CN114410699A - 一种生物催化生产r-扁桃酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于R‑扁桃酸制备技术领域，具体公开了一种生物催化生产R‑扁桃酸的方法。本发明以扁桃腈、生物催化酶为主要原料，将扁桃腈溶解于有机溶剂中，在特定温度下与生物催化酶接触反应，生产R‑扁桃酸。该方法操作简便，所用原料价廉易得，反应条件温和、能耗低，对环境友好，反应时间短，产品收率高，生产成本相较现有方法大幅降低。本发明可以提高产品纯度达99.0％以上，反应后的溶剂回收利用，可以节约资源。
Description
技术领域
本发明属于R-扁桃酸制备技术领域，具体涉及一种生物催化生产R-扁桃酸的方法。
背景技术
手性合成技术和手性药物的开发是目前生物制药和有机化学的研究热点，药物手性化已成为新药研发的方向之一。手性药物(chiral drug)是指具有药用生理活性的单一对映体化合物药物。不同手性的药物作用于生物体时，在生物活性、代谢过程及毒性等方面往往存在显著差异。
扁桃酸(mandelic acid)是一种重要的计划生育手性药物，也是许多重要手性药物的中间体原料。扁桃酸本身具有杀***和灭滴虫的双重功效，以扁桃酸为前体可以合成血管扩张药环扁桃酯，***消炎药扁桃酸乌洛托品、奥昔布宁，镇痉药扁桃酸苄酯等。
扁桃酸分子中有一个手性碳原子，因此有R型和S型两个对映体。目前，市场上销售的扁桃酸有R-扁桃酸、S-扁桃酸和扁桃酸消旋体。中国专利CN102559781B公开了一种生产R-扁桃酸的方法，包括步骤：(1)以固定化腈水解酶为原料，加入缓冲溶液超声活化；(2)将活化的固定化腈水解酶装入中压保温层析柱中，得到柱式反应器；(3)以市售的外消旋扁桃腈为原料，加水溶解后泵入柱式反应器中催化生成R-扁桃酸，收集流出液；(5)再生固定化腈水解酶柱式反应器，收集清洗液；(5)用市售的大孔强碱性阴离子树脂制备离子交换柱，合并流出液和清洗液过柱吸附；(6)用盐酸和乙醇的混合液洗脱柱上吸附的R-扁桃酸，洗脱液浓缩后结晶，得到R-扁桃酸产品，收率为70～75％。该专利公开的方法工艺复杂，原料成本高，产品收率和纯度也有待提高。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，该方法简化了工艺流程，并提高了产品收率和纯度，降低了生产成本。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，包括步骤：
将扁桃腈与有机溶剂混合，之后与生物催化酶接触，在20～25℃下反应，生产R-扁桃酸。
作为本发明一种优选的实施方案，所述有机溶剂为甲基异丁酮、乙酸乙酯、甲苯中的一种或多种。
进一步优选地，所述有机溶剂为甲基异丁酮。
作为本发明一种优选的实施方案，所述扁桃腈(g)与有机溶剂(mL)的用量配比为(1～1.5)：1，即每毫升有机溶剂对应添加扁桃腈原料1～1.5g。
作为本发明一种优选的实施方案，所述与生物催化酶接触之前，可以先将生物催化酶与水混合制成含酶溶液。
优选地，所述生物催化酶(固态，单位酶活≥10000IU/g)与水的质量配比为(0.01～0.1)：1。
进一步优选地，所述生物催化酶与水的质量配比为(0.01～0.02)：1。
所述接触优选是将扁桃腈与有机溶剂的混合溶液(缓慢)滴加到所述含酶溶液中，在滴加过程中控制温度为10～25℃，进一步优选控制在10～20℃。所述滴加过程在搅拌条件下进行，搅拌转速为100～130rpm。
作为本发明一种优选的实施方案，所述生物催化酶为腈水解酶，选自野生型腈水解酶和/或突变型腈水解酶。所述突变型腈水解酶相较野生型腈水解酶在酶活性和/或立体选择性上具有显著的提升。
所述野生型腈水解酶或突变型腈水解酶均可通过商业途径获得。所述突变型腈水解酶也可参照已有专利如CN105505904B、CN101691574B等制备得到。
优选地，所述生物催化酶的添加量为每100克扁桃腈添加生物催化酶4～6克。
作为本发明一种优选的实施方案，反应生产R-扁桃酸时，所述反应的时间为6～8小时。优选在搅拌条件下进行，搅拌转速为80～110rpm。
作为本发明一种优选的实施方案，所述反应完成后，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液为有机相，所得下层溶液为含有R-扁桃酸的水相。
为获得纯的R-扁桃酸，优选将下层溶液浓缩、干燥后重结晶，得到R-扁桃酸晶体。所述重结晶使用乙醇溶剂，先将干燥后的固体完全溶解，之后降温结晶，得到纯的R-扁桃酸晶体。
为降低生产成本，所述上层溶液(有机相)回收后可以重复使用，如与新的扁桃腈混合进行配料，之后再催化生产R-扁桃酸。
本发明提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，以扁桃腈、生物催化酶为主要原料，将扁桃腈溶解于特定的有机溶剂中，并在控制温度的条件下加入到含生物催化酶的水料液中，之后在特定温度下(20～25℃)与生物催化酶接触反应，生产得到R-扁桃酸。该方法操作简便，所用原料价廉易得，反应条件温和、能耗低，对环境友好，反应时间短，产品收率高，生产成本相较现有方法大幅降低。
本发明的方法可以对反应后得到的产物重结晶，从而提高产品纯度(高达99.0％以上)，也可以将反应后回收的溶液重复使用，使其进入配料环节重新参与生产，从而进一步降低生产成本，节约资源。
