CN105168085B - 间充质干细胞衍生液及其制备方法和在化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞衍生液及其制备方法和在化妆品中的应用，该间充质干细胞衍生液的制备方法包括以下步骤：(1)使用间充质干细胞培养基对胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行培养，收集细胞培养液；(2)向步骤(1)所得细胞培养液中加入1‑3丙二醇、透明质酸钠和蜂王浆，即得间充质干细胞衍生液。所得间充质干细胞衍生液用于化妆品，保湿效果好；能明显减少细纹、提高皮肤光滑度；改善皮肤弹性；改善皮肤泛红、脱皮和炎症的状况，减少皮肤过敏的发生。

Description

间充质干细胞衍生液及其制备方法和在化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及一种护肤品及其制备方法和应用，特别涉及一种间充质干细胞衍生液及其制备方法和在化妆品中的应用。
背景技术
进入21世纪以来，随着国家的不断发展，社会的不断进步，人们生活水平的提高及对自身美的追求，人们尤其是女性对于日常生活护肤美容愈加重视，而目前市场上的化妆品产品鱼龙混杂，良莠不齐，消费者难以鉴别。
很多精细化工护肤品含有铅汞、乙醇、着色剂及矿物油等对人体肌肤有害的物质，消费者每天在使用这些护肤品的同时，不知不觉对自身皮肤造成了一定的损害，严重的还会造成皮炎及感染问题。而且现有市场出售的化妆品，大多是通过植物成分提取或精细化工制作工艺加工而成，其产品中的大分子物质不易被皮肤吸收，造成皮肤的额外负担。另外由于技术瓶颈和产能原因，目前阶段的化妆品产品基本都不具有生物活性，不能从根本上改善表皮细胞的生存环境和新陈代谢，对于外界因素造成的皮肤损害没有修复作用，尤其不适宜皮肤敏感或孕妇使用。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种间充质干细胞衍生液及其制备方法和在化妆品中的应用。该间充质干细胞衍生液保湿效果好；能明显减少细纹、提高皮肤光滑度；改善皮肤弹性；改善皮肤泛红、脱皮和炎症的状况，减少皮肤过敏的发生；其制备方法简单，可以进行大规模推广形成产业化生产加工
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用间充质干细胞培养基对胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行培养，收集细胞培养液；
(2)向步骤(1)所得细胞培养液中加入1-3丙二醇、透明质酸钠和蜂王浆，即得间充质干细胞衍生液。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，还优选的向步骤(1)所得细胞培养液中加入生长因子、谷胱甘肽、海藻糖和壳寡糖。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，在所述间充质干细胞衍生液中：1-3丙二醇的浓度为50-100g/L；透明质酸钠的浓度为5-10mg/L；蜂王浆的浓度为3～6mg/L。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其中所述生长因子包括：干细胞生长因子、拮抗黑色素生长因子和血管内皮生长因子，在间充质干细胞衍生液中：干细胞生长因子的浓度为0.5～2mg/L、拮抗黑色素生长因子的浓度为3～5mg/L、血管内皮生长因子的浓度为1～3mg/L；谷胱甘肽的浓度为2～8mg/L；海藻糖的浓度为4～6mg/L；壳寡糖的浓度为2～8mg/L。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，在间充质干细胞衍生液中：优选的使1-3丙二醇的浓度为100g/L、透明质酸钠的浓度为8mg/L、蜂王浆的浓度为5mg/L、干细胞生长因子的浓度为1.5mg/L、拮抗黑色素生长因子的浓度为4mg/L、血管内皮生长因子的浓度为2mg/L、谷胱甘肽的浓度为5mg/L、海藻糖的浓度为5mg/L、壳寡糖的浓度为4mg/L。壳寡糖又叫低聚壳聚糖，是将壳聚糖经降解得到的一种聚合度在2～20之间寡糖产品，分子量≤3200Da，是水溶性较好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其中所述间充质干细胞培养基即通过商业渠道可获得的适合脂肪组织来源间充质干细胞培养的培养基即可，如：德国promocell公司的、产品名称为间充质干细胞生长培养基。