CN107397710A - 一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用。本发明皮肤干细胞活性素是采用胎盘间充质干细胞经过接种培养、诱导分化以及皮肤干细胞活性素的制备与收集获得的。本发明的技术优势在于：采用胰蛋白酶与胶原蛋白酶复配使用用于酶解胎盘组织进而分散组织细胞；皮肤干细胞培养基采用基础培养基添加一系列功能性组分，有利于胎盘间充质干细胞的诱导分化成为皮肤干细胞以及后续皮肤干细胞的扩增培养；本发明制备的皮肤干细胞活性素应用于霜剂化妆品中能显著改善皮肤老化、降低不良反应的发生，增加角质层含水量和油脂含量。

Description

一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用。
背景技术
皮肤衰老是由于自然因素或非自然因素造成的皮肤老化现象，皮肤衰老与细胞衰老密切相关，尤其与成纤维细胞和角质形成细胞的衰老紧密联系。干细胞是一种尚未分化发育的细胞，具有无限自我更新复制能力，且能分化成特定组织，研究表明干细胞的自我复制及多潜能分化还依赖于多种生长因子、细胞因子、活性多肽、蛋白质、生长激素、微量元素等物质，促进自身的扩增及分化的子细胞的增殖。
中国专利CN103202794B公开了一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用，其中的一个主要发明点是将皮肤干细胞破碎，从细胞内容物中提取活性组分，但皮肤干细胞破碎后，会释放大量的酶，将皮肤干细胞分泌的生物活性成分降解，降低皮肤干细胞活性素的本质上的功效。
中国专利CN102552099B公开了一种用于皮肤美容修复的复合生物制剂及制备方法，该复核生物制剂含有脐带血干细胞活性成分和胎盘活性成分，具有促进产妇表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛斑的目的，但所述的复合生物制剂是按照常规的护肤品生产方法制备而成的，即将脐带血干细胞活性物、胎盘活性物按比例与常规化妆品的赋形物混合按照常规的护肤品生产方法制成霜类化妆品等。众所周知，干细胞美容产品中的活性产品很容易在常温下失活，要保持它的活性，就必须在特定条件下制备和保存。因此此类干细胞美容产品的效果有待商榷。
发明内容
为解决现有技术中皮肤干细胞粉碎导致生物活性成分降解等问题，本发明提供一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用。
本发明一种皮肤干细胞活性素的制备方法，包括以下步骤：
S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用400-600u/ml的青霉素浸泡10-30min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.1-0.2g/mL和胶原蛋白酶0.05-0.08g/mL于37℃下消化30-60min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴3-5min去除红细胞即得；
S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育15-25h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近80-90％融合时，进行传代扩增培养；
S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增5-10代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。
优选的，步骤S1所述的皮肤干细胞培养基包括以下组分及其浓度：基础培养基12-15mL、胰岛素15-25mg/L、L-谷氨酰胺2-8mg/L、表皮生长因子6-10μg/L、成纤维细胞生长因子1-3μg/L、神经生长因子0.85-0.9μg/L、糖皮质激素100-250μg/L、柠檬酸铁铵0.5-1.5mg/L、硝酸铁0.4-0.6mg/L、EDTA-2Na 4-8mg/L、虾青素4-6mg/L、黄芩甙元0.08-0.12mg/L、飞燕草素20-50μg/L和桑色素2-4ng/L。
优选的，所述的皮肤干细胞培养基由以下组分及其浓度组成：基础培养基13.5mL、胰岛素20mg/L、L-谷氨酰胺5mg/L、表皮生长因子8μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、神经生长因子0.88μg/L、糖皮质激素175μg/L、柠檬酸铁铵1mg/L、硝酸铁0.5mg/L、EDTA-2Na 6mg/L、虾青素5mg/L、黄芩甙元0.1mg/L、飞燕草素35μg/L和桑色素3ng/L。
再优选的，所述的基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明皮肤干细胞活性素的制备方法制备的皮肤干细胞活性素在霜剂化妆品中的用途。
优选的，所述的霜剂化妆品包括以下组分及其质量百分比：
