CN105102446B - 甲基修饰酶的调节剂、其组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于调节组蛋白甲基修饰酶的具有结构式(II)的药剂、其组合物以及例如作为抗癌药剂的用途。

Description

甲基修饰酶的调节剂、其组合物及用途

相关申请案的交叉参考

本申请要求2013年2月11日提交的国际申请第PCT/US2013/025639号的优先权。国际申请第PCT/US2013/025639号要求2012年2月10日提交的美国临时申请第61/597,695号及2012年7月03日提交的美国临时申请第61/667,821号的优先权。前述申请的全部内容通过引用并入本文。

发明背景

真核染色质由称为核小体的高分子复合物构成。核小体具有围绕一个蛋白质八聚体缠绕的147个DNA碱基对，该蛋白质八聚体具有组蛋白H2A、H2B、H3及H4中的每一个的两个亚单元。组蛋白经受转译后修饰，该修饰反过来影响染色质结构及基因表达。在组蛋白上发现的一类转译后修饰为赖氨酸及精氨酸残基的甲基化。组蛋白甲基化在调控真核生物中的基因表达中起关键作用。甲基化影响染色质结构且与转录的活化和抑制两者相关联(Zhang和Reinberg,Genes Dev.15:2343-2360,2001)。催化甲基与组蛋白的附接及移除的酶牵涉在基因沉默、胚胎发育、细胞增殖及其他过程中。

发明内容

本发明涵盖以下认知：鉴于其在调控不同生物过程中的作用甲基修饰酶是一种用于调节的具有吸引力的靶标。目前已发现本发明的化合物和其药学上可接受的组合物有效用作刺激组蛋白甲基修饰酶(包括组蛋白甲基化酶和组蛋白去甲基酶)的活性的药剂。该化合物具有通式II：

或其药学上可接受的盐，其中各变量如本文所定义。

本发明的化合物和其药学上可接受的组合物适用于治疗与甲基修饰酶相关的多种疾病、病症或病状。该类疾病、病症或病状包括本文所描述的那些。

本发明所提供的化合物还适用于生物和病理性现象中甲基修饰酶的研究；由甲基修饰酶介导的细胞内信号转导路径的研究和新甲基修饰酶调节剂的比较评估。

附图简要说明

图1：式II的示例性化合物。

发明详述

1.本发明的化合物的一般描述

在某些实施方式中，本发明提供一种式II化合物，

或其药学上可接受的盐，其中：

A为CH或N；

R^1a选自-C₁-C₂烷基和-O-(C₁-C₂烷基)，其中R^1a任选地被一或多个氟取代；

R^4a选自-(C₁-C₄亚烷基)-O-(C₁-C₃烷基)、1-取代-哌啶-4-基、任选地被一或多个氟取代的C₃-C₆环烷基和四氢吡喃基；且

R¹³选自氢、卤代、苯基、吡啶基和-O-(C₁-C₄烷基)。

2.化合物和定义

下文更详细地描述特定官能基团和化学术语的定义。出于本发明的目的，根据化学和物理学手册(Handbook of Chemistry and Physics),第75版里封，元素周期表(CAS版本)来鉴别化学元素，且特定官能基团一般如其中所描述来定义。另外，有机化学的一般原理以及特定官能性部分和反应性描述于Organic Chemistry(有机化学),Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999；Smith和March March's Advanced OrganicChemistry(高等有机化学),第5版，John Wiley&Sons公司,New York,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations(综合有机转换),VCH Publishers公司,NewYork,1989；Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis(有机合成的一些现代方法),第3版,Cambridge University出版社,Cambridge,1987中；其中每一个的全部内容通过引用并入本文。

除非另外陈述，否则本文所示出的结构还意图包括该结构的所有异构(例如对映异构、非对映异构和几何异构(或构型异构))形式；例如，对各不对称中心的R和S构型、Z和E双键异构体、和Z和E构型异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构、非对映异构和几何异构(或构型异构)混合物处于本发明的范围内。除非另外陈述，否则本发明的化合物的所有互变异构型式均处于本发明的范围内。另外，除非另外陈述，否则本文所示出的结构还意图包括仅在存在一或多个同位素富集的原子不同的化合物。例如，包括氢由氘或氚替换或碳由¹³C-或¹⁴C-富集的碳替换的具有本发明的结构的化合物处于本发明的范围内。该类化合物适用作例如分析工具，用作生物分析中的探针，或用作本发明的治疗剂。

在其中优选特定对映异构体的情况下，在一些实施方式中，可提供基本上不含相应对映异构体的特定对映异构体，且还可称为“光学富集”。如本文所用的“光学富集”意味着化合物由比例明显更大的一个对映异构体组成。在某些实施方式中，化合物由至少约90重量％的优选的对映异构体组成。在其他实施方式中，化合物由至少约95重量％、98重量％或99重量％的优选的对映异构体组成。优选的对映异构体可通过本领域技术人员已知的任何方法(包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶)从外消旋混合物分离，或通过不对称合成来制备。参见例如Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen等人,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tablesof Resolving Agents and Optical Resolutions第268页(E.L.Eliel编,Univ.of NotreDame出版社,Notre Dame,IN 1972)。

在化学结构中手性中心处的波浪键用于表示光学纯的本发明的化合物，但其旋光度尚未被测定。手性中心处的直线键指示外消旋混合物，尽管如以上所述，本发明还包括该外消旋体的所有可能异构形式。

如本文所用的术语“卤代”和“卤素”是指选自氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)和碘(碘代，-I)的原子。

术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”为聚亚甲基，即-(CH₂)_n-，其中n为正整数，优选1至6、1至4、1至3、1至2、或2至3。被取代的亚烷基链为其中一个或多个亚甲基氢原子由取代基替换的聚亚甲基。适合的取代基包括下文为被取代的脂族基团所描述的那些。

本文所用的术语“烷基”是指通过移除单个氢原子而衍生自含有一至六个碳原子的脂族部分的单价饱和直链或支链烃基。在一些实施方式中，烷基含有1-5个碳原子。在另一个实施方式中，烷基含有1-4个碳原子。在其他实施方式中，烷基含有1-3个碳原子。在又一个实施方式中，烷基含有1-2个碳。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基等。

如本文所描述，本发明的化合物可含有“任选地被取代的”部分。通常，术语“被取代的”不论是否在术语“任选地”之后均意味着指定部分的一或多个氢被适合的取代基替换。除非另外指示，否则“任选地被取代的”基团在该基团的各可取代的位置处均可具有适合的取代基，且当任何既定结构中一个以上位置可被选自指定基团的一个以上取代基取代时，该取代基在各位置处可为相同或不同的。根据本发明所预想的取代基的组合优选为促使形成稳定或化学可行的化合物的那些组合。本文所用的术语“稳定的”是指化合物在经受被允许其生产、检测和(在某些实施方式中)其回收、纯化和用于本文所公开的一或或多种目的的条件时不发生实质上改变。

在“任选地被取代的”基团的可取代的碳原子上的适合的单价取代基独立地为：卤素；-(CH₂)_0-4R^○；-(CH₂)_0-4OR^○；-O-(CH₂)₀-₄C(O)OR^○；-(CH₂)_0-4CH(OR^○)₂；-(CH₂)_0-4SR^○；可被R^○取代的-(CH₂)_0-4Ph；可被R^○取代的-(CH₂)_0-4O(CH₂)_0-1Ph；可被R^○取代的-CH＝CHPh；-NO₂；-CN；-N₃；-(CH₂)_0-4N(R^○)₂；-(CH₂)_0-4N(R^○)C(O)R^○；-N(R^○)C(S)R^○；-(CH₂)_0-4N(R^o)C(O)NR^○ ₂；-N(R^○)C(S)NR^○ ₂；-(CH₂)_0-4N(R^○)C(O)OR^○；-N(R^○)N(R^○)C(O)R^○；-N(R^○)N(R^○)C(O)NR^○ ₂；-N(R^○)N(R^○)C(O)OR^○；-(CH₂)_0-4C(O)R^○；-C(S)R^○；-(CH₂)_0-4C(O)OR^○；-(CH₂)_0-4C(O)SR^○；-(CH₂)_0-4C(O)OSiR^○ ₃；-(CH₂)_0-4OC(O)R^○；-OC(O)(CH₂)_0-4SR-；-SC(S)SR^○；-(CH₂)_0-4SC(O)R^○；-(CH₂)_0-4C(O)NR^○ ₂；-C(S)NR^○ ₂；-C(S)SR^○；-SC(S)SR^○；-(CH₂)_0-4OC(O)NR^○ ₂；-C(O)N(OR^○)R^○；-C(O)C(O)R^○；-C(O)CH₂C(O)R^○；-C(NOR^○)R^○；-(CH₂)_0-4SSR^○；-(CH₂)_0-4S(O)₂R^○；-(CH₂)_0-4S(O)₂OR^○；-(CH₂)_0-4OS(O)₂R^○；-S(O)₂NR^○ ₂；-(CH₂)_0-4S(O)R^○；-N(R^○)S(O)₂NR^○ ₂；-N(R^○)S(O)₂R^○；-N(OR^○)R^○；-C(NH)NR^○ ₂；-P(O)₂R^○；-P(O)R^○ ₂；-OP(O)R^○ ₂；-OP(O)(OR^○)_2；-SiR^○ ₃；-(C_1-4直链或支链亚烷基)O-N(R^○)₂；或-(C_1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(R^○)₂，其中各R^○可如下文所定义被取代且独立地为氢、C_1-6脂族基团、-CH₂Ph、-O(CH₂)_0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环；或不管以上定义，两个独立出现的R^○与其中间原子结合在一起形成可如下文所定义被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和环、部分不饱和环或芳基单环或双环。

在“任选地被取代的”基团的可取代氮上的适合的取代基包括 或其中各独立地为氢、可如下文所定义的可被取代的C_1-6脂族基团、未被取代的-OPh、或未被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环；或不管以上定义，两个独立出现的与其中间原子结合在一起形成未被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和环、部分不饱和环或芳基单环或双环。

脂族基团上的适合的取代基独立地为卤素、-R^●、-(卤代R^●)、-OH、-OR^●、-O(卤代R^●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR^●、-NH₂、-NHR^●、-NR^● ₂或-NO₂，其中各R^●为未被取代的或在“卤代”之后的情况下仅被一或多个卤素取代，且独立地为C_1-4脂族基团、-CH₂Ph、-O(CH₂)_0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。

如本文所用，术语“抑制剂”定义为利用具有可测量的亲和性的酶结合和/或抑制靶标S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的化合物。在某些实施方式中，抑制剂的IC₅₀和/或结合常数小于约50μM，小于约1μM，小于约500nM，小于约100nM或小于约10nM。