该培养基是为脂肪组织来源的人类间充质干细胞设计的，可以支持人类间充质干细胞的扩增，但不会出现标准培养基中观察到的细胞被诱导导致提早衰老和分化的现象，该培养基没有任何动物源性成分，除了人来源的人类血清白蛋白。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其中所述胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞是通过以下方式获得的：(1)冲洗胎盘组织，优选使用含有红霉素的硫酸盐缓冲液冲洗胎盘组织；(2)将胎盘组织处理成小块后，优选1～2mm3的小块，再将真皮脂肪层面朝下平铺于培养皿中，加入中性蛋白酶II，18-24h后除去表皮，得到预处理好的胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞。将胎盘组织剪成小块可以得到最好的存活率。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其中所述对胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行培养包括原代培养，优选的还包括传代培养以获得更多的细胞培养液，所述原代培养和传代培养可以采用现有技术中的常规方法，如：在间充质干细胞培养基中加入青霉素和链霉素，使其浓度均为100U/ml，在37℃、3-5％CO2的条件下进行培养，每2-5天更换一次间充质干细胞培养液；当细胞生长至80％融合状态时传代，传代时用0.25％的胰酶消化3-5分钟，使细胞脱离瓶壁，将细胞悬浮液离心弃上清，细胞稀释2-3倍进行传代培养，在37℃、3-5％CO2的条件下进行传代培养时，每一代优选培养14天。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其中步骤(1)中所述收集细胞培养液优选收集传代至3-7代的细胞培养液。当细胞生长至3～7代时，其产生的对皮肤有利的活性蛋白分子达到最大峰值，但是传代次数超过7代时会产生对皮肤组织不利的的代谢产物，因此获取传代至3～7代的细胞培养液是最合适的。
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其中所述胎盘优选来源于人。
一种通过上述制备方法获得的间充质干细胞衍生液。
一种上述间充质干细胞衍生液在化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明间充质干细胞衍生液能够起到促进皮肤上皮细胞***增殖、抗辐射抗氧化及去自由基等作用的护肤效果；长效保湿效果好；能明显减少细纹、提高皮肤光滑度，使用8周后试验组的平均最深皱纹深度减少16％，平均皱纹深度减少9％，平均皱纹总数量减少10％；改善皮肤弹性，使用28天后试验组的平均皮肤弹性值增加了21％；改善皮肤泛红状况；且本发明间充质干细胞衍生液未出现不良反应，在美容护肤品市场上具有良好的发展空间；
2、本发明间充质干细胞衍生液摆脱了传统的植物成分萃取和精细化工生产工艺，采用细胞工程的方法、通过培养人胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞获得含有亲人体皮肤的有益活性蛋白分子的间充质干细胞培养液，将所得细胞培养液作为整个产品充质干细胞衍生液的基础配方，而且间充质干细胞衍生液中不添加化工添加物，如：乙醇、铅汞、着色剂、矿物油等致敏毒素，最大程度保证了产品持续使用的安全性；
3、本发明在间充质干细胞衍生液中加入1-3丙二醇和蜂王浆，可以提高皮肤组织的抗氧化能力、修复光照引发的肌肤老化现象、提高皮肤真皮层组织细胞和成纤维细胞的***增殖力；本发明在间充质干细胞衍生液中加入了干生长因子、拮抗黑色素生长因子、血管内皮生长因子，这几种生长因子具有促进皮肤重金属离子毒素排除、强化皮肤屏障防御机能、对抗自由基抗氧化的功效；其中的活性因子包括干细胞生长因子，拮抗黑色素生长因子及血管内皮生长因子，对于皮肤的美白补水修复具有更好的效果。本发明还特别添加海藻糖，其能够促进皮肤内在胶原及弹性纤维产生、加强皮肤角质层细胞对外界环境的防御机能；本发明间充质干细胞衍生液中的各种配方成分互相协同，得以实现其最佳的皮肤保养效果；
4、本发明间充质干细胞衍生液的制备方法简单，可以进行大规模推广形成产业化生产加工。
附图说明
图1为实施例4中进行改善皮肤弹性效果测试时，试验前后试验组和对照组志愿者皮肤弹性值的数据图；
图2为实施例4中进行改善皮肤泛红状况测试时，志愿者使用本发明产品前后的皮肤图片。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
