CN102618493A - 一种羊水与绒毛细胞培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羊水与绒毛细胞培养基，属于细胞生物学领域。羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组份：基础培养基，胎牛血清，生长因子，抗氧化剂、抗生素和缓冲***。本发明能够减低成本，并且能够迅速有效地提高体外增殖的羊水与绒毛细胞克隆数目和细胞增殖速度，缩短培养周期，获得***相染色体数目多的羊水与绒毛细胞培养基及其配方。

Description

一种羊水与绒毛细胞培养基

技术领域

本发明涉及一种羊水与绒毛细胞培养基，属于细胞生物学领域

背景技术

近年来，由于环境压力的日益增加，在群体中和遗传有关的疾病的发生率明显地上升。预防严重的先天畸形和遗传疾病的发生，保证人类后代的健康和繁荣，是遗传学和医学的一项重要任务。产前诊断目前主要有孕早期绒毛组织取材，孕中期羊水和脐带血、孕妇外周血分离胎儿细胞及植入前诊断等方法。但由于羊水穿刺检查具有操作安全、妊娠流失率低于自然流产率以及诊断染色体异常较为可靠的特点，所以孕中期羊水细胞检查仍是最主要的方法。

羊水穿刺检查的主要对象是高龄(大于34岁)、不良接触史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色体异常儿分娩史、夫妻之一核型异常、B超示畸形、家族性连锁遗传病史、近亲婚配等的孕妇。羊水细胞培养后通过染色体显带技术，能够辨别三体综合症、平衡易位、倒位以及染色体异常等疾病，同时，还可以用于胎儿窘迫现象的判断及确定胎儿成熟程度。

羊水穿刺属于介入性产前诊断，每次抽取20ml羊水，占羊水总量的1/20～1/12，但羊水中活细胞少，培养周期长，无菌要求高，稍不注意即致失败。即使培养成功，因***相少、形态不佳而达不到分析要求，无法进行进一步研究，使羊水产前检测的应用受到限制。因此，成功的羊水细胞培养，除需要严格的试验操作技术和经验外，培养基的质量也是非常关键的。羊水细胞可能是胎儿皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖道的脱落细胞，其中只有小部分是有活力的细胞(约0.1％)。

传统的羊水细胞培养基组成是：基础培养基(RPMI1640、DMEM或F12)+小牛血清(胎牛血清)。但这种培养基的成功率低于30％，而且平均培养周期在20天，且***相少，不能有效用于羊水细胞检查；为了缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了改良型的培养基的研究报道，基本上是在培养基的基础上添加含有生长因子的提取物组成。如Chang HC(ChangHC，Jones OW，Masui H，Human amniotic fluid cells grown in ahormone-supplement medium：suitability for prenatal diagnosis，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.79，4795-4799(1982))。在DMEM与F12按1∶1混合的基础培养基(DMEM/F12)中添加10种促生长因子，分别为：转铁蛋白(transferrin)5mg/L、***钠20nMol/L、胰岛素10mg/L、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.1nMol/L、胰高血糖素(glucagong)1mg/L、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10、氢化可的松(hydrocortisone)1nMol/L、睾酮(testosterone)1nMol/L、***(estradiol)1nMol/L、孕酮(progesterone)1nMol/L。Chang HC把含此10种促生长因子配方的培养基称为H培养基，而将此10种促生长因子含量增倍后的培养基称为H-1培养基。生长因子加倍的H-1培养基的培养效果要明显好于H培养基，H-1在培养基添加较低含量的胎牛血清的情况下，依然能够明显增加羊水细胞的克隆形成率和克隆生长速度，使培养成功率达到99％以上，培养周期缩短到10天左右。

中国专利申请200910193962.2公开了一种羊水细胞培养基，包含下列组份：基础培养基，转铁蛋白，***钠，胰岛素，三碘甲氟腺氨酸，胰高血糖素，碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，睾酮，***，孕酮，并在上述成分中加入了维生素E和L-抗坏血酸两种抗氧化剂的混合物。该专利申请通过添加维生素E和L-抗坏血酸两种抗氧化剂的混合物来达到增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，缩短培养周期的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种羊水与绒毛细胞培养基，它仍能够显著改进羊水细胞的培养效果，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，可减少培养时间(6--10天即可)，同时提高了细胞培养成功率，充分发挥了不同细胞生长因子的协同作用。

