CN102329757A

CN102329757A - 一种用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂及其应用

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Publication number: CN102329757A
Application number: CN201110304076A
Authority: CN
Inventors: 孙安顺
Original assignee: Individual
Current assignee: Cai Jianhua
Priority date: 2011-10-10
Filing date: 2011-10-10
Publication date: 2012-01-25

Abstract

本发明涉及一种用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂及其应用。该催化剂：菌体发酵培养；催化剂悬浮液制取；催化剂的应用，包括如下步骤：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在光照、常压，温度为25℃，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20％(wt)，经过10h的反应，获得丙烯酰胺溶液；催化剂悬浮液与丙烯腈反应液质量比为1∶100～1∶200之间。本发明的光敏性腈水合酶恶臭假单胞菌菌种，经传统发酵、水合催化合成丙烯酰胺，利用本发明菌株合成的丙烯酰胺水合产物浓度高，减少了浓缩的负担，且副产物少，产品纯度高，适合工业化生产丙烯酰胺。

Description

一种用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂及其应用。

背景技术

丙烯酰胺是一种用途广泛的有机化工原料，以它为单体合成的产品不下百种，其中以聚丙烯酰胺用途最广。聚丙烯酰胺的主要用途是用于油田调整吸水剖面和“三次采油”中，近年来，为适应我国原油“三次采油”对超高分子量聚丙烯酰胺(相对分子质量≥2000万)的需求，丙烯酰胺的生产将有较大的发展。

丙烯酰胺是以丙烯腈为原料水合而成，从20世纪50年代至今，生产工艺先后经历了硫酸水合、铜系催化的化学水合及微生物腈水合酶生物转化3个发展阶段。1973年，法国研究者Galzy及其研究组发现了一种能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物BrevbacteriumR312，从而开始了用微生物成产丙烯酰胺的研究。1985年，日本日东公司建成了世界上第一个微生物法生产丙烯酰胺的工业性装置。上海农药所也在1986年从泰山的土壤中找到了一株产腈水合酶的菌株，并开始了微生物法生产丙烯酰胺的研究。与铜系催化法相比，微生物法有许多优点：酶催化反应在常温、常压下进行，提高了生产安全性；丙烯腈的转化率接近100％，不需回收未反应原料；由于省去了铜分离工段，产品中不含铜离子，产品纯度高，特别适合生产超高分子量的聚丙烯酰胺；工艺过程简单，设备投资少，生产经济效益高。微生物法催化生产丙烯酰胺是石油化工骨干产品利用酶催化技术成功的第一范例，具有划时代的意义。腈水合酶是一种可以把腈化合物的腈基进行水合后转变为酰胺基，制造对应的酰胺化合物的微生物的酶，腈水合酶作为催化剂催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的方法正成为主流。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂及其应用，本发明的光敏性腈水合酶恶臭假单胞菌菌种，经传统发酵、水合催化合成丙烯酰胺，利用本发明菌株合成的丙烯酰胺水合产物浓度高，减少了浓缩的负担，且副产物少，产品纯度高，适合工业化生产丙烯酰胺。

本发明所采用的技术方案是：该用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂：

菌体发酵培养：将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，摇床转速100～200r·min^-1，温度为25～40℃，每6小时用4mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，使之维持在6.5～7.5之间，培养50～100h后得到具有腈水合酶活力的发酵液，且发酵液的总酶活达800～1200万单位/毫升发酵液；

催化剂悬浮液：将发酵液在分离因素≥4000离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或20mM、pH为7.0～8.0的磷酸钾缓冲溶液中，配成细胞浓度为5％(wt)的催化剂悬浮液。

上述方案中所用的固体培养基配方为：甘油0.2～2％、酵母浸膏0.5～1.5％、琼脂0.2～2％、尿素0.1～1％、K₂HPO₄ 0.1～0.5％、KH₂PO₄0.1～0.5％、NaCl 0.1～1％及MgSO₄ 0.005～0.02％，脱盐水10～15％，余量为淀粉；发酵培养基配方为：甘油0.2～2％，酵母浸膏0.5～1.5％，谷氨酸0.2～2％，尿素0.2～2％，K₂HPO₄ 0.1～0.5％，KH₂PO₄ 0.1～0.5％，MgSO₄ 0.005～0.02％，Fe³⁺ 0.001～0.01％，pH值6.5～7.5，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。

含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂的应用：包括如下步骤：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在光照、常压，温度为25℃，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20％(wt)，经过10h的反应，获得丙烯酰胺溶液；催化剂悬浮液与丙烯腈反应液质量比为1∶100～1∶200之间。

上述发酵过程中添加的Fe³⁺为FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃、Fe(NO)₃中的任意一种；丙烯腈反应液丙烯腈和水。