本文所用术语“可测量的亲和性”和“可测量地抑制”意味着在不存在该化合物或其组合物的情况下在包含所提供的化合物或其组合物和至少一种SAM依赖性酶的样品与包含至少一种SAM依赖性酶的等效样品之间的至少一种SAM利用酶的活性中可测量的变化。

3.示例性化合物的描述

在式II的一些实施方式中，R^1a选自-OCH₃、-CH₃、-OCHF₂和-CH₂CH₃。

在式II的一些实施方式中，R^4a选自-CH₂OCH₃、-CH(CH₃)OCH₃、4,4-二氟环己基、环丙基、四氢吡喃-4-基、1-(叔丁氧羰基)-哌啶-4-基、1-(异丁氧羰基)-哌啶-4-基、1-(异丙氧羰基)-哌啶-4-基、1-(2-氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2,2-二氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2,2,2-三氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2-羟基异丁基)-哌啶-4-基、1-(羟基异丙基羰基)-哌啶-4-基、1-(乙氧基羰基甲基)哌啶-4-基、1-(异丙基羰基)-哌啶-4-基、1-甲基哌啶-4-基、1-(甲基磺酰基)-哌啶-4-基、1-(乙基磺酰基)-哌啶-4-基、1-(异丙基磺酰基)-哌啶-4-基、1-(苯基)-哌啶-4-基、1-(氧杂环丁烷-3-基)哌啶-4-基、1-(吡啶-2-基)-哌啶-4-基和1-(嘧啶-2-基)-哌啶-4-基。

在式II的一些实施方式中，R¹³选自氢、氯代、氟代、-OCH(CH₃)₂、苯基和吡啶-2-基。

式II的示例性化合物阐述于图1中。在一些情况下，图1中具有一个(或多个)波浪键的化合物中的两个(或多个)具有完全相同的结构。因为波浪键表示未测定旋光性的手性中心，该类化合物应理解为彼此分离且截然不同的光学异构体。图1注释为指示所示出的结构相同但立体化学不同的两种或更多种化合物的那些集合。

4.用途、制剂和给药

药学上可接受的组合物

根据另一个实施方式，本发明提供一种组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受衍生物、和药学上可接受的载体、佐剂或媒剂。本发明的组合物中的化合物的量使得有效地在生物样品中或在患者中可测量地调节组蛋白甲基修饰酶或其突变体。在某些实施方式中，本发明的组合物中的化合物的量使得有效地在生物样品中或在患者中可测量地调节组蛋白甲基修饰酶或其突变体。

在某些实施方式中，配制本发明的组合物以用于向需要该组合物的患者给药。在一些实施方式中，配制本发明的组合物以用于向患者口服给药。

本文所用的术语“患者”是指动物，优选为哺乳动物，且最优选为人。

术语“药学上可接受的载体、佐剂或媒剂”是指不破坏与其一起配制的化合物的药理学活性的无毒载体、佐剂或媒剂。可在本发明的组合物中使用的药学上可接受的载体、佐剂或媒剂包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人类血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，硅胶、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

“药学上可接受的衍生物”是指在向接受者给药时能够直接或间接提供本发明的化合物或其抑制活性的代谢物或残余物的本发明化合物的任何无毒盐、酯、酯的盐或其他衍生物。

本发明的组合物可经口、非肠道、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、***或借助于植入式贮器而给药。本文所用的术语“非肠道”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物经口、腹膜内或静脉内给药。本发明的组合物的无菌可注射形式可为水性或油性悬浮液。此类悬浮液可根据本领域中已知的技术使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可为无毒非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1,3-丁二醇溶液。水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等张氯化钠溶液为可采用的可接受的媒剂和溶剂。另外，无菌不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。

出于此目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸如油酸和其甘油酯衍生物适用于制备可注射制剂，天然的药学上可接受的油如橄榄油或蓖麻油尤其其聚氧乙烯化形式也一样适用。此类油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或常用于配制药学上可接受的剂型包括乳液和悬浮液的类似分散剂。其他常用表面活性剂如吐温、Span和其他乳化剂或常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型中的生物可用性增进剂也可用于配制的目的。

本发明的药学上可接受的组合物可以任何经口可接受的剂型口服给药，包括但不限于：胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，如硬脂酸镁。对以胶囊形式口服给药而言，适用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当需要水性悬浮液用于口服使用时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。若需要，还可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。

或者，本发明的药学上可接受的组合物可为以用于经直肠给药的栓剂形式给药。可通过将药剂与适合的非刺激性赋形剂混合来制备此类栓剂，该赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体且因此将在直肠中熔融以释放药物。该类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

本发明的药学上可接受的组合物还可局部给药，尤其当治疗靶标包括通过局部施用容易进入的区域或器官(包括眼睛、皮肤或低位肠道的疾病)时。容易制备用于此类区域或器官中的每一个的适合的局部制剂。

用于低位肠道的局部施用可以直肠栓剂制剂(参见上文)形式或以适合的灌肠制剂形式实现。还可使用局部经皮贴片。

对局部施用而言，所提供的药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种载体中的活性组分的适合的软膏形式配制。用于本发明化合物的局部给药的载体包括但不限于：矿物油、液体石蜡脂、白石蜡脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所提供的药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种药学上可接受的载体中的活性组分的适合的洗剂或乳膏形式配制。适合的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。

对眼部使用而言，所提供的药学上可接受的组合物可配制为具有或不具有防腐剂(诸如氯苄烷铵)的于等张的pH调节的无菌生理食盐水中的微粒化的悬浮液，或优选为于等张的pH调节的无菌生理食盐水中的溶液。或者，对眼部使用而言，药学上可接受的组合物可以软膏如石蜡脂配制。

本发明的药学上可接受的组合物还可通过经鼻气雾剂或吸入来给药。该类组合物根据医药配制技术中熟知的技术来制备，且可采用苯甲醇或其他适合的防腐剂、增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂来制备为于生理食盐水中的溶液。

最优选地，配制本发明的药学上可接受的组合物以用于口服给药。该类制剂可在存在或不存在食物的情况下给药。在一些实施例中，本发明的药学上可接受的组合物在不存在食物的情况下给药。在其他实施例中，本发明的药学上可接受的组合物在存在食物的情况下给药。

可与载体材料组合以产生呈单一剂型的组合物的本发明的化合物的量将视所治疗的宿主和特定给药模式而变化。优选地，应配制所提供的组合物以使得可向接受此类组合物的患者给药每日每千克体重0.01-100mg剂量的抑制剂。

还应理解，用于任何特定患者的特定剂量和治疗方案将视多种因素而定，该类因素包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、膳食、给药时间、***率、药物组合和治疗医师的判断和所治疗的特定疾病的严重强度。本发明的化合物在组合物中的量还视组合物中的特定化合物而定。

化合物和药学上可接受组合物的用途

本文所描述的化合物和组合物一般适用于调节参与表观遗传调控的一种或多种酶的活性。

表观遗传学为对由除基础DNA序列改变外的机制引起的基因表达中可遗传性改变的研究。在表观遗传调控中起一定作用的分子机制包括DNA甲基化和染色质/组蛋白修饰。组蛋白甲基化在许多表观遗传现象中尤为关键。

染色质为核DNA和组蛋白的组织集合，其为多种至关重要核过程的基础，该类核过程包括转录的调控、复制、DNA损坏修复和经由细胞循环的进展。已鉴别出在维持染色质的动力学平衡中起重要作用的多种因素如染色质修饰酶(Margueron等人(2005)Curr.Opin.Genet.Dev.15:163-176)。

组蛋白为染色质的主要蛋白质组分。其充当DNA围绕其卷绕的线轴，且其在基因调控中起一定作用。存在总共六个类别的组蛋白(H1、H2A、H2B、H3、H4和H5)，其可分组为两个超类别：核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)和连接组蛋白(H1和H5)。染色质的基本单元为核小体，其由围绕组蛋白八聚体缠绕的约147个DNA碱基对组成，该组蛋白八聚体由核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4中的每一个的两个复本组成(Luger等人(1997)Nature389:251-260)。

组蛋白，尤其是组蛋白H3和H4的氨基末端的残基和组蛋白H2A、H2B和H1的氨基和羧基末端，易受多种翻译后修饰的影响，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、核糖基化、类泛素化、泛素化、瓜胺酸化、去氨基化和生物素化。组蛋白H2A和H3的核心还可被修饰。组蛋白修饰对不同生物过程为整合的，该类生物过程如基因调控、DNA和染色体缩合。

本发明提供用于调节组蛋白甲基修饰酶的活性的化合物和组合物。组蛋白甲基修饰酶为细胞和发育过程的关键调节剂。组蛋白甲基修饰酶可表征为组蛋白甲基转移酶或组蛋白去甲基酶。组蛋白去甲基酶具有介导与甲基化残基的结合的模块。例如，多个去甲基酶含有都铎结构域(Tudor domain)(例如JMJD2C/GASC1)或PHD结构域(例如JARID1C/SMCX、PHF8)。

已表征许多组蛋白甲基转移酶的赖氨酸特异性。例如，SET7/9、SMYD3和MLL1-5对H3K4具有特异性。SUV39H1、DIM-5和G9a对H3K9具有特异性。SET8对H4K20具有特异性。

DOT1为含有组蛋白甲基化酶的非SET结构域的一个实例。DOT1使赖氨酸79上的H3甲基化。

在已显示组蛋白甲基化酶调控转录活性、染色质结构和基因沉默的同时，还发现去甲基酶影响基因表达。LSD1为第一个得到表征的组蛋白赖氨酸去甲基酶。该酶显示与FAD依赖性胺氧化酶的同源性，且充当神经元基因的转录共抑制剂(Shi等人,Cell 119:941-953,2004)。已发现限定单独去甲基酶家族的另外的去甲基酶，包括JHDM1(或KDM2)、JHDM2(或KDM3)、JMJD2(或KDM4)、JARID(或KDM5)、JMJD3(或KDM6)和JMJD6家族(Lan等人,Curr.Opin.Cell Biol.20(3):316-325,2008)。

去甲基酶对底物序列内特定赖氨酸残基起作用，且辨别存在于所给定残余物上的甲基化程度之间的差别。例如，LSD1移除来自H3K4的单甲基或二甲基。JARID1A-D家族的成员自H3K4移除三甲基。UTX和JMJD3使H3K27去甲基，抵消EZH2甲基化酶活性的效果。已表征其他去甲基酶的底物特异性(参见Shi,Nat.Rev.8:829-833,2007)。

