CN101260415A - 生物催化法制备4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的两种高光学活性对映体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物催化法制备4－氰基－3－羟基丁酸乙酯的两种高光学活性对映体的方法，该方法采用的微生物菌株为Klebsiellapneumoniae Phe－E4或Bacillus pumilus Phe－C3进行催化，用Klebsiellapneumoniae Phe－E4菌株进行生物催化所得到的产物为(S)－4－氰基－3－羟基丁酸乙酯，用Bacillus pumilus Phe－C3进行生物催化所得的产物为(R)－4－氰基－3－羟基丁酸乙酯。采用该方法得到的产物底物转化率可达98％以上，能得到高光学纯度的手性产物，并且反应专一性强，副产物少，后处理简单，具有很好工业应用开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的制备方法，更具体地说利用它们催化不对称还原生产手性β-羟基丁酸酯的微生物转化方法。
背景技术
光学活性手性仲醇是许多手性药物和手性精细化学品合成的重要中间体，其合成方法通常包括酮的不对称还原以及消旋体的不对称拆分。
通过对外消旋体的拆分制备光学活性手性仲醇可以采用天然或者人工合成的手性拆分试剂，也可以用生物酶法，但是手性拆分试剂的来源远不如生物酶法的种类众多，所以最为常见的莫过于采用商品化的酯酶或者脂肪酶进行水解拆分，但是，对于拆分来讲，其最大产率也不会超过50％，工业化的时候通常还需考虑其另一对映体的处理，有时候丢弃另外一半也是无奈之举。
因此，更为经济的考虑是潜手性酮的不对称还原，理论上能得到100％的转化结果。基本方法有化学法还原和生物催化还原，一般在无水无氧条件苛刻的情况下，使用手性配体和过渡金属配合物作为催化剂，其产率往往很高。但废弃的重金属催化剂往往无法后处理，掩埋是唯一途径，然而又会对环境不利，而且该类催化剂往往价格昂贵，其工业化成本较高。
生物催化法制备光学活性手性仲醇以其独特的优势正逐步受到关注。高选择性是酶催化的最大特点，此外，生物催化法往往较为迅速，而且副产物较少，后处理简单，省却了诸多化学合成中的对敏感基团的保护和脱保护步骤。利用整细胞进行催化无需添加辅酶，也不需要进行酶的纯化，可以更进一步的节省工业化生产成本。
(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯((R)-ethyl 4-cyano-3-hydroxybutyrate)是一个非常重要的手性化合物，它是合成HMG-CoA还原酶抑制剂Atorvastatin(Lipitor)的中间体，HMG-CoA还原酶抑制剂可以控制胆固醇的生物合成。它还是合成L-Carnitine和(R)-4-amino-3-hydroxybutyricacid(GABOB)的中间体。L-Carnitine是运送长链脂肪酸通过细胞膜进入粒线体代谢，以产生能量的运输工具，它常做为营养补充品，供运动员用，而且常见于婴幼儿的营养品中。(R)-4-amino-3-hydroxybutyric acid(GABOB)是gamma-aminobutyric acid的收缩剂，该类药物可以用做控制一些临床反应如精神***症，癫痫症等。
目前报道其合成路径主要有以表氯醇或者(S)-3-羟基-γ-丁内酯为起始原料，也有从4-氯-3-羟基丁酸乙酯经过氰基化而得到，但直接采用酶法不对称催化还原4-氰基-3-羰基丁酸乙酯，尚未见文献报道。
发明内容
本发明提供一种新的能有效催化不对称还原反应生产手性β-羟基丁酸酯的方法，利用生物催化法催化还原4-氰基乙酰乙酸乙酯，以获得高产率，高光学纯度的(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
在本发明中，能有效催化不对称还原反应生成手性β-羟基丁酸酯的两株菌株，其中一株经过LB琼脂培养基后，革兰氏染色表明，该菌为革兰氏阳性菌，菌的大小为2～3μm×1μm，短杆状，两端钝圆，无鞭毛和荚膜，成单排列，芽孢椭圆位于菌体两端，被DSMZ命名为Bacillus pumilusPhe-C3，保藏编号：DSM-355。另一株在经过LB琼脂培养基后，革兰氏染色表明为革兰阴性杆菌，为较短粗的杆菌，大小0.5-1μm×2μm，短链状排列，无芽孢，无鞭毛，有较厚的荚膜，有菌毛，被DSMZ命名为Klebsiellapneumoniae Phe-E4，保藏编号：DSM-2026。
本发明利用上述两种菌株Klebsiella pneumoniae Phe-E4和Bacilluspumilus Phe-C3可以用于生产高光学纯的(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，Klebsiella pneumoniae Phe-E4用于生产S构型，Bacillus pumilus Phe-C3用于生产R构型。具体包括以下步骤：
(1)将上述菌株进行划板、摇瓶培养、发酵罐培养，得到的菌液离心获得湿菌体；
(2)将(1)所得的湿菌体分散到磷酸盐缓冲液中去；
(3)将底物4-氰基乙酰乙酸乙酯加入(2)所述的体系中去反应，然后从反应体系中收集还原产物。
其中，所述的4-氰基乙酰乙酸乙酯以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料进行合成的。
