de ressonância plasmónica de superfície (também denominado ensaio Flexchip) foi efectuado como descrito em Wassaf et al. (2006) Analytical Biochem., 351:241-253. O valor de KD foi calculado com base na fórmula KD = Kd/Ka.
Os valores de KD de Ab n° 6 e Ab n° 3, respectivamente, tal como medidos usando o ensaio de ressonância plasmónica de superfície, apresentam-se nas figuras 2A e 2B. Ab n° 6 tem um valor de KD de cerca de 4 nM e Ab n° 3 tem um valor de KD de cerca de 8 nM, tal como apresentado nas figuras 2A e 2B, respectivamente.
Ensaio de ligação celular O ensaio de ligaçao celular para determinar os valores de KD de Ab n° 6 e Ab n° 3 foi efectuado da seguinte forma.
Desligaram-se células MALME-3M com 2 ml tripsina-EDTA + 2 ml de RMPI + EDTA 5 mM à temperatura ambiente durante 5 minutos. Adicionou-se imediatamente RPMI completo (10 ml) às células tripsinizadas, ressuspenderam-se suavemente e centrifugaram-se numa centrífuga de bancada Beckman a 1100 rpm durante 5 minutos. Ressuspenderam-se as células em tampão de coloração BD (PBS + soro fetal bovino a 2% + azida de sódio a 0,1%, Becton Dickinson) a uma concentração de 2 x 106 células por ml e plaquearam-se alíquotas de 50 μΐ (1 x 105 células) numa placa de titulação de 96 poços.
Preparou-se 150 μΐ de solução de anticorpo anti-ErbB3 200 nM (Ab n° 6 ou Ab n° 3) em tampão de coloração BD num tubo eppendorf e diluiu-se em série 2 vezes em 75 μΐ de tampão de coloração BD. As concentrações do anticorpo diluído estavam na gama de 200 nM a 0,4 nM. Adicionaram-se então alíquotas de 50 μΐ das diferentes diluições de proteína directamente a 50 ul da suspensão celular para concentrações finais de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12 nM, 6 nM, 3 nM, 1,5 nM, 0,8 nM, 0,4 nM e 0,2 nM do anticorpo.
Incubaram-se as células aliquotadas na placa de 96 poços com as diluições de proteína durante 30 minutos à temperatura 72 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ ambiente num agitador de plataforma e lavaram-se 3 vezes com 300 μΐ de tampão de coloração BD. As células foram então incubadas com 100 μΐ de uma diluição 1:750 de IgG de cabra anti-humano marcado com Alexa 647 em tampão de coloração BD durante 45 minutos num agitador de plataforma na câmara fria. Finalmente lavaram-se as células duas vezes, sedimentaram-se e ressupenderam-se em 250 μΐ de tampão de coloração BD + iodeto de propídio a 0,5 pg/ml. Efectuou-se análise de 10 000 células num citómetro de fluxo FACScalibur usando o canal FL4. Representaram-se graficamente os valores de MFI e as concentrações de anticorpos anti-ErbB3 correspondentes no eixo dos y e no eixo dos x, respectivamente. Determinou-se o KD da molécula com GraphPad Prism usando um modelo de ligação de um local com uma curva regressão não linear.
Calculou-se o valor de KD com base na fórmula Y=Bmax*X/KD + X (Bmax = fluorescência de saturação. X= concentração de anticorpo. Y = grau de ligação). Tal como apresentado nas figuras 2C e 2D, Ab n° 6 e Ab n° 3 tinham valores de KD de cerca de 4 nM e 1,3 nM, respectivamente, num ensaio de ligação celular usando células MALME-3M.
Exemplo 4: Especificidade de ligação/ligação de epítopo de ErbB3
Ensaiou-se a especificidade de ligação de um isotipo IgG2 de Ab n° 6 a ErbB3 usando ELISA da seguinte forma. Também se analisou a identificação do epítopo ligado por Ab n° 6.
Especificamente revestiram-se placas de 96 poços Nunc Maxisorb com 50 μΐ de proteína a 5 pg/ml (ErbB3 recombinante humana, EGFR recombinante humana ou proteína não relacionada (BSA)) e incubou-se durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, lavaram-se as placas 3 vezes com 1000 μΐ/poço de PBST (Tween-20 a 0,05%) no lavador de placas BioTek. Bloquearam-se os poços durante 1 h à temperatura ambiente com BSA a 2% em PBS. Lavaram-se as placas 3 vezes com 1000 μΐ/poço de PBST (Tween-20 a 0,05%) no lavador de placas BioTek. Adicionou-se cerca de 50 pL do Ab n° 6 a várias diluições (1 μΜ e diluições em série de 2 vezes) em BSA a 2%, PBST. Correram-se todas as amostras em duplicado e incubaram-se durante 2 h a 4 °C num agitador de placas. 73 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Lavaram-se as placas 3 vezes com 1000 μΐ/poço de PBST (Tween-20 a 0,05%) no lavador de placas BioTek. Adicionou-se 50 μΐ de anticorpo de detecção de IgG humano (conjugado a HRP (Bethyl Inc; diluição 1:75000 em BSA a 2%, PBST)) e incubaram-se as placas durante 1 h à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas 3 vezes com 1000 μΐ/poço de PBST (Tween-20 a 0,05%) no lavador de placas BioTek. Adicionou-se 50 pL de substrato de ELISA Supersignal Pico e leu-se a placa no leitor de placas Fusion. Analisaram-se os dados usando o programa EXCEL. Calculou-se a média de amostras em duplicado e as barras de erro representam o desvio padrão entre as duas réplicas.
Tal como apresentado na figura 3, Ab n° 6 ligou ErbB3 recombinante num ELISA, mas não mostrou qualquer ligação considerável a EGFR, BSA ou TGF-a.
Clonou-se um fragmento (mutante de truncagem) correspondente aos residuos de aminoácidos 20-202 de ErbB3 para o vector de disposição de levedura pYD2 (uma versão modificada de pYDl (Invitrogen) com um codão de paragem concebido por engenharia genética em frente do marcador His) entre os locais de restrição Nhe e BsiWI. Transformou-se o plasmideo para a estirpe de levedura EBY100 (Invitrogen) e seleccionaram-se clones contendo o plasmideo seleccionado em meio selectivo Trp-. Cultivou-se o clone em meio contendo glicose durante a noite a 30 °C e induziu-se a expressão do mutante de truncagem de ErbB3 por transferência para um meio contendo galactose durante 2 dias a 18 °C. Corou-se a levedura apresentando o mutante de truncagem de ErbB3 com Ab n°6 50 nM, seguido por anticorpo de cabra anti-humano marcado com corante Alexa 647. Corou-se uma amostra independente com anticorpo de cabra anti-humano apenas para mostrar que não ocorre ligação não especifica do anticorpo secundário à levedura. Efectuou-se análise por citometria de fluxo num citómetro de fluxo FACS Calibur (BD Biosciences).
