CN101955978A

CN101955978A - 添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法

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Publication number: CN101955978A
Application number: CN201010268074.5A
Authority: CN
Inventors: 姜岷; 方晓江; 李建; 郑晓宇; 奚永兰; 张敏; 韦萍; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2011-01-26

Abstract

添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，步骤是，菌种活化：菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37℃厌氧培养箱中活化培养24h；种子培养：活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37℃培养后作为种子液；发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为体积比3~10%，特征是，在发酵罐培养基中添加有渗透压保护剂，渗透压保护剂的加入量为：1g/L~6g/L。本发明通过添加渗透压保护剂，保护菌体细胞在高底物、高产物和高金属离子浓度时的渗透压，维持菌体活力，实现丁二酸的浓度与生产强度较大幅度的提高，降低丁二酸生产过程中的能耗，提高了生产效率，具有工业化应用价值。

Description

添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法

技术领域

本发明属于有机酸生产技术领域，涉及一种添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法。

背景技术

丁二酸，俗称琥珀酸，作为一种常见的天然有机酸，广泛存在于动植物和微生物中，许多厌氧微生物以丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为一种优秀的C4平台化合物，丁二酸可被广泛用于药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物前体，如可作为1，4-丁二醇、四氢呋喃、脂肪酸、γ-丁内酯等的中间物，而这些化学制品都具有很大的市场潜力。

利用生物法转化可再生资源生产丁二酸，成本低，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收大量的CO₂用于菌株的代谢，能够有效减轻温室效应，这也是丁二酸生产有别于传统有机酸生产的一个重要特点。生物法生产丁二酸的主要原料是葡萄糖和木糖等糖类物质，其来源广泛且价格低廉(玉米、废乳清、工业生产废料等)，可以减少石油、煤等不可再生资源的消耗，大大缓解现今社会的能源短缺。美国能源部的报告表明，丁二酸的生物生产法的应用每年将为全世界节约大约1.034×1016J的能源。另外，生物法制备丁二酸的过程中，吸收并固定大量的CO₂温室气体，能够减少温室气体的排放，缓解由温室效应所导致的全球气候变暖的现状。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1公开了丁二酸生产菌及其发酵方法，这些生产菌株大多是从瘤胃、狗的口腔等特征性厌氧环境中筛选出来的，在发酵过程中存在产物收率较低、副产物较多、丁二酸浓度偏低、生产强度较低的问题，因此开发高效的丁二酸生产方法是目前丞待解决的问题。

在丁二酸生产菌发酵产酸过程中，由于有主要产物丁二酸及其甲酸，乙酸，乳酸等副产物的产生会降低发酵罐中的pH，为了维持菌体生长的最适pH，在发酵过程中需要用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸镁等碱来中和产生的酸，随着在发酵过程中碱的不断流入，发酵罐中金属离子浓度的不断升高必然导致渗透压的升高，过高的渗透压将影响菌体的生长和产酸。而渗透压保护剂比如甜菜碱、海藻糖、脯氨酸、甘氨酸等渗透压保护剂能够很好的缓解环境中渗透压过高的问题，因此发酵过程中添加适当的渗透压保护剂，从而提高了生产强度。专利文件CN101457243公开了一种提高L-谷氨酸发酵产率的新工艺，发明了在发酵培养基中添加甜菜碱、脯氨酸的方法，来有效提高L-谷氨酸发酵产率。目前国内外还未见利用渗透压保护剂应用于丁二酸的发酵生产中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种添加渗透压保护剂提高厌氧发酵产丁二酸生产强度的方法，以提高丁二酸的生产强度与浓度。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是，一种添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，步骤如下：

菌种活化：菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37℃厌氧培养箱中活化培养24h；

种子培养：活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37℃培养10～12h后作为种子液；

发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为体积比3～10％，温度为35～40℃，始终通入CO₂气体来保持厌氧环境，整个发酵过程中pH控制在6.5～7.0，搅拌速度为100～300rpm，发酵30～48h。

其特征在于，在所述发酵罐培养的培养基中，添加有渗透压保护剂，所述的渗透压保护剂的加入量为：1g/L～6g/L。

本发明所述的渗透压保护剂选自：甜菜碱、海藻糖、甘氨酸或脯氨酸等中的一种或多种。

换言之，本发明菌种活化、种子培养与发酵罐培养等步骤，可以采用与传统方法基本相同的步骤，其主要区别是在发酵罐培养步骤中加入了渗透压保护剂。

本发明推荐：接种量采用体积比7％；搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25vvm。本发明推荐：所述的渗透压保护剂的加入量为：1～5g/L；最佳值为：2.9g/L。