皮肤干细胞活性素10-15％、羊毛醇2-5％、白蜂蜡5-10％、银耳多糖0.2-0.4％、SOD4-6％、肌肽2-4％、壳寡糖1-3％、L-苹果酸2-5％、蜂胶2-4％和水47.6-71.8％。
再优选的，所述的霜剂化妆品由以下组分及其质量百分比组成：
皮肤干细胞活性素12.5％、羊毛醇3.5％、白蜂蜡7.5％、银耳多糖0.3％、SOD5％、肌肽3％、壳寡糖2％、L-苹果酸3.5％、蜂胶3％和水59.7％。
胰蛋白酶CAS号：9002-07-7；胶原蛋白酶CAS号：9001-12-1；胰岛素CAS号：9004-10-8；L-谷氨酰胺CAS号：56-85-9；表皮生长因子CAS号：62229-50-9；成纤维细胞生长因子CAS号：106098-92-8；神经生长因子CAS号：9061-61-4；糖皮质激素CAS号：51372-29-3；柠檬酸铁铵CAS号：1185-57-5；EDTA-2Na CAS号：6381-92-6；虾青素CAS号：472-61-7；黄芩甙元CAS号：491-67-8；飞燕草素CAS号：528-53-0；桑色素CAS号：654055-01-3。
羊毛醇CAS号：8027-33-6；白蜂蜡CAS号：8006-40-4；银耳多糖CAS号：9075-53-0；SOD CAS号：9054-89-1；肌肽CAS号：305-84-0；壳寡糖CAS号：148411-57-8；L-苹果酸CAS号：97-67-6；蜂胶CAS号：8012-89-3。
DMEM/F12培养基是含有氨基酸和葡萄糖的培养基，该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种动物细胞的细胞培养；胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞活性因子；L-谷氨酰胺具有改善机体代谢、氮平衡、促进蛋白质合成的功效。
表皮生长因子是一种小肽，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促***作用，成纤维细胞生长因子、神经生长因子和糖皮质激素是重要的促生长因子和激素，对皮肤细胞生长具有促进作用，本发明将表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子按不同浓度组合加入，能够有效促进皮肤干细胞的增殖，缩短细胞生长周期；柠檬酸铁铵、硝酸铁和EDTA-2Na组合能够代替传统培养基中转铁蛋白的作用，能够促进铁的运输。
虾青素能有效清除细胞内的氧自由基、增强细胞再生能力，维持机体平衡和减少衰老细胞的堆积，由内而外保护细胞和DNA健康；飞燕草素(C15H11ClO7)和桑色素(C15Hl0O7·2H2O)属于生物类黄酮化合物，均具有很强的抗养化与抑菌作用，如桑色素对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌和伤寒杆菌有较强的抗菌作用，飞燕草素对弹性蛋白酶和胶原蛋白酶具有抑制作用；黄芩甙元属于生物类黄酮，具有显著的抗菌作用。培养基中添加虾青素、黄芩甙元不仅能够起到抗氧化、有效抑制培养基中微生物及病毒的感染作用，同时能够保护细胞，促进皮肤干细胞的增殖。
与现有技术相比，本发明的技术优势在于：采用胰蛋白酶与胶原蛋白酶复配使用，用于酶解胎盘组织进而分散组织细胞；皮肤干细胞培养基采用基础培养基添加一系列功能性组分，有利于胎盘间充质干细胞的诱导分化成为皮肤干细胞以及后续皮肤干细胞的扩增培养；制备的皮肤干细胞活性素应用于霜剂化妆品中能显著改善皮肤老化、降低不良反应的发生，增加角质层含水量和油脂含量。
附图说明
图1流式细胞仪检测胎盘间充质干细胞表面抗原的表达示意图
图2免疫荧光染色观察诱导后CK19及CK15的表达示意图
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。
D-Hank’s液购自北京华迈科生物技术有限公司。
实施例1一种皮肤干细胞活性素的制备方法
S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用400u/ml的青霉素浸泡10min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.1g/mL和胶原蛋白酶0.05g/mL于37℃下消化30min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴3min去除红细胞即得；
S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育15h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近80％融合时，进行传代扩增培养；
S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增5代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。