Tal como apresentado na figura 30, Ab n° 6 liga-se ao mutante de truncagem, i.e., residuos de aminoácidos 20-202 de ErbB3. 74 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Exemplo 5: Regulação negativa de ErbB3 total em células de tumor
Ensaiou-se a capacidade de Ab n° 6 regular negativamente a expressão de ErbB3 tanto in vitro, como in vivo em células de tumor da seguinte forma.
Inocularam-se células MALME-3M em placas de cultura de tecidos de 96 poços e cultivaram-se em meio RPMI-1640 suplementado com antibióticos, L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino (FBS) a 10% durante 24 horas a 37 °C e dióxido de carbono a 5%. Mudou-se então o meio para meio RPMI-1640 com antibióticos, L-glutamina 2 mM com e sem o anticorpo a concentrações de 1 uM, 250 nM, 63 nM, 16 nM, 4,0 nM, 1,0 nM, 240 pM, 61 pM e 15 pM. Cultivaram-se as células durante 24 horas a 37 °C e dióxido de carbono a 5%, lavaram-se com PBS frio, seguidamente recolheram-se com tampão de lise de extracto de proteína de mamífero (MPER, Pierce, 78505) contendo NaCl 150 mM, pirofosfato de sódio 5 mM, bpV (phen) 10 uM, fenalarsina 50 uM, ortovanadato de sódio 1 mM e mistura de inibidor de protease (Sigma, P714). Diluíram-se os lisados celulares duas vezes com albumina de soro bovino a 4% em solução salina tamponada de fosfato com Tween-20 a 0,1%, seguidamente analisaram-se por ELISA com anticorpo de captura de ratinho anti-ErbB3 humano e anticorpo de detecção secundário de ratinho anti-ErbB3 humano. O sinal foi gerado com estreptavidina conjugada a peroxidase de rábano gue reagiu com substrato quimioluminescente (Pierce, 37070). Visualizaram-se ELISA usando um luminómetro.
Tal como apresentado na figura 4, Ab n° 6 diminuiu os niveis totais de ErbB3 em cerca de 46,9% em células MALME-3M in vitro, tal como medido por ELISA. Usou-se meio isento de soro e anticorpo como controlo.
Numa experiência adicional, analisou-se a regulação negativa de receptores de ErbB3 em células MALME-3M usando isotipos IgGl e IgG2 de Ab n° 6 usando análise FACS. Tripsinizaram-se células MALME-3M de uma placa de 15 cm e lavaram-se uma vez com RPMI + soro fetal bovino a 10%. Ressuspenderam-se os sedimentos celulares a uma densidade de 1 x 106 células por ml. Adicionaram-se duas alíquotas de 2 x 75 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ ΙΟ5 células a uma placa de cultura de tecidos de 12 poços e ressuspenderam-se num volume final de 800 ul de RPMI + soro fetal bovino a 10%. Adicionou-se a um poço Ab n° 6 de isotipo IgGl ou Ab n° 6 de isotipo IgG2 a uma concentração final de 100 nM (amostra tratada) e ao outro poço adicionou-se um volume equivalente de PBS (amostra não tratada).
No dia seguinte, tripsinizaram-se células tratadas e não tratadas, lavaram-se e incubaram-se com Ab n° 6 100 nM em tampão de coloração BD durante 30 minutos em gelo. Lavaram-se as células duas vezes com 1 ml de tampão de coloração BD e incubaram-se com 100 ul de uma diluição 1:500 de cabra anti-humano Alexa 647 marcado com Alexa 647 durante 45 minutos em gelo. Lavaram-se então as células e ressuspenderam-se em 300 ul de tampão de coloração BD + iodeto de propídio a 0,5 ug/ml. Efectuou-se a análise de 10 000 células num citómetro de fluxo FACScalibur usando o canal FL4.
Tal como apresentado nas figuras 5A e 5B, ambos os isotipos IgGl e IgG2 de Ab n° 6 regularam negativamente ErbB3 em células MALME-3M em cerca de 62% e cerca de 66%, respectivamente.
De modo a determinar se esta diminuição foi devida a internalização do receptor de ErbB3 na superfície de células MALME-3M, mediu-se a expressão de ErbB3 na presença do anticorpo ao longo do tempo. Especificamente, tripsinizaram-se células MALME-3M de uma placa de 15 cm e lavaram-se uma vez com RPMI + soro fetal bovino a 10%. Ressuspenderam-se os sedimentos celulares a uma densidade de 1 x 106 células por ml. Adicionaram-se duas alíquotas de 2 x 105 células a uma placa de cultura de 12 poços e ressuspenderam-se num volume final de 800 μΐ de RPMI + soro fetal bovino a 10%. Adicionou-se o anticorpo anti-ErbB3 a um poço a uma concentração final de 100 nM (amostra tratada) e ao outro poço adicionou-se um volume equivalente de PBS (amostra não tratada) . No dia seguinte, as células tratadas e não tratadas foram tripsinizadas, lavadas e incubadas com anticorpo anti-ErbB3 100 nM em tampão de coloração BD durante 30 minutos em gelo. Lavaram-se as células duas vezes com 1 ml de tampão de coloração BD e incubaram-se com 100 μΐ de uma diluição de 1:500 de cabra anti-humano Alexa 647 marcado com Alexa 647 76 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ durante 45 minutos em gelo. As células foram então lavadas e ressuspensas em 300 μΐ de tampão de coloração BD + iodeto de propidio a 0,5 pg/ml. Efectuou-se análise de 10 000 células num citómetro de fluxo FACScalibur usando o canal FL4.
Tal como apresentado na figura 6, a regulação negativa de ErbB3 na presença de Ab n° 6 foi medida às 0 horas (figura 6A) , 0,5 horas (figura 6B) , 2 horas (figura 6C) e 24 horas (figura 6D) . Tal como apresentado na figura 6A-6D, cerca de 50% dos receptores de superfície celular de ErbB3 foram regulados negativamente após cerca de 30 minutos e a cerca de 24 horas cerca de 93% dos receptores de superfície celular tinham sido regulados negativamente.
Analisou-se também a capacidade de Ab n° 6 causar regulação negativa de ErbB3 in vivo em células de melanoma da seguinte forma.