一类组蛋白甲基化酶的特征在于存在SET结构域，其以共享该结构域的蛋白质(Su(var)3-9、zeste强化子(enhancer of zeste)[E(Z)]和三胸基因(trithorax))命名。SET结构域包括约130个氨基酸。含SET结构域的甲基化酶家族包括SUV39H1、SET1、SET2、EZH2、RIZ1、SMYD3、SUV4-20H1、SET7/9和PR-SET7/SET8家族(综述于Dillon等人Genome Biol.6:227,2005中)。家族成员通常在SET结构域附近和在SET结构域内包括类似的序列基序。人类基因组编码超过50个含SET结构域的组蛋白甲基化酶，其中的任一者可用于本文所描述的试验。

EZH2为含SET结构域的人类甲基化酶的一个实例。EZH2与EED(胚胎外胚层发育；Embryonic Ectoderm Development)和SUZ12(zeste 12同源物的抑制因子)相关联以形成具有在赖氨酸27处使组蛋白H3三甲基化的能力的复合体PRC2(称为多梳家族抑制复合体2(Polycomb Group Repressive Complex 2))(Cao和Zhang,Mol.Cell 15:57-67,2004)。PRC2复合体还可包括RBAP46和RBAP48亚单元。

多个研究已显示EZH2的致癌活性。在细胞系实验中，EZH2的过表达诱导细胞侵袭、在软琼脂中的生长和活动性，而EZH2的基因敲除(knockdown)抑制细胞增殖和细胞侵袭(Kleer等人,2003,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100:11606-11611；Varambally等人,(2002),“The polycomb group protein EZH2is involved in progression of prostatecancer”，Nature 419,624-629)。已显示EZH2抑制若干肿瘤抑制因子的表达，其中包括E-钙黏素、DAB2IP和RUNX3。在异种移植物模型中，EZH2基因敲除抑制肿瘤生长和癌转移。最近，已显示在鼠类模型中向下调节EZH2阻断***癌症癌转移(Min等人,“An oncogene-tumorsuppressor cascade drives metastatic prostate cancer by coordinatelyactivating Ras and nuclear factor-kappaB”,Nat Med.2010年3月；16(3):286-94)。EZH2过表达与某些癌症(如乳癌)的侵袭性相关(Kleer等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100:11606-11611,2003)。近期研究还表明，***癌特异性致癌融合基因TMPRSS2-ERG通过直接活化EZH2来诱导抑制性表观遗传程序(Yu等人,“An Integrated Network of AndrogenReceptor,Polycomb,and TMPRSS2-ERG Gene Fusions in Prostate CancerProgression”,Cancer Cell.2010年5月18日；17(5):443-454)。

在一些实施方式中，本发明的化合物调节一种或多种参与表观遗传调控的酶的活性。在一些实施方式中，本发明的化合物调节组蛋白甲基修饰酶或其突变体的活性。在一些实施方式中，本发明的化合物调节EZH2活性。在一些实施方式中，本发明的化合物下调或抑制EZH2的活性。在一些实施方式中，本发明的化合物为EZH2活性的拮抗剂。

在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物适用于治疗与组蛋白甲基修饰酶相关的疾病和/或病症。相应地，在一些实施方式中，本发明提供一种调节与组蛋白甲基修饰酶相关的疾病和/或病症的方法。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与组蛋白甲基修饰酶相关的疾病和/或病症的个体的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。

在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物适用于治疗与EZH2的过表达相关的疾病和/或病症。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与EZH2的过表达相关的疾病和/或病症的患者的方法，其包含施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，以上方法另外包括测定个体是否过表达EZH2的预先步骤。

在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物适用于治疗与细胞增殖相关的疾病和/或病症。在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物适用于治疗与细胞循环或DNA修复的误调控相关的疾病和/或病症。在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物适用于治疗癌症。示例性癌症类型包括乳腺癌、***癌、结肠癌、肾细胞癌、多形性成胶质母细胞瘤癌、膀胱癌、黑色素瘤、支气管癌、淋巴瘤和肝癌。

EZH2缺失、误义和移码突变的研究表明EZH2在血液病如骨髓发育不良症候群(MDS)和骨髓恶性病中充当肿瘤抑制因子(Ernst等人,Nat Genet.2010年8月；42(8):722-6；Nikoloski等人,Nat Genet.2010年8月；42(8):665-7)。相应地，在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物适用于治疗与EZH2的突变体形式的存在相关的疾病和/或病症。在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物适用于治疗与Y641N EZH2的存在相关的疾病和/或病症。在一些实施方式中，与EZH2突变体形式的存在相关的疾病或病症为人类B细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，与Y641N EZH2的存在相关的疾病和/或病症为滤泡性淋巴瘤或弥漫性大B细胞性淋巴瘤。在一些实施方式中，本发明的化合物或组合物适用于治疗血液病，如骨髓发育不良症候群、白血病、贫血和细胞减少症。Sneeringer等人,“Coordinatedactivities of wild-type plus mutant EZH2drive tumor-associatedhypertrimethylation of lysine 27on histone H3(H3K27)in human B-celllymphomas”,Proceedings of the National Academy of Sciences,PNAS2010年11月15日在印刷前出版的早期版本。

在一些实施方式中，本发明提供一种降低个体中EZH2的活性的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种降低个体中野生型EZH2的活性的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种降低个体中EZH2突变体形式的活性的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种降低个体中EZH2突变体形式的活性的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤，其中EZH2突变体形式为Y641N EZH2。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与EZH2相关的疾病和/或病症的个体的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与野生型EZH2相关的疾病和/或病症的个体的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与EZH2突变体形式相关的疾病和/或病症的个体的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与EZH2突变体形式相关的疾病和/或病症的个体的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤，其中EZH2突变体形式为Y641N EZH2。在一些实施方式中，以上方法还包括测定个体是否表达EZH2突变体形式如Y641N EZH2的准备步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种降低有需要的个体中EZH2突变体形式如Y641N EZH2的活性的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗患有与EZH2突变体形式相关的疾病和/或病症的个体的方法，其包括施用式II的化合物或组合物的步骤。在一些实施方式中，以上方法还包括测定个体是否表达EZH2突变体形式如Y641N EZH2的准备步骤。在一些实施方式中，该测定通过测定与已知不表达EZH2突变体形式的个体相比个体的组蛋白H3Lys-27特异性三甲基化(H3K27me3)的水平是否已经增加来进行。

等效物

以下代表性实施例意图帮助说明本发明，而并不意图也不应解释为限制本发明的范围。实际上，除本文所示出与描述的那些外，来自该文件的全部内容(包括以下实施例和对本文所引用的科学和专利文献的参考文献)的本发明的各种修改和其许多其他实施例对本领域技术人员而言将变得显而易见。进一步应了解，那些所引用的参考文献的内容通过引用并入本文中以帮助说明现有技术的状态。

应了解对本文所描述的化合物制备而言，当使用反相HPLC来纯化化合物时，化合物可以酸加成盐形式存在。在一些实施方式中，化合物可以甲酸盐或单-、二-、或三-三氟乙酸盐形式存在。

进一步应了解本发明涵盖本文所描述的个别化合物。在其中所例示的个别化合物以盐形式(例如以三氟乙酸盐形式)被分离和/或表征的情况下，本发明涵盖该盐的游离碱，以及该游离碱的其他药学上可接受的盐。

以下实施例包含重要的其他信息、范例和指导，该类信息、范例和指导可适于本发明的实践的各种实施方式和其等效物。

用于制备以下所例示的化合物的步骤以及合成流程中的其他化合物/中间体可见于国际申请第PCT/US2013/025639号，其内容通过引用并入本文。

实施例

如在以下实施例中所示，在某些示例性实施方式中，根据以下通用步骤来制备化合物。应了解，尽管合成方法和流程示出本发明的某些化合物的合成，但以下方法和本领域普通技术人员已知的其他方法可应用于如本文所描述的所有化合物和这些化合物中的每一个的子类和种类。

除非另外说明，否则所有溶剂、化学品和试剂均为商购所得且无需纯化即使用。在CDCl₃、d₆-DMSO、CD₃OD或d₆-丙酮中于25℃下在OXFORD(Varian)上300MHz处以相对于作为内标的TMS而报告的化学位移(δ,ppm)获得¹H NMR光谱。用岛津(Shimadzu)LC-MS-2020***获得HPLC-MS色谱和光谱。用Yilite P270获得手性分析和纯化。

实施例1.化合物327与346和相关化合物与中间体的合成。

根据以下通用流程来制备此实施例的标题化合物和其他相关化合物。另外，在所指示的情况下，为了本发明的其他相关化合物和其中间体的合成公开了此流程的修改。

步骤1：(S,E)-4-(((叔丁基亚磺酰基)亚氨基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯：

(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺

向装有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中添加(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(20.46g，169mmol)、4-甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯(30g，141mmol)、DCM(300mL)和Ti(OEt)₄(59.0ml，281mmol)。溶液在室温下搅拌溶液3小时，随后用盐水(80mL)淬灭。搅拌溶液30分钟，随后过滤。用DCM洗涤滤饼，并将滤液置放在分液漏斗中且用水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机物层，过滤，并在真空中浓缩。粗残余物固化为标题化合物(29g，92mmol，产率65.1％)m/z 217。

根据概述于步骤1中的通用程序使用适当的起始物质和更改来制备下表中所示的中间体。

步骤2：4-((S)-1-((R或S)-1,1-二甲基乙基亚磺酰胺基)乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯：

向装有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中添加(S,E)-4-((叔丁基亚磺酰基亚氨基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(36.4g，115mmol)、DCM(400mL)，并在搅拌下在冰浴中将溶液冷却至0℃。向此溶液中添加MeMgBr(77ml，230mmol)(***中3M)，并在升温至室温的同时搅拌反应4小时。通过添加饱和NH₄Cl水溶液小心地淬灭反应。通过添加1N HCl来打碎固体。分离各层并用DCM萃取水相。用Na₂SO₄干燥合并的有机物相，过滤，并在真空中浓缩，得到标题化合物(29g，>9:1dr)，该标题化合物无需进一步纯化即在下一步骤中使用。

根据概述于步骤2中的通用程序使用适当的起始物质和更改来制备下表中所示的中间体。

步骤3：(R或S)-4-(1-氨基乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯：

向装有磁性搅拌棒的1L圆底烧瓶中添加溶解于MeOH(200mL)中的粗物质4-((S)-1-((S)-1,1-二甲基乙基亚磺酰胺基)乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(29g)，随后添加HCl于1,4-二噁烷中的4N溶液(24.06ml，96mmol)。随后在室温下搅拌所得溶液1小时。在真空中移除甲醇，得到黏稠油状物，用饱和NaHCO₃水溶液(约500mL)处理该油状物并用乙酸乙酯(2×500mL)萃取。合并该有机相，用MgSO₄干燥，过滤，随后在真空中移除溶剂，得到标题化合物(22g)，该化合物无需进一步纯化即使用。