本发明的目的是提供一种羊水与绒毛细胞培养基及其配方，它含有较少种类的成分，使生产成本明显降低。

为达到上述目的，本发明所采取的解决方案是：

具体方法如下：

一种羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组份：基础培养基，胎牛血清，生长因子，抗氧化剂、抗生素和缓冲***。

一种羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组分：

生长因子包含成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子中的一种或多种。

生长因子由成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子组成。

生长因子中成纤维细胞生长因子∶表皮细胞生长因子∶淋巴细胞生长因子的单位比为(50～80)∶(10～40)∶(10～40)。

抗氧化剂包括抗坏血酸及衍生物和盐等、去氧胆酸钠、柠檬酸钠、维生素E及衍生物等的一种或几种。

抗氧化剂优选抗坏血酸葡糖苷。

缓冲***选自磷酸缓冲液、Earle’s平衡盐、Hank’s平衡盐、HEPES缓冲液，碳酸盐缓冲液。

缓冲***优选HEPES/NaHCO3缓冲***。

一种羊水与绒毛细胞培养基，优选包含下列组分：

一种羊水与绒毛细胞培养基，用于羊水细胞、绒毛细胞的培养。

基础培养基可自行配制，也可通过商业途径获得，包括但不限于Dubecco’sModified Eagle’s Medium(DMEM)、DMEM/F 12培养基、Eagle’s MinimumEssential Medium、F-12K培养基、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium或RPMI-1640培养基。

生长因子是指能够刺激细胞生长和增殖的细胞外多肽信号分子，包括但不限于上皮生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子。

抗氧化剂是指是能够阻止氧气不良影响的物质，包括但不限于抗坏血酸及衍生物和盐等、去氧胆酸钠、柠檬酸钠、维生素E及衍生物。

抗生素是指用于减轻细菌、支原体和真菌污染的物质，包括但不限于青霉素、链霉素、红霉素、氯霉素、土霉素、庆大霉素等。

缓冲***可以通过商业途径购买，包括但不限于磷酸缓冲液、Earle’s平衡盐、Hank’s平衡盐、HEPES缓冲液，碳酸盐缓冲液。

HEPES是指4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

HEPES缓冲液是指由4-羟乙基哌嗪乙磺酸或其与盐配制的缓冲溶液。

开放式培养是指：在5％CO2培养箱培养，通过CO2调节培养***PH值.

封闭式培养是指：可密闭培养，例如用一个紧密加盖的培养瓶。通过培养液里缓冲***调节培养***PH值.

本发明所述抗生素中“单位”是指：抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。

本发明所述生长因子中“单位”是指：生长因子对细胞的生长具有刺激作用，细胞的生长状况因生长因子生物学活性的不同而异，可以用生物活性表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(IU)。

本发明组合物有益的技术效果：

(1)使羊水细胞及绒毛细胞克隆形成率和克隆生长速度明显增加，提高了细胞培养成功率。

(2)大大降低了成本，利于产品规模化。

(3)本发明所述培养基在4℃的温度下可以贮存2周；在-20±2℃的温度下可贮存24个月。

具体实施例

购自SIMGA公司的DMEM/F12细胞培养基，注射用水，碳酸氢钠，上海科兴生物科技有限公司提供的HEPES，暨南大学提供的成纤维细胞生长因子与表皮细胞生长因子、惠州鸿雨科技有限公司的淋巴细胞生长因子，日本HAYASHIBARA的抗坏血酸葡糖苷，青链霉素。

提供下列实施例，以描述和进一步阐明本发明的某些实施方案和方面，并不能认为其是对本发明范围的限制。

制备例1

配制浓度20mmol/L的HEPES/NaHCO₃缓冲***

取4.76g HEPES溶解在900ml注射用水中，用1.5～3g的NaHCO₃水溶液调节pH为7，然后用注射用水定容至1000ml，于4℃下保存。

制备例2

青链霉素双抗储备液的配制

a)取青霉素1瓶100万单位，加水稀释成20万单位/ml。

b)取链霉素1瓶80万单位，加水稀释成20万单位/ml。

c)用a和b等比混合，于4℃下保存。

实施例1(A-1培养基)：

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加10mmol HEPES/NaHCO3缓冲液，添加50000个单位的成纤维细胞生长因子、10000个单位的表皮细胞生长因子、40000个单位的淋巴细胞生长因子，0.3g抗坏血酸葡糖苷、50000个单位的青霉素，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例2(配制A-2培养基)：

