CN104975049A - 一种生物法合成(r)-(-)-扁桃酸的方法 - Google Patents

一种生物法合成(r)-(-)-扁桃酸的方法 Download PDF

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范海洋
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Abstract

本发明提供了一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，其包括如下步骤：将扁桃腈流加入转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸；该转化液中包括含有J2315腈水解酶的E.coli工程菌；本发明由于采用了J2315腈水解酶和流加扁桃腈相结合的方法制备(R)‐(‐)‐扁桃酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且单批次反应(R)‐(‐)‐扁桃酸的积累浓度高达2.9M，ee值大于97％，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种生物法合成(R)-(-)-扁桃酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法。
背景技术
扁桃酸是极其重要的手性药物中间体，具有消炎和杀菌的双重作用。目前，在国际市场上，对扁桃酸的需求约以年均10％左右的速度增长，尤其是(R)‐(‐)‐扁桃酸早已成为国内外急需的产品。
(R)‐(‐)‐扁桃酸及其衍生物是合成环扁桃酯、羟苄唑、匹莫林等血管扩张剂、杀菌剂、镇痉剂的重要药物中间体，且具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由(R)‐(‐)‐扁桃酸拆分。
目前，常见的制备扁桃酸旋光性单体的方法大致有：(1)物理化学法，其中包括不对称合成法、光学异构体拆分法和层析法等，不对称合成法可直接化学合成扁桃酸的异构体，拆分法先合成外消旋体扁桃酸，再拆分获得手性扁桃酸；(2)生物合成法，国外文献报道制备手性扁桃酸大致有3种方法：
1、以苯甲醛和氢氰酸为原料，先制得扁桃腈，后在腈水解酶的作用下，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸，但是该方法仅是(R)‐(‐)‐扁桃酸生产的一种研究方向，由于受限于已知的腈水解酶活力较低，目前还达不到工业化生产的要求。
2、先合成扁桃酸外消旋体，而后酯化或氨解获得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺，再在酯化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到单一对映体扁桃酸，但是该方法同样仅是(R)‐(‐)‐扁桃酸生产的一种研究方向，目前受限于已知的酯化水解酶及酰胺水解酶活力较低，立体选择型较差，得到的(R)‐(‐)‐扁桃酸纯度低，目前也达不到工业应用的要求。
3、以苯乙酮酸为底物直接利用具有氧化还原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，但是该方法也仅是一种研究方向，同样受限于目前已报道的酶活力低等问题，工业化应用困难。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，该方法的反应条件温和，并且原料扁桃腈具有较高的转化率。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，其包括如下步骤：将扁桃腈流加入转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到(R)‐(‐)‐ 扁桃酸；其中，上述的转化液含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌。
其中，整个流加反应过程(20‐24h)可以分为若干个不同的阶段，每个阶段采用不同的流加速度，但要确保前一个阶段的流加速度大于后一个阶段的流加速度。在本发明的优选实施例中，整个流加反应过程(20‐24h)可以分为两个阶段，在第一个阶段(10‐12h)将扁桃腈以第一流加速度进行流加，在第二个阶段(即剩余的流加反应时间)以第二流加速度进行流加，但要保证第一流加速度大于第二流加速度。
进一步地，第一流加速度可以为10‐40gL‐1h‐1，第二流加速度可以为5‐20gL‐1h‐1；另外，第一流加速度还可以优选为15‐35gL‐1h‐1，第二流加速度还可以优选为7.5‐17.5gL‐1h‐1；进一步地，第一流加速度还可以优选为20‐30gL‐1h‐1，第二流加速度还可以优选为10‐15gL‐1h‐1；更进一步地，第一流加速度还可以优选为24gL‐1h‐1，第二流加速度还可以优选为12gL‐1h‐1。
在本发明的优选实施例中，pH可以优选为7‐8.5，还可以进一步优选为7.9‐8.1。
在本发明的优选实施例中，温度可以优选为25‐37℃，还可以进一步优选为30℃。
在上述步骤中，转化液的制备方法包括如下步骤：
(1)、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；
(2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。