根据概述于步骤3中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的中间体。

步骤4：2-(2-溴苯基)-3-氧代丁酸甲酯：

在圆底烧瓶中装入磁性搅拌棒和2-(2-溴苯基)乙酸甲酯(25g，109mmol)与THF(50mL)。将该溶液冷却至-78℃，随后滴加LiHMDS于THF中的1M溶液(218ml，218mmol)。在-78℃下搅拌反应30分钟，随后添加溶解于THF:DMF混合物(112mL THF，24mL DMF)中的1-(1H-咪唑-1-基)乙酮(14.42g，131mmol)。溶液搅拌1小时，随后用饱和NH₄Cl水溶液(约250mL)淬灭并用EtOAc稀释。分离各层，并用EtOAc(约2×250mL)萃取水相。用盐水洗涤合并的有机萃取物，用Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空中浓缩。通过硅胶层析使用乙酸乙酯/己烷(10:1)洗脱液脱液来纯化粗残余物，得到2-(2-溴苯基)-3-氧代丁酸甲酯(32.5g，102mmol，产率93％)。

根据概述于步骤4中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的中间体。

步骤5：(R或S,E和Z)-4-(1-(3-(2-溴苯基)-4-甲氧基-4-氧代丁-2-烯-2-基氨基)乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯：

向圆底烧瓶中添加(R或S)-4-(1-氨基乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(9.35g，40.9mmol)、EtOH(75mL)和2-(2-溴苯基)-3-氧代丁酸甲酯(7.40g，27.3mmol)(来自步骤4)。向该溶液中添加AcOH(1.563ml，27.3mmol)，并在85℃下加热反应过夜，随后冷却至室温并浓缩。通过硅胶层析(330g，100％己烷至己烷中的25％EA)来纯化粗残余物，得到标题化合物(6.45g，13.40mmol，产率49.1％)。

根据概述于步骤5中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的中间体。

步骤6：(R或S)-1-(1-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-羧酸甲酯：

在250mL圆底烧瓶中装入磁性搅拌棒、(R或S,Z)-4-(1-(3-(2-溴苯基)-4-甲氧基-4-氧代丁-2-烯-2-基氨基)乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.33g，6.92mmol)、RuPhos预催化剂II(甲磺酸根基(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯)(2-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II))(0.463g，0.553mmol)、二环己基(2',6'-二异丙氧基联苯-2-基)膦(0.387g，0.830mmol)、无水1,4-二噁烷(27.7ml，6.92mmol)和甲醇钠(0.561g，10.38mmol)。用氮气吹扫和回填反应混合物，并在搅拌下加热至100℃持续过夜，随后使之冷却至室温。用乙酸乙酯(约100ml)稀释反应，并经由硅藻土床过滤混合物。将滤液预吸附至硅胶(约30g)上，并通过硅胶层析(120g)使用乙酸乙酯/己烷(1:1)作为洗脱液来纯化，得到标题化合物(2.01g，4.77mmol，产率68.9％)。

根据概述于步骤6中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的中间体。

步骤7：(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-羧酸：

在1L圆底烧瓶中装入磁性搅拌棒、(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-羧酸甲酯(11.60g，38.5mmol)、乙醇(96ml，38.5mmol)和6N NaOH水溶液(64.1ml，385mmol)。在烧瓶上安装回流冷凝器，并加热至回流持续6小时，随后使之冷却至室温。在真空中移除挥发物，并将所得混合物倒入10％HCl(约300mL)中。形成沉淀，使用布氏漏斗通过真空过滤收集该沉淀。将滤饼用额外部分的水(约200mL)冲洗，收集，并在真空下干燥，得到呈灰白色固体的标题化合物(10.87g，35.9mmol，产率93％)。

根据概述于步骤7中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的中间体。

步骤8：(R或S)-4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基氨基甲酰基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(化合物327)

在250mL圆底烧瓶中装入磁性搅拌棒、(R或S)-1-(1-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-羧酸(1.950g，5.05mmol)、3-(氨基甲基)-4-甲氧基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(2.065g，10.09mmol)、DMF(25.2ml，5.05mmol)、Hunig's碱(3.52ml，20.18mmol)。将反应混合物冷却至0℃，并添加COMU(2.16g，5.05mmol)。使反应搅拌过夜至室温。用水稀释反应混合物并用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机萃取物，用MgSO₄干燥，过滤并在真空中浓缩，得到粗物质，使用MeOH/乙酸乙酯(1:5)作为洗脱液通过硅胶层析(120g)来纯化该粗物质，得到标题化合物(1.86g，3.29mmol，产率65.3％)。LCMS 537(M+1)^{+ 1}H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝11.83-11.71(m,1H),7.80(br.s.,1H),7.73(d,J＝7.6Hz,1H),7.62(d,J＝7.8Hz,1H),7.06(td,J＝7.1,14.4Hz,2H),6.21(s,1H),4.32(br.s.,2H),4.16(br.s.,1H),4.02(br.s.,1H),3.85(s,3H),3.75(br.s.,1H),2.70(br.s.,1H),2.58(s,3H),2.37(br.s.,1H),2.21(s,3H),1.90(d,J＝12.9Hz,1H),1.53(d,J＝6.9Hz,3H),1.35(s,10H),1.21(br.s.,1H),0.89(d,J＝8.7Hz,1H),0.67(d,J＝11.8Hz,1H)。

根据概述于步骤8中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的化合物。化合物的结构显示在图1中。

步骤9：(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺盐酸盐(化合物326)

在250mL圆底烧瓶中装入磁性搅拌棒、(R或S)-4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基氨基甲酰基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(化合物327)(1.850g，3.45mmol)、MeOH(13.79ml，3.45mmol)和HCl(2.59ml，10.34mmol)(二噁烷中4N)。使反应在室温下搅拌6小时，随后在真空中浓缩，得到标题化合物(1.65g，3.14mmol，产率91％)。LCMS 437(M+1)⁺。

根据概述于步骤9中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的化合物。该化合物的结构显示在图1中。

步骤10：(R或S)-4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基氨基甲酰基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-羧酸异丙酯(化合物346)

在250mL圆底烧瓶中装入磁性搅拌棒、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺盐酸盐(0.467g，0.987mmol)、DMF(2.468ml，0.987mmol)、THF(2.468ml，0.987mmol)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.638g，4.94mmol)。将反应冷却至0℃，并通过注射器滴加氯甲酸异丙酯(0.160ml，1.086mmol)。将反应搅拌2小时至室温，并随后用5N LiOH处理1小时以移除任何酰基化吡啶酮。该物质用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并过滤并在真空中浓缩。使用乙酸乙酯/MeOH(5:1)作为洗脱液通过硅胶层析(50g)来纯化所得物质，得到呈浅黄色固体状的纯标题化合物(0.300g，0.545mmol，产率55.2％)。LCMS 523(M+1)⁺；¹H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.59(br.s.,1H),7.74(d,J＝7.8Hz,1H),7.69(t,J＝4.9Hz,1H),7.62(d,J＝7.8Hz,1H),7.13-7.01(m,2H),6.15(s,1H),4.78-4.67(m,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),4.23-4.12(m,1H),4.12-4.02(m,1H),3.84(s,3H),3.82-3.74(m,1H),2.79-2.66(m,1H),2.58(s,3H),2.46-2.34(m,2H),2.20(s,3H),1.96-1.88(m,1H),1.58-1.46(m,4H),1.15(d,J＝6.0Hz,6H),0.95-0.89(m,1H),0.74-0.65(m,1H)。

根据概述于步骤10中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的化合物。化合物的结构显示在图1中。

实施例2.(R或S)-l-(1-(1-异丙基哌啶-4-基)乙基)-N-(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(化合物358)的合成

在25mL小瓶中装入磁性搅拌棒、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺盐酸盐、THF(2.114ml，0.211mmol)、丙-2-酮(0.061g，1.057mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(0.224g，1.057mmol)。使反应在室温下搅拌12小时。将反应在饱和NaHCO₃水溶液上反相淬灭，用乙酸乙酯萃取，并在真空中浓缩。所得物质用10mL MeOH中的7N氨处理，并在真空中浓缩以得到物质，使用DCM/MeOH/NH₄OH(90:1:0.1)作为洗脱液通过硅胶层析(10g)来纯化该物质，得到33mg(0.065mmol，产率31.0％)呈白色固体的标题化合物。LCMS 479(M+1)⁺；¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ11.59(s.,1H),7.64-7.82(m,2H),7.59(d,1H),6.95-7.17(m,2H),6.15(s,1H),4.32(d,2H),4.04-4.24(m,1H),3.84(σ,3H),2.77–2.93(μ,2H),2.68(δ,1H),2.60(σ,3H),2.20(σ,3H),2.08-2.15(μ,1H),1.92(δ,1H),1.83(βp,σ.,1H),1.54(σ,3H),1.27-1.43(μ,2H),0.91(τ,6H),0.71-0.67(μ,2H)。

根据概述于此实施例中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的化合物。化合物的结构显示在图1中。

实施例3.(R或S)-1-(1-(1-(2-氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(化合物356)的合成：

在25mL小瓶中装入磁性搅拌棒、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺盐酸盐(0.062g，0.131mmol)、K₂CO₃(0.072g，0.524mmol)、MeCN(0.655ml，0.131mmol)、DMF(0.262ml，0.131mmol)和1-溴-2-氟乙烷(0.020ml，0.262mmol)。加盖反应并在搅拌下加热至82℃持续4小时。使反应冷却至室温，过滤，并将滤液预吸附至硅胶上(12g)。使用DCM/MeOH/Et₃N(85:15:0.5)作为洗脱液通过SiO₂层析(25g)来纯化物质，得到呈灰白色固体的标题化合物(30mg，0.059mmol，产率45.1％)。LCMS 483(M+1)⁺；¹H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.59(s,1H),7.75-7.68(m,2H),7.60(d,1H)7.09-7.03(m,2H),6.15(s,1H)4.53-4.51(m,1H),4.42-4.39(m,1H),4.32(d,2H),4.24-4.2(m,1H),3.84(s,3H),2.98(br.d.,1H),2.70-2.49(m,4H),2.60(s,3H),2.20(s,3H),2.01(dt,1H),1.92-1.90(m,1H),1.75-1.71(m,1H),1.54(d,3H),1.38-1.36(m,1H),1.02-0.98(m,1H),0.7-0.66(br.d.,1H)。

根据概述于该实施例中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的化合物。化合物的结构显示在图1中。

实施例4.(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(1-嘧啶-2-基)哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(化合物361)的合成