Sucintamente, compraram-se ratinhos nu/nu deficientes em células T (ratinhos fêmea de 3-4 semanas de idade originários de NIH; não consanguíneos; antecessores albinos) a Charles River Labs (Wilmington, MA) . Cultivaram-se células MALME-3M para implante em cultura (meio RPMI, FBS a 10%, L-glutamina e antibióticos, 37 °C, CO2 a 5%) até cerca de 80% de confluência antes de colheita. Mantiveram-se as células em gelo até implante. Implantaram-se ratinhos através de injecção subcutânea com 100 ul de células MALME-3M no flanco direito e deixaram-se recuperar enquanto se monitorizavam para crescimento de tumor inicial.
Mediram-se os tumores (comprimento por largura) com uma craveira digital e dosearam-se os ratinhos com IgG2a (Sigma, M7769-5MG) por injecção intravenosa. Dosearam-se os ratinhos intra-peritonealmente, em dias alternados com 15 pg ou 100 pg de anticorpo número 6 e mediram-se os tumores três vezes por semana e registaram-se numa folha de cálculo de Microsoft EXCEL.
Registaram-se as medições de tumor finais (C x L) , eutanizaram-se os ratinhos por asfixia com CO2 e excisaram-se os tumores, congelaram-se rapidamente em azoto líquido e armazenaram-se a -80 °C (para análise bioquímica). 77 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Analisaram-se as medições de tumor finais e representou-se graficamente por área de tumor e volume de tumor tal como descrito, por exemplo, em Burtrum et al., (2003) Câncer Res., 63:8912-8921. Os dados foram também analisados pelas médias "normalizadas" e "não normalizadas" para volume de tumor e área de tumor. Para a "normalização" dos dados, em cada ponto temporal de medição, dividiu-se cada tumor em cada grupo pelo tamanho de tumor inicial determinado por medição com craveira.
Tal como apresentado na figura 7, entre os vários anticorpos ensaiados neste ensaio, Ab n °6 causou regulação negativa de ErbB3 total logo às 24 horas após injecção em tumores tratados com isotipo IgGl ou IgG2 de Ab n° 6) . Usou-se PBS como controlo.
Numa experiência adicional, analisou-se a capacidade de Ab n° 6 para regular negativamente ErbB3 em xeno-enxertos ADRr in vivo.
Sucintamente pulverizaram-se as amostras num criopulverizador (Covaris Inc). Armazenaram-se os tumores em sacos especiais (pré-pesados antes da adição do tumor) e colocaram-se em azoto liquido enquanto se manuseavam. Para tumores pequenos, adicionou-se primeiramente 200 pL de tampão de lise ao saco com o tumor, congelou-se em azoto liquido e seguidamente pulverizaram-se para melhorar a recuperação do tumor do saco. Transferiram-se os tumores pulverizados para tubos Eppendorf de 2 mL e colocaram-se em azoto liquido até lise. Lisaram-se os tumores em tampão de lise suplementado com inibidores de protease e fosfatase. Adicionou-se tampão de lise às alíquotas de tumor numa concentração final de 62,5 mg/ml. Homogeneizaram-se as amostras de tumor com vortex durante 30 segundos e deixaram-se repousar em gelo durante 30 min. Centrifugaram-se os lisados durante 10 minutos em colunas Qiagen Qiashredder para homogeneização adicional das amostras. Os lisados límpidos foram aliquotados para tubos frescos.
Efectuou-se o ensaio BCA tal como apresentado na secção anterior de materiais e métodos. 78 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Determinaram-se os níveis totais de ErbB3 por ELISA. Adquiriram-se os reagentes de ELISA a R&D Systems como kits Duoset. Revestiram-se placas de 96 poços Nunc Maxisorb com 50 μΐ do respectivo anticorpo de captura e incubaram-se durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, lavaram-se as placas 3 vezes com 1000 μΐ/poço num lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%) e seguidamente bloquearam-se durante 1 hora à temperatura ambiente com BSA a 2% em PBS. As placas foram então lavadas três vezes com 1000 μΐ/poço no lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). Diluíram-se os lisados (50 μΐ) e padrões em tampão de lise a 50% e BSA a 1%; todas as amostras foram corridas em duplicado. Incubaram-se as placas durante 2 horas a 4 °C num agitador de placas e seguidamente lavaram-se três vezes com 1000 μΐ/poço num lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). Adicionou-se cinquenta microlitros de anticorpo de detecção diluído em BSA a 2%, PBST e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas três vezes com 1000 μΐ/poço no lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). Adicionou-se cinquenta microlitros de estreptavidina-HRP e incubaram-se as placas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lavaram-se novamente as placas três vezes com 1000 μΐ/poço num lavador de placas BioTek com PBST (Tween-20 a 0,05%). Adicionou-se cinquenta microlitros de substrato de ELISA Supersignal Pico e efectuou-se leitura num leitor de placas Fusion. Analisaram-se os dados utilizando EXCEL. Calculou-se a média de amostras duplicadas e as barras de erro representam o desvio padrão entre as duas réplicas.
Os resultados desta experiência apresentam-se na figura 8. Tal como apresentado na figura 8, Ab n° 6 regulou negativamente ErbB3 em xeno-enxertos ADRr in vivo.
Exemplo 6: Inibição de proliferação de células de tumor
Analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir proliferação celular de células que expressam ErbB3 (e.g., células de cancro) da seguinte forma.
Inocularam-se células MALME3M, ACHN e NCl/ADRr em placas de cultura de tecidos de 96 poços e cultivaram-se em meio 79 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ RPMI-1640 suplementado com antibióticos, L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino (FBS) a 10% durante 24 horas a 37 graus Celsius e dióxido de carbono a 5%. Trocou-se então o meio para meio RPMI-1640 com antibióticos, L-glutamina 2 mM e com e sem o anticorpo a concentrações de 1 uM, 250 nM, 63 nM, 16 nM, 4,0 nM, 1,0 nM, 240 pM, 61 pM e 15 pM. Cultivaram-se as células durante 96 horas a 37 °C e dióxido de carbono a 5%, seguidamente recolheram-se com ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (Promega, G7573) e analisaram-se num luminómetro. Utilizou-se meio sem soro e anticorpo como controlo.
Tal como apresentado nas figuras 9, 10 e 11, Ab n° 6 inibiu a proliferação de células MALME-3M (figura 9), células de cancro de ovário ADRr (figura 10) e células ACHN (figura 11) que expressam ErbB3. Especificamente, Ab n° 6 inibiu a proliferação de células MALME-3M em cerca de 19,6%, tal como medido usando o ensaio de brilho de titulação de células e inibiu a proliferação de células de cancro de ovário ADRr em cerca de 30,5%. Igualmente, tal como apresentado na figura 11, Ab n° 6 inibiu a proliferação de células ACHN em cerca de 25,4%.
Exemplo 7: Inibição de fosforilação de ErbB3 em células de tumor
Analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir fosforilação de ErbB3 in vivo da seguinte forma.
