CN107260653A - 一种美容组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学美容领域，尤其涉及一种美容组合物及其制备方法和应用。本发明提供了一种美容组合物，包括：脂肪干细胞、脂肪干细胞培养液浓缩液、透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E；所述脂肪干细胞培养液浓缩液由脂肪干细胞培养液浓缩50倍制备而成。该发明解决了现有的干细胞美容产品中干细胞死亡率高而造成的护肤效果差的技术缺陷。同时，所述美容组合物的制备方法具有操作简单、便于大规模生产的优点。

Description

一种美容组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学美容领域，尤其涉及一种美容组合物及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的提高，人们对美丽容颜的追求越来越迫切，特别是在环境污染日益严重的今天，各种因为污染产生的肌肤问题也频频出现，如肌肤老化、皱纹加深、皮肤暗黑、毛孔粗大和肌肤油腻等等。如何拥有靓丽的肌肤成为广大爱美女性迫切渴求的焦点。

目前，市场上充斥着以化学成分为主的各种护肤品，其中面膜膏和面膜纸因使用方便更是成为广大爱美女性必备的护肤产品。但由于这些面膜护肤品以化学成分为主，即使添加了一些植物精华素，其有效成分仍然极其有限，难以达到抗皱、美白的效果，更遑论使老化肌肤再生修复。

脂肪干细胞是从脂肪组织中分离提取的一类多能成体干细胞。脂肪干细胞可以修复受损的细胞或组织，激活皮肤的成纤维细胞，加速胶原蛋白的合成，并分泌各种营养因子，滋养肌肤重焕生机，真正达到使肌肤再生修复，回复年轻的效果。

但脂肪干细胞存活的条件极其严苛，微生物污染、渗透压的改变、PH值的变化等等，往往在将其制成美容组合物的过程中多数细胞就已死亡，这也是市面上一些宣称含有脂肪干细胞的生物面膜产品难以达到理想护肤效果的主要原因。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种美容组合物及其制备方法和应用，能有效解决现有干细胞美容产品中干细胞死亡率高而造成的护肤效果差的技术缺陷。

本发明提供了一种美容组合物，包括：脂肪干细胞、脂肪干细胞培养液浓缩液、透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E；所述脂肪干细胞培养液浓缩液由脂肪干细胞培养液浓缩50倍制备而成。

作为优选，所述脂肪干细胞在美容组合物中的密度为1×10⁷个/ml-10×10⁷个/ml。

作为优选，脂肪干细胞培养液浓缩液在美容组合物中的体积为50ml。

作为优选，所述的美容组合物，包括：

作为优选，所述脂肪干细胞培养液浓缩液为无血清培养条件下培养脂肪干细胞时，收集培养过程中的肪干细胞培养液浓缩而成。

作为优选，所述浓缩采用超滤法浓缩或透析法浓缩。

作为优选，所述超滤法采用截留率为3000KDa的超速离心管进行超滤。

作为优选，所述肪干细胞培养液浓缩液包括：αFGF、TGF-β1、EGF和KGF。

本发明还提供了一种美容组合物的制备方法，包括：

无菌条件下将脂肪干细胞、透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E加入脂肪干细胞培养液浓缩液中混合，置于4℃保存。

本发明公开的所述的美容组合物和所述的制备方法制得的美容组合物在滋养和修复皮肤中的应用。

本发明提供了一种美容组合物及其制备方法和应用，所述美容组合物包括脂肪干细胞、脂肪干细胞培养液浓缩液、透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E；所述脂肪干细胞培养液浓缩液由脂肪干细胞培养液浓缩50倍制备而成。脂肪干细胞培养液浓缩液富含脂肪干细胞分泌的各种细胞因子，如αFGF、TGF-β1、EGF和KGF等细胞因子，且其PH值、渗透压均未改变，适合脂肪干细胞继续存活，能有效保证脂肪干细胞的存活率；在使用美容组合物时，由于美容组合物含有透明质酸，透明质酸会吸水成凝胶状使得美容组合物呈半凝胶状，方便美容组合物更好的停留在皮肤上；而且脂肪干细胞是活细胞，而且，脂肪干细胞在4℃保存48h后，存活率仍能达到80％以上，这些活的脂肪干细胞直接接触皮肤，真正达到使肌肤修复再生的美容效果；浓缩液中存在高浓度的脂肪干细胞分泌因子，以及透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E使得本发明美容组合物具有抗皱、美白，有效激活肌肤自我更新及修复效果。

此外，本发明提供的美容组合物中的脂肪干细胞本发明提供的美容组合物的制备方法十分简单，可大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示P6代脂肪干细胞形态；