向可再密封小瓶中添加2-氯嘧啶(185mg，1.611mmol)、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺盐酸盐(508mg，1.074mmol)和EtOH(8mL)。向该溶液中添加Et₃N(449μl，3.22mmol)。密封小瓶，并加热至100℃持续过夜。使溶液冷却至室温，并在真空中浓缩。通过硅胶层析(己烷:(3:2DCM:IPA))来纯化粗残余物，得到呈固体的标题化合物(357mg，0.694mmol，产率64.6％)。LCMS515(M+1)⁺；¹H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.60(s,1H),8.30(d,J＝4.7Hz,2H),7.76(d,J＝7.6Hz,1H),7.73-7.64(m,2H),7.14-7.01(m,2H),6.55(t,J＝4.7Hz,1H),6.15(s,1H),4.84-4.75(m,1H),4.57-4.47(m,1H),4.33(d,J＝4.2Hz,2H),4.22-4.11(m,1H),3.84(s,3H),2.92-2.81(m,1H),2.63-2.52(m,4H),2.20(s,3H),2.05-1.94(m,1H),1.61-1.49(m,4H),1.34-1.21(m,1H),1.04-0.91(m,1H),0.83-0.75(m,1H)。

根据概述于该实施例中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的化合物。化合物的结构显示在图1中。

实施例5.(R或S)-1-(1-(1-(2-羟基乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(化合物347)的合成

向装有磁性搅拌棒的密封管中添加(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(0.1g，0.229mmol)，添加DCM(3mL)，并将反应冷却至0℃。向被冷却的反应混合物中添加在反应小瓶中冷凝的环氧乙烷(约1mL)。使反应搅拌4小时以上至室温，随后在真空中浓缩，得到粗物质，使用乙酸乙酯/MeOH(4:1)作为洗脱液通过硅胶层析(12g)来纯化该粗物质，得到呈白色固体的标题化合物(50mg)。LCMS 481(M+1)⁺；¹H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ)δ11.58(s,1H),7.77-7.65(m,2H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H),7.11-6.99(m,2H),6.14(s,1H),4.54-4.44(m,1H),4.31(d,J＝5.1Hz,3H),4.13(dd,J＝7.1,10.3Hz,1H),3.83(s,3H),3.42(q,J＝6.0Hz,2H),2.93(br.s.,1H),2.71-2.56(m,4H),2.31(br.s.,2H),2.19(s,3H),2.03-1.83(m,2H),1.64(br.s.,1H),1.53(d,J＝6.9Hz,3H),1.32(d,J＝11.1Hz,1H),1.02(d,J＝10.3Hz,1H),0.65(d,J＝11.8Hz,1H)。

根据概述于该实施例中的通用程序使用适当的起始物质来制备下表中所示的化合物。化合物的结构显示在图1中。

实施例6.(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-6-苯基-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基-1H-吲哚-3-甲酰胺(化合物374)的合成

在25mL反应管中装入磁性搅拌棒、苯基硼酸(72.6mg，0.596mmol)、K₃PO₄(103mg，0.447mmol)、X-Phos预催化剂(氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)[2-(2-氨基乙基)苯基)]钯(II))(4.92mg，5.96μmol)，并密封小瓶。抽空/用氮气(3×)回填小瓶，随后添加6-氯-2-甲基-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-羧酸甲酯(化合物314)(100mg，0.298mmol)于1,4-二噁烷(1mL)中的溶液。随后在搅拌下将小瓶加热至100℃持续过夜。随后使小瓶冷却至室温，并在真空中浓缩反应。使用乙酸乙酯/己烷(4:1)洗脱液通过SiO₂层析(10g)来纯化粗残余物，呈白色固体的标题化合物(106mg，0.281mmol，产率94％)。LCMS 514(M+1)⁺；¹H NMR ¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝11.59(s,1H),7.98-7.84(m,2H),7.75-7.67(m,3H),7.47(t,J＝7.8Hz,2H),7.39(d,J＝8.5Hz,1H),7.35-7.27(m,1H),6.15(s,1H),4.35(d,J＝4.9Hz,2H),4.25-4.12(m,1H),3.93(d,J＝8.5Hz,1H),3.86-3.77(m,3H),3.67(d,J＝8.5Hz,1H),3.39-3.32(m,1H),3.10-3.00(m,1H),2.62(s,3H),2.21(s,3H),1.85(d,J＝10.0Hz,1H),1.63-1.49(m,4H),1.45-1.33(m,1H),1.20-0.99(m,1H),0.66(d,J＝12.0Hz,1H)。

实施例7.(R或S)-2-(4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基氨基甲酰基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-基)乙酸(化合物364)的合成

向圆底烧瓶中装入磁性搅拌棒，添加(R或S)-2-(4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基氨基甲酰基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-基)乙酸乙酯(化合物363)(69mg，0.132mmol)、THF(1.5mL)、MeOH(1.5mL)和水(0.75mL)。向该溶液中添加一水合氢氧化锂(5.54mg，0.132mmol)，并且在室温下搅拌反应1小时。在减压下移除有机物，并通过反相HPLC(水/MeCN)0→95％来纯化所得水溶液，得到标题化合物(66mg，0.108mmol，产率82％)。LCMS 514(M+1)⁺¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝11.67(s,1H),9.65(s,1H),7.84-7.68(m,2H),7.63(d,J＝7.4Hz,1H),7.14-7.03(m,2H),6.18(s,1H),4.33(d,J＝3.6Hz,2H),4.27-4.15(m,1H),4.04(br.s.,2H),3.85(s,3H),3.57(s,1H),3.35-3.23(m,1H),3.14-2.99(m,1H),2.86-2.74(m,1H),2.62(s,3H),2.21(s,3H),2.18-2.08(m,1H),1.75(s,1H),1.60-1.49(m,4H),1.46-1.33(m,1H),0.92-0.81(m,1H)。

实施例8.(R或S)-2-甲基-6-(吡啶-3-基)-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-乙基)-1H-吲哚-3-羧酸甲酯的合成

此中间体作为实施例1中所阐述的步骤7中的替代性起始物质用于合成本发明的其他化合物。

(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)-1H-吲哚-3-羧酸甲酯

向圆底烧瓶中添加Pd(OAc)₂(10.03mg，0.045mmol)、醋酸钾(219mg，2.233mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-双(1,3,2-二氧杂硼戊烷)(567mg，2.233mmol)和2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos)(85mg，0.179mmol)，并密封小瓶。向该容器中添加溶解于二噁烷(3.4mL)中的(R或S)-6-氯-2-甲基-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-羧酸甲酯(步骤6)(500mg，1.489mmol)，并抽空/用N₂(3×)回填反应，随后加热至100℃过夜。随后使反应冷却至室温，并用EtOAc稀释。经由硅藻土过滤反应，并浓缩滤液，得到标题化合物，该标题化合物无需进一步纯化即用于后续反应中。LCMS 428(M+1)⁺。

(R或S)-2-甲基-6-(吡啶-3-基)-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-羧酸甲酯：

向可再密封小瓶中添加K₂CO₃(206mg，1.488mmol)、PdCl₂(dppf)-CH₂Cl₂加合物(60.8mg，0.074mmol)，并密封小瓶。抽空/用N₂(3×)回填此小瓶，随后添加溶解于1,4-二噁烷(4mL)中的(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊环-2-基)-1H-吲哚-3-羧酸甲酯(318mg，0.744mmol)、3-溴吡啶(71.7μl，0.744mmol)和水(400μL)。抽空/用N₂(3×)回填反应，随后加热至100℃。将溶液冷却至室温，并用EtOAc稀释。过滤溶液，并在真空中浓缩。通过硅胶层析(10g，EtOAc/己烷(1:1))来纯化粗残余物，得到标题化合物(101mg，0.267mmol，产率35.9％)。LCMS 379(M+1)⁺。

实施例9.其他羧酸烷基酯中间体

以与在实施例1的步骤2中所阐述方法类似的方式使用适当的起始物质和反应物来合成以下羧酸烷基酯中间体。

实施例10.由羧酸中间体生产本发明的其他化合物。

以与实施例1的步骤4中所阐述方法类似的方式使用适当的起始物质来合成以下化合物。这些化合物的结构阐述于图1中。

实施例11. 1-(1-(l,4-二噁烷-2-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-羧酸甲酯的合成

标题化合物用作实施例1的步骤3中的替代性羧酸烷基酯起始物质。

步骤1：1-(1,4-二噁烷-2-基)乙酮：

于室温下在氮气氛围下向过氧化苯甲酰(20g，141mmol)于200mL 1,4-二噁烷的溶液中添加双乙酰(24.3g，282mmol)。在添加后，将混合物加热至回流并搅拌24小时。将反应混合物冷却至0℃。通过在0℃以下逐渐添加2N氢氧化钠来将pH值调整至约9，用2-甲氧基-2-甲基丙烷(10mL×3)萃取，并浓缩，得到呈黄色油状的1-(1,4-二噁烷-2-基)乙酮(13g，36％)，该产物无需纯化即直接用于下一步骤中。

步骤2：1-(1,4-二噁烷-2-基)乙胺：

在室温下向1-(1,4-二噁烷-2-基)乙酮(12g，92.2mmol)于1,2-二氯乙烷(100mL)的溶液中添加(4-甲氧基苯基)甲胺(25g，184.4mmol)。使混合物搅拌3小时，随后添加三乙酰氧基硼氢化钠(39g，184.4mmol)。在室温下使所得混合物搅拌48小时。通过添加水来淬灭反应混合物，用二氯甲烷(100mL×3)萃取。通过无水硫酸钠干燥合并的有机相，随后过滤。浓缩滤液，并通过硅胶上的柱层析(洗脱：二氯甲烷/甲醇100:1→50:1→0:1)来纯化，得到呈黄色固体的1-(1,4-二噁烷-2-基)-N-(4-甲氧基苄基)乙胺(16.4g，71％)。LCMS(M+H⁺)m/z:计算值251.15,实验值251.9。向1-(1,4-二噁烷-2-基)-N-(4-甲氧基苄基)乙胺(5g，19.9mmol)于无水甲醇(100mL)的溶液中添加10％钯/碳(240mg，2mmol)，随后用氢气(30psi)吹扫，在室温下使混合物搅拌过夜。过滤反应混合物，并浓缩滤液，得到呈棕色固体的标题化合物(2.5g，96％)。

根据以上概述的通用程序使用适当的起始物质和更改来制备下表中所示的胺中间体。

步骤3：(E)-3-((1-(1,4-二噁烷-2-基)乙基)亚氨基)-2-(2-溴苯基)丁酸甲酯：

向1-(1,4-二噁烷-2-基)乙胺(2.5g，19mmol)于甲醇(100mL)的溶液中添加2-(2-溴苯基)-3-氧代丁酸甲酯(5.4g，20mmol)和乙酸(1.8g，30mmol)。将所得反应物***升温至回流，并使之搅拌过夜。浓缩反应混合物，并通过硅胶上的柱层析来纯化(洗脱：二氯甲烷/甲醇50:1→20:1→5:1)，得到呈棕色固体的标题化合物(1g，14％)。LCMS(M+H⁺)m/z:计算值383.07,实验值384.9。