其中，在步骤(1)中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。
在步骤(2)中的转化液中，静息细胞的浓度大于10gL‐1，可以优选为10‐100gL‐1，还可以更优选为10‐50gL‐1，可以最优选为10‐20gL‐1。
步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种；步骤(2)中还可以添加扁桃腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐25％的甲醇、体积分数为1％‐25％的乙醇、体积分数为1％‐25％的异丙醇、体积分数为1％‐25％的正己烷或其他任何常用有机溶剂中的任意一种或几种。
进一步地，步骤(2)中的缓冲液的浓度还可以为20‐200mM，助溶剂的体积分数还可以为5％‐10％。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的方法以扁桃腈为起始原料，利用高密度发酵获得的静息细胞(用于分泌J2315腈水解酶)为生物催化剂，并采用具有较高水解活性的J2315腈水解酶和扁桃腈的流加工艺相结合来生产(R)‐(‐)‐扁桃酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且能够通过不断控制扁桃腈的加入来实现(R)‐(‐)‐扁桃酸的高浓度积累，使单批次反应(R)‐(‐)‐扁桃酸积累浓度高达2.9M，ee值大于97％，扁桃腈转化率大于99％，，从而具有良好的工业化应用前景。另外，本发明的方法成本低廉，能耗也较低。
附图说明
图1为本发明的静息细胞催化水解扁桃腈合成(R)‐(‐)‐扁桃酸反应进程曲线图。
具体实施方式
本发明公开了一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，该方法包括如下步骤：
(1)、将用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；
(2)、收集步骤(1)所得的静息细胞，将该静息细胞悬浮于pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液；
(3)、将扁桃腈流加入步骤(2)所得的转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h(即流加反应阶段)，然后停止流加，继续反应2‐6h(即非流加反应阶段)，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。
其中，在步骤(1)中，J2315腈水解酶(BCJ2315)是伯克霍尔德氏菌J2315菌株(Burkholderiacenocepacia J2315)分泌的。用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌是通过在Escherichia coli M15中克隆BCJ2315基因并且过表达从而构建而成的E.coli M15/BCJ2315重组体(Recombinant E.coli M15/BCJ2315)。关于该E.coli工程菌，请详见Wang等人在BMC Biotechnology 2013,13:14公开的非专利文献《Discovery and characterization of a highly efficient enantioselective mandelonitrile hydrolase from BurkholderiacenocepaciaJ2315by phylogeny‐based enzymatic substrate specificity prediction》的记载。
步骤(1)中的发酵培养基含有以下组分并且每种组分的含量如下：酵母膏16‐60g/L、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。
在步骤(1)中，还可以根据实际情况添加发酵补料培养基。
在步骤(2)所得的转化液中，静息细胞的浓度应大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，更优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。催化反应所需的J2315腈水解酶是通过静息细胞分泌的，所以静息细胞的浓度影响的是J2315腈水解酶的浓度。而J2315腈水解酶的浓度越高则相对的催化效率越高，即单位时间内扁桃腈的转化量越高。理论上随着静息细胞的浓度的提高，第一流加速度是可以成比例增加的，即第一流加速度所需静息细胞的浓度等于在15‐20min内能够完全转化100mM扁桃腈的静息细胞的浓度。
步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。
步骤(2)中除了添加缓冲液外，还可以添加扁桃腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。该缓冲液的浓度可以为20‐200mM，助溶剂添加量可以为5％‐10％(v/v)。
