CN110129265A - 一种脐带间充质干细胞外泌体、制备方法及在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞外泌体、制备方法及在化妆品中的应用。间充质干细胞释放的外泌体具有干细胞的特点，具有促进组织修复、免疫抑制、神经保护等多项生物学功能。虽然间充质干细胞被认为是产生外泌体最强的细胞，但是，当用作化妆品原料时，仍然难以满足市场需求。本发明发现，脐带间充质干细胞外泌体具有促进人皮肤成纤维细胞增殖的作用，对间充质干细胞修饰改造使其高表达miR‑525‑3p后可以显著提高外泌体对人皮肤成纤维细胞增殖的促进作用，单位质量外泌体的抗皮肤衰老活性显著提高，可以将脐带间充质干细胞外泌体和miR‑525‑3p高表达脐带间充质干细胞外泌体用于抗皮肤衰老的化妆品。

Description

一种脐带间充质干细胞外泌体、制备方法及在化妆品中的 应用

技术领域

本发明属于干细胞领域，涉及干细胞美容，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体、制备方法及在化妆品中的应用。

背景技术

皮肤的老化是一个复杂的生物学过程，主要涉及真皮层，如基质金属蛋白酶水平增加导致细胞间基质胶原蛋白和弹性纤维降解增加，TGF-1β信号传导障碍导致胶原蛋白合成减少等，此外皮下组织血管减少以及结构变化也是皮肤老化的重要因素，因此通过补充细胞因子激活真皮层细胞活力在皮肤抗衰老领域有很大的潜力。从多种干细胞主要是间充质干细胞获得的细胞培养产物已被证实具有皮肤抗衰老功效(闵倩等，间充质干细胞和淋巴细胞分泌细胞因子的抗衰老功效研究，《中国医疗美容》第8卷第7期2018年7月)。

大量的研究表明，间充质干细胞分泌外泌体的能力与其治疗效果密切相关。外泌体是细胞释放的一种囊泡样泡体，具有脂质双分子膜结构，直径约40～100nm。外泌体中含有多种细胞膜成分以及miRNA等调控物质。间充质干细胞释放的外泌体具有干细胞的特点，具有促进组织修复、免疫抑制、神经保护等多项生物学功能。

虽然间充质干细胞被认为是产生外泌体最强的细胞，但是，当用作化妆品原料时，仍然难以满足市场需求。此时，要么通过改变体外培养参数提高间充质干细胞分泌外泌体的能力，要么对间充质干细胞进行改造提高单位质量外泌体的活性。

细胞外泌体是细胞内多囊泡体，含有蛋白质、RNA等多种生物活性成分，是细胞间信息传递分子及遗传物质传递载体。间充质干细胞外泌体携带特定miRNA，具有增强干细胞的生物学作用。因此，miRNA基因修饰成为特异改造间充质干细胞外泌体的策略。

经过研究，发现一种miRNA基因修饰的脐带间充质干细胞分泌的外泌体的抗皮肤衰老活性显著提高，因此，特提出本发明。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，对间充质干细胞进行改造提高单位数量外泌体的活性，提供一种脐带间充质干细胞外泌体、制备方法及在化妆品中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种脐带间充质干细胞外泌体，由脐带间充质干细胞分泌。

优选地，所述脐带间充质干细胞为miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞。

一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，将脐带间充质干细胞在体外培养；

步骤S2，收集脐带间充质干细胞的体外培养上清液，依次用710×g离心5min和3100×g离心30min再次收集上清，最后用超速离心机100000×g离心2h收集外泌体。

脐带间充质干细胞外泌体在制备化妆品中的应用，该化妆品用于抗皮肤衰老、促进创面愈合。

miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，将脐带间充质干细胞在体外培养；

步骤S2，用miR-525-3p过表达腺病毒载体感染脐带间充质干细胞制备miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞；