根据以上概述的通用程序使用适当的起始物质(例如在该实施例的步骤2中的表中所阐述的胺之一)和更改来制备下表中所示的亚氨基溴中间体。

步骤4：1-(1-(1,4-二噁烷-2-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-羧酸甲酯

向(E)-3-((1-(1,4-二噁烷-2-基)乙基)亚氨基)-2-(2-溴苯基)丁酸甲酯(400mg，1.1mmol)于二噁烷(3mL)的溶液中添加氯[2-(二环己基膦基)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基联苯][2-(2-氨基乙基)苯基]钯(II)(160mg，0.2mmol)、2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯(93mg，0.2mmol)和叔丁醇钠(192mg，2mmol)。在搅拌下于微波中将所得反应混合物加热至120℃持续30分钟。通过添加水来淬灭反应混合物，并用乙酸乙酯(25mL×3)萃取。通过无水硫酸钠干燥合并的有机相，随后过滤。浓缩滤液，并通过硅胶上的柱层析(洗脱：石油醚/乙酸酯10:1→5:1→2:1)来纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(282mg，89％)。LCMS(M+H⁺)m/z:计算值303.15,实验值303.9。

根据以上概述的通用程序使用适当的起始物质(例如显示在此实施例的步骤3中的表中的亚氨基溴中间体之一)和修改来制备下表中所示的化合物。

在本发明的某些化合物的合成中，还使用这些羧酸烷基酯作为实施例1的步骤3中的起始物质。

实施例12.手性分离化合物219以得到化合物223和224

通过超临界流体层析(SFC)(A：C₂H₅OH，B：NH₃·H₂O，A:B＝55:45AD柱)使N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(1-甲氧基丙-2-基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(200mg)(化合物219)经受手性层析，得到单独对映异构体223(峰1)和224(峰2)(各60mg)LCMS 398(M+1)⁺¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.69(d,J＝7.2Hz,1H),7.53(d,J＝7.6Hz,1H),7.12(m,2H),6.26(s,1H),4.80(m,1H),4.52(s,2H),3.99(m,4H),3.75(m,1H),3.20(s,3H),2.62(s,3H),2.31(s,3H),1.59(d,J＝7.2Hz,3H)。未测定各对映异构体的旋光度。

根据以上概述的通用手性层析程序来制备下表中所示的化合物。未测定所分离的对映异构体的旋光度，但指示洗脱峰(“峰1”或“峰2”)。各化合物的结构显示在图1中。

实施例1. 1-(2,3-二氢-1H-茚-1-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯的合成

在本发明的某些化合物的合成中，标题化合物作为实施例36的步骤3中的起始物质。

2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯

向含有N-乙酰基-N-(3-溴吡啶-2-基)乙酰胺(14.815g，57.6mmol)的500mL圆底烧瓶中添加碘化铜(I)(1.098g，5.76mmol)、L-脯氨酸(1.327g，11.53mmol)、碳酸铯(28.2g，86mmol)，随后添加乙酰乙酸叔丁酯(11.47ml，69.2mmol)和二噁烷(100mL)。抽真空/用N₂3×吹扫反应，随后适配隔膜和N₂入口，并在70℃下加热过夜。通过用硅藻土过滤来移除无机固体，并用100mL EtOAc洗涤滤饼。浓缩该溶液，并将残余物分配于250mL盐水与250mLEtOAc之间。进一步用EtOAc萃取水层(2×250mL)，并用Na₂SO₄干燥合并的有机层，过滤，浓缩，并通过CC使用1:1EtOAc:己烷作为洗脱液来纯化，得到2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(2.7g，20.2％)。LRMS(M+H⁺)m/z:计算值233.28；实验值233.1。

1-(2,3-二氢-1H-茚-1-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯

在0℃下于氮气氛围下在干燥THF(10mL)中搅拌2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸乙基叔丁酯(100mg，0.74mmol)、2,3-二氢-1H-茚-1-醇(176mg，0.74mmol)、PPh₃(195mg，1.49mmol)的溶液。在5分钟内向该混合物中滴加DIAD(150mg，1.48mmol)，并在室温下搅拌反应16小时。用盐水洗涤混合物，干燥并浓缩，得到粗产物。通过硅胶层析(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)来纯化粗产物，得到1-(2,3-二氢-1H-茚-1-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(150mg，60％)。

根据以上概述的通用程序使用适当的起始物质和修改来制备下表中所示的化合物。

在本发明的某些化合物的合成中，使用以上羧酸烷基酯中的每一个作为实施例1的步骤3中的起始物质。

实施例13.分离的N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-l,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺非对映异构体(化合物261、266、267和302)的合成

步骤1：2-甲基-1-(3-氧代丁-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯

向2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(5.0g，21.53mmol)于CH₃CN(50mL)的溶液中添加Cs₂CO₃(21.0g，64.58mmol)、碘化钾(3.57g，21.53mmol)。在27℃下搅拌混合物30分钟。随后添加3-氯丁-2-酮(2.75g，25.83mmol)，并在70℃下搅拌混合物12小时。过滤混合物，并浓缩滤液。通过柱(洗脱：石油醚:乙酸乙酯＝50:1)来纯化残余物，得到呈黄绿色油状的2-甲基-1-(3-氧代丁-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(3.23g，产率50％)。LCMS(M+H⁺)m/z:计算值303.37；实验值302.9。1H NMR(400MHz,CDC1₃):8.32-8.30(m,1H),8.25-8.23(m,1H),7.17-7.14(m,1H),5.50-5.44(m,1H),2.71(s,3H),1.96(s,3H),1.65-1.67(d,3H),1.64(s,9H)。

步骤2：1-(3-羟基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯

在0℃下向2-甲基-1-(3-氧代丁-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(3.1g，10.25mmol)于甲醇(30mL)的溶液中添加硼氢化钠(0.30g，8.2mmol)。在30分钟后，在0℃下添加另一批次的硼氢化钠(0.30g，8.2mmol)。在约2小时后反应完成之后，极小心地逐滴添加水(30mL)以淬灭反应。用CH₂Cl₂萃取混合物。用Na₂SO₄干燥萃取物，过滤，并在真空下浓缩，得到呈黄色固体的1-(3-羟基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(3.0g，产率96％)。LCMS(M+H⁺)m/z:计算值305.38；实验值304.9。1H NMR(400MHz,CDCl₃):8.31-8.29(m,1H),8.13-8.12(m,1H),7.11-7.07(m,1H),4.46-4.43(m,1H),4.12(m,1H),2.73(s,3H),1.58(s,9H),1.51-1.49(d,3H),0.92-0.91(d,3H)。

步骤3：1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯

向干燥THF(20mL)中添加NaH(矿物油中60％，2.37g，59.14mmol)。随后在27℃下搅拌混合物20分钟，随后添加1-(3-羟基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(3.0g，9.86mmol)。在27℃下搅拌混合物1小时，随后添加CH₃I(13.99g，98.6mmol)。在27℃下搅拌混合物12小时，并随后冷却至0℃。添加饱和NH₄Cl，并用CH₂Cl₂萃取。用硫酸钠干燥萃取物，过滤并浓缩，得到呈黄色油状的1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(3.2g，产率100％)。LCMS(M+H⁺)m/z:计算值319.41；实验值318.9。

步骤4：1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸

向预冷却的1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯(3.0g，9.42mmol)于CH₂C1₂(20mL)中的溶液中逐滴添加三氟乙酸(20mL)。在27℃下搅拌溶液1.5小时。在27℃下于真空下移除溶剂。残余物无需纯化即用于下一步骤。LCMS(M+H+)m/z:计算值263.30；实验值262.9。

步骤5：N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺

向1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧酸(2.4g，9.15mmol)于DMF(30mL)中的溶液中添加TEA(4.2g，41.50mmol)、3-(氨基甲基)-4-甲氧基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(2.1g，12.81mmol)。在27℃下搅拌10分钟之后，冷却混合物，并添加HATU(5.56g，14.64mmol)。在27℃下搅拌混合物72小时，仍存在30％起始物质。随后在80℃下加热混合物5小时。用盐水(100mL)稀释溶液，并用CH₂Cl₂(100mL*3)萃取。合并萃取物并用Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并通过闪柱(洗脱液：二氯甲烷:甲醇＝95:5)来纯化残余物，得到N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(3.6g，产率95％)。

步骤6：N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺的分离：异构体(化合物261、266、267和302)：

通过制备型HPLC(条件：柱：SHIMADZU LC-8A，250*50mm*10μm；流动相A：含0.2％甲酸的水；流动相B：MeCN；柱温度：30℃；梯度：B/A 10％-50％)来纯化来自步骤5的异构体混合物N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺，得到主要异构体对(化合物261与化合物266组合)(1.0g，纯度98.8％)和次要异构体对(化合物267与化合物302组合)(180mg，纯度63％)。通过SFC(条件：柱：Chiralpak AD 250*30mm*5μm；流动相A：超临界CO₂；流动相B：IPA+NH₃·H₂O；梯度：B/A：75:25)来个别地分离所得异构体对，得到以下个别单一化合物：

化合物261，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(主要异构体对；峰1)：¹H NMR(400MHz,CDC1₃):δ8.173-8.157(m,1H),8.140-8.116(m,1H),7.582-7.555(m,1H),6.968-6.936(m,1H),5.927(s,1H),4.707-4.609(m,2H),4.348(s,1H),3.892(s,3H),2.869(s,3H),2.788(s,3H),2.173(s,3H),1.644-1.627(d,3H),1.263-1.249(d,3H)。

化合物266，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(主要异构体对；峰2)：¹H NMR(400MHz,CDC1₃):δ8.179-8.163(m,1H),8.143-8.120(m,1H),7.558-7.531(m,1H),6.986-6.954(m,1H),5.931(s,1H),4.702-4.605(m,2H),3.897(s,3H),2.892(s,3H),2.789(s,3H),2.189(s,3H),1.647-1.629(d,3H),1.267-1.252(d,3H)。

化合物267，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(次要异构体对；峰1)：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.174-8.162(d,1H),8.111-8.094(d,1H),7.551-7.526(m,1H),6.993-6.961(m,1H),5.935(s,1H),4.683-4.579(m,2H),3.887(s,3H),3.442(s,3H),2.753(s,3H),2.194(s,3H),1.695-1.678(d,3H),0.781-0.768(d,3H)。