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加15mmol HEPES/NaHCO3缓冲液，添加50000单位成纤维细胞生长因子、15000单位淋巴细胞生长因子，0.3g抗坏血酸葡糖苷、50000个单位的链霉素，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例3(配制A-3培养基)：

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加20mM HEPES/NaHCO3缓冲液，添加25000单位的表皮细胞生长因子、30000单位的淋巴细胞生长因子，0.25g的维生素E、50000单位的1∶1的青霉素/链霉素混合物，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例4(配制A-4培养基)：

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加25mM HEPES/NaHCO3缓冲液，添加25000单位成纤维细胞生长因子、15000单位的表皮细胞生长因子，0.1g抗坏血酸葡糖苷和0.15g维生素E、80000单位的利福平，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例5(配制A-5培养基)：

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加30mM HEPES/NaHCO3缓冲液，添加40000单位的成纤维细胞生长因子，0.1g抗坏血酸葡糖苷和0.1g抗坏血酸钠、70000单位的庆大霉素，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例6(配制A-6培养基)：

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加40mM HEPES/NaHCO3缓冲液，添加30000单位表皮细胞生长因子，0.1g抗坏血酸葡糖苷和0.05g抗坏血酸钠、100000单位的博来霉素，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例7(配制A-7培养基)：

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加50mM HEPES/NaHCO3缓冲液，添加40000单位淋巴细胞生长因子，0.25g抗坏血酸钠、100000单位的卡那霉素，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例8(培养基A-8)

取1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加10mmol HEPES/NaHCO3缓冲液，添加10000个单位的成纤维细胞生长因子、10000个单位的表皮细胞生长因子、10000个单位的淋巴细胞生长因子，0.3g抗坏血酸葡糖苷、50000个单位的青霉素，然后用注射用水定容至1000ml。

实施例9(培养基A-9)

同上，添加20000个单位的成纤维细胞生长因子、40000个单位的表皮细胞生长因子、10000个单位的淋巴细胞生长因子。

实施例10(培养基A-10)

同上，添加30000个单位的成纤维细胞生长因子、20000个单位的表皮细胞生长因子、20000个单位的淋巴细胞生长因子。

试验例1：不同配方的培养基培养效果比较

根据中国专利申请200910193962.2实施例中DF-J1的配方配制培养基。

取实施例1-7所配培养基及DF-J1培养基，分别向其中加入10％的胎牛血清。

羊水细胞培养：收集10份羊水样品(为18-22周龄之间的羊水样品，每份约20-25ml，共240ml)，混合均匀，得到检测用羊水细胞收集样品，比较不同培养基的培养效果。细胞培养、制片方法按以下步骤进行。

在无菌条件下取羊水各30ml/管，共8管。

以1500rpm离心10min

在无菌操作台上吸去上清液，每管约留1ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，向管中加入4ml培养基，吸管轻轻混匀，移至25cm2方形一次性培养瓶中置于含5％CO2的37℃培养箱饱和湿度下开放式培养。

6天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，此时换相应新鲜的羊水培养基5ml，24-48小时后，如细胞生长状况好，加入秋水仙素0.04-0.08μg/ml，(20μg/ml，7号针头垂直滴加2滴)4-6小时进行细胞学处理。

收获细胞：倒出瓶中细胞液入10ml离心管，0.85％NaCl溶液冲洗细胞壁两遍，0.25％胰酶消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞。室温离心1500rpm，10min，去上清液。