上述所述光照条件为日光灯照射发酵罐。

本发明所具有的有益效果是：是通过在传统发酵过程中培养基中加入Fe³⁺生产含有腈水合酶的恶臭假单胞菌菌株或其诱变菌株细胞，并将该细胞从培养液中分离制成催化剂悬浮液，催化丙烯腈水合成丙烯酰胺水溶液，在传统工艺条件下采用光照发酵罐，丙烯腈的转化率可达99.99％，所获得的丙烯酰胺水溶液经过纳滤、离子交换等工序，即可获得高纯度的丙烯酰胺水溶液。本发明通过在发酵过程中加入Fe³⁺，显著提高了腈水合酶的酶活性，将酶活性提高50％以上的同时使发酵的培养周期大大缩短了；此外，本发明还在丙烯腈水合阶段增加了光照条件，从而使丙烯腈水合酶的酶活性大大提高了，并且将腈水合酶半衰期延长了1.5倍。利用本发明菌株合成的丙烯酰胺水合产物浓度高，减少了浓缩的负担，且副产物少，产品纯度高，适合工业化生产丙烯酰胺。

本发明中菌株、Fe³⁺、光照条件互相协调作用才能高效催化丙烯腈水合成丙烯酰胺。本发明使用的恶臭假单胞菌菌株及其诱变菌株产生的腈水合酶可将丙烯腈高效转化成丙烯酰胺，其操作过程简单、反应条件温和、对环境污染小、分离提纯简单、丙烯腈转化率高、产品纯度高。

本发明与现有技术相比具有以下特点：

现有技术用于催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的菌株主要有红球菌属、棒杆菌的细菌及其经诱变的菌种。本发明的菌种属于假单胞菌属。该菌株在发酵过程中加入Fe³⁺，水合阶段有光照的条件时，该菌种产酶能力大幅度提高，最高达50毫克/毫升发酵液，而且其单位体积发酵液的总酶活达1200万单位/毫升发酵液。

具体实施方式：

实施例1：

(1)、催化剂悬浮液的制取：

菌体发酵培养：将恶臭假单胞菌菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，摇床转速100r·min^-1，温度为30℃，每6小时用4mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，使之维持在7.5，培养72h后得到具有腈水合酶活力的发酵液。

通过称量法测定菌株产酶能力。取10mL发酵液，在分离因素为5000，离心分离，去上清液，用蒸馏水洗涤三次后，将获得的细胞置于红外干燥箱内，85℃干燥至恒重，约4h，取出放入干燥器内，冷却后称量。由上述方法测得的产酶能力为40.3毫克/毫升发酵液。

将上述发酵液在分离因素为5000，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于20mM、pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中，配成细胞浓度为5％(wt)的催化剂悬浮液。

(2)、利用催化剂悬浮液合成丙烯酰胺：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在日光照射发酵液、常压，温度为25℃，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20％(wt)，经过10h的反应，获得浓度为26.74％的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率99.81％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度0.00005％。发酵液与丙烯腈反应液的质量比为1∶120。采用高压液相色谱法(HPLC)分析丙烯腈及转化产物丙烯酰胺，配制两者的混合溶液做标准曲线，通过外标法定量，测定反应液中腈水合酶活力.由上述方法测得的腈水合酶活力为800u/mL。

固体培养基：甘油0.5％，酵母浸膏1％，琼脂1％，尿素0.3％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，NaCl0.5％，MgSO₄0.01％，脱盐水10～15％，余量为淀粉；发酵培养基：甘油1.5％，酵母浸膏1％，谷氨酸1％，尿素1.2％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.01％，Fe³⁺0.003％，pH值7，余量为脱盐水。

实施例2：

(1)、催化剂悬浮液的制取：

菌体发酵培养：将恶臭假单胞菌菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，摇床转速100r·min^-1，温度为30℃，每6小时用4mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，使之维持在7.5，培养72h后得到具有腈水合酶活力的发酵液。由上述方法测得的产酶能力为45.6毫克/毫升发酵液。

(2)、利用催化剂悬浮液合成丙烯酰胺：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在日光照射发酵液、常压，温度为25℃下，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20％(wt)，经过15h的反应，获得浓度为29.45％的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率99.93％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度0.00002％。发酵液与丙烯腈反应液的质量比为1∶100。由上述方法测得的腈水合酶活力为1100u/mL。

固体培养基：甘油0.5％，酵母浸膏1％，琼脂1％，尿素0.3％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，NaCl0.5％，MgSO₄0.01％，脱盐水10～15％，余量为淀粉；

发酵培养基：甘油1.5％，酵母浸膏1％，谷氨酸1％，尿素1.2％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.01％，Fe³⁺0.005％，pH值7，余量为脱盐水。

实施例3：

(1)、催化剂悬浮液的制取：

菌体发酵培养：将恶臭假单胞菌菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，摇床转速100r·min^-1，温度为35℃，每6小时用4mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，使之维持在7.5，培养60h后得到具有腈水合酶活力的发酵液。由上述方法测得的产酶能力为48.1毫克/毫升发酵液。

(2)、利用催化剂悬浮液合成丙烯酰胺：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在日光照射发酵液、常压，温度为25℃下，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应丙烯腈的添加量占反应体系的20％(wt)，经过10h的反应，获得浓度为26.72％的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率99.75％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度0.00006％。发酵液与丙烯腈反应液的质量比为1∶150。由上述方法测得的腈水合酶活力为1000u/mL。