化合物302，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(次要异构体对；峰2)：¹HNMR(400MHz,CDC1₃):δ8.177-8.166(d,1H),8.122-8.104(d,1H),7.587-7.562(m,1H),6.984-6.952(m,1H),5.933(s,1H),4.698-4.591(m,2H),4.426(s,2H),3.983(s,3H),3.448(s,3H),2.764(s,3H),2.180(s,3H),1.701-1.684(d,3H),0.786-0.772(d,3H)。

实施例14.(±)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酰胺的合成

步骤1：1-(3-甲氧基苯基)乙醇

在-78℃下向3-氨基-4-甲基吡啶(7g，64.8mmol)于无水THF(200mL)的搅拌溶液中在20分钟内逐滴添加仲丁基锂(150mL，环己烷中的1.3M，194mmol)。将溶液升温至室温并搅拌3小时。在-78℃下向反应中逐滴添加乙酸乙酯(2.3g，25.9mmol)，并在相同温度下搅拌混合物2小时。向反应中在10分钟内逐滴添加甲醇(50mL)。将混合物升温至室温并搅拌1小时。添加半饱和NH₄C1(250mL)。用EA萃取混合物。用盐水洗涤合并的有机层，干燥并浓缩，得到粗产物。通过硅胶层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1)来纯化粗产物，得到2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(2.5g，73.5％)。

步骤2：2,2,2-三氯-1-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)乙酮：

在室温下向2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(2.5g，18.9mmol)和氯化铝(5g，37.8mmol)于DCM(100mL)的搅拌溶液中在0.5小时内逐滴添加三氯乙酰氯(4.1g，22.7mmol)至反应中。在搅拌2小时之后，将反应冷却至0℃，并用水(100mL)淬灭。通过过滤来分离所得沉淀，得到2,2,2-三氯-1-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)乙酮，其无需进一步纯化即用于下一步骤。假定产率100％。(5.24g)。

步骤3：2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸甲酯：

2,2,2-三氯-1-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)乙酮(5.24g，18.9mmol)和KOH(1.2g，20.9mmol)于MeOH(100mL)的混合物在室温下搅拌16小时。浓缩反应混合物以移除MeOH，将残余物分配于EA与水之间。用盐水洗涤有机层，干燥并浓缩，得到2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸甲酯(3g，83％)。

步骤4：2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸甲酯：

2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸甲酯(550mg，2.89mmol)和氢化钠(200mg，4.34mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中的混合物在室温下搅拌0.5小时，随后添加(1-溴乙基)苯(589mg，3.18mmol)。在室温下搅拌混合物3小时。将反应混合物倒入饱和NH₄Cl中，并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并浓缩，得到残余物。通过层析(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)来纯化残余物，得到2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸甲酯(800mg，94％)。

步骤5：2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸：

2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸甲酯(800mg，2.72mmol)和KOH(1.5g，27.2mmol)于(15mL)和水(5mL)中的混合物回流2小时。通过10％HCl将混合物PH值调节至2，并用EA萃取。用盐水洗涤合并的有机层，干燥并浓缩，得到粗产物。粗产物无需进一步纯化即用于下一步骤中。产率100％。(760mg)。

步骤6：(±)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酰胺(化合物203)：

在室温下搅拌2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-羧酸(280mg，1.0mmol)添加HATU(456mg，1.2mmol)、TEA(1g，10mmol)和3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(182mg，1.2mmol)于无水二氯甲烷(30mL)中的混合物16小时。向反应混合物添加水(10mL)，用二氯甲烷(30mL×2)萃取。合并有机层并浓缩，得到残余物。残余物自MeCN重结晶，得到呈灰白色固体的化合物N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酰胺(80mg，21.6％)。LRMS(M+H)m/z:计算值414.21；实验值414。¹H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ:8.84(s,1H),8.16(d,J＝7.6Hz,1H),8.03(d,J＝6.8Hz,1H),7.44-7.37(m,5H),6.09(s,1H),6.01-5.99(m,1H),4.49(s,2H),2.73(s,3H),2.38(s,3H),2.22(s,3H),2.06(d,J＝7.2Hz,3H)。

根据概述于此实施例中的通用程序使用适当的起始物质和修改来制备下表中所示的化合物。结构显示在图1中。

实施例15.用于合成本发明的其他化合物的通用程序

通用程序A：吲哚烷基化

向冷却(0℃)的NH吲哚酯(1当量)于N,N-二甲基甲酰胺(制得0.4M浓度的体积)的溶液中添加氢化钠(60％w/w，相对于吲哚1.1当量)。搅拌所得混合物15分钟。随后添加RX(2当量)，并使反应升温至室温。将反应维持在环境温度下12小时。在搅拌下将反应混合物倒入饱和氯化铵溶液(100mL)中。用乙酸乙酯(200mL×2)萃取混合物，并用盐水洗涤合并的有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，通过柱层析(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝20:1)来纯化该粗产物，得到所需的烷基化吲哚酯产物。

通用程序B：烷基化吲哚酯的皂化

向烷基化吲哚酯(1当量)于四氢呋喃:甲醇:水(2.5:5:1，制得0.05M浓度的体积)的溶液中添加氢氧化锂(4当量)。在60℃下搅拌所得反应混合物48小时。在真空中浓缩混合物。随后用水(40mL)稀释残余物，并用1N氯化氢缓慢酸化至pH值＝4-5。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取混合物。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到吲哚酸粗品，该粗品无需额外纯化即用于后续步骤中。

通用程序C：酰胺键形成

向吲哚酸(1当量)于二氯甲烷(制得0.05M浓度的体积)中的溶液中添加1-羟基苯并***(1.5当量)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.5当量)和三乙胺(3当量)。在室温下搅拌所得混合物30分钟。随后添加吡啶酮胺(1.2当量)，并在室温下搅拌所得混合物16小时。向混合物中添加水(50mL)。用二氯甲烷(100mL×2)萃取混合物。在真空中浓缩有机层，得到粗产物，通过柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝20:1)来纯化该粗产物，得到目标化合物。

通用程序D：手性层析

通过正相HPLC或SFC(超临界二氧化碳流体层析)来实现手性化合物的分离。所分离的化合物通常>95％ee。未测定手性中心的绝对构型。

通用程序L：磺酰化

在18℃下于N₂下向手性胺(1当量)于二氯甲烷(制得0.1M浓度的体积)中的溶液中添加三乙胺(4当量)。将反应冷却至0℃，并添加甲磺酰氯(1.5当量)。在0℃下搅拌反应1小时。随后在真空中浓缩混合物，并添加甲醇和碳酸钾，并再搅拌反应1小时。过滤混合物，并通过制备型HPLC纯化粗产物。

下表列举本发明的化合物和以上通用方法中的哪一个用于其合成。此类化合物的结构阐述于图1中。

实施例16.使用EZH2测量抑制剂的IC₅₀

EZH2分析：通过在放射性标记的酶辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(³H SAM)(PerkinElmer)存在下将rPRC2与生物素标记的寡核小体底物混合在一起并监测氚代甲基自³H SAM至组蛋白赖氨酸残基的酶促介导转移来进行分析。通过首先在被抗生蛋白链菌素(SAV)涂布的闪烁板(FlashPlates)(Perkin Elmer)中捕获生物素标记的寡核小体，继而进行洗涤步骤以移除未反应的³H SAM，随后在TopCount NXT 384孔板闪烁计数器(Perkin Elmer)上计数来测量所得氚代甲基组蛋白产物的量。EZH2的最终分析条件如下：50mM Tris缓冲液(pH值8.5)、1mM DTT、69μM Brij-35洗涤剂、5.0mM MgCl₂、0.1mg/mL BSA、0.2μM ³H SAM、0.2μM生物素标记的寡核小体、3.6μM H3K27me3肽和2nM EZH2。

如下获得化合物IC₅₀测量值：首先在100％DMSO中将化合物溶解为10mM储备溶液。通过在384孔板(Echo；Labcyte)的10个孔中分配变化量的10mM化合物溶液，随后使用纯DMSO回填该类孔以保证所有孔均具有相同量的DMSO来产生十点剂量反应曲线。使用Multidrop Combi(ThermoFisher)向分析板的各孔中添加12.5μL体积的分析缓冲液中的HMT酶、H3K27me3肽和寡核小体底物。化合物与酶一起预培育20分钟，继而通过添加12.5μL的分析缓冲液中的³H SAM(最终体积＝25μL)来引发甲基转移酶反应。化合物的最终浓度介于最高预设浓度80μM至十个2倍稀释步骤中的0.16μM的范围内。反应进行60分钟，并用每孔20μL 1.96mM SAH、50mM Tris(pH 8.5)、200mM EDTA淬灭。将停止的反应转移至被SAV涂布的闪烁板(Perkin Elmer)上，培育120分钟，用洗板机洗涤，随后在TopCount NXT(1.0分钟/孔)上读取以测量在反应期间形成的甲基组蛋白产物的量。将甲基组蛋白产物的量与在0％和100％抑制对照孔中形成的产物量相比，计算得到在各种浓度的个别化合物存在下的％抑制。使用4参数拟合非线性曲线拟合软件包(XLFIT，部分数据库套装，ActivityBase(IDBS))来计算IC₅₀，其中四个参数为IC₅₀、希尔斜率(Hill slope)、预过渡基线(0％INH)和后过渡基线(100％INH)；其中预设后两个参数分别固定为0和100％。

如上所述使用重构H3K27Me2寡核小体作为底物对Y641N EZH2进行分析。

表2显示所选本发明化合物在EZH2和Y641N EZH2活性抑制分析中的活性。IC₅₀值报告如下：“A”指示IC₅₀值小于100nM；“B”指示IC₅₀值为100nM至1μM；“C”指示IC₅₀值对各酶大于1μM且小于10μM；“D”指示IC₅₀值对各酶大于10μM；且「*(XμM)」指示在所测试化合物的最高浓度(即XμM)下未观察到抑制。

表2.式I化合物对EZH2和Y641N EZH2突变体酶的IC₅₀值

实施例17.抑制剂在海拉细胞分析(HeLa Cell Assays)中的EC50测量

H3K27me3 MSD海拉分析。对胰蛋白酶化海拉细胞计数并在10％DMEM(LifeTechnologies，目录#10569)中稀释至5000个细胞/75微升。将75μL细胞置放在96孔平底板的各孔中并在37℃下培育4小时。向细胞中添加25μL测试化合物(在各种浓度下)，并在37℃下继续培育96小时。随后移除培养基，并用冰冷PBS冲洗细胞一次。向各孔中添加40μL冰冷MSD缓冲液AT(10mM HEPES(pH 7.9)、5mM MgCl₂、0.25M蔗糖、Benzonase(1:10000)、1％Triton X-100，补充有新鲜1×蛋白酶抑制剂混合液和1mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF))，并将板置放于冰上30分钟。随后向各孔中添加10μL 5M NaCl，并在冰上继续再培育15分钟。上下吸液以使各孔中的材料悬浮，随后转移至新的96孔板上。用补充有新鲜1×蛋白酶抑制剂混合液和1mM AEBSF(“无盐无洗涤剂缓冲液”)的150μL冰冷20mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA、1mM EGTA冲洗空的孔，并转移至新板中的各个孔中。随后向溶胞物的各孔中添加300μL无盐无洗涤剂缓冲液，并将板在-80℃下冷冻。