培养基加入了渗透压保护剂之后，菌体浓度明显比未添加的高，同时发酵周期得到较大幅度缩短。其原理是：根据微生物厌氧发酵产丁二酸的特性，在发酵体系中添加了适量的渗透压保护剂，而这些渗透压保护剂大都是亲水性的物质，它们能够进入细胞，维持菌体细胞在高底物、高产物和高金属离子浓度时的渗透压，防止菌体因渗透压过高而失水死亡。较高的菌体量保证了丁二酸的浓度与生产强度较大幅度的提高，从而降低了丁二酸生产过程中的能耗，提高了生产效率。

本发明所述的厌氧发酵生产丁二酸的微生物为从特征厌氧环境中筛选出的丁二酸生产菌株，包括产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO.1716)，产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618)，重组大肠杆菌Escherichia coli，产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirilum succiniciproducens(ATCC 53488)。以上菌种均为本领域早已公开使用，公开销售的菌种，公众能够通过公开途径获得这些菌种。

本发明所述的菌种活化步骤中，菌株活化的斜面培养基为pH6.0～8.0的能提供碳源、氮源及无机盐的固体斜面培养基，培养时将菌体在斜面培养基中平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱含N₂、CO₂和H₂的混合气体，温度为30～40℃，活化培养24～48h，用于种子培养基接种和菌株保存。

本发明所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为pH6.0～8.0的能够提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，培养时在100mL的血清瓶中加入20～80mL的种子培养基，通入CO₂气体1min，在115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入斜面培养菌株，在温度为30～40℃，摇床转速为100～300rpm的条件下培养10～16h，用于发酵培养基接种。

本发明所述的发酵步骤中，发酵培养的培养基为pH6.0～8.0的能够提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，并加入渗透压保护剂，3L发酵罐中装1.5L发酵培养基，接种量为体积比3～10％，温度为35～40℃，始终通入CO₂气体来保持厌氧环境，整个发酵过程中pH控制在6.5～7.0，搅拌速度为100～300rpm，发酵30～48h。

本发明所述的渗透压保护剂包括甜菜碱、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸等中的一种或多种。

本发明通过在丁二酸发酵体系中添加了适量的渗透压保护剂，保护菌体细胞在高底物、高产物和高金属离子浓度时的渗透压，维持菌体活力，实现丁二酸的浓度与生产强度较大幅度的提高，降低丁二酸生产过程中的能耗，提高了生产效率，具有工业化应用价值。

说明书附图

图1为未添加脯氨酸的发酵进程曲线；

图2为添加了脯氨酸之后的发酵进程曲线。

具体实施方式

以下所述实施例对本发明做了详细说明，但对本发明没有限制

实施例1

菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO.1716)该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为CN100537744C。

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10(分消)，酵母膏5，NaHCO₃ 10，NaH₂PO₄·2H₂O 9.6，K₂HPO₄·3H₂O 15.5，琼脂20，pH 7.0，121℃灭菌15min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10(分消)，酵母膏5，NaHCO₃ 10，NaH₂PO₄·2H₂O 9.6，K₂HPO₄·3H₂O 15.5，pH 7.0，121℃灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60(分消)，酵母膏10，富马酸二钠1，KH₂PO 3，MgCl₂·6H₂O0.3，CaCl₂ 0.3，NaCl 1，脯氨酸2.9，pH 7.0，121℃灭菌15min。

菌种活化：将冻存于-70℃冰箱的菌种融化后在斜面培养基中进行平板划线后，在37℃厌氧培养箱中活化培养24h后转接到种子培养基中，200r/min，37℃培养10～12h后作为种子液。

3L发酵罐培养：3L发酵罐培养时装液量为1.5L，将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25vvm。结果见表1、图A、图B通过添加了2.9g/L的脯氨酸之后菌体浓度明显比未添加的高，同时发酵周期缩短了30％。

表1未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比

实施例2

本实施例采用与实施例1完全相同的菌种、发酵条件和实验方法。

在3L发酵罐中添加了2.9g/L的脯氨酸。结果见表2。经过48h发酵，添加2.9g/L的脯氨酸，丁二酸的产量比未添加脯氨酸的增加了21.7％。

表2未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比

实施例3

本实施例采用与实施例1完全相同的菌种、发酵条件和实验方法

在3L发酵罐中添加了5.35g/L的脯氨酸。结果见表3。添加5.35g/L的甜菜碱比未添加甜菜碱的发酵周期缩短了18％。

表3未添加甜菜碱与添加甜菜碱结果对比

实施例4

在3L发酵罐中添加了5.35g/L的甜菜碱。结果见表4，通过添加5.35g/L的甜菜碱比未添加甜菜碱的丁二酸的浓度提高了11.9％。

表4未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比

实施例5

菌种：产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirilum succiniciproducens(ATCC 53488)。