所述的皮肤干细胞培养基由以下组分及其浓度组成：DMEM/F12培养基12mL、胰岛素15mg/L、L-谷氨酰胺2mg/L、表皮生长因子6μg/L、成纤维细胞生长因子1μg/L、神经生长因子0.85μg/L、糖皮质激素100μg/L、柠檬酸铁铵0.5mg/L、硝酸铁0.4mg/L、EDTA-2Na 4mg/L、虾青素4mg/L、黄芩甙元0.08mg/L、飞燕草素20μg/L、桑色素2ng/L。
实施例2一种皮肤干细胞活性素的制备方法
S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用500u/ml的青霉素浸泡20min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.15g/mL和胶原蛋白酶0.065g/mL于37℃下消化45min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴4min去除红细胞即得；
S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育20h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近85％融合时，进行传代扩增培养；
S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增8代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。
所述的皮肤干细胞培养基由以下组分及其浓度组成：DMEM/F12培养基13.5mL、胰岛素20mg/L、L-谷氨酰胺5mg/L、表皮生长因子8μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、神经生长因子0.88μg/L、糖皮质激素175μg/L、柠檬酸铁铵1.0mg/L、硝酸铁0.5mg/L、EDTA-2Na 6mg/L、虾青素5mg/L、黄芩甙元0.1mg/L、飞燕草素35μg/L、桑色素3ng/L。
实施例3一种皮肤干细胞活性素的制备方法
S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用600u/ml的青霉素浸泡30min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.2g/mL和胶原蛋白酶0.08g/mL于37℃下消化60min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴5min去除红细胞即得；
S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育25h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近90％融合时，进行传代扩增培养；
S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增10代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。
所述的皮肤干细胞培养基由以下组分及其浓度组成：DMEM/F12培养基15mL、胰岛素25mg/L、L-谷氨酰胺8mg/L、表皮生长因子10μg/L、成纤维细胞生长因子3μg/L、神经生长因子0.9μg/L、糖皮质激素250μg/L、柠檬酸铁铵1.5mg/L、硝酸铁0.6mg/L、EDTA-2Na 8mg/L、虾青素6mg/L、黄芩甙元0.12mg/L、飞燕草素50μg/L、桑色素4ng/L。
对比例1一种皮肤干细胞活性素的制备方法
S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用500u/ml的青霉素浸泡20min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.15g/mL和胶原蛋白酶0.065g/mL于37℃下消化45min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴4min去除红细胞即得；
S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育20h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近85％融合时，进行传代扩增培养；
S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增8代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。
所述的皮肤干细胞培养基由以下组分及其浓度组成：DMEM/F12培养基13.5mL、胰岛素20mg/L、L-谷氨酰胺5mg/L、表皮生长因子8μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、神经生长因子0.88μg/L、糖皮质激素175μg/L、柠檬酸铁铵1mg/L、硝酸铁0.5mg/L、EDTA-2Na 6mg/L、虾青素5.1mg/L、飞燕草素35μg/L、桑色素3ng/L。