以下实施例使用的间充质干细胞培养基是德国promocell公司的、名称为间充质干细胞生长培养基的产品；以下实施例中的人胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞是通过以下方式获得的：冲洗人胎盘组织后将其剪成1mm3小块，将该组织的真皮脂肪层面朝下平铺于培养皿中，加入DispaseII(中性蛋白酶)24h后，除去表皮，得到预处理好的胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞；以下实施例中的原代培养为在37℃、3％CO2的条件下进行培养，每2天更换一次间充质干细胞培养液，当细胞生长至80％融合状态时传代；以下实施例中的传代培养为：传代时用0.25％的胰蛋白酶对原代培养细胞进行消化3分钟，使细胞脱离瓶壁，加入牛血清蛋白终止反应，将细胞悬浮并离心弃上清后，细胞稀释2倍进行传代培养，在37℃、3％CO2的条件下进行传代培养，每一代培养14天后再传下一代。
实施例1
一种间充质干细胞衍生液的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用间充质干细胞培养基对人胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行原代培养后传代至第7代，收集第7代细胞培养液；
(2)向步骤(1)所得细胞培养液中加入1-3丙二醇、透明质酸钠、蜂王浆、干细胞生长因子、拮抗黑色素生长因子、血管内皮生长因子、谷胱甘肽、海藻糖和壳寡糖，使1-3丙二醇的浓度为100g/L、透明质酸钠的浓度为8mg/L、蜂王浆的浓度为5mg/L、干细胞生长因子的浓度为1.5mg/L、拮抗黑色素生长因子的浓度为4mg/L、血管内皮生长因子的浓度为2mg/L、谷胱甘肽的浓度为5mg/L、海藻糖的浓度为5mg/L、壳寡糖的浓度为4mg/L，即得间充质干细胞衍生液。
实施例2
(1)使用间充质干细胞培养基对人胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行原代培养后传代至第3代，收集第3代细胞培养液；
(2)向步骤(1)所得细胞培养液中加入1-3丙二醇、透明质酸钠、蜂王浆、生长因子、谷胱甘肽、海藻糖和壳寡糖，使1-3丙二醇的浓度为50g/L、透明质酸钠的浓度为10mg/L、蜂王浆的浓度为3mg/L、干细胞生长因子的浓度为2mg/L、拮抗黑色素生长因子的浓度为3mg/L、血管内皮生长因子的浓度为3mg/L、谷胱甘肽的浓度为2mg/L、海藻糖的浓度为6mg/L、壳寡糖的浓度为2mg/L，即得间充质干细胞衍生液。
实施例3
(1)使用间充质干细胞培养基对人胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行原代培养后传代至第7代，收集第7代细胞培养液；
(2)向步骤(1)所得细胞培养液中加入1-3丙二醇、透明质酸钠、蜂王浆，使1-3丙二醇的浓度为80g/L、透明质酸钠的浓度为5mg/L、蜂王浆的浓度为6mg/L，即得间充质干细胞衍生液。
实施例4对比试验
1、保湿效果测试
100位18-50岁身体健康、皮肤干燥的男性、女性混合志愿者，随机将其分为试验组和对照组，每组各50人，试验前使试验组和对照组的志愿者在室温24℃，湿度50％的环境中保持12h后，使用corneometer CM825测试探头测量皮肤水分含量(该仪器能检测到表皮以下100μm附近的水分含量)，测得试验组的平均含水量为38.9％，对照组的平均含水量为37.6％，二者没有显著差异；开始试验后，试验组使用的是将实施例1获得的间充质干细胞衍生液用化妆品用水稀释10倍后得到的10％间充质干细胞衍生液，对照组使用的10％透明质酸钠溶液；使用方法为每天早晚各一次涂抹至志愿者前臂内侧同一区域(25mm×25mm)，连续使用28天，在试验第28天当天最后一次使用试验样品和对照品后，使试验组和对照组的志愿者在室温24℃，湿度50％的环境中保持12h，使用corneometer CM825测试探头测量皮肤水分含量，试验组的平均含水量为70.3％，对照组的平均含水量为51.4％，可以看出实施例1中的间充质干细胞衍生液长效保湿效果显著。使用24小时后，仍对90％以上的试验组志愿者有保湿效果。
2、抗皱效果测试
40位50-60岁身体健康的男性、女性混合志愿者，随机将其分为试验组和对照组，每组各20人；试验组使用的是将实施例1获得的间充质干细胞衍生液用化妆品用水稀释10倍后得到的10％间充质干细胞衍生液，对照组使用的是空白凝胶；使用方法为：每天两次，取适量涂抹在眼部周围，轻轻打圈至完全吸收，连续使用8周，使用样品和对照品前后分别对眼部外周皱纹做硅胶倒模数字影像分析,使用后试验组数据如下：平均最深皱纹深度减少16％，平均皱纹深度减少9％，平均皱纹总数量减少10％；使用后对照组数据如下：平均最深皱纹深度增加了2％，平均皱纹深度减少3％，平均皱纹总数量减少2％。