步骤(1)中的划板培养所用的培养基为LB琼脂培养基，其组成为：蛋白胨：1％；酵母浸膏：0.5％；氯化钠：1.0％；琼脂：1.5％；其余为蒸馏水。pH为7.0。
步骤(1)中摇瓶培养所用的培养基为M9培养基，其组成为：Na2HPO4：6.78‰；KH2PO4：3.0‰；NaCl：0.5‰；NH4Cl：1.0‰；MgSO4：0.24‰；CaCl2：0.01‰；其余为蒸馏水。pH为7.4。
步骤(3)中所用到的细胞浓度为3-24g cdw/L。
步骤(4)中反应温度为28℃，反应时间为0.5-70小时，所用的缓冲液pH为7.0，底物浓度为5-30mM。
反应完毕的混合液先离心，水层用乙酸乙酯萃取，有机层干燥，减压蒸馏出去溶剂，得到(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
以下具体描述各个步骤：
菌株的制备：
平板培养：培养基配置蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，氯化钠1.0％，琼脂1.5％，pH7.0的LB琼脂培养基，121℃下灭菌20分钟，冷却，倒人平板，分别接种Klebsiella pneumoniae Phe-E4和Bacillus pumilus Phe-C3，28℃培养4-6天。
摇瓶培养：培养基配置Na2HPO46.78‰，KH2PO43.0‰，NaCl 0.5‰，NH4Cl 1.0‰，MgSO40.24‰，CaCl20.01‰，pH 7.4的M9培养基，装入三角瓶(装液量500mL/1000mL)，121℃下灭菌20分钟，冷却，分装到250mL摇瓶中，并加入2％的葡萄糖，接种，接种量5-10％，28℃，摇瓶转速220rpm。培养2-3天，离心，收集菌体，保存待用。
底物制备：
将4-氯乙酰乙酸乙酯溶解在无水乙醇中，冰浴冷却下，加入适量***，加料完毕后室温搅拌过夜，将反应液倒入水中并用乙酸乙酯萃取，有机相饱和食盐水洗，干燥，浓缩即可得到4-氰乙酰乙酸乙酯。
微生物催化：
将所得的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤后再重新分散到磷酸盐缓冲液中去，加入4-氰基乙酰乙酸乙酯，并加入2％的葡萄糖，底物浓度为5-30mM，菌体浓度为3-24g cdw/L，反应温度为28℃，反应时间为0.5-70小时。有机溶剂萃取反应液后，GC跟踪反应，当反应结束后，将溶液离心，上清液用乙酸乙酯萃取，有机层饱和食盐水洗后分层干燥，减压出去溶剂，并用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯/3∶1)分离纯化产物。
底物4-氰基乙酰乙酸乙酯和产物(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯GC分析条件：
(1)：转化率的测定，使用天美公司的GC-7900气相色谱仪，HP-5柱子(30m×0.25mm×0.25μm)，色谱条件为：进样口250℃，检测器280℃，升温程序：100℃下保留1分钟，以10℃/min升温至250℃，保温10分钟。载气N2流速40mL/min。
(2)：ee值的测定，使用天美公司的GC-7900气相色谱仪，ChiralDEX-CB柱子(30m×0.25mm×0.25μm)，色谱条件为：进样口250℃，检测器280℃，升温程序：100℃下保留2分钟，以4℃/min升温至250℃，保温10分钟。载气N2流速40mL/min。
本发明的有益效果
本发明采用两株菌株生产(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，底物转化率可达98％以上，能得到高光学纯度的手性产物，并且反应专一性强，副产物少，后处理简单，具有很好工业应用开发前景。同时根据本发明公开的技术方案，本领域技术人员可以很方便的将本发明中的两株菌株的培养条件和生物转化工艺应用于其他含有β-羰基化合物的不对称生物催化中。
附图说明
图1：本发明实施例6中Bacillus pumilus Phe-C3催化不同浓度的底物转化进程图。
图2：本发明实施例7中Klebsiella pneumoniae Phe-E4催化不同浓度的底物转化进程图。
具体实施方式
下面提供具体的实施例来对本发明进一步进行阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
底物制备：
将4-氯乙酰乙酸乙酯溶解在无水乙醇中，冰浴冷却下，加入适量***，加料完毕后室温搅拌过夜，将反应液倒入水中并用乙酸乙酯萃取，有机相饱和食盐水洗，干燥，浓缩即可得到4-氰乙酰乙酸乙酯。
实施例1：平板培养。
培养基配置蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，氯化钠1.0％，琼脂1.5％，pH 7.0的LB琼脂培养基(其余为水)，121℃下灭菌20分钟，冷却，倒平板，分别接种Bacillus pumilus Phe-C3和Klebsiella pneumoniaePhe-E4，28℃培养4-6天，即可转入摇瓶培养。
实施例2：摇瓶培养。
培养基配置Na2HPO46.78‰，KH2PO43.0‰，NaCl 0.5‰，NH4Cl 1.0‰，MgSO40.24‰，CaCl20.01‰，pH 7.4的M9培养基(其余为水)，装入三角瓶(装液量500mL/1000mL)，121℃下灭菌20分钟，冷却，分装到250mL摇瓶中，并加入2％的葡萄糖，分别接种上述Bacillus pumilusPhe-C3和Klebsiella pneumoniae Phe-E4，接种量5-10％，28℃，摇瓶转速220rpm。培养2-3天，离心，收集菌体，保存待用。