Pulverizaram-se as amostras usando a técnica descrita no exemplo 5 anterior, relativamente à figura 8. Efectuou-se o ensaio BCA como estabelecido na secção anterior de materiais e métodos e efectuou-se o ensaio de ELISA tal como descrito no exemplo 5 anterior relativamente à figura 8.
Apresentam-se os resultados desta experiência na figura 12. Tal como apresentado na figura 12, Ab n° 6 inibiu significativamente a fosforilação de ErbB3 em xeno-enxertos de ADRr de ovário in vivo, tal como medido pela quantidade de ErbB3 fosforilado (pErbB3) em ng/mg de proteína total. 80 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Analisou-se também a capacidade de Ab n° 6 inibir fosforilação de ErbB3 induzida por betacelulina (BTC) ou herregulina (HRG) da seguinte forma.
Pré-incubaram-se células ADRr de ovário com Ab n° 6 durante 30 minutos antes de estimulação com BTC 50 mM, HRG 10 mM ou TGF-a 333 nM. Após pré-incubação, removeu-se o meio e estimularam-se as células durante 5 minutos a 37 °C, CO2 a 5% com BTC 50 nM ou TGF-a 333 nM (para PE498). Também se usaram controlos de HRG (5 minutos, 5 nM) , soro a 10% e soro a 0%. Lavaram-se as células com IX PBS frio e lisaram-se em 30 μΐ de tampão de lise frio (tampão M-PER com vanadato de sódio (NaV04, Sigma), 2-glicerofosfato, óxido de fenilarsina, BpV e inibidores de protease) por incubação em gelo durante 30 minutos. Armazenaram-se os lisados durante a noite a -80 °C.
Tal como apresentado nas figuras 13A-13C, Ab n° 6 inibiu significativamente fosforilação de ErbB3 mediada tanto por betacelulina, como por herregulina.
Numa experiência adicional, analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir fosforilação de ErbB3 em linhas celulares de tumor de ovário OVCAR 5 e OVCAR 8, da seguinte forma.
Obtiveram-se as linhas celulares OVCAR 5 e OVCAR 8 de National Câncer Institute, Division of Câncer Treatment and Diagnostics ("DCTD"). Efectuou-se ELISA tal como descrito na secção anterior de materiais e métodos.
Os resultados desta experiência apresentam-se nas figuras 14A e 14B. Tal como apresentado nas figuras 14A e 14B, Ab n° 6 inibiu fosforilação de ErbB3 em ambas as linhas celulares de cancro de ovário OVCAR 5 e OVCAR 8.
Tal como discutido anteriormente, Ab n° 6 inibe fosforilação de ErbB3 mediada por betacelulina. De modo a investigar se a fosforilação de ErbB3 mediada por betacelulina ocorre através de ErbBl ou ErbB3, efectuou-se a seguinte experiência.
Pré-incubaram-se células ADRr ou células MALME-3M (1 x 105) com Ab n° 6 anti-ErbB3 25 μΜ ou Erbitux 25 μΜ (como 81 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ controlo) em 50 μΐ de tampão de coloração BD durante 30 minutos em gelo. Após 30 minutos, adicionou-se 50 μΐ de BTC biotinilada 400 nM às células e incubaram-se durante mais 30 minutos em gelo. Tal proporciona uma concentração final de 12,5 μΜ de anticorpos e 200 nM de BTC. Lavaram-se então as células duas vezes com 500 μΐ de tampão de coloração BD e incubaram-se com 100 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE (PE=ficoeritrina) (Invitrogen) em tampão de coloração BD durante 45 minutos. Finalmente lavaram-se as células duas vezes, ressuspenderam-se em 300 μΐ de tampão de coloração BD e analisaram-se num citómetro de fluxo FACScalibur. Como controlo positivo, incubaram-se 1 x 105 células ADRr ou MALME-3M com BTC 200 nM durante 30 minutos em gelo, lavaram-se duas vezes e incubaram-se com uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. Para avaliar a coloração de base do conjugado estreptavidina-PE, incubaram-se as células com 100 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE apenas durante 45 minutos.
Os resultados desta experiência são apresentados nas figuras 15A-15C. Tal como apresentado na figura 15A, betacelulina (BTC) não apresenta qualquer ligação significativa a células MALME-3M negativas para ErbBl. No entanto, tal como apresentado nas figuras 15B e 15C, BTC mostra ligação a células ADRr positivas para ErbBl.
Igualmente, tal como apresentado nas figuras 15B e 15C, esta ligação foi bloqueada por Erbitux, que é um anticorpo anti-EGFR que se liga especificamente a EGFR e foi incluído como um controlo para demonstrar que os ligandos do tipo EGF se ligam a EGFR, o que está descrito em e.g., Adams et al. (2005), Nature Biotechnology 23, 1147 - 1157.
Exemplo 8: Inibição de sinalização mediada por herregulina em células de tumor
Investigou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir sinalização de células de tumor mediada por herregulina da seguinte forma.
Inocularam-se células MALME-3M em placas de cultura de tecidos de 96 poços e cultivaram-se em meio RPMI-1640 82 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ suplementado com antibióticos, L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino (FBS) a 10% durante 24 horas a 37 °C e dióxido de carbono a 5%. Privaram-se as células de soro em meio RPMI-1640 com antibióticos e L-glutamina 2 mM durante 24 horas a 37 °C e dióxido de carbono a 5%. Pré-trataram-se as células com e sem o anticorpo anti-ErbB3 (isotipo IgG2 de Ab n° 6) a concentrações de 1 μΜ, 250 nM, 63 nM, 16 nM, 4,0 nM, 1,0 nM, 240 pM e 61 pM durante 30 minutos, seguidamente estimularam-se com HRGl-betal-ECD durante 10 minutos a 37 °C e dióxido de carbono a 5%. As células foram então lavadas com PBS frio, seguidamente recolhidas com tampão de lise de extracto de proteína de mamífero (MPER, Pierce, 78505) contendo NaCl 150 mM, pirofosfato de sódio 5 mM, bpV (phen) 10 uM, fenalarsina 50 μΜ, ortovanadato de sódio 1 mM e mistura de inibidores de protease (Sigma, P714). Diluíram-se os lisados celulares duas vezes com albumina de soro bovina a 4% em solução salina tamponada de fosfato com tween-20 a 0,1%, seguidamente analisaram-se por ELISA para AKT (um efector de ErbB3 a jusante) e fosforilação de ErbB3.
De modo a ensaiar fosforilação de AKT, correram-se os lisados numa placa de ELISA com um anticorpo de captura específico para AKT e anticorpo de detecção biotinilado específico para o local de fosforilação na serina 473 de AKT. Gerou-se o sinal com estreptavidina conjugada a peroxidase de rábano reagida com substrato quimioluminescente (Pierce, 37070). De modo a ensaiar a fosforilação de ErbB3, correram-se os lisados numa placa de ELISA com um anticorpo de captura específico para ErbB3 e um anticorpo de detecção anti-fosfotirosina conjugado a peroxidase de rábano. Reagiu-se então esta com substrato quimioluminescente (Pierce, 37070). Visualizaram-se ELISA usando um luminómetro.
Tal como apresentado nas figuras 16A e 16B, Ab n° 6 foi um inibidor potente de sinalização mediada por herregulina em células MALME-3M, tal como medida por diminuição da fosforilação de ErbB3 (figura 16A) e AKT (figura 16B). Notavelmente, Ab n° 6 inibiu a fosforilação de AKT quase em 100%. 83 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Exemplo 9: Inibição de crescimento de tumor de ovário, da próstata e pancreático
Para avaliar a eficácia de Ab n° 6 in vivo, estabeleceram-se vários modelos de xeno-enxerto de cancro humano em ratinhos nus e avaliou-se a inibição e crescimento de tumor em doses múltiplas. Por exemplo, adquiriram-se ratinhos nu/nu deficientes em células T (ratinhos fêmea de 3-4 semanas de idade originários de NIH; não consanguíneos; antecessores albinos) a Charles River Labs (Wilmington, MA) para estudos de xeno-enxerto. Cultivaram-se células ADRr para implante em cultura (meio RPMI, FBS a 10%, L-glutamina e antibióticos, 37 °C, CO2 a 5%) até cerca de 85% de confluência antes de recolha. Mantiveram-se as células em gelo até ao implante. Implantaram-se ratinhos através de injecção subcutânea com 100 μΐ de células ADRr no flanco direito e deixaram-se recuperar enquanto se monitorizaram para crescimento de tumor inicial.
Mediram-se os tumores (comprimento por largura) com uma craveira digital e dosearam-se os ratinhos com IgG2a (Sigma, M7769-5MG) por injecção intravenosa. Dosearam-se os ratinhos intra-peritonealmente de três em três dias com 30 pg ou 300 pg de Ab n° 6 e mediram-se os tumores três vezes por semana e registaram-se numa folha de cálculo de Microsoft Excel.
Obtiveram-se as medições de tumor finais (C x L), eutanizaram-se os ratinhos por asfixia com CO2 e excisaram-se os tumores, congelaram-se rapidamente em azoto líquido e armazenaram-se a -80 °C (para análise bioquímica). Analisaram-se as medições finais de tumor e representaram-se graficamente por área de tumor e volume de tumor, tal como descrito em Burtrum et al., anteriormente. Os dados também foram analisados pelas médias "normalizadas" e "não normalizadas" de volume de tumor e área de tumor. Para a "normalização" dos dados, a cada ponto de tempo, cada tumor de cada grupo foi dividido pelo tamanho de tumor inicial determinado por medição com craveira.
Os dados para os três modelos diferentes derivados de linhas celulares de tumor humano, ADRr (ovário), Dul45 (próstata) e OvCAR8 (ovário) apresentam-se nas figuras 17A-C 84 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ e ο estudo de xeno-enxerto Colo357 apresenta-se na figura 17D. Os dados destes estudos demonstraram que uma dose de 300 pg de Ab n° 6 de três em três dias (Q3d) resulta numa inibição significativa de crescimento de tumor (p<0,05 para múltiplos pontos temporais durante os estudos). Além disso, este efeito de inibição de Ab n° 6 foi ainda mais elevado quando a dose aumentou para 600 pg, Q3d, no modelo de cancro de próstata Dul45, bem como no modelo de xeno-enxerto de carcinoma renal e pancreático (ACHN e C0L0357). No entanto, a elevação adicional da dose para 1500 ug Q3d não resultou num aumento de eficácia (OvCAR8-figura 17; C0L0357) o que sugere que 600 pg é saturante relativamente a inibição de crescimento de tumor. A análise farmacocinética (PK) do soro dos animais destes estudos demonstra um aumento dependente da dose na retenção sérica de Ab n° 6. Similarmente, a análise bioquímica dos níveis intra-tumor de Ab n° 6 destes diferentes estudos mostrou uma gama dependente da dose de 0 a ~6 pg de MM121/pg de lisado de tumor total (dados não apresentados).
Exemplo 10: Inibição da ligação de ligandos de ErbB3 a ErbB3 em células de tumor
Numa experiência adicional, investigou-se a especificidade dos anticorpos do invento para inibir a ligação de ligandos de ErbB3 a ErbB3 e não de ligandos do tipo EGF a EGFR, da seguinte forma.
Numa experiência, investigou-se a especificidade de Ab n° 6 e uma versão Fab de Ab n° 3 (Ab/Fab n° 3) para inibir a ligação de ligandos de ErbB3 (e.g., herregulina e epirregulina) a ErbB3.
De modo a investigar a capacidade de Ab n° 6 e Ab/Fab n° 3 inibirem a ligação de herregulina a ErbB3, efectuou-se a seguinte experiência.
Incubaram-se células ADRr (1 x 105) com um anticorpo anti-ErbB3 10 pM (e.g., Ab n° 6 ou Ab/Fab n° 3) em 50 pl de tampão de coloração BD durante 30 minutos em gelo. Após 30 minutos, adicionou-se 50 pl de herregulina EGF biotinilada 40 nM às células e incubaram-se durante mais 10 minutos em gelo. 85 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Tal proporciona uma concentração final de anticorpo de 5 μΜ e de herregulina EGF de 20 nM. Lavaram-se então as células duas vezes com 500 μΐ de tampão de coloração BD e incubaram-se com 100 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE (PE=ficoeritrina) (Invitrogen) em tampão de coloração BD durante 45 minutos. Finalmente lavaram-se as células duas vezes, ressuspenderam-se em 300 μΐ de tampão de coloração BD e analisaram-se num citómetro FACScalibur. Como controlo positivo, incubaram-se 1 x 105 células ADRr com herregulina EGF 20 nM durante 10 minutos em gelo, lavaram-se duas vezes e incubaram-se com uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. De modo a avaliar a coloração de base do conjugado estreptavidina-PE, incubaram-se 1 x 105 células ADRr com 100 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE durante apenas 45 minutos.
Os resultados desta experiência apresentam-se nas figuras 18A e 18B. Tal como apresentado nas figuras 18A e 18B, tanto Ab n° 6, como Ab/Fab n° 3 foram capazes de inibir a ligação de herregulina a ErbB3.
Similarmente, a capacidade de Ab n° 6 inibir a ligação de outro ligando de ErbB3, epirregulina, a ErbB3, foi analisada da seguinte forma.