3、改善皮肤弹性效果测试
30位18-50岁身体健康的男性、女性混合志愿者，随机将其分为试验组和对照组，每组15人，试验组使用的是将实施例1获得的间充质干细胞衍生液用化妆品用水稀释10倍后得到的10％间充质干细胞衍生液，对照组使用的是空白凝胶；使用方法为：每天早晚各一次涂抹至志愿者前臂内侧同一区域(25mm×25mm)，连续使用28天，采用皮肤测试仪(Derma-Expert MC760)对试验前后试验组和对照组志愿者进行皮肤弹性测定，如图1所示，试验组数据如下：使用1周、2周和4周后平均皮肤弹性值分别增加了5％、9％、21％；对照组数据如下：使用1周、2周和4周后平均皮肤弹性值分别增加了2％、4％、4.5％。
4、改善皮肤泛红状况测试
22位18-50岁身体健康、皮肤泛红、易过敏的男性、女性混合志愿者，在面部使用将实施例1获得的间充质干细胞衍生液用化妆品用水稀释5倍后得到的20％间充质干细胞衍生液，使用周期为30天，85％以上的使用者皮肤泛红的情况得到改善，对比图请见图2。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用间充质干细胞培养基对胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行培养，收集细胞培养液；
(2)向步骤(1)所得细胞培养液中加入1-3丙二醇、透明质酸钠和蜂王浆，即得间充质干细胞衍生液；
其中，在所得的间充质干细胞衍生液中：1-3丙二醇的浓度为50-100g/L；透明质酸钠的浓度为5-10mg/L；蜂王浆的浓度为3～6mg/L。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，还向步骤(1)所得细胞培养液中加入生长因子、谷胱甘肽、海藻糖和壳寡糖。
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述生长因子包括：干细胞生长因子、拮抗黑色素生长因子和血管内皮生长因子，在间充质干细胞衍生液中：干细胞生长因子的浓度为0.5～2mg/L、拮抗黑色素生长因子的浓度为3～5mg/L、血管内皮生长因子的浓度为1～3mg/L；谷胱甘肽的浓度为2～8mg/L；海藻糖的浓度为4～6mg/L；壳寡糖的浓度为2～8mg/L。
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，在间充质干细胞衍生液中：1-3丙二醇的浓度为100g/L；透明质酸钠的浓度为8mg/L、蜂王浆的浓度为5mg/L、干细胞生长因子的浓度为1.5mg/L、拮抗黑色素生长因子的浓度为4mg/L、血管内皮生长因子的浓度为2mg/L、谷胱甘肽的浓度为5mg/L、海藻糖的浓度为5mg/L、壳寡糖的浓度为4mg/L。
5.根据权利要求1-4之一所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞是通过以下方式获得的：(1)冲洗胎盘组织，优选使用含有红霉素的硫酸盐缓冲液冲洗胎盘组织；(2)将胎盘组织处理成小块后，优选1～2mm3的小块，再将真皮脂肪层面朝下平铺于培养皿中，加入中性蛋白酶II，18-24h后除去表皮，得到预处理好的胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞。
6.根据权利要求1-4之一所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述对胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行培养包括原代培养。
7.根据权利要求1-4之一所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述对胎盘脂肪组织来源的间充质干细胞进行培养还包括传代培养。
8.根据权利要求1-4之一所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述收集细胞培养液收集传代至3-7代的细胞培养液。
9.一种通过权利要求1-8之一所述的制备方法获得的间充质干细胞衍生液。
10.一种权利要求9所述的间充质干细胞衍生液在化妆品中的应用。
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