图2示浓缩后脂肪干细胞分泌的细胞因子浓度；

图3示美容组合物中的脂肪干细胞存活率。

具体实施方式

本发明提供了一种美容组合物及其制备方法和应用，能有效解决现有干细胞美容产品中干细胞死亡率高而造成的护肤效果差的技术缺陷。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其中，以下实施例所用的试剂均为市售。

实施例1

脂肪干细胞的培养，步骤如下：

步骤一：以DMEM/F12为基础培养基，加入血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺制成完全培养基，使血小板裂解物在完全培养基的体积百分比为5％、使bFGF和L-谷氨酰胺在完全培养基的浓度分别为50ng/ml和4mM，血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺在DMEM/F12充分混匀，4℃避光保存备用。

步骤二：通过吸脂手术从专业的美容机构或专业医院获得脂肪组织。将脂肪组织用含有双抗(质量百分比为1％青霉素和质量百分比为1％链霉素)的生理盐水冲洗3遍，洗去血细胞直至加入生理盐水后脂肪组织悬液澄清无血色，将清洗完毕的脂肪组织置于含有步骤一的完全培养基的培养瓶中，培养24h后全量换液，每隔2天对培养瓶进行半量换液，培养至第9天后刮除脂肪组织，脂肪干细胞继续培养至细胞融合度达80％-90％时，去除培养瓶中培养基，用生理盐水冲洗2次，加入0.25％EDTA-胰酶进行消化，待细胞变圆时加入等体积完全培养基终止消化(即为组织块贴壁法分离培养细胞)，消化后的细胞可以用于传代，将细胞采用完全培养基传代培养至P6代时收集细胞，并收集细胞培养过程中的所有培养液。脂肪干细胞培养图如图1所示，P6代脂肪干细胞贴壁生长，成成纤维状，说明P6代脂肪干细胞生产良好。

实施例2

P6代脂肪干细胞流式表型检测，步骤如下：

实施例1收集的P6代脂肪干细胞，将细胞转入流式管中，600g离心3min，弃上清，加入1ml PBS冲洗2遍。200μl PBS重悬细胞后，分别加入CD34、CD45、CD29、CD73、CD90、CD105和HLA-DR抗体。室温孵育30min后，PBS洗涤3次，弃上清后PBS重悬细胞，流式检测细胞表型。

表1ADSCs细胞流式表型

CD34

CD45

CD29

CD73

CD90

CD105

HLA-DR

P6

0.13±0.05

0.12±0.06

99.98±0.05

99.95±0.07

99.93±0.02

99.89±0.45

0.13±0.04

结果如表1所示，分离培养获得的脂肪干细胞完全符合脂肪干细胞表面标志的鉴定标准，即高表达CD29、CD73、CD90、CD105，低表达或不表达CD34、CD45和HLA-DR，说明实施例1的细胞确定为脂肪干细胞。

实施例3

浓缩脂肪干细胞培养液，采用超滤法对细胞培养液进行高倍浓缩，具体操作如下：

将培养液转入50ml 3000KDa的无菌超滤管，在4℃条件下，3000rpm/min离心30min，收集上层浓缩液，每50ml原液获得1ml浓缩液，浓缩倍数达到50倍，获得脂肪干细胞培养液浓缩液。将脂肪干细胞培养液浓缩液置于-80℃保存备用。

实施例4

脂肪干细胞培养液浓缩液中细胞因子浓度测定，具体操作如下：

对实施例3所收集的脂肪干细胞培养液浓缩液用ELISA试剂盒检测细胞因子的浓度，操作步骤如下：

取酶标板室温平衡30min，先稀释浓缩液50倍，再采用1/50-1/400的稀释度将培养液样本加入酶标孔，每孔20μl，做3个复孔。置于37℃放置60min后，用洗涤液满孔洗涤3遍。每孔50μl/孔加入酶标抗体，37℃避光孵育60min。洗涤3次后，加入底物100μl/孔，37℃避光放置3-5min，加入50μl/孔终止液终止反应，并在20min内用酶标仪检测实验结果。

结果如图2所示，浓缩液中αFGF、TGF-β1、EGF和KGF浓度均大于20000pg/ml。

实施例5

美容组合物制备，产品主要成分如下：

表2实施例5的美容组合物组分表

组分	在美容组合物中的含量
		脂肪干细胞	5×107个/ml
脂肪干细胞培养液浓缩液	50ml
		透明质酸	5％v/v
甘油	5％v/v
		曲二糖	1％v/v
维生素C	10ng/ml
		维生素E	10ng/ml

所有操作均为无菌操作，用浓缩液将收集的脂肪干细胞重悬，并按照表2的含量加入透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E，制备得到美容组合物，标记为实施例5。将配置好的半凝胶状美容组合物保存在无菌玻璃瓶中，4℃保存备用。