具体实施方式
下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方案，例如修改、替换后得到的实施方案，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
下述实施例和对比例中使用的催化酶为腈水解酶，购自尚科生物，货号ES-NIT-127，单位酶活≥10000IU/g。
实施例1
本实施例提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，包括步骤：
取133g扁桃腈与100mL甲基异丁酮，搅拌均匀制成扁桃腈溶液待用；将6g生物催化酶加入到500g水中，搅拌均匀并控制温度为20-25℃，制成含酶溶液待用；将配好的扁桃腈溶液缓慢滴加到搅拌状态(搅拌转速110rpm)的含酶溶液中，滴加过程控制温度为10-20℃；滴加结束继续搅拌(搅拌转速100rpm)，控制温度为20-25℃保温反应6小时；反应结束停止搅拌，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液回收重新去配料，所得下层溶液浓缩、干燥，在干燥的固体中加入乙醇，降温结晶得到R-扁桃酸产品。
本实施例生产得到R-扁桃酸产品146g，测比旋光度-150.5°(c＝2.5，H2O)，熔点131～133℃，液相色谱测纯度99.3％。
实施例2
本实施例提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，包括步骤：
取133.5g扁桃腈与100mL甲基异丁酮，搅拌均匀制成扁桃腈溶液待用；将8g生物催化酶加入到600g水中，搅拌均匀并控制温度为20-25℃，制成含酶溶液待用；将配好的扁桃腈溶液缓慢滴加到搅拌状态(搅拌转速120rpm)的含酶溶液中，滴加过程控制温度为10-20℃；滴加结束继续搅拌(搅拌转速110rpm)，控制温度为20-25℃保温反应8小时；反应结束停止搅拌，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液回收重新去配料，所得下层溶液浓缩、干燥，在干燥的固体中加入乙醇，降温结晶得到R-扁桃酸产品。
本实施例生产得到R-扁桃酸产品147g，测比旋光度-150.3°(c＝2.5，H2O)，熔点131～133℃，液相色谱测纯度99.1％。
实施例3
本实施例提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，包括步骤：
取136g扁桃腈与100mL甲基异丁酮，搅拌均匀制成扁桃腈溶液待用；将8g生物催化酶加入到500g水中搅拌均匀并控制温度为20-25℃，制成含酶溶液待用；将配好的扁桃腈溶液缓慢滴加到搅拌状态(搅拌转速120rpm)的含酶溶液中，滴加过程控制温度为10-20℃；滴加结束继续搅拌(搅拌转速90rpm)，控制温度为20-25℃保温反应6小时；反应结束停止搅拌，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液回收重新去配料，所得下层溶液浓缩、干燥，在干燥的固体中加入乙醇，降温结晶得到R-扁桃酸产品。
本实施例生产得到R-扁桃酸产品151g，测比旋光度-150.1°(c＝2.5，H2O)，熔点131～133℃，液相色谱测纯度99.6％。
实施例4
本实施例提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，采用甲苯为有机溶剂，包括步骤：
取133g扁桃腈与100mL甲苯，搅拌均匀制成扁桃腈溶液待用；将6g生物催化酶加入到500g水中搅拌均匀并控制温度为20-25℃，制成含酶溶液待用；将配好的扁桃腈溶液缓慢滴加到搅拌状态(搅拌转速120rpm)的含酶溶液中，滴加过程控制温度为10-20℃；滴加结束继续搅拌(搅拌转速100rpm)，控制温度为20-25℃保温反应6小时；反应结束停止搅拌，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液回收重新去配料，所得下层溶液浓缩、干燥，在干燥的固体中加入乙醇，降温结晶得到R-扁桃酸产品。
本实施例生产得到R-扁桃酸产品101g，测比旋光度-150.1°(c＝2.5，H2O)，熔点129～132℃，液相色谱测纯度99.1％。
实施例5
本实施例提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，采用乙酸乙酯为有机溶剂，包括步骤：
取133g扁桃腈与100mL乙酸乙酯，搅拌均匀制成扁桃腈溶液待用；将6g生物催化酶加入到500g水中搅拌均匀并控制温度为20-25℃，制成含酶溶液待用；将配好的扁桃腈溶液缓慢滴加到搅拌状态(搅拌转速120rpm)的含酶溶液中，滴加过程控制温度为10-20℃；滴加结束继续搅拌(搅拌转速100rpm)，控制温度为20-25℃保温反应6小时；反应结束停止搅拌，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液回收重新去配料，所得下层溶液浓缩、干燥，在干燥的固体中加入乙醇，降温结晶得到R-扁桃酸产品。