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10(分消)，酵母膏5，蛋白胨5，NaHCO₃ 10，Na₂HPO₄·2H₂O15，KH₂PO₄·3H₂O 4，琼脂20，pH 7.0，121℃灭菌15min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10(分消)，酵母膏5，蛋白胨5，NaHCO₃ 10，Na₂HPO₄·2H₂O15，KH₂PO₄·3H₂O 4，pH 7.0，121℃灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60(分消)，酵母膏10，蛋白胨10，MnCl₂0.05，FeCl₂ 0.05，K₂HPO₄ 2.0，CaCl₂ 0.05，脯氨酸2.9，pH 7.0，121℃灭菌15min。

菌种活化：将冻存于-70℃冰箱的菌种融化后在斜面培养基中进行平板划线后，培养24h后转接到种子培养基中，200r/min，37℃培养10～12h后作为种子液。

3L发酵罐培养：3L发酵罐培养时装液量为1.5L，将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25vvm。发酵结果见表5，通过添加了2.9g/L脯氨酸之后，在相同初糖浓度下，葡萄糖完全耗完，发酵周期缩短了23％。

表5未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比

实施例6

菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succmogenes 130Z(ATCC55618)。本实施例采用与实施例1完全相同的菌种、发酵条件和实验方法。通过添加了2.9g/L的脯氨酸比未添加的周期缩短了29.73％。

表6未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比

实施例7，与实施例1基本相同，但所用的菌种改为重组大肠杆菌Escherichia coli。

实施例8，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂的加入量为：3g/L。

实施例9，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂的加入量为：1g/L。

实施例10，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂为甜菜碱与海藻糖各50％。

实施例11，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂为甜菜碱与甘氨酸各50％。实施例12，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂为甜菜碱与脯氨酸各50％。实施例13，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂为海藻糖与甘氨酸各50％。实施例14，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂为脯氨酸与甘氨酸各50％。实施例15，与实施例1基本相同，但所述的渗透压保护剂为甜菜碱、海藻糖、甘氨酸与脯氨酸各25％。

Claims

1.一种添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，步骤如下：

菌种活化：菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37 ℃厌氧培养箱中活化培养24 h；种子培养：活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37 ℃培养10~12 h后作为种子液；

发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为体积比3~10 %，其特征在于，在所述发酵罐培养的培养基中，添加有渗透压保护剂，所述的渗透压保护剂的加入量为：1 g/L~6 g/L。

2. 根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述的厌氧发酵生产丁二酸的微生物选自：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113、产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes 130Z 、重组大肠杆菌 Escherichia coli，或产琥珀酸厌氧螺菌 Anaerobiospirilum succiniciproducens。

3.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述的渗透压保护剂选自：甜菜碱、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述的菌种活化步骤中，菌株活化的斜面培养基为pH6.0~8.0的能提供碳源、氮源及无机盐的固体斜面培养基，培养时将菌体在斜面培养基中平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱含N₂、CO₂和H₂的混合气体，温度为30~40 ^??C，活化培养24~48 h，用于种子培养基接种和菌株保存。

5.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为pH6.0~8.0的能够提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，培养时在100mL的血清瓶中加入20~80 mL的种子培养基，通入CO₂气体1 min，在115~121 ^??C灭菌15~30 min，冷却后接入斜面培养菌株，在温度为30~40 ^??C，摇床转速为100~300 rpm的条件下培养10~16 h，用于发酵培养基接种。

6.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述的发酵步骤中，发酵培养的培养基为pH6.0~8.0的能够提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，并加入渗透压保护剂，3 L发酵罐中装1.5 L发酵培养基，接种量为体积比7%，温度为35~40 ^??C，始终通入CO₂气体来保持厌氧环境，整个发酵过程中pH控制在6.5~7.0，搅拌速度为100~300 rpm，发酵30~48 h。

7.根据权利要求6所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述发酵罐培养的条件是：搅拌转速为200 rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25 vvm。

8.根据权利要求1~7之一所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述的渗透压保护剂的加入量为：1~5 g/L。

9.根据权利要求8所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，所述的渗透压保护剂的加入量为：2.9 g/L。