步骤S3，收集miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞的体外培养上清液，依次用710×g离心5min和3100×g离心30min再次收集上清，最后用超速离心机100000×g离心2h收集外泌体。

miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞外泌体在制备化妆品中的应用，该化妆品用于抗皮肤衰老、促进创面愈合。

皮肤的老化是一个复杂的生物学过程，主要涉及真皮层，如基质金属蛋白酶水平增加导致细胞间基质胶原蛋白和弹性纤维降解增加，TGF-1β信号传导障碍导致胶原蛋白合成减少等，此外皮下组织血管减少以及结构变化也是皮肤老化的重要因素，因此通过补充细胞因子激活真皮层细胞活力在皮肤抗衰老领域有很大的潜力。从多种干细胞主要是间充质干细胞获得的细胞培养产物已被证实具有皮肤抗衰老功效(闵倩等，间充质干细胞和淋巴细胞分泌细胞因子的抗衰老功效研究，《中国医疗美容》第8卷第7期2018年7月)。具体实施例中，脐带间充质干细胞外泌体、miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞外泌体可以显著促进人皮肤成纤维细胞的增殖，抗皮肤衰老、促进创面愈合，且呈现剂量依赖性。

有益效果：

间充质干细胞释放的外泌体具有干细胞的特点，具有促进组织修复、免疫抑制、神经保护等多项生物学功能。虽然间充质干细胞被认为是产生外泌体最强的细胞，但是，当用作化妆品原料时，仍然难以满足市场需求。此时，要么通过改变体外培养参数提高间充质干细胞分泌外泌体的能力，要么对间充质干细胞进行改造提高单位质量外泌体的活性。本发明发现，脐带间充质干细胞外泌体具有促进人皮肤成纤维细胞增殖的作用，对间充质干细胞修饰改造使其高表达miR-525-3p后可以显著提高外泌体对人皮肤成纤维细胞增殖的促进作用，单位质量外泌体的抗皮肤衰老活性显著提高，可以将脐带间充质干细胞外泌体和miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞外泌体用作抗皮肤衰老化妆品的原料。

附图说明

图1为第4代脐带间充质干细胞的倒置显微镜观察结果；

图2为第4代脐带间充质干细胞的流式检测结果；

图3为转染48h后脐带间充质干细胞荧光显微镜观察结果；

图4为转染48h后脐带间充质干细胞的qRT-PCR检测结果；

图5为各组HFF-1细胞增殖活性增加百分率(％)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。

实施例1：脐带间充质干细胞的分离、培养、修饰改造及其外泌体提取

一、实验材料和仪器

脐带组织取自健康剖宫产孕妇，4℃保存，24h内进行脐带间充质干细胞的分离与培养。产妇本人签署知情同意书，声明所取脐带仅可用于科学研究。

直径100mm的无菌培养皿为美国Corning产品。

细胞培养箱为Thermo Fisher Scientific产品。

流式细胞仪为美国BD Biosciences产品。

胎牛血清为美国Gibco公司产品，α-MEM培养基为Hyclone公司产品，胰酶购自碧云天。

流式鉴定使用到的荧光标记流式抗体CD14-PE、CD31-FITC、CD34-PE、CD44-FIT、CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PE为Beckman产品。

miR-525-3p过表达腺病毒载体和阴性对照腺病毒载体由广州辉骏生物构建。

BCA试剂盒购自碧云天。

低温冰箱为Thermo Fisher Scientific产品。

二、实验方法

1、脐带间充质干细胞的分离、培养和流式鉴定

按照本领域常规操作方法，无菌操作台内将脐带剪成3-5cm小段，用生理盐水充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的残存血液，剔除静脉、动脉。将脐带沃顿胶剪碎成0.5-1.0mm³的组织块，均匀平铺在直径100mm的无菌培养皿中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中，约1～2h后待组织块略干燥能牢固贴于培养皿壁上时，缓慢加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基，使培养液浸泡组织块，继续培养，每隔3～4d换液1次，待细胞克隆长至80％-90％融合时，用0.05％胰酶消化传代至新的无菌培养皿中。流式鉴定方法如下：