实施例3：Bacillus pumilus Phe-C3的发酵罐培养。
发酵罐培养基与摇瓶培养所用的培养基一致。待Bacillus pumilusPhe-C3在摇瓶中生长到指数生长后期的时候，接种到5升的发酵罐中。发酵罐预先装入了2升培养基(含2％的葡萄糖)。发酵条件：转速220rpm，温度30℃，空气流速1.5L/min。20小时的时候，以25g/h的速度向发酵罐中补充50％的葡萄糖以维持体系的葡萄糖浓度，同时转速提高到400rpm以提高通气量。40小时的时候，达到其指数生长后期，4℃下离心并保存到冰箱中待用。
实施例4
将按实施例3所述方法得到的Bacillus pumilus Phe-C3菌株解冻，并用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，并加入5mM的底物4-氰基乙酰乙酸乙酯，分别添加0％，2％的葡萄糖，在28℃，220rpm下进行转化，用GC跟踪反应进程，测其转化率，结果如表1：
表1：添加不同葡萄糖浓度对Bacillus pumilus Phe-C3的催化效率的影响
| 葡萄糖浓度(％) | 底物/细胞干重(w/w) | 转化率(％) | 转化率/细胞干重(％/mg) |
| 0 | 0.14 | 48.1(6h)53.3(18h) | 0.320.36 |
| 2 | 0.14 | 89.3(6h)94.6(18h) | 0.610.64 |
由表1可以看出，添加适当浓度的葡萄糖可以大大提高Bacilluspumilus Phe-C3的催化效率。
实施例5
将按实施例2所得到的Klebsiella pneumoniae Phe-E4菌株解冻，并用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，并加入5mM的底物4-氰乙酰乙酸乙酯，分别添加0％，2％的葡萄糖，在28℃，220rpm下进行转化，用GC跟踪反应进程，测其转化率，结果如表2：
表2：添加不同葡萄糖浓度对Klebsiella pneumoniae Phe-E4的催化效率的影响
| 葡萄糖浓度(％) | 底物/细胞干重(w/w) | 转化率(％) | 转化率/细胞干重(％/mg) |
| 0 | 0.14 | 68.7(6h)90.3(18h) | 0.460.62 |
| 2 | 0.14 | 66.5(6h)89.9(18h) | 0.440.60 |
由表1可以看出，添加适当浓度的葡萄糖对Klebsiella pneumoniaePhe-E4的催化效率影响不大。
实施例6
按实施例3所述方法生产Bacillus pumilus Phe-C3菌株，湿菌体用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，细胞浓度调至6g/L，添加2％的葡萄糖，并加入5-30mM的底物4-氰乙酰乙酸乙酯，在28℃，220rpm下进行转化，用GC跟踪，测得其实时的转化率，得到结果如图1，可以看出，底物浓度为20mM时，Bacillus pumilus Phe-C3还能对其进行有效的催化，但当浓度达到30mM时，转化效果则变得很差。
实施例7
按实施例2所述方法生产Klebsiella pneumoniae Phe-E4菌株，湿菌体用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，细胞浓度调至6g/L，添加2％的葡萄糖，并加入5-30mM的底物4-氰乙酰乙酸乙酯，在28℃，220rpm下进行转化，用GC跟踪，测得其实时的转化率，得到结果如图2，可以看出Klebsiella pneumoniae Phe-E4可以有效催化最大底物浓度为10mM，更高的底物浓度将导致转化率的下降。
实施例8
按实施例3所述方法生产Bacillus pumilus Phe-C3菌株，湿菌体用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，并调节细胞浓度为3-24g/L，同时添加2％的葡萄糖，加入20mM的底物4-氰乙酰乙酸乙酯，在28℃，220rpm下进行转化，用GC跟踪，测得其实时的转化率和酶活，结果如表3：
表3：不同菌体浓度对Bacillus pumilus Phe-C3的转化效果的影响
| 细胞浓度(g/L) | 酶括(U/g cdw) | 转化率(％) |
| 3 | 1.2 | 83 |
| 6 | 5.6 | 93 |
| 12 | 1.1 | 79 |
| 24 | 0.3 | 35 |
细胞酶活的定义为：28℃，pH 7.0条件下，每分钟催化转化1μmol底物所需的细胞量。
由表3可以看出，Bacillus pumilus Phe-C3菌株的浓度为6g/L时具有最好的催化效果。
实施例9
按实施例2所述方法生产Klebsiella pneumoniae Phe-E4菌株，湿菌体用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，并调节细胞浓度为3-24g/L，加入10mM的底物4-氰乙酰乙酸乙酯，在28℃，220rpm下进行转化，用GC跟踪，测得转化率和酶活，结果如表4：
