CN104630195A - 海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法 - Google Patents

海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，具体步骤为：先将产生γ-内酰胺酶菌种活化，再经过逐级低温驯化，使菌种在低温环境中生长良好，将低温驯化后的γ-内酰胺酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积3～9％接种于液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，得低温γ-内酰胺酶，收集到的粗酶液根据不同需要和使用对象不同，进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明生产的低温γ-内酰胺酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、具有更广阔的工业开发价值与市场应用优势。

Description

海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法。
背景技术
γ-内酰胺酶(γ-lactamses,EC 3.5.2.-)是催化酰胺类化合物酰胺键水解的一种新型酰胺酶。(+)γ-内酰胺酶能够高效率动力学拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺。光学纯的(-)γ-内酰胺是制备抗病毒药物的手性中间体，是抗艾滋病药物(-)阿巴卡韦和(-)卡巴韦的合成原料，也是抗流感药物帕拉米韦的合成原料。此外，γ-内酰胺酶催化外消旋体γ-内酰胺还可获得不同构型的γ-氨基丁酸类似物(GABA)。GABA是一种抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性(***等，微生物学报，2010)。人们在发现(+)γ-内酰胺酶之前，常规方法制备光学纯的(-)γ-内酰胺一般采用不对称合成的方法，此方法的缺点是原料昂贵、工艺繁琐、生产成本高、造成环境污染，不利于工业化生产(VelazquezF.,Current Organic Chemistry,2002)。运用γ-内酰胺酶进行工业化生产(-)γ-内酰胺，具有反应条件温和、工艺简单、生产成本低、环境友好、产物光学纯度高等优点。目前对微生物发酵生产γ-内酰胺酶的研究处于γ-内酰胺酶产生菌株的选育和产酶条件优化(Taylor SJC,etal.Journal ofthe Chemical Society:Chemical Communications,1990；李海泉等，微生物学报，2006；陈红干等，中国生物工程杂志，2012等)、酶学性质以及相关基因克隆(Wang JJ,et al.Annals of Microbiology,2009；Qin XX,et al.Appl Biochem Biotechnol,2010；Yang M,et al.Biotechnology Letters,2012等)阶段，且集中于中温γ-内酰胺酶。低温γ-内酰胺酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可减少加工工艺，缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用，在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质(朱非等，微生物学报，2002)，因此，低温γ-内酰胺酶上述特性将有助于其推广和应用，具有更广阔的工业开发价值与市场应用优势。低温γ-内酰胺酶的应用将对生物酶法拆分制备(-)γ-内酰胺工业产生深远影响。目前国内外还未见海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，该方法主要是海洋微生物经过低温驯化后，在10～16℃液体发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，这种生产方法获得的低温γ-内酰胺酶，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法具体包括以下步骤：
(1)将能产生γ-内酰胺酶菌种活化，再逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，当菌种在低温环境中稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基为：酵母膏0.2～5.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0～10.0g，NH4Cl2.0～15.0g，Na2HPO40.1～1.0g，NaH2PO40.1～1.0g，MgSO40.05～0.5g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
所述的能产生γ-内酰胺酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.761或1.647或1.1830；
(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的γ-内酰胺酶产生菌在液体种子培养基中于10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基为：酵母膏20.0～25.0g，蛋白胨10.0～20g，NaCl10.0～15.0g，MgSO40.05～0.5g，ZnSO4·7H2O 2.4～8.0mg，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
(3)将液体二级种子按发酵液体积的3～9％接种量接入液体产酶培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶结束；所述的液体产酶培养基为：牛肉膏10.0～25.0g，蛋白胨2.0～20.0g，乙酰胺5.0～20g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4～8.0mg，自来水1.0L，pH为5.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
(4)将步骤(3)的发酵液在4000～8000rpm离心收集菌体，超声破碎，收集到的上清液即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将步骤(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
进一步的，步骤(1)中产生γ-内酰胺酶菌种的活化培养基为：酵母膏20.0～25.0g，蛋白胨10.0～12.0g，NaCl 10.0～15.0g，琼脂20.0～25.0g，自来水1.0L，pH值为7.4，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。
本发明中使用的能产生γ-内酰胺酶的菌种，初期活化和生长条件按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的说明进行。菌株先活化、再经过逐级低温驯化后发酵生产低温γ-内酰胺酶时按本发明产酶条件进行培养，低温驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用10～25vt％甘油制成的菌悬液、在-80℃条件下可以长期保藏。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明生产的低温γ-内酰胺酶经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理并不会影响产品的品质，尤其是在低温下还具有高酶活力及高催化效率；改善并提高产品质量；
(2)本发明的方法简化了加工工艺，缩短加工时间，提高了生产效率并从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备的环节，省却昂贵的加热或冷却费用，在节能方面有相当大的优势；
(3)利用微生物发酵生产的低温γ-内酰胺酶主要应用于拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺，低温γ-内酰胺酶的应用可进一步提高原料的利用率及转化率，而且该酶制剂在应用中操作简单、方便、快捷、成本低，具有更广阔的工业开发价值与市场应用优势。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明，但不限制本发明。
实施例1
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH7.4，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
②菌种低温驯化培养基：酵母膏0.2g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0g，NH4Cl 2.0g，Na2HPO40.1g，NaH2PO40.1g，MgSO40.05g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH值为6.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
③液体种子培养基：酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，MgSO40.05g；ZnSO4·7H2O2.4mg，自来水1.0L，pH6.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
④液体产酶培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨2.0g，乙酰胺5.0g，Tween800.1g，(NH4)2SO41.0g，KH2PO41.4g，MgSO40.1g，CaCl20.2g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，自来水1.0L，pH值5.0，121℃，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生γ-内酰胺酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌种说明进行初始活化；
(3)将(2)中活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，驯化8天左右，使菌种能在低温环境中生长良好，当菌种在低温环境中稳定生长即驯化结束；
(4)按常规方法将步骤(3)中低温驯化后的γ-内酰胺酶产生菌在液体种子培养基中于10～12℃培养48～72h后，按5vt％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)中制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入5L的液体产酶培养基中，在10～12℃培养120～144h时，即微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶结束；
(6)将步骤(5)的发酵液在4000～8000rpm离心20min收集液体，收集到的上清液即为粗酶液，粗酶液酶活达到160U/ml；
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温γ-内酰胺酶制剂。
实施例2
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH值为7.4，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
②菌种低温驯化培养基：酵母膏2.0g；N-乙酰-L-苯丙氨酸6.0g；NH4Cl 6.0g；Na2HPO40.5g；NaH2PO40.5g；MgSO40.05g；琼脂粉20g，自来水1.0L，pH值为7.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
③液体种子培养基：酵母膏20.0g，蛋白胨15.0g，NaCl12.0g，MgSO40.01g；ZnSO4·7H2O6.0mg，自来水1.0L，pH值为7.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
④液体产酶培养基：牛肉膏15.0g，蛋白胨15.0g，乙酰胺15.0g，Tween800.3g，(NH4)2SO41.2g，KH2PO41.6g，MgSO40.3g，CaCl20.2g，ZnSO4·7H2O 6.0mg，自来水1.0L，pH值为6.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
(2)将产生γ-内酰胺酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌种说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，驯化8天左右，使菌种能在低温环境中生长良好，当菌种在低温环境中稳定生长即驯化结束；
(4)按常规方法将步骤(3)中低温驯化后的γ-内酰胺酶产生菌在液体种子培养基中于12～14℃培养48～72h后，按5vt％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)中制备的二级种子按发酵液体积5～7％的接种量接入50L的液体产酶培养基中，在12～14℃培养120h时，即微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶结束；
(6)将步骤(5)的发酵液在4000～8000rpm离心20min收集液体，收集到的上清液即为粗酶液，粗酶液酶活达到159.1U/ml；
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温γ-内酰胺酶制剂。
实施例3
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH值为7.4，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
②菌种低温驯化培养基：酵母膏5.0g；N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g；NH4Cl 15.0g；Na2HPO41.0g；NaH2PO41.0g；MgSO40.5g；琼脂粉20g，自来水1.0L，pH值为8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
③液体种子培养基：酵母膏25.0g，蛋白胨20g，NaCl 15.0g，MgSO40.5g；ZnSO4·7H2O8.0mg，自来水1.0L，pH值为8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
④液体产酶培养基：牛肉膏25.0g，蛋白胨20.0g，乙酰胺20g，Tween800.4g，(NH4)2SO41.5g，KH2PO42.0g，MgSO40.4g，CaCl20.3g，ZnSO4·7H2O 8.0mg，自来水1.0L，pH值为8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
(2)将产生γ-内酰胺酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌种说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，驯化8天左右，使菌种能在低温环境中生长良好，当菌种在低温环境中稳定生长即驯化结束；
(4)按常规方法将步骤(3)中低温驯化后的γ-内酰胺酶产生菌在液体种子培养基中于14～16℃培养48～72h后，按5vt％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)中制备的二级种子按发酵液体积7～9％的接种量接入500L的液体产酶培养基中，在14～16℃培养72h时，即微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶结束；
(6)将步骤(5)的发酵液在4000～8000rpm离心20min收集液体，收集到的上清液即为粗酶液，粗酶液酶活达到158.3U/ml；
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温γ-内酰胺酶制剂。