Pré-incubaram-se células ADRr (1 x 105) com Ab n° 6 25 μΜ ou Erbitux 25 μΜ (como controlo) em 50 μΐ de meio de coloração BD durante 30 minutos em gelo. Após 30 minutos, adicionou-se 50 μΐ de Epi biotinilado 2 μΜ às células e incubaram-se durante mais 30 minutos em gelo. Tal proporciona uma concentração final de anticorpos de 12,5 μΜ e de Epi de 1 μΜ. Lavaram-se então as células duas vezes com 500 μΐ de tampão de coloração BD e incubaram-se com 100 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE (PE=ficoeritrina) (Invitrogen) em tampão de coloração BD durante 45 minutos. Finalmente lavaram-se duas vezes as células, ressuspenderam-se em 300 μΐ de tampão de coloração BD e analisaram-se num citómetro de fluxo FACScalibur. Como controlo positivo, incubaram-se 1 x 105 células ADRr com Epi 1 μΜ durante 30 minutos em gelo, lavaram-se duas vezes e incubaram-se com uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. Para avaliar a coloração de base do conjugado estreptavidina-PE, 86 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ incubaram-se as células com 100 μΐ de uma diluição 1 :200 de estreptavidina-PE durante apenas 45 minutos.
Os resultados desta experiência apresentam-se nas figuras 19A e 19B. Tal como apresentado na figura 19A, epirregulina liga-se a células ADRr positivas para ErbB3. Adicionalmente, tal como apresentado na figura 19B, esta ligação é inibida tanto por Erbitux, como por Ab n° 6, sugerindo que epirregulina se pode ligar tanto a EGFR, como a ErbB3.
Efectuou-se uma experiência adicional para investigar se Ab n° 6 é capaz de inibir a ligação de um ligando do tipo EGF (e.g., HB-EGF) a células de tumor.
Pré-incubaram-se células ADRr (1 x 105) com Ab n° 6 25 μΜ ou Erbitux 25 μΜ (como controlo) em 50 μΐ de tampão de coloração BD durante 30 minutos em gelo. Após 30 minutos, adicionou-se 50 μΐ de HB-EGF biotinilado 400 nM às células e incubaram-se durante mais 30 minutos em gelo. Tal proporcionou uma concentração final de anticorpos de 12,5 μΜ e de HB-EGF de 200 nM. Lavaram-se então as células duas vezes com 500 μΐ de tampão de coloração BD e incubaram-se com 100 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE (PE=ficoeritrina) (Invitrogen) em tampão de coloração BD durante 45 minutos. Finalmente, lavaram-se as células duas vezes, ressuspenderam-se em 300 μΐ de tampão de coloração BD e analisaram-se num citómetro de fluxo FACScalibur. Como controlo positivo, incubaram-se 1 x 105 células ADRr com HB-EGF 200 nM durante 30 minutos em gelo, lavaram-se duas vezes e incubaram-se com uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE durante 45 minutos. Para avaliar a coloração de base do conjugado estreptavidina-PE, incubaram-se as células com 100 μΐ de uma diluição 1:200 de estreptavidina-PE durante apenas 45 minutos.
Tal como apresentado nas figuras 20A e 20B, HB-EGF liga-se a ErbB em células ADRr e Ab n° 6 não inibe esta ligação, evidenciando que Ab n° 6 é especifico para inibir a ligação de ligandos ErbB3 (e.g., herregulina e epirregulina) a ErbB3. 87 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Exemplo 11: Inibição de excreção de VEGF em células de tumor A capacidade de Ab n° 6 inibir a excreção de VEGF de células que expressam ErbB3 (e.g.; células de cancro) foi analisada usando ensaio de excreção de VEGF (kit de ELISA de VEGF disponível de R&D Systems, Minneapolis, MN, n° de catálogo DY293B). Primeiramente, analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir excreção de VEGF em células MCF-7, T47D e COLO-357 não tratadas e tratadas com HRG-betal. Estes estudos revelaram que COLO-357 excretaram a maior quantidade de VEGF para o meio. Dado que estas células também tinham níveis muito elevados de HRG (dados não apresentados) , a adição de HRG ao meio não foi capaz de induzir adicionalmente a excreção de VEGF (figura 24A). Contrariamente, HRG foi capaz de induzir excreção de VEGF em células MCF-7 e T47D.
Ab n° 6 apresenta um efeito de inibição potente a níveis elevados em todas as três linhas celulares, sendo os mais elevados em COLO-357 (figura 24A) . Ab n° 6 também apresenta um efeito similar in vivo por inibição da excreção de VEGF em três xeno-enxertos diferentes, sendo o mais elevado no xeno-enxerto COLO-357 (figura 24B). A inibição de VEGF está correlacionada com a inibição de fosforilação de ErbB3 (figura 24 C) . A inibição da excreção de VEGF também está correlacionada com a inibição de angiogénese de células de tumor. Especificamente, identificou-se que os factores de excreção celular de mieloma, tais como VEGF e bFGF, desencadeiam angiogénese (consultar, e.g., Leung et al. (1989) Science 2 46 (4935):13 06-9,- Yen et al. (2000) Oncogene 19 (31) :3460-9) .
Exemplo 12: Inibição de migração celular
Analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir a migração de células que expressam ErbB3 (e.g., células MCF-7) usando um ensaio de trans-poço (Millipore Corp., Billerica, MA, n° de catálogo ECM552). Primeiramente, privaram-se células MCF-7 de soro durante a noite e seguidamente incubaram-se na presença ou ausência de Ab n° 6 (concentração final de 8 uM) durante 15 minutos à temperatura ambiente. As células foram então transferidas para uma câmara superior que está separada de 88 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ uma câmara inferior por uma membrana revestida com colagénio de tipo I, através da qual as células podem migrar. Adicionou-se FBS a 10% ao meio na câmara inferior para actuar como um quimioatractor na presença ou ausência de Ab n° 6. Incubaram-se as câmaras a 37 °C durante 16 horas e seguidamente removeram-se as células que migraram através da membrana usando um tampão de desligamento e incubaram-se com um corante fluorescente de ligação de células. Quantificou-se a fluorescência usando um leitor de placas de florescência. Apresenta-se na figura 25 a fluorescência média ± EPM (n=2).
Tal como apresentado na figura 25, FBS a 10% estimula a migração celular (pista 3) comparativamente a controlo não tratado (pista 1) e Ab n° 6 8 uM inibe a migração celular induzida por FBS (pista 4).