在步骤(3)中，扁桃腈在整个流加反应过程的不同阶段可以以不同的流加速度进行流加。在流加反应初始的10‐12h，扁桃腈可以以第一流加速度进行流加，在剩余的流加反应时间内，扁桃腈可以以第二流加速度进行流加，但第一流加速度应大于第二流加速度，并且优选为第二流加速度的两倍。本发明在整个流加反应过程(20‐24h)的不同阶段采用不同的流加速度 进行流加的原因如下：扁桃腈对J2315腈水解酶具有一定的毒性，随着流加反应的进行，J2315腈水解酶的催化效率会逐渐降低。第一流加速度采用较大的数值能够充分利用J2315腈水解酶的最高催化效率，而当J2315腈水解酶的催化效率降低至一定程度，则采用第二流加速度从而保证扁桃腈被充分转化。如果整个流加反应的全过程只采用第一流加速度则会导致扁桃腈转化效率降低，而整个流加反应的全过程均采用第二流加速度则会导致J2315腈水解酶的催化效率的浪费。
整个反应过程中J2315腈水解酶的催化效率由于受到扁桃腈毒性的影响是逐渐降低的，从而导致在每小时中能够转化的扁桃腈的量是逐渐降低的。第一流加速度可以认为是在J2315腈水解酶的催化效率最高的情况下每小时可以转化的扁桃腈的量，当J2315腈水解酶的催化效率降低时，为保证扁桃腈能够完全转化则需要降低扁桃腈的流加速度。若从整个反应的全局考虑，则只需保证反应结束时扁桃腈能够达到理论上100％完全转化而不需要考虑反应进程中每个时间节点扁桃腈是否能够完全转化。静息细胞催化水解扁桃腈合成(R)‐(‐)‐扁桃酸反应进程曲线图如图1所示。
在本发明的一个优选实施例中，第一流加速度可以为10‐40gL‐1h‐1，第二流加速度可以为5‐20gL‐1h‐1；在本发明的另一个优选实施例中，所述的第一流加速度也可以为15‐35gL‐1h‐1，所述的第二流加速度也可以为7.5‐17.5gL‐1h‐1；在本发明的再一个优选实施例中，所述的第一流加速度可以为20‐30gL‐1h‐1，所述的第二流加速度可以为10‐15gL‐1h‐1；在本发明的最优选实施例中，所述的第一流加速度可以为20‐30gL‐1h‐1，所述的第二流加速度可以为10‐15gL‐1h‐1。
上述的流加方式只是一种优选的流加方式，由于在整个反应的过程中，J2315腈水解酶的催化效率随着反应的进行是逐渐下降的，因此，还可以在流加反应的不同阶段以逐渐降低的流加速度进行流加，或者将整个流加反应阶段分为若干个阶段，每一个阶段采用一个不同的流加速度，并且前一阶段的流加速度大于后一阶段的流加速度。如：可以将整个流加反应阶段分为三个阶段，每个阶段分别对应于第一流加速度、第二流加速度和第三流加速度，第一流加速度大于第二流加速度，第二流加速度大于第三流加速度；还可以将整个流加反应阶段分为四个阶段，每个阶段分别对应于第一流加速度、第二流加速度、第三流加速度和第四流加速度，第一流加速度大于第二流加速度，第二流加速度大于第三流加速度，第三流加速度大于第四流加速度；还可以将整个流加反应阶段分为五个阶段，每个阶段分别对应于第一流加速度、第二流加速度、第三流加速度、第四流加速度和第五流加速度，第一流加速度大于第二流加速度，第二流加速度大于第三流加速度，第三流加速度大于第四流加速度，第四流加速度大于第五流加速度；以此类推，最终可以得到平滑的流加速度曲线。
在步骤(3)中，转化pH还可以为7‐8.5，优选为7.5‐8.3，更优选为7.9‐8.1。对转化pH的调节可以采用氨水、NaOH溶液或者Na2CO3溶液进行。其中，氨水的浓度可以为1M到纯氨水，优选为2‐10M，更优选为4‐8M，最优选为6M。
转化时温度还可以为25‐37℃，优选为30℃。转化时pH和温度直接对J2315腈水解酶的 活力即J2315腈水解酶的催化效率产生影响。酶的活力在不同的转化温度或者不同的转化pH条件下是不同的。本发明选择的转化温度与转化pH适于酶的最佳催化效率的发挥。通过影响酶的催化效率从而影响扁桃腈的第一流加速度，最终影响的即是反应完成时(R)‐(‐)‐扁桃酸的最终浓度。
本发明的反应原理如下所示：
对于底物外消旋扁桃腈，J2315腈水解酶只催化其中的R型扁桃腈反应生成R型扁桃酸，而S型扁桃腈实际是不反应的。通过利用扁桃腈本身的自消旋特性，即S型扁桃腈会发生自水解形成苯甲醛，进而重新形成R型与S型等比例混合物，因此最终结果为每1M的扁桃腈即可生成1M的R型扁桃酸，因此通过不断加入扁桃腈，控制扁桃腈的流加速度，使扁桃腈完全转化为R型扁桃酸，扁桃腈的累积加入浓度即R型扁桃酸的积累浓度，由此，便通过不断控制扁桃腈的加入最终实现(R)‐(‐)‐扁桃酸的高浓度积累。
本发明的测定J2315腈水解酶活性的方法和下列实施例中酶活力的单位特定义如下：
在pH 7.0的50mM的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲体系中，以100mM的扁桃腈为底物，10mg/ml(湿重)的静息细胞浓度下，30℃下震荡15min，2M盐酸终止反应，HPLC方法检测扁桃腈转化情况。若扁桃腈转化完全，则认为该批次细胞酶活力合格，可用于进行后续(R)‐(‐)‐扁桃酸的制备。针对于扁桃腈这个底物，J2315腈水解酶的酶学性质要显著高于已报道的大部分腈水解酶。以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例
本实施例公开了一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，其包括如下步骤：
(1)、取出在‐80℃下保藏的E.coli工程菌，在LB琼脂平板上进行接种，之后于37℃培养过夜； 
(2)、挑取LB琼脂平板上的单克隆菌落，并将其接种于LB液体培养基中，之后于37℃培养过夜； 