Claims (2)

1.一种海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将能产生γ-内酰胺酶菌种活化，再逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，当菌种在低温环境中稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基为：酵母膏0.2～5.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0～10.0g，NH4Cl2.0～15.0g，Na2HPO4 0.1～1.0g，NaH2PO4 0.1～1.0g，MgSO4 0.05～0.5g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
所述的能产生γ-内酰胺酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.761或1.647或1.1830；
(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的γ-内酰胺酶产生菌在液体种子培养基中于10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基为：酵母膏20.0～25.0g，蛋白胨10.0～20g，NaCl10.0～15.0g，MgSO4 0.05～0.5g，ZnSO4·7H2O 2.4～8.0mg，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
(3)将液体二级种子按发酵液体积的3～9％接种量接入液体产酶培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶结束；所述的液体产酶培养基为：牛肉膏10.0～25.0g，蛋白胨2.0～20.0g，乙酰胺5.0～20g，Tween80 0.1～0.4g，(NH4)2SO4 1.0～1.5g，KH2PO4 1.4～2.0g，MgSO4 0.1～0.4g，CaCl2 0.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4～8.0mg，自来水1.0L，pH为5.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；
(4)将步骤(3)的发酵液在4000～8000rpm离心收集菌体，超声破碎，收集到的上清液即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将步骤(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的海洋微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，其特征在于，步骤(1)中产生γ-内酰胺酶菌种的活化培养基为：酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH值为7.4，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。
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