Exemplo 13: Inibição de crescimento de esferóides
Analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir o crescimento de esferóides de células que expressam ErbB3 usando um ensaio que aproxima as condições de crescimento de um tumor em desenvolvimento (Herman et al. (2007) Journal of Biomolecular
Screening: publicação electrónica). Iniciaram-se esferóides AdrR e DU145 a uma frequência de 1 esferóide por poço numa placa de 96 poços usando o método de gota suspensa (Herrman et al., 2008). Trataram-se então os esferóides individuais com Ab n° 6 (concentração final de 8 uM) , domínio EGF de herregulina-βΐ (R&D Systems, Minneapolis, MN, n° de catálogo 396-HB, concentração final de 3,4 nM) ou uma combinação de ambos, tal como indicado. Mediram-se os diâmetros dos esferóides usando microscopia óptica (objectiva de 10X) no dia 1 e dia 13.
Ab n° 6 inibe o crescimento de esferóides em células AdrR (figura 26A) . Além disso, HRG 3,4 nM estimula o crescimento de esferóides e Ab n° 6 inibe o efeito de HRG (figura 26B) . Os esferóides derivados de DU145 não aumentaram de tamanho durante os 13 dias da experiência; no entanto, o crescimento foi estimulado significativamente por HRGl-beta 1. Nestas células, Ab n° 6 8 uM inibe o crescimento de esferóides induzido por HRG (figura 26C). 89 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ
Exemplo 14: Inibição de sinalização
Analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir a sinalização induzida por diferentes ligandos. Por exemplo, ensaiou-se o efeito de Ab n° 6 na ligação de HRG e BTC a células AdrR que expressam receptor de ErbB3. Tal como apresentado nas figuras 27A e B, usando análise FACS, Ab n° 6 compete com HRG, mas não com BTC, para ligação a células AdrR: Assim, o bloqueamento por Ab n° 6 de ligação de HRG a ErbB3 evitaria a sinalização induzida por HRG.
Adicionalmente, ensaiaram-se vários ligandos para indução de fosforilação de ErBb3. Três ligandos, HRG, BTC e HGF, foram capazes de estimular fosforilação induzida por ErbB3 em células AdrR, enquanto EGF não foi. Tal como apresentado na figura 28, Ab n° 6 inibe fosforilação de pErbB3 induzida por HGF em células AdrR (figura 28) . Adicionalmente, tal como conhecido na especialidade (consultar, e.g., Wallenius et al. (2000) Am J Pathol. 156 (3):821-9 10702398), verificou-se sinalização de HGF melhorada em vários tumores epiteliais e não epiteliais.
Interacção ErbB3/cMET e o papel de Ab n° 6 na modulação desta interacção
Demonstrou-se que os cancros de pulmão de não pequenas células com mutações de activação no receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) desenvolvem resistência a inibidores de tirosina cinase por recrutamento MET e HER3 e assim activando a via de sobrevivência celular PI3K-AKT (Engelmann et al. (2007) Science 316: 1039-1043; Gou (2007) PNAS: 105 (2): 692-697). A associação entre EGFR e c-MET em linhas celulares que contêm mutações de activação de EGFR foi bem estabelecida por co-imunoprecipitação (Engelmann et al. 2007; Gou 2007). Guo et al. demonstraram recentemente que c-MET e ErbB3 também existem num complexo numa linha celular gástrica MKN45 que se sabe ser dependente de c-MET amplificado, usando co-imunoprecipitação.
Esta interacção c-MET-erbB3 também ocorre em células AdrR com EGFR de tipo selvagem e não é dependente de c-MET amplificado. HGF (factor de crescimento de hepatócitos) induz 90 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ fosforilação de ErbB3 em células AdrR de uma forma dependente da dose, tal como apresentado na figura 28. Além disso, Ab n° 6 inibe fosforilação de erbB3 induzida por HGF.
Também se investigou o efeito de HRG e BTC na fosforilação tanto de ErbBl, como de ErbB3 e verificou-se que HRG e BTC induzem fosforilação de ambos ErbBl e ErbB3. Verificou-se que HRG é um indutor mais potente de fosforilação de ErbB3 enquanto BTC foi um indutor potente de fosforilação de ErbBl (figura 29). Provavelmente, esta fosforilação é dirigida pelo complexo entre ErbBl e ErbB3. Sucintamente, a ligação de HRG a ErbB3 induz a formação de complexo entre ErbBl e ErbB3, levando à activação de ambos os receptores. 0 mesmo fenómeno parece provável para BTC, em que a ligação de BTC a ErbBl estimula a formação do complexo entre ErbBl e ErbB3, levando à fosforilação de ambos ErbBl e ErbB3.
Inibição de fosforilação de ErbB3 estimulada por ligando (HRG, BTC, EGF e HGF) por anticorpo.
Analisou-se a capacidade de Ab n° 6 inibir fosforilação de ErbB3 induzida por ligando (HRG, BTC, EGF e HGF) com base no seguinte método: 1. Plaquearam-se células AdrR em placas de 96 poços a uma densidade de 30 000 células/poço/100 uL em meio RPMI contendo FBS a 10% e deixaram-se crescer durante a noite; 2. No dia seguinte, privaram-se as células de soro por troca do meio para meio isento de FBS e deixaram-se crescer durante a noite; 3. Pré-trataram-se as células com diferentes concentrações de Ab n° 6 (de 0,01 nM a 100 nM) ou tampão (controlo), durante 2 horas; 4. As células foram então estimuladas com HRG e HGF 10 nM durante 10 minutos ou BTC e EGF 10 nM durante 5 minutos; 91 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ 5. Parou-se a reacçao por remoção do meio de cultura e lavaram-se as células uma vez com PBS gelado; 6. Lisaram-se então as células em Tris 25 mM, pH+7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 a 1,0%, CHAPS a 1,0%, glicerol a 10% v/v, contendo inibidor de protease IX e inibidor de fosfatase IX; e 7. Mediu-se a fosforilação de ErbB3 em Usados celulares usando o kit de ELISA de fosfo-ErbB3 humano (R&D Systems, Minneapolis, MN, n° de catálogo DYC1769) de acordo com as instruções do fabricante.
Inibição de formação de complexo de proteínas ErbB2-ErbB3 por anticorpo.