取生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，经洗涤、过滤、固定、荧光抗体标记、再洗涤，流式细胞仪上样，检测表面标记物CD14、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105和HLA-DR的表达率。

2、脐带间充质干细胞的修饰改造和检测

取生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞接种于含10％胎牛血清的α-MEM培养基中，将miR-525-3p过表达腺病毒载体和阴性对照腺病毒载体按照MOI＝100感染脐带间充质干细胞，48h后洗涤重悬用荧光显微镜观察GFP⁺细胞比例以检测感染率，利用qRT-PCR检测miR-525-3p的表达(同时设置未修饰改造的脐带间充质干细胞为空白对照)。

3、修饰改造后脐带间充质干细胞的培养和外泌体提取

分别收集miR-525-3p过表达腺病毒载体、阴性对照腺病毒载体修饰改造的脐带间充质干细胞，PBS洗涤后重新接种于含10％胎牛血清的α-MEM培养基中，继续培养48h后，收集上清，依次用710×g离心5min和3100×g离心30min再次收集上清，最后用超速离心机100000×g离心2h收集外泌体。重悬后用BCA测定浓度，重悬液标记浓度，分装后-80℃储存备用。

同时设置未修饰改造的脐带间充质干细胞为空白对照。

4、数据处理

实验结果数据以均值±标准偏差表示，采用SPSS17.0软件进行分析。不同组之间的比较采用t检验，P＜0.05代表差异有统计学意义。

三、实验结果

1、脐带间充质干细胞的分离和培养结果

脐带间充质干细胞生长状态良好，图1为第4代脐带间充质干细胞的倒置显微镜观察结果，可观察到呈类纤维状；图2为第4代脐带间充质干细胞的流式检测结果，CD44、CD90、CD105均强表达，表达率不低于98％；CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均弱表达，表达率不足2％。倒置显微镜观察结果和流式检测结果均符合人脐带间充质干细胞的特点。

2、重组腺病毒转染脐带间充质干细胞的转染效率

图3为转染48h后荧光显微镜观察结果，GFP⁺细胞比例在90％以上，并且细胞状态良好。

图4为转染48h后qRT-PCR检测结果，与空白对照组相比，miR-525-3p过表达腺病毒载体转染的脐带间充质干细胞显著过表达miR-525-3p，阴性对照腺病毒载体转染的脐带间充质干细胞未见明显的miR-525-3p表达改变。

3、修饰改造后脐带间充质干细胞的培养和外泌体提取

外泌体提取方法参照文献(方玲等，miR-486基因修饰的脐带间充质干细胞外泌体对心肌细胞生物学特性影响，中国实验血液学杂志，2018年第26卷第5期)，分别收集得到miR-525-3p过表达腺病毒载体修饰改造、阴性对照腺病毒载体修饰改造和未经修饰改造的脐带间充质干细胞外泌体345mg、323mg、327mg，单位细胞分泌量之比约为1.07:1:1.01。

实施例2：外泌体的抗皮肤衰老活性测试

一、实验材料和仪器

HFF-1细胞为上海沪震生物科技有限公司产品。

胎牛血清为美国Gibco公司产品。

DMEM/F12培养液为Sigma-Aldrich公司产品。

CCK-8购自碧云天；DMSO为Sigma-Aldrich公司产品。

细胞培养箱、酶标仪为Thermo Fisher Scientific产品。

二、实验方法和结果

1、细胞培养

HFF-1细胞培养于10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，在温度37℃、浓度5％CO₂的饱和湿度培养箱中进行常规培养，细胞长至85％时用胰酶消化、传代培养。