低渗：加入37℃0.075M KCl 4-6ml，吸管吹打，37℃水浴10-15分钟。

预固定：加入1.5ml甲醇∶冰醋酸＝3∶1固定剂，轻混匀37℃水浴5分钟，1500rpm离心10min。去上清，约留0.5ml。

固定：加入固定剂，轻混匀，37℃水浴10分钟，1500rpm离心10min。去上清，约留0.5ml。

重复固定：同上。1500rpm离心10min。去上清，根据管底细胞量加入适当几滴固定剂。

滴片、烤片：每片1-2滴，75℃烤箱烘烤3小时。

培养结束染色体制片前统计细胞克隆总数，包括有***相的克隆总数，以及有效克隆的大小；制备染色体后统计***相细胞数目。

羊水细胞收集样品I培养8天后收获，进行染色体制片，结果见表1。

表1各配方培养基对羊水细胞的培养效果比较

注：

克隆大小判断标准为：在100倍倒置显微镜下判断观察，克隆≥1个视野判断为大克隆；克隆≤1/2个视野判断为小克隆；介于两者之间的为中等克隆。

总克隆数＝有***相的总克隆数+无***相的克隆数；有***相总克隆数为大、中、小各克隆数目之和。

从结果可以看出，采用本发明所述方法配制的培养基与中国专利申请20091013962中所述DF-J1培养基相比，在总克隆数，包括有***相的总克隆数和***相细胞数目上具有相近、或者更优的结果。说明本发明所述培养基配方具有良好的培养效果。当在培养基中同时添加成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子三种生长因子时，细胞克隆结果达到最优。

试验例2：培养基中成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子的比例对培养效果比较

羊水细胞培养方法同上。

表2培养基中成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子的比例对培养效果比较

注：

克隆大小判断标准为：在100倍倒置显微镜下判断观察，克隆≥1个视野判断为大克隆；克隆≤1/2个视野判断为小克隆；介于两者之间的为中等克隆。

总克隆数＝有***相的总克隆数+无***相的克隆数；有***相总克隆数为大、中、小各克隆数目之和。

从结果可以看出，当在培养基中同时添加单位比为5∶1∶4的成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子三种生长因子时，细胞克隆结果达到最优。

试验例3：不同培养方式对羊水与绒毛细胞培养基的培养效果的影响

取实施例1所述培养基A-1一份，按上述羊水细胞培养方法操作，其中在进行完毕步骤(3)后将培养瓶进行封闭式培养，结果如下：

表3：不同培养方式对羊水与绒毛细胞培养基的培养效果的影响

从表3可以看出，本发明中采用封闭式培养和开放式培养对羊水与绒毛细胞培养基之间培养效果并没有显著区别，皆可以在短期内获得大量的***羊水细胞。

试验例4：不同比例胎牛血清对羊水与绒毛细胞培养基的培养效果的影响

收集8份羊水细胞样品(为18-21周龄之间的羊水样品，每份约10ml，共80ml左右)，混合均匀，制成检测用羊水细胞收集样品。将羊水细胞样品均分为4份后离心，吸去大部分上清，留1ml混匀接种于4ml按实施例1配制的含不同胎牛血清比例的羊水细胞培养基中，比较添加不同体积百分比胎牛血清的羊水与绒毛细胞培养基的培养效果。结果见表4。

表4：不同比例胎牛血清对羊水与绒毛细胞培养基的培养效果的影响

从表4可以看出，本发明中不同比例胎牛血清对羊水与绒毛细胞培养基之间培养效果并没有显著区别，皆可以在短期内获得大量的***羊水细胞。

试验例5用羊水与绒毛细胞培养基培养绒毛细胞

收集8份羊水细胞样品(为18-21周龄之间的羊水样品，每份约10ml，共60ml左右)，混合均匀，制成检测用羊水细胞收集样品。根据实施例1所述的方法配制羊水与绒毛细胞培养基，在4℃条件下贮藏14天后进行绒毛细胞培养。结果见表5。

表5：羊水与绒毛细胞培养基放置时间对培养效果的影响

从表5可以看出，本发明的培养基在4℃下放置14天后，与新配置的培养基相比，其培养能力并没有显著区别，说明本发明所述的培养基性质稳定。

Claims (10)

1.一种羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组份：基础培养基，胎牛血清，生长因子，抗氧化剂、抗生素和缓冲***。

2.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组分：

3.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，其中所述的生长因子包含成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，其中所述的生长因子中纤维细胞生长因子∶表皮细胞生长因子∶淋巴细胞生长因子的单位比为(50～80)∶(10～40)∶(10～40)。

5.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，其中抗氧化剂包括抗坏血酸及衍生物和盐等、去氧胆酸钠、柠檬酸钠、维生素E及衍生物等的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，其中抗氧化剂是抗坏血酸葡糖苷。

7.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，其中缓冲***选自磷酸缓冲液、Earle’s平衡盐、Hank’s平衡盐、HEPES缓冲液，碳酸盐缓冲液。

8.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，其中缓冲***是HEPES/NaHCO₃缓冲***。

9.根据权利要求1所述的羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组分：

10.一种羊水与绒毛细胞培养基，用于羊水细胞、绒毛细胞的培养。