Pré-incubaram-se células AdrR com tampão (controlo) ou Ab n° 6 250 nM durante 60 minutos à temperatura ambiente, seguidamente trataram-se com HRG 10 nM ou BTC 10 nM ou tampão de controlo durante 10 minutos. As células foram lisadas em Tris 25 mM, pH+7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 a 1,0%, CHAPS a 1,0%, glicerol a 10% v/v, contendo PMSF 0,2 mM, aprotinina a 50 mTU/mL e leupeptina 100 uM e o lisado impuro foi centrifugado brevemente para remover material insolúvel. Transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo eppendorf e adicionou-se anticorpo anti-ErbB3 (Santa Cruz sc-285) a uma diluição 1:500. Incubaram-se os sobrenadantes durante a noite com agitação suave a 4 °C. Lavaram-se primeiramente 60 ul de pérolas de agarose com proteína A/G imobilizada (Pierce, Rockford, IL, n° de catálogo 20421) com IX PBS. Adicionou-se a mistura de lisado celular-anticorpo às pérolas lavadas com PBS e incubaram-se durante 2 horas com agitação suave a 4 °C. Os imunoprecipitados foram então lavados com tampão de lise gelado 3 vezes, ressuspenderam-se em 30 ul de tampão de amostra de SDS 2X, desnaturou-se por calor a 95 °C durante 7 minutos e correram-se em géis de SDS-PAGE Bis-Tris a 4-12% e electro-transferiram-se para membrana de PVDF em tampão de Tri-Glicina com MeOH a 10%. Bloqueou-se a membrana durante 1 hora em 10 ml de tampão de bloqueamento (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, n° de catálogo 927-40000) e seguidamente incubaram-se com o anticorpo anti-ErbB2 a 1:1000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, n° de catálogo 29D8) em 10 92 ΕΡ 2 129 396/ΡΤ ml de tampão de bloqueamento (Li-Cor Biosciences, n° de catálogo 927-40000). Detectou-se o sinal usando IRDye800 de cabra anti-coelho a 1:5000 (2 ul) em 10 ml de tampão de bloqueamento (Li-Cor Biosciences, N° de catálogo 927-40000).
Também se demonstrou que Ab n° 6 inibiu completamente a formação de complexo ErbB2/3 estimulada por HRG (figura 29B).
Lisboa, 2013-11-11

Claims (23)

  1. ΕΡ 2 129 396/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal isolado ou sua parte de ligação de antigénio que se liga a ErbB3 humano e compreende: a) uma região variável de cadeia pesada, em que a CDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, a CDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e a CDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e uma região variável de cadeia leve, em que a CDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, a CDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e a CDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; ou b) uma região variável de cadeia pesada, em que CDR1, CDR2 e CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos que são pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 definidas em (a); e uma região variável de cadeia leve, em que CDR1, CDR2 e CDR3 compreendem sequências de aminoácidos que são pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 definidas em (a) e em que o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é capaz de inibir a fosforilação de ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF.
  2. 2. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio da reivindicação 1, em que a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. ΕΡ 2 129 396/ΡΤ 2/5
  3. 3. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio da reivindicação 1 ou 2, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio da reivindicação 1, em que o ligando do tipo EGF é betacelulina.
  5. 5. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio da reivindicação 4, que é capaz de inibir a fosforilação de ErbB3 mediada por betacelulina em células AdrR in vitro.
  6. 6. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é seleccionado do grupo que consiste de um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo bi-específico e um anticorpo quimérico.
  7. 7. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é seleccionado do grupo que consiste de Fab, Fab'2, ScFv e um domínio de anticorpo.
  8. 8. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o isotipo de anticorpo é seleccionado do grupo que consiste de um anticorpo IgGl, um IgG2, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgAl, um IgA2, um IgAsec, um IgD e um IgE.
  9. 9. Composição compreendendo o anticorpo ou parte de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores num transportador farmaceuticamente aceitável.
  10. 10. Composição de ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo humano que se liga a ErbB3 humano de acordo com a reivindicação 1, cuja composição compreende um ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 25 ou é uma sequência que híbrida em condições altamente rigorosas com SEQ ID NO: 25 e um ácido nucleico ΕΡ 2 129 396/ΡΤ 3/5 compreendendo uma sequência que codifica uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 26 ou é uma sequência que híbrida em condições altamente rigorosas com SEQ ID NO:26.
  11. 11. Composição de ácido nucleico da reivindicação 10, na qual a sequência de nucleótidos que codifica uma região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 25 e a sequência de nucleótidos que codifica uma região variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 26.
  12. 12. Composição de ácido nucleico da reivindicação 10 ou 11, em que cada ácido nucleico está compreendido num vector de expressão.
  13. 13. Célula hospedeira compreendendo a composição de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 10 a 12.
  14. 14. Mamífero não humano transgénico ou planta transgénica que expressa o anticorpo ou parte de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
  15. 15. Célula hospedeira que produz um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
  16. 16. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15 em que o anticorpo é codificado por uma sequência de nucleótidos de região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO:25 e uma sequência de nucleótidos de região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO:26 e suas modificações conservativas de sequência.
  17. 17. Kit compreendendo um anticorpo monoclonal ou sua parte de ligação de antigénio isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e instruções para uso no tratamento ou diagnóstico de uma doença associada a sinalização dependente de ErbB3, opcionalmente em que a doença é um cancro.
  18. 18. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso num ΕΡ 2 129 396/ΡΤ 4/5 método de inibir fosforilaçao of ErbB3 mediada por ligando do tipo EGF ou tratar cancro num indivíduo humano.
  19. 19. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso de acordo com a reivindicação 18, em que o cancro é cancro pancreático, melanoma, cancro da mama, cancro dos ovários, carcinoma renal, cancro gastrointestinal/cólon, cancro do pulmão, sarcoma das células claras ou cancro da próstata.
  20. 20. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso de acordo com a reivindicação 18, em que: - o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é administrado intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente ao indivíduo; e/ou - o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico, em que o segundo agente terapêutico é (a) um segundo anticorpo anti-cancro; ou (b) uma molécula pequena anti-cancro.
  21. 21. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso de acordo com a reivindicação 20, em que o anticorpo anti-cancro é um anticorpo anti-IGFlR, um anticorpo anti-EGFR ou um anticorpo anti-cMet.
  22. 22. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso de acordo com a reivindicação 20, em que a molécula pequena anti-cancro é um anti-metabolito, um agente alquilante, um inibidor de topoisomerase, um agente de direcção a alvo de microtúbulo, um inibidor de cinase, um inibidor de síntese proteica, um imunoterapêutico, uma hormona ou seu análogo, um análogo de somatostatina, um glucocorticóide, um inibidor de aromatase, um inibidor de mTOR, uma molécula pequena que tem como alvo IGF1R ou uma molécula pequena que tem como alvo EGFR. ΕΡ 2 129 396/ΡΤ 5/5
  23. 23. Anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso num método de diagnóstico de um cancro associado a ErbB3 num indivíduo humano, compreendendo (a) pôr em contacto ex vivo ou in vivo células do indivíduo com o referido anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio e (b) medir o nivel de ligação do referido anticorpo ou parte de ligação de antigénio a ErbB3 nas células, em que niveis anomalamente elevados de ligação do referido anticorpo ou parte de ligação de antigénio a ErbB3 indicam que o indivíduo tem um cancro associado a ErbB3. Lisboa, 2013-11-11
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