对比例1与实施例2的区别在于：皮肤干细胞培养基中不含黄芩甙元，增加虾青素的含量。
对比例2一种皮肤干细胞的制备方法
S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用500u/ml的青霉素浸泡20min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.15g/mL和胶原蛋白酶0.065g/mL于37℃下消化45min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴4min去除红细胞即得；
S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育20h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近85％融合时，进行传代扩增培养；
S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增8代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。
所述的皮肤干细胞培养基由以下组分及其浓度组成：DMEM/F12培养基13.5mL、胰岛素20mg/L、L-谷氨酰胺5mg/L、表皮生长因子10μg/L、神经生长因子0.88μg/L、糖皮质激素175μg/L、柠檬酸铁铵1mg/L、硝酸铁0.5mg/L、EDTA-2Na 6mg/L、虾青素5mg/L、黄芩甙元0.1mg/L、飞燕草素35μg/L、桑色素3ng/L。
对比例2与实施例2的区别在于：皮肤干细胞培养基中不含成纤维细胞生长因子，增加表皮生长因子的含量。
产品性能评价测试
试验例1：本发明实施例1-3和对比例1-2中步骤S2中得到的细胞为皮肤干细胞的验证试验
培养细胞表面抗原检测：取培养2代或3代的细胞，用胰蛋白酶0.15g/mL和胶原蛋白酶0.065g/mL消化后，用含体积分数1％小牛血清蛋白pH为7.2的磷酸盐缓冲液调整细胞浓度至1×108L-1。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、HLA-DR，置4℃孵半小时，pH为7.2的磷酸盐缓冲液洗一次，进行流式细胞仪分析。
诱导细胞免疫荧光染色分析：培养细胞在诱导分化7d后采用常规方法免疫荧光染色。贴壁细胞去培养基用pH为7.2的磷酸盐缓冲液洗3次，经40g/L多聚甲醛固定30min，pH为7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，0.3％TritonX-100处理20min，pH为7.2的磷酸盐缓冲液漂洗3次，10％羊血清室温封闭20min，吸出血清，分别加入鼠抗人CK19单克隆抗体、鼠抗人CK15单克隆抗体，37℃孵育2h后pH为7.2的磷酸盐缓冲液洗3次，加入羊抗鼠荧光二抗(1:500)孵30min，洗涤后在荧光显微镜下观察。
主要观察指标：流式细胞仪检测胎盘间充质干细胞表面抗原的表达；免疫荧光染色观察诱导后CK19及CK15的表达。
流式检测仪检测显示胎盘间充质干细胞表达CD73、CD90和CD105，不表达CD34、CD45、CD14和HLA-DR，结果如图1所示；免疫荧光染色结果显示表皮细胞标志物CK19以及CK15染色结果不同程度阳性，结果如图2所示，检测结果为表皮细胞。
试验例2：本发明制备的皮肤干细胞活性素应用于在霜剂化妆品中的效果
将实施例1-3和对比例1-2制备的皮肤干细胞活性素应用于霜剂化妆品中，所述的霜剂化妆品包括以下组分及其质量百分比：皮肤干细胞活性素12.5％、羊毛醇3.5％、白蜂蜡7.5％、银耳多糖0.3％、SOD5％、肌肽3％、壳寡糖2％、L-苹果酸3.5％、蜂胶3％和水59.7％。
试验方法：筛选600例皮肤出现老化的女性受试志愿者，年龄25-45岁，平均年龄35岁，入选标准：皮肤干燥、弹性降低、出现皱纹、色素沉着、肤色灰暗等皮肤老化现象，在整个试验期间不使用其他抗衰老产品。
600名女性受试志愿者分为6组每组100例，分别为对照组、实施例1-3组和对比例1-2组，其中对照组受试者不使用任何护肤产品，实施例1-3组和对比例1-2组受试者分别使用本发明实施例1-3和对比例1-2制得的霜剂化妆品，早晚洁面后取适量的霜剂化妆品涂抹于面部，各组整个试验时间为100天，记录试验期间发生的不良反应，并对受试者进行效果评价。
皮肤老化评估：通过观察受试者的5个受试区的皱纹来评价(眉间纹、前额皱纹、鱼尾纹、鼻唇沟、唇周皱纹)，评判标准：没有皱纹；轻度(有2-3条皱纹，长度<1.5cm)；中度(有2-6条浅皱纹，长度<3cm)；重度(有数条主皱纹，长度达4cm，同时伴有浅皱纹)。
安全性评估：主要评价使用产品后受试者出现轻微不适、红斑、干燥、瘙痒和刺痛等不良反应的发生情况。
在第100天对受试者采用无创性仪器检测受试部位的含水量、油脂含量，进行统计分析。试验结果如表1-3所示。