2、CCK-8测定细胞增殖活性

取对数生长期的HFF-1细胞，每孔1×10⁴个细胞接种于96孔培养板。12小时后，更换为含有终浓度0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL脐带间充质干细胞外泌体(实施例1制备，miR-525-3p过表达腺病毒载体修饰改造、阴性对照腺病毒载体修饰改造和未经修饰改造的脐带间充质干细胞外泌体分别命名为过表达组、阴性对照组和空白对照组)的完全培养基，继续培养48h后，每孔加入5mg/mL的CCK-8溶液20μL，温度37℃避光继续孵育4小时，然后除去每孔培养液，加入DMSO 150μL，震荡混匀，充分溶解。酶标仪检测570nm波长处的吸光度OD值，以0μg/mL为对照孔，按照如下公式计算：

增殖活性增加百分率(％)＝(OD实验孔-OD对照孔)/OD对照孔×100％。

结果如表1和图5所示，阴性对照组和空白对照组可以将HFF-1细胞的增殖活性显著提高；与阴性对照组和空白对照组相比，过表达组可以将HFF-1细胞的增殖活性显著进一步提高。由此可见，脐带间充质干细胞外泌体可以显著促进人皮肤成纤维细胞的增殖，miR-525-3p修饰改造的脐带间充质干细胞外泌体可以显著进一步促进人皮肤成纤维细胞的增殖，且呈现剂量依赖性，脐带间充质干细胞外泌体可以用于抗皮肤衰老，miR-525-3p修饰改造的脐带间充质干细胞外泌体抗皮肤衰老效果显著更为优异。

表1各组HFF-1细胞增殖活性增加百分率(％)

	5μg/mL	10μg/mL
			过表达组	96.3±8.9	172.8±10.4
阴性对照组	65.5±7.7	110.3±8.5
			空白对照组	68.2±7.3	107.5±9.6

实施例3：一种抗皮肤衰老的精华液

由如下百分含量的原料组成：脐带间充质干细胞外泌体，0.5％；吡咯烷酮羧酸钠，0.5％；甘油，3.5％；1,3-丙二醇，3.5％；甜菜碱，1％；谷胱甘肽，0.05％；乙二胺四乙酸二钠，0.05％；月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱，0.5％；尿囊素，0.1％；抗坏血酸，0.1％；透明质酸钠，0.1％；黄原胶，0.5％；香精，0.05％；余量为去离子水。

间充质干细胞释放的外泌体具有干细胞的特点，具有促进组织修复、免疫抑制、神经保护等多项生物学功能。虽然间充质干细胞被认为是产生外泌体最强的细胞，但是，当用作化妆品原料时，仍然难以满足市场需求。此时，要么通过改变体外培养参数提高间充质干细胞分泌外泌体的能力，要么对间充质干细胞进行改造提高单位质量外泌体的活性。本发明发现，脐带间充质干细胞外泌体具有促进人皮肤成纤维细胞增殖的作用，对间充质干细胞修饰改造使其高表达miR-525-3p后可以显著提高外泌体对人皮肤成纤维细胞增殖的促进作用，单位质量外泌体的抗皮肤衰老活性显著提高，可以将脐带间充质干细胞外泌体和miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞外泌体用作抗皮肤衰老、促进创面愈合化妆品的原料。

上述实施例用来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：由脐带间充质干细胞分泌。

2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于：所述脐带间充质干细胞为miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞。

3.权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，将脐带间充质干细胞在体外培养；

步骤S2，收集脐带间充质干细胞的体外培养上清液，依次用710×g离心5min和3100×g离心30min再次收集上清，最后用超速离心机100000×g离心2h收集外泌体。

4.权利要求1所述的外泌体在制备化妆品中的应用，该化妆品用于抗皮肤衰老、促进创面愈合。

5.权利要求2所述外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，将脐带间充质干细胞在体外培养；

步骤S2，用miR-525-3p过表达腺病毒载体感染脐带间充质干细胞制备miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞；

步骤S3，收集miR-525-3p高表达的脐带间充质干细胞的体外培养上清液，依次用710×g离心5min和3100×g离心30min再次收集上清，最后用超速离心机100000×g离心2h收集外泌体。

6.权利要求2所述外泌体在制备化妆品中的应用，该化妆品用于抗皮肤衰老、促进创面愈合。