在同一天，用30微升/孔的总H3捕捉抗体(Millipore，目录#MAB3422)以PBS中1μg/mL浓度涂布适当数量的MSD标准结合96孔板。首先通过在板侧面温和轻拍，随后通过在1000rpm下震荡板数分钟来使抗体溶液均匀分布。被抗体涂布的板在4℃下储存过夜。

次日，将溶胞物解冻至室温。用TBS-T(Tris缓冲生理食盐水(Fisher Scientific，目录#BP2471-1)+0.2％Tween-20)洗涤被抗体涂布的MSD板3次。向各孔中添加150μL TBS-T中的5％阻断剂A。覆盖孔，并在震荡器上于室温下震荡一小时。重复阻断剂A步骤第二次。在移除阻断剂之后，将25μL细胞溶胞物转移至被各抗体涂布的孔中。在室温下震荡板2小时，移除溶胞物并再次用TBS-T中的阻断剂A洗涤板。向各孔中添加25μL适当新鲜制备的抗体混合物(包括一级和二级抗体两者)，并在室温下震荡板1小时。所用抗体混合物为在下表中示出的那些混合物的一种(或两种)：

两种H3抗体均自Cell Signalling(目录#4499和9733)获得。山羊抗兔抗体自Meso-Scale Discovery(目录#R32AB-1)获得。

随后移除抗体混合物，并用阻断剂A洗涤孔。随后向各孔中添加150μL新鲜制备的1×MSD读取缓冲液(Meso-Scale Discovery；目录#R927C-2)，并在MSD Sector 2400读板仪上读取板。

使用分析辅助(Assay Assistant)(Constellation Pharmaceuticals公司内部产品)和Activity Base(IDBS有限公司,Surrey,UK)模板来分析数据。将数据文件导入分析辅助，并指定分析条件。产生独特分析ID，并将数据文件输出至Activity Base。在ActivityBase上产生分析模板以分别测量H3K27me3标记的剂量依赖性抑制和细胞活力。DMSO孔的读数用于标准化数据。使用Activity base软件模型205(IDBS有限公司,Surrey,UK)来拟合所得曲线。使用SARview(IDBS有限公司,Surrey,UK)来检查数据质量，验证并整合为excel格式。

H3K27me3 Alpha海拉分析(AlphaLISA)。在双重复384孔被组织培养物处理的板(目录#781080；Greiner Bio One；Monroe,North Carolina)中接种十个不同剂量的各测试化合物(以3倍稀释系列)。在培养物中生长的海拉细胞被胰蛋白酶化并使用细胞计数器(目录#C10281；Life Technologies,Grand Island,NY)计数。在10％DMEM(目录#10569-010Life Technologies,Grand Island,NY)中将细胞稀释至每毫升67,000个细胞，并使用Biotek MicroFlo^TM选择分配器(BioTek Instruments公司Vermont,USA)将15μL(1,000个细胞)接种至384孔板的各孔中。在37℃/5％CO₂下培育板72小时。处理针对海拉分析的双重复板之一，另一者针对活力。

向针对AlphaLISA被处理的板中添加每孔5μL细胞-组蛋白溶解缓冲液(1×)(目录#AL009F1Perkin Elmer；Waltham,MA)，并于室温下在板震荡器(型号#4625-Q ThermoScientific；Waltham,MA)上低速培育板30分钟。随后，每孔添加10μL组蛋白萃取缓冲液(目录#AL009F2；Perkin Elmer；Waltham,MA)，并于室温下在板震荡器上低速进一步培育板20分钟。随后向各孔中添加每孔10μL的抗K27me3受体珠加生物素标记的抗组蛋白H3(C封端)抗体(最终稀释至3nM)的5×混合物(目录#AL118Perkin Elmer；Waltham,MA)。用自所提供的10×储备液稀释而产生的1×组蛋白检测缓冲液(目录#AL009F3Perkin；Waltham,MA)稀释受体珠，随后稀释抗组蛋白H3。用铝板密封物密封板，并在23℃下培育60分钟。随后添加10μL抗生蛋白链菌素供体珠(目录#6760002Perkin Elmer；Waltham,MA)的5×溶液(在1×组蛋白检测缓冲液中最终为20μg/mL)，用铝板密封物密封板，并在23℃下培育30分钟。随后使用EnVision-α读取器(型号#2104Perkin Elmer；Waltham,MA)来读取板。

通过向具有细胞和培养基的各孔中添加15μL Cell Titer Glo((目录#G7571Promega Madison,WI)来分析细胞活力。于室温下在板震荡器上低速培育板15-20分钟。随后使用EnVision-Alpha读取器(型号#2104Perkin Elmer；Waltham,MA)来读取板。

使用分析辅助(Constellation Pharmaceuticals公司内部产品)和ActivityBase(IDBS有限公司,Surrey,UK)模板来分析来自两个分析的数据。将数据文件导入分析辅助，并指定分析条件。产生独特分析ID，并将数据文件输出至Activity Base。在ActivityBase上产生分析模板以分别测量H3K27me3标记的剂量依赖性抑制和细胞活力。DMSO孔的读数用于标准化数据。使用Activity base软件模型205(IDBS有限公司,Surrey,UK)来拟合所得曲线。使用SARview(IDBS有限公司,Surrey,UK)来检查数据质量，验证并整合为excel格式。

表3显示所选本发明化合物在上述两个不同海拉细胞分析中的活性。EC₅₀值报告如下：“A”指示EC₅₀值小于400nM；“B”指示EC₅₀值为400nM至2μM；“C”指示EC₅₀值对各酶大于2μM且小于10μM；“D”指示EC₅₀值对各酶大于10μM；且“*(XμM)”指示在所测试化合物的最高浓度(即XμM)下未观察到抑制。

表3.所选本发明化合物在表达H3k27突变体EZH2的海拉细胞中的Ec50值

实施例18.肿瘤生长抑制分析

化合物362和365在雌性CB-17SCID小鼠中的皮下Karpas422人类淋巴瘤异种移植物模型中的抗肿瘤功效如下。

动物

物种：小家鼠(Mus Musculus)

品系：CB-17SCID小鼠

年龄：6-8周

性别：雌性

体重：18-22g

动物数量：50只小鼠加备用

动物供货商：Shanghai SLAC Laboratory Animal有限公司

细胞培养

在37℃下于空气中5％CO₂的氛围中维持试管内Karpas422肿瘤细胞为补充有10％热不活化胎牛血清的RPMI1640培养基中的悬浮培养物。例行每周两次继代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期中生长的细胞并计数以用于肿瘤接种。

肿瘤接种

在各小鼠右翼皮下接种0.2ml PBS与基质胶(1:1)中的Karpas422肿瘤细胞(5×10⁶)以用于肿瘤生成。肿瘤接种之后第23日为治疗开始之后第0日，此时平均肿瘤尺寸达到约300mm³。各组由10只携带肿瘤的小鼠组成。

肿瘤测量

使用卡尺在二维中每周三次量测肿瘤尺寸，并以mm³为单位使用公式：V＝0.536a×b²表示体积，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。随后使用肿瘤尺寸来计算T/C值。T/C值(以百分比为单位)为抗肿瘤有效性的指示；T和C分别为在既定日的治疗组和对照组的平均体积。对各组使用公式：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)×100来计算TGI；Ti为在既定日的治疗组的平均肿瘤体积；T0为在治疗开始日的治疗组的平均肿瘤体积；Vi为在与Ti同一日的媒剂对照组的平均肿瘤体积，且V0为在治疗开始日的媒剂组的平均肿瘤体积。

实验终点和样品收集

1).在治疗开始之后第16日给药6小时后在EPZ-6438组中收集血浆、肿瘤和肌肉。在治疗开始之后第25日给药1小时后在媒剂、CPI-524369、CPI-524416和CPI-591780组中收集血浆、肿瘤和肌肉。2).全部血液均在使用EDTA-K2作为抗凝剂的情况下自各动物获得。将血浆分为两个部分。第一部分用于PK分析；第二部分冷冻备用。3).肿瘤分为三个部分。第一部分快速冷冻用于PK；第二部分快速冷冻用于PD分析；第三部分冷冻备用。4).肌肉分为两个部分。第一部分快速冷冻用于PK；第二部分冷冻备用。

肿瘤生长抑制分析

表4.基于在治疗开始之后第25日或第16日的肿瘤体积测量值而计算的karpass422异种移植物模型中化合物362和365的肿瘤生长抑制计算值

附注：a.平均值±SEM，b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。对于被视为具有抗肿瘤活性的测试物品而言，T/C必须为0.5或0.5以下。d.统计学显著性差异(单因子ANOVA)，相对媒剂：***p<0.001。

Claims (12)

1.一种具有结构式(II)的化合物，

或其药学上可接受的盐，其中：

A为CH或N；

R^1a是选自-C₁-C₂烷基和-O-(C₁-C₂烷基)，其中R^1a任选地被一个或多个氟取代；

R^4a是1-卤代(C₁-C₃)烷基-哌啶-4-基；且

R¹³是选自氢、卤代、苯基、吡啶基和-O-(C₁-C₄烷基)。

2.如权利要求1所述的化合物，其中R^1a是选自-OCH₃、-CH₃、-OCHF₂和-CH₂CH₃。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其中R^4a选自1-(2-氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2,2-二氟乙基)-哌啶-4-基和1-(2,2,2-三氟乙基)-哌啶-4-基。

4.如权利要求1-3任一项所述的化合物，其中R¹³是选自氢、氯、氟、-OCH(CH₃)₂、苯基和吡啶-2-基。

5.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺：

或其药学上可接受的盐。

6.如权利要求5所述的化合物，其中所述化合物为R-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺：

或其药学上可接受的盐。

7.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为1-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺：

或其药学上可接受的盐。

8.如权利要求7所述的化合物，其中所述化合物为R-1-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺：

或其药学上可接受的盐。

9.一种药物组合物，其包含如权利要求1-8任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体。

10.如权利要求1-8任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗与细胞增殖相关的疾病或病症的药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述疾病为癌症。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述癌症是选自乳腺癌、***癌、结肠癌、肾细胞癌、多形性成胶质母细胞瘤癌、膀胱癌、黑色素瘤、支气管癌、淋巴瘤和肝癌。