(3)、从过夜培养后的LB液体培养基中取适量菌液，接种于LB液体培养基中，于37℃培养8h，之后接种于发酵培养基(如表1所示，最终pH值为7)中，于37℃培养至OD600为20，然后加入适量IPTG，于30℃诱导16h，离心收集菌体(取沉淀物)，用pH为8.0的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液洗涤两次，得到静息细胞；在37℃培养的过程中可以视情况添加发 酵补料培养基。发酵补料培养基是为了提高静息细胞的发酵浓度，而不断的向发酵培养基中补加的营养成分。理论上当发酵培养基当中的碳源消耗至较低水平时即开始添加，实际操作过程中则通过观察发酵液的pH变化情况，当pH开始升高(一般反应3‐4h)时则开始添加发酵补料培养基。
(4)、取10g静息细胞加入到1L 100mM pH为8.0的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中，然后加入50mL甲醇，搅拌均匀，使静息细胞悬浮在pH为6.0‐9.0的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中，得到转化液；
(5)、以24gh‐1的流加速度向转化液中流加扁桃腈，在流加过程中使用6M氨水将pH稳定在7.95‐8.10(即转化pH值为7.95‐8.10)并且保持温度在30℃(即转化温度为30℃)，同时以300rpm的速度不断搅拌，持续反应11h；
(6)、以12gh‐1的流加速度向转化液中流加扁桃腈，在流加过程中使用6M氨水将pH稳定在7.95‐8.10(即转化pH值为7.95‐8.10)并且保持温度在30℃(即转化温度为30℃)，同时以300rpm的速度不断搅拌，继续反应11h；
(7)、停止流加扁桃腈，继续反应4h，使总反应的时间达到26h，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。
表1发酵培养基的组分含量表
组分 含量
酵母膏 16gL‐1
蛋白胨 12gL‐1
甘油 1ml
K2HPO4 24.75gL‐1
KH2PO4 3.47gL‐1
MgSO4 1gL‐1
表2发酵补料培养基的组分含量表
组分 含量
酵母膏 60gL‐1
蛋白胨 80gL‐1
甘油 500ml
经HPLC方法检测可知，本实施例中(R)‐(‐)‐扁桃酸的生成量达到2.9M，ee值大于97％。由此可知，本实施例的制备(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法反应转化率高，单批次产率浓度积累高，生产安全简便，无任何副产物，不污染环境。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将扁桃腈流加入转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸；
所述的转化液含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述的扁桃腈以第一流加速度流加10‐12h，在剩余的反应时间内以第二流加速度进行流加，所述的第一流加速度大于所述的第二流加速度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的第一流加速度为10‐40gL‐1h‐1，所述的第二流加速度为5‐20gL‐1h‐1；
优选地，所述的第一流加速度为15‐35gL‐1h‐1，所述的第二流加速度为7.5‐17.5gL‐1h‐1；
更优选地，所述的第一流加速度为20‐30gL‐1h‐1，所述的第二流加速度为10‐15gL‐1h‐1；
最优选地，所述的第一流加速度为24gL‐1h‐1，所述的第二流加速度为12gL‐1h‐1。
4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述的转化液的制备方法包括如下步骤：
(1)、将所述的E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；
(2)、收集所述的静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到所述的转化液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中的转化液中，所述的静息细胞的浓度大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，更优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中和Tris‐HCl缓冲液的任意一种；或者，步骤(2)中还添加了助溶剂，所述的助溶剂为体积分数为1％‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种；
优选地，步骤(2)中的缓冲液的浓度为20‐200mM；或者，所述的助溶剂的体积分数为5％‐10％。
8.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述的pH为7‐8.5，优选为7.9‐8.1。
9.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述的温度为25‐37℃，优选为30℃。
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