本实施例生产得到R-扁桃酸产品121g，测比旋光度-146.3°(c＝2.5，H2O)，熔点121～125℃，液相色谱测纯度93.3％。
对比例1
本对比例提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，包括步骤：
取133g扁桃腈与100mL甲基异丁酮，搅拌均匀制成扁桃腈溶液待用；将6g生物催化酶加入到500g水中搅拌均匀并控制温度为20-25℃，制成含酶溶液待用；将配好的扁桃腈溶液缓慢滴加到搅拌状态(搅拌转速120rpm)的含酶溶液中，滴加过程中控制温度为30-35℃；滴加结束继续搅拌(搅拌转速100rpm)，控制温度为20-25℃保温反应6小时；反应结束停止搅拌，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液回收重新去配料，所得下层溶液浓缩、干燥，在干燥的固体中加入乙醇，降温结晶得到R-扁桃酸产品。
本对比例生产得到R-扁桃酸产品31g，测比旋光度-149.3°(c＝2.5，H2O)，熔点126～129℃，液相色谱测纯度96.3％。
对比例2
本对比例提供了一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，包括步骤：
取133g扁桃腈与100mL甲基异丁酮，搅拌均匀制成扁桃腈溶液待用；将6g生物催化酶加入到500g水中搅拌均匀并控制温度为20-25℃，制成含酶溶液待用；将配好的扁桃腈溶液缓慢滴加到搅拌状态(搅拌转速120rpm)的含酶溶液中，滴加过程控制温度为10-20℃；滴加结束继续搅拌(搅拌转速100rpm)，控制温度为5-10℃保温反应6小时；反应结束停止搅拌，过滤除去催化酶，将滤液静置分层，所得上层溶液回收重新去配料，所得下层溶液浓缩、干燥，在干燥的固体中加入乙醇，降温结晶得到R-扁桃酸产品。
本对比例生产得到R-扁桃酸产品67g，测比旋光度-150.1°(c＝2.5，H2O)，熔点131～133℃，液相色谱测纯度99.3％。
通过以上实施例和对比例可知，采用甲基异丁酮，并控制滴加时的温度和反应的温度，可以高收率获得产品R-扁桃酸。
本发明的方法通过优化生产工艺，大幅提高了R-扁桃酸产品的收率和纯度。相较现有方法，本发明的生产工艺简单，所用原料价廉易得，反应条件温和、能耗低，对环境友好，反应时间短，产品收率和纯度高，节约了资源和能源。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
将扁桃腈与有机溶剂混合，之后与生物催化酶接触，在20～25℃下反应，生产R-扁桃酸。
2.根据权利要求1所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲基异丁酮、乙酸乙酯、甲苯中的一种或多种；优选为甲基异丁酮。
3.根据权利要求1或2所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述扁桃腈与有机溶剂的用量配比为(1g～1.5g)：1mL。
4.根据权利要求1所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述与生物催化酶接触之前，先将生物催化酶与水混合制成含酶溶液；优选地，所述生物催化酶与水的质量配比为(0.01～0.1)：1，进一步优选，所述生物催化酶与水的质量配比为(0.01～0.02)：1。
5.根据权利要求4所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述接触为将扁桃腈与有机溶剂的混合溶液滴加到含酶溶液中，并控制温度为10～25℃，优选控制为10～20℃；进一步优选地，所述滴加过程在搅拌条件下进行，搅拌转速为100～130rpm。
6.根据权利要求1所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述生物催化酶为腈水解酶，选自野生型腈水解酶和/或突变型腈水解酶；优选地，所述生物催化酶的添加量为每100克扁桃腈添加生物催化酶4～6克。
7.根据权利要求1所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述反应的时间为6～8小时；优选地，所述反应在搅拌条件下进行，搅拌转速为80-110rpm。
8.根据权利要求1所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述反应完成后，过滤除去生物催化酶，将滤液静置分层，得到上层溶液和含有R-扁桃酸的下层溶液。
9.根据权利要求8所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述下层溶液浓缩、干燥后重结晶，得到R-扁桃酸晶体；优选地，所述重结晶使用乙醇溶剂，先将干燥后的固体完全溶解，之后降温结晶。
10.根据权利要求8所述的生物催化生产R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述上层溶液回收后重复使用，与新的扁桃腈混合进行配料，之后再催化生产R-扁桃酸。
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