比较例1

配置比较例1美容组合物，其产品主要成分如下：

表3对比例1的美容组合物组分表

组分	在美容组合物中的含量
		脂肪干细胞培养液浓缩液	50ml
透明质酸	5％v/v
		甘油	5％v/v
曲二糖	1％v/v
		维生素C	10ng/ml
维生素E	10ng/ml

所有操作均为无菌操作，按照表3的组分别加入透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E于浓缩液中，制备得到美容组合物，标记为对比例1。将配置好的半凝胶状美容组合物保存在无菌玻璃瓶中，4℃保存备用。

比较例2

配置比较例2美容组合物，其产品主要成分如下：

表4对比例2的美容组合物组分表

组分	在美容组合物中的含量
		脂肪干细胞	5×107个
D-PBS	50ml
		透明质酸	5％v/v
甘油	5％v/v
		曲二糖	1％v/v
维生素C	10ng/ml
		维生素E	10ng/ml

所有操作均为无菌操作，按照表4的组分表用D-PBS将收集的脂肪干细胞重悬，并加入透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E，制备得到美容组合物，标记为对比例2。将配置好的半凝胶状美容组合物保存在无菌玻璃瓶中，4℃保存备用。

比较例3

配置比较例3美容组合物，其产品主要成分如下：

表5对比例3的美容组合物组分表

组分	在美容组合物中的含量
		D-PBS	50ml
透明质酸	5％v/v
		甘油	5％v/v
曲二糖	1％v/v
		维生素C	10ng/ml
维生素E	10ng/ml

所有操作均为无菌操作，按照表5的组分表依次加入透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E于D-PBS中。将配置好的半凝胶状美容组合物保存在无菌玻璃瓶中，4℃保存备用。

实施例9

美容组合物中的脂肪干细胞存活率检测，具体步骤如下：

将实施例5的美容组合物置于4℃保存0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h和96h后进行脂肪干细胞存活率检测，结果如图3所示，随着保存时间的延长，细胞存活率逐渐降低，在4℃保存48h后，存活率仍能达到80％以上。

实施例10

护肤效果检测，具体步骤如下：

征集120名30-60岁的女性健康人群，30人一组，随机分成四组，进行单盲对照实验。每组每天晚上分别使用实施例5、比较例1、比较例2、比较例3中所制备的美容组合物，即每天晚上敷一次美容组合物于脸部，每次敷脸的时间为25min，连续使用一个月，一个月后由使用者对所使用产品的美白、祛皱、抗衰、保湿效果进行自我评估，每组30人使用后对产品的效果进行评价，统计使用效果。

统计结果如表6所示，本发明实施例5所配置的美容组合物中有22个人、23个人、25个人和27个人评价认为分别具有美白、祛皱、抗衰、保湿的效果，其总体有效率达90％，而对比例1～3的美白、祛皱、抗衰、保湿的效果明显比实施例5差，说明脂肪干细胞和脂肪干细胞培养液浓缩液对本发明的美容组合物产品起到美白、祛皱、抗衰、保湿的作用。

其中，总体有效率的计算方法为每种美容组合物的自我评估中美白、祛皱、抗衰、保湿中人数最多的项目在该组30人中百分比例。

表6美容组合物护肤效果统计

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种美容组合物，其特征在于，包括：脂肪干细胞、脂肪干细胞培养液浓缩液、透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E；所述脂肪干细胞培养液浓缩液由脂肪干细胞培养液浓缩50倍制备而成。

2.根据权利要求1所述的美容组合物，其特征在于，所述脂肪干细胞在美容组合物中的密度为1×10⁷个/ml-10×10⁷个/ml。

3.根据权利要求1所述的美容组合物，其特征在于，所述脂肪干细胞培养液浓缩液在美容组合物中的体积为50ml。

4.根据权利要求1所述的美容组合物，其特征在于，包括：

5.根据权利要求1所述的美容组合物，其特征在于，所述脂肪干细胞培养液浓缩液为无血清培养条件下培养脂肪干细胞时，收集培养过程中的肪干细胞培养液浓缩而成。

6.根据权利要求1所述的美容组合物，其特征在于，所述浓缩采用超滤法浓缩或透析法浓缩。

7.根据权利要求6所述的美容组合物，其特征在于，所述超滤法采用截留率为3000KDa的超速离心管进行超滤。

8.根据权利要求1所述的美容组合物，其特征在于，所述肪干细胞培养液浓缩液包括：αFGF、TGF-β1、EGF和KGF。

9.一种美容组合物的制备方法，其特征在于，包括：

无菌条件下将脂肪干细胞、透明质酸、甘油、曲二糖、维生素C和维生素E加入脂肪干细胞培养液浓缩液中混合，置于4℃保存。

10.权利要求1至8任意一项所述的美容组合物和权利要求9所述的制备方法制得的美容组合物在滋养和修复皮肤中的应用。