表1试验结束后各组受试者的皮肤老化评估
表2试验期间各组受试者的不良反应评价
表3各组受试者的试验期间的角质层含水量和油脂含量评价
从表1-3可以看出使用本发明实施例1-3制备的霜剂化妆品受试者皮肤老化达到严重程度人数较对比例1-2少，同时受试者也没有出现红斑、刺痛的不良反应；此外使用本发明实施例1-3制备的霜剂化妆品均可显著增加受试者角质层含水量和油脂含量，且角质层含水量和油脂含量增加量较对比例1-2更加明显，其中以实施例2制备的护肤品效果最佳。以上结果表明本发明实施例1-3制备的霜剂化妆品可显著改善皮肤老化，降低不良反应的发生，增加角质层含水量和油脂含量，表明含有本发明制备的皮肤干细胞活性素的霜剂化妆品能显著改善皮肤老化、降低不良反应的发生，增加角质层含水量和油脂含量。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选的实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种皮肤干细胞活性素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用400-600u/ml的青霉素浸泡10-30min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.1-0.2g/mL和胶原蛋白酶0.05-0.08g/mL于37℃下消化30-60min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴3-5min去除红细胞即得；
S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育15-25h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近80-90％融合时，进行传代扩增培养；
S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增5-10代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。
2.根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性素的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的皮肤干细胞培养基包括以下组分及其浓度：基础培养基12-15mL、胰岛素15-25mg/L、L-谷氨酰胺2-8mg/L、表皮生长因子6-10μg/L、成纤维细胞生长因子1-3μg/L、神经生长因子0.85-0.9μg/L、糖皮质激素100-250μg/L、柠檬酸铁铵0.5-1.5mg/L、硝酸铁0.4-0.6mg/L、EDTA-2Na4-8mg/L、虾青素4-6mg/L、黄芩甙元0.08-0.12mg/L、飞燕草素20-50μg/L和桑色素2-4ng/L。
3.根据权利要求2所述的皮肤干细胞活性素的制备方法，其特征在于，所述的皮肤干细胞培养基由以下组分及其浓度组成：基础培养基13.5mL、胰岛素20mg/L、L-谷氨酰胺5mg/L、表皮生长因子8μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、神经生长因子0.88μg/L、糖皮质激素175μg/L、柠檬酸铁铵1mg/L、硝酸铁0.5mg/L、EDTA-2Na 6mg/L、虾青素5mg/L、黄芩甙元0.1mg/L、飞燕草素35μg/L和桑色素3ng/L。
4.根据权利要求2或3所述的皮肤干细胞活性素的制备方法，其特征在于，所述的基础培养基为DMEM/F12培养基。
5.根据权利要求1-4任一项所述的皮肤干细胞活性素的制备方法制备的皮肤干细胞活性素在霜剂化妆品中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的霜剂化妆品包括以下组分及其质量百分比：
皮肤干细胞活性素10-15％、羊毛醇2-5％、白蜂蜡5-10％、银耳多糖0.2-0.4％、SOD4-6％、肌肽2-4％、壳寡糖1-3％、L-苹果酸2-5％、蜂胶2-4％和水47.6-71.8％。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的霜剂化妆品由以下组分及其质量百分比组成：
皮肤干细胞活性素12.5％、羊毛醇3.5％、白蜂蜡7.5％、银耳多糖0.3％、SOD5％、肌肽3％、壳寡糖2％、L-苹果酸3.5％、蜂胶3％和水59.7％。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108456656A (zh) * 2018-03-26 2018-08-28 北京贝诗丹生物科技有限公司 DBMSCs活性物质、制备方法及其在护肤品中的应用
CN108913647A (zh) * 2018-08-08 2018-11-30 新乡医学院 一种干细胞培养基及其制备方法