固体培养基：甘油0.5％，酵母浸膏1％，琼脂1％，尿素0.3％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，NaCl 0.5％，MgSO₄0.01％，脱盐水10～15％，余量为淀粉；

发酵培养基：甘油1.5％，酵母浸膏1％，谷氨酸1％，尿素1.2％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.01％，Fe³⁺0.008％，pH值7.5，余量为脱盐水。

实施例4：

(1)、菌体发酵培养：将恶臭假单胞菌菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，摇床转速100r·min^-1，温度为35℃，每6小时用4mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，使之维持在7.5，培养50h后得到具有腈水合酶活力的发酵液。由上述方法测得的产酶能力为49.8毫克/毫升发酵液。

(2)、利用催化剂悬浮液合成丙烯酰胺：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在日光照射发酵液、常压，温度为25℃下，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20％(wt)，经过20h的反应，获得浓度为29.47％的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率99.99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度0.00003％。发酵液与丙烯腈反应液的质量比为1∶100。由上述方法测得的腈水合酶活力为1000u/mL。

固体培养基：甘油0.5％，酵母浸膏1％，琼脂1％，尿素0.3％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，NaCl 0.5％，MgSO₄0.01％，脱盐水10～15％，余量为淀粉；发酵培养基：甘油1.5％，酵母浸膏1％，谷氨酸1％，尿素1.2％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.01％，Fe³⁺0.01％，pH值7.5，余量为脱盐水。

实施例5：

本实施例在发酵过程中未加入Fe³⁺，且在水合阶段没用光照条件，以和上述实施例4进行对比。

(1)、催化剂悬浮液的制取：

菌体发酵培养：将恶臭假单胞菌菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，摇床转速100r·min^-1，温度为35℃，每6小时用4mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，使之维持在7，培养90h后得到具有腈水合酶活力的发酵液。

由上述方法测得的产酶能力为15.7毫克/毫升发酵液.

将上述发酵液在分离因素为5000，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于20mM、pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中，配成浓度为5％(wt)的催化剂悬浮液。发酵液与丙烯腈反应液的质量比为1∶100。

(1)、利用催化剂悬浮液合成丙烯酰胺：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在常压，温度为25℃，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的22％(wt)，经过10h的反应，获得浓度为8.9％的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率30.4％。

由上述方法测得的腈水合酶活力为106u/mL.

固体培养基：甘油0.8％，酵母浸膏1％，琼脂1％，尿素0.3％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，NaCl0.5％，MgSO₄0.01％，脱盐水10％，余量为淀粉；

发酵培养基：甘油1.5％，酵母浸膏1％，谷氨酸1％，尿素1.2％，K₂HPO₄0.3％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.01％，pH值7，余量为脱盐水。

上述实施例中所用的百分比为质量百分比。

Claims

1.一种用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂，

催化剂悬浮液：将发酵液在分离因素≥4000离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或20mM、pH为7.0～8.0的磷酸钾缓冲溶液中，配成细胞浓度为5％(wt)的催化剂悬浮液；

上述方案中所用的固体培养基配方为：甘油0.2～2％、酵母浸膏0.5～1.5％、琼脂0.2～2％、尿素0.1～1％、K₂HPO₄0.1～0.5％、KH₂PO₄0.1～0.5％、NaCl0.1～1％及MgSO₄0.005～0.02％，脱盐水10～15％，余量为淀粉；发酵培养基配方为：甘油0.2～2％，酵母浸膏0.5～1.5％，谷氨酸0.2～2％，尿素0.2～2％，K₂HPO₄0.1～0.5％，KH₂PO₄0.1～0.5％，MgSO₄0.005～0.02％，Fe³⁺0.001～0.01％，pH值6.5～7.5，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。

2.权利要求1所述的用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂，其特征在于：菌体发酵培养：将菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，摇床转速100r·min^-1，温度为35℃，每6小时用4mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，使之维持在7.5，培养72h后得到具有腈水合酶活力的发酵液；且发酵液的总酶活达800～1200万单位/毫升发酵液；

将上述发酵液在分离因素为5000，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于20mM、pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中，配成细胞浓度为5％(wt)的催化剂悬浮液；

固体培养基：甘油0.5％，酵母浸膏1％，琼脂1％、尿素0.3％、K₂HPO₄0.3％、KH₂PO₄0.3％、NaCl 0.5％、MgSO₄0.01％、脱盐水10～15％，余量为淀粉；

发酵培养基：甘油1.5％、酵母浸膏1％、谷氨酸1％、尿素1.2％、K₂HPO₄0.3％、KH₂PO₄0.3％、MgSO₄0.01％、Fe³⁺0.003％，pH值7，余量为脱盐水。

3.权利要求3所述的用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化剂的应用，包括如下步骤：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，在光照、常压，温度为25℃，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20％(wt)，经过10h的反应，获得丙烯酰胺溶液；催化剂悬浮液与丙烯腈反应液质量比为1∶100～1∶200之间。