表4：不同菌体浓度对Klebsiella pheumoniae Phe-E4的转化效果的影响
| 细胞浓度(g/L) | 酶活(U/g cdw) | 转化率(％) |
| 3 | 5.5 | 82 |
| 6 | 8.5 | 90 |
| 12 | 10.7 | 95 |
| 24 | 1.6 | 63 |
由表4可以看出，Klebsiella pneumoniae Phe-E4菌株的浓度为12g/L时具有最好的催化效果。
实施例10
按实施例3所述方法生产Bacillus pumilus Phe-C3菌株，湿菌体用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，并调节细胞浓度为6g/L，同时添加2％的葡萄糖，加入20mM的底物4-氰乙酰乙酸乙酯，在28℃，220rpm下进行转化，反应26小时后，GC跟踪显示原料已经完全转化，随即进行后处理。取出反应液，离心，上清液用乙酸乙酯萃取，有机层饱和食盐水洗后分层干燥，减压出去溶剂，并用柱层析(石油醚∶乙酸乙酯/3∶1)分离纯化产物，减压蒸干溶剂，得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。ee值96.3％
1HNMR(500MHz，CDCl3)：δ4.15(q，2H，J＝7.1Hz)，3.75(m，2H)，3.13(m，1H)，2.65(m，2H)，1，25(t，3H，J＝7.2Hz)；13CNMR(75Hz，CDCl3)：δ171.7，117.3，64.2，40.1，25.2，14.4.
实施例11
按实施例2所述方法生产Klebsiella pneumoniae Phe-E4菌株，湿菌体用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，之后重新分散到磷酸盐缓冲液中去，并调节细胞浓度为12/L，加入10mM的底物4-氰乙酰乙酸乙酯，在28℃，220rpm下进行转化，反应18小时后，GC跟踪显示原料已经完全转化，随即进行后处理。取出反应液，离心，上清液用乙酸乙酯萃取，有机层饱和食盐水洗后分层干燥，减压出去溶剂，并用柱层析(石油醚∶乙酸乙酯/3∶1)分离纯化产物，减压蒸干溶剂，得到(S)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。ee值94.7％
利用上述两株菌株的培养条件和生物转化工艺，还可应用于其他含有β-羰基化合物的不对称生物催化中。
Claims (7)
1.一种生物催化法制备4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的两种高光学活性对映体的方法，其特征在于，所采用的微生物菌株为Klebsiella pneumoniaePhe-E4或Bacillus pumilus Phe-C3；用Klebsiella pneumoniae Phe-E4菌株进行生物催化所得到的产物为(S)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，用Bacillus pumilus Phe-C3进行生物催化所得的产物为(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
2.如权利要求1所述的制备4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的两种高光学活性对映体的方法，包括以下步骤：
(1)将权利要求1中所述的菌株Klebsiella pneumoniae Phe-E4或Bacillus pumilus Phe-C3进行平板培养、摇瓶培养、发酵罐培养，得到的菌液离心获得湿菌体；
(2)将(1)所得的湿菌体分散到磷酸盐缓冲液中去；
(3)将4-氰基乙酰乙酸乙酯加入(2)所述的体系中去反应，然后从反应体系中收集还原产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的划板培养所用的培养基为LB琼脂培养基，其组成为：蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，氯化钠1.0％，琼脂1.5％，余量为蒸馏水；pH 7.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中摇瓶培养所用的培养基为M9培养基，其组成为：Na2HPO46.78‰，KH2PO43.0‰，NaCl 0.5‰，NH4Cl 1.0‰，MgSO40.24‰，CaCl20.01‰，余量为蒸馏水；pH为7.4。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的4-氰基乙酰乙酸乙酯是以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料进行合成。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所用到的细胞浓度为3-24g cdw/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应温度为28℃，反应时间为0.5-70小时，所用的缓冲液pH为7.0，底物浓度为5-30mM。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20080910 |