CN109897820A (zh) * 2019-03-25 2019-06-18 内蒙古大学 一种延缓体外培养卵子老化的方法
CN111588737A (zh) * 2020-04-17 2020-08-28 焕生汇生物基因技术(北京)有限公司 一种含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法
CN113462641A (zh) * 2021-07-15 2021-10-01 广州市宙斯生物科技有限责任公司 脐带间充质干细胞提取物、应用及检测方法
CN113499306A (zh) * 2021-07-30 2021-10-15 广州市宙斯生物科技有限责任公司 一种脐带间充质干细胞中高分子提取物、应用及检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105078777A (zh) * 2014-05-15 2015-11-25 金凤华 间充质干细胞分泌因子精华液及其制备方法和应用
CN105168085A (zh) * 2015-09-08 2015-12-23 严芳 间充质干细胞衍生液及其制备方法和在化妆品中的应用
CN105708860A (zh) * 2016-01-26 2016-06-29 深圳爱生再生医学科技有限公司 用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂
CN106635979A (zh) * 2017-01-16 2017-05-10 广东万海细胞生物科技有限公司 脂肪间充质干细胞的无血清培养基
CN106754640A (zh) * 2016-12-19 2017-05-31 江西宜信堂医疗科技有限公司 一种表皮细胞培养基及其制备方法
CN106906180A (zh) * 2016-12-28 2017-06-30 里程 一种具有生物活化作用的复合添加剂及其制备方法和用途
CN106983704A (zh) * 2016-01-20 2017-07-28 北京泰盛生物科技有限公司 间充质干细胞培养物或其培养上清的用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105078777A (zh) * 2014-05-15 2015-11-25 金凤华 间充质干细胞分泌因子精华液及其制备方法和应用
CN105168085A (zh) * 2015-09-08 2015-12-23 严芳 间充质干细胞衍生液及其制备方法和在化妆品中的应用
CN106983704A (zh) * 2016-01-20 2017-07-28 北京泰盛生物科技有限公司 间充质干细胞培养物或其培养上清的用途
CN105708860A (zh) * 2016-01-26 2016-06-29 深圳爱生再生医学科技有限公司 用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂
CN106754640A (zh) * 2016-12-19 2017-05-31 江西宜信堂医疗科技有限公司 一种表皮细胞培养基及其制备方法
CN106906180A (zh) * 2016-12-28 2017-06-30 里程 一种具有生物活化作用的复合添加剂及其制备方法和用途
CN106635979A (zh) * 2017-01-16 2017-05-10 广东万海细胞生物科技有限公司 脂肪间充质干细胞的无血清培养基

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108456656A (zh) * 2018-03-26 2018-08-28 北京贝诗丹生物科技有限公司 DBMSCs活性物质、制备方法及其在护肤品中的应用
CN108913647A (zh) * 2018-08-08 2018-11-30 新乡医学院 一种干细胞培养基及其制备方法
CN108913647B (zh) * 2018-08-08 2021-06-04 新乡医学院 一种干细胞培养基及其制备方法
CN109897820A (zh) * 2019-03-25 2019-06-18 内蒙古大学 一种延缓体外培养卵子老化的方法
CN109897820B (zh) * 2019-03-25 2022-03-04 内蒙古大学 一种延缓体外培养卵子老化的方法
CN111588737A (zh) * 2020-04-17 2020-08-28 焕生汇生物基因技术(北京)有限公司 一种含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法
CN113462641A (zh) * 2021-07-15 2021-10-01 广州市宙斯生物科技有限责任公司 脐带间充质干细胞提取物、应用及检测方法
CN113499306A (zh) * 2021-07-30 2021-10-15 广州市宙斯生物科技有限责任公司 一种脐带间充质干细胞中高分子提取物、应用及检测方法

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