CN104968367B - 抗血凝素抗体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗血凝素抗体、包含抗血凝素抗体的组合物和使用这些抗体的方法。

Description

抗血凝素抗体和使用方法
相关申请
本申请要求2012年11月13日提交的美国临时申请号61/725,859的权益，该文献通过引用的方式完整并入本文。
序列表
本申请含有已经通过电子方式以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。2013年10月22日创建的所述ASCII副本命名为P4982R1_US_SL.txt并且大小为222,627比特。
技术领域
本发明提供抗血凝素抗体、包含抗血凝素抗体的组合物和使用这些抗体的方法。
背景技术
流感病毒感染每年在全世界造成三百万至五百万严重疾病病例和250,000和500,000例死亡。单在美国，每年5％至20％的人群遭流感病毒感染，这些感染大部分由甲型流感病毒引起。((参见，例如，Dushoff等人,(2006)Am J Epidemiology 163:181-187；Thompson等人,(2004)JAMA 292:1333-1340；Thompson等人,(2003)JAMA 289:179-186)。在美国每年大约200,000人在具有流感相关并发症的情况下住院，导致每年7,000至30,000例死亡。与流感病毒感染相关的医疗费用和生产率损失负担是庞大的。住院和死亡主要地出现在高风险组，如老年人、儿童和长期病人中。
流感病毒是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的分节段有包膜负链RNA病毒。甲型流感病毒由9种结构蛋白和1种非结构性蛋白组成，这些蛋白质包含三种病毒表面蛋白：血凝素(HA或H)、神经氨酸酶(NA或N)和基质蛋白2(M2)。流感病毒基因组的分节段性质引起遗传重配机制(即，基因组区段交换)在不同流感病毒株混合感染细胞期间发生。 当病毒表面蛋白血凝素和神经氨酸酶的抗原性特性改变时，流感的年度流行性出现。抗原性改变机制具有双重性：由至少两个病毒亚型共感染宿主细胞后人病毒和动物病毒之间的遗传重排引起的抗原性转变，这可能造成大流行；和由病毒表面上血凝素和神经氨酸酶蛋白质中的小变化引起的抗原性漂移，这可能造成流感流行。
根据其表面上展示的不同血凝素病毒蛋白和神经氨酸酶病毒蛋白，甲型流感病毒可以进一步划分成各种亚型。通过其血凝素和神经氨酸酶蛋白的组合来识别每种甲型流感病毒亚型。存在16个已知的HA亚型(H1–H16)和9个已知的NA亚型(N1–N9)。16个血凝素亚型进一步划分成两个***进化群：群1包括血凝素H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16亚型；群2包括血凝素H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型。
血凝素促进病毒附着和进入宿主细胞；神经氨酸酶是病毒从感染细胞出芽必需的。甲型流感病毒的血凝素包含两个在结构上不同的区域-球状头部区和茎部区或茎区。球状头部区含有负责病毒与靶细胞接合的受体结合位置。血凝素的茎部(或茎)区含有在病毒包膜和感染细胞的内体膜之间膜融合必需的融合肽。(参见，例如，Bouvier和Palese(2008)Vaccine 26Suppl 4:D49-53；Wiley等人,(1987)Ann Rev Biochem556:365-394)。
流感病毒感染的当前治疗药包括神经氨酸酶抑制剂，如奥塞米韦和扎那米韦。奥塞米韦是针对甲型流感病毒感染广泛使用的预防性和早期治疗性治疗选项。((参见，例如，Kandel和Hartshorn(2001)BioDrugs:Clinical Immunotherapy,Biopharmaceuticals andGene Therapy15:303-323；Nicholson等人,(2000)Lancet 355:1845-1850；Treanor等人,(2000)JAMA 283:1016-1024；和Welliver等人,(2001)JAMA285:748-754)。然而，奥塞米韦治疗必须在症状开始48小以内开始以提供明显的临床益处。(参见，例如，Aoki等人,(2003)J Antimicrobial Chemotherapy 51:123-129)。这种必要性损害奥塞米韦治疗严重病情患者的能力，这些患者一般在寻求治疗时超出最佳48小时治疗窗口之外。因此，近来人们明显关注鉴定治疗流感病毒感染的住院患者的流感病毒治疗药。一项策略致力于开发靶向甲型流感病毒血凝素茎部上高度保守表位的人单克隆抗体(mAb)。(参见，例如，Corti等人,(2011)Science333:850-856；Ekiert等人,(2009)Science 324:246-251；Ekiert等人,(2011)Science 333:843-850；Sui等人,(2009)Nature Structural&Molecular Biology16:265-273；Dreyfus等人,(2012)Science 337:1343-1348；Wu等人,(2012)J Virology2012.09.034；Clementi等人,(2011)PLoS One6:1-10)。还参见国际专利申请公开号：WO2009/115972、WO 2011/117848、WO 2008/110937、WO 2010/010466、WO 2008/028946、WO2010/130636、WO 2012/021786、WO 2010/073647、WO 2011/160083、WO 2011/111966、WO2002/46235和WO 2009/053604；美国专利号5,631,350和5,589,174)。
几分报告已经描述了结合血凝素并广泛中和甲型流感病毒的单克隆抗体(mAb)。例如，Corti等人(上文)描述了从人浆细胞克隆并显示中和属于群1和群2血凝素亚型的人甲型流感病毒的抗体FI6v3。FI6v3mAb因史诗般地努力分析大约104,000个人浆细胞而发现。另外，Dreyfus等人(上文)最近描述通过噬菌体展示淘洗鉴定抗体CR9114；抗体CR9114显示与甲型流感病毒和乙型流感病毒血凝素之间共有的高度保守茎部表位结合。
尽管这些报道，本领域仍然需要有效对抗群1和群2甲型流感病毒亚型的新甲型流感病毒治疗药。本发明满足这种需求和提供治疗甲型流感病毒感染的其他益处。
发明概述
本发明提供抗血凝素抗体、包含抗血凝素抗体的组合物和使用这些抗体的方法。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:180和181的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:182、183、184、185和186的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:188、189和190的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:180和181的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:182、183、184、185和186的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:188、189和190的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:182、183、184、185和186的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:188、189和190的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:180和181的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:182、183、184、185和186的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:188、189和190的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:180和181的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:111和115的氨基酸序列，并且轻链可变区包含选自SEQ ID NO:113、117、119、122、124、126、128、130和132的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:113、117、119、122、124、126、128、130和132的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:111和115的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链和轻链，其中重链包含选自SEQ ID NO:110、114和120的氨基酸序列，并且轻链包含选自SEQ ID NO:112、116、118、121、123、125、127、129和131的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:112、116、118、121、123、125、127、129和131的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:110、114和120的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:191和192的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:197、198和199的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:191和192的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:197、198和199的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:197、198和199的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:191和192的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:197、198和199的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:191和192的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:134、138、142、148和234的氨基酸序列，并且轻链可变区包含选自SEQ ID NO:136、140、144、146、150、152和235的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:136、140、144、146、150、152和235的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:134、138、142、148和234的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链和轻链，其中重链包含选自SEQ ID NO:133、137、141和147的氨基酸序列， 并且轻链包含选自SEQ ID NO:135、139、143、145、149和151的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:135、139、143、145、149和151的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:133、137、141和147的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:154和158的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQID NO:156的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:1154和158的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链和轻链，其中重链包含选自SEQ ID NO:153和157的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链，所述轻链包含SEQID NO:155的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:153和157的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链，所述轻链包含SEQID NO:161的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链，所述重链包含SEQID NO:159的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链，所述轻链包含SEQID NO:165的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链，所述重链包含SEQID NO:163的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含轻链，所述轻链包含SEQID NO:169的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体包含重链，所述重链包含SEQID NO:167的氨基酸序列。
本发明也提供编码本发明抗血凝素抗体的分离核酸。本发明也提供载体，所述载体包含编码本发明抗血凝素抗体的核酸。本发明也提供包含本发明核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型，例如，重组载体如表达载体。可以使用多种宿主细胞的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还提供一种产生本发明抗血凝素抗体的方法。例如，本发明提供用于产生抗血凝素抗体(如本文定义，其包括全长抗体及其片段)的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码抗血凝素抗体或其片段的本发明重组载体，从而产生该抗体或其片段。在一些实施方案中，该方法包括培养包含编码本发明抗血凝素抗体(或其片段)的核酸的宿主 细胞，从而表达该核酸。该方法还可以包括从宿主细胞培养物或宿主细胞培养基回收抗血凝素抗体或其片段。
本发明也提供包含本发明抗血凝素抗体和可药用载体的药物制剂。药物制剂还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
本发明也提供包含本发明抗血凝素抗体的组合物。该组合物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
本发明也提供一种用于预防甲型流感病毒感染的包含本发明抗血凝素抗体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防甲型流感病毒感染的包含本发明抗血凝素抗体的药物组合物。本发明还提供一种用于治疗甲型流感病毒感染的包含本发明抗血凝素抗体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗甲型流感病毒感染的包含本发明抗血凝素抗体的药物组合物。本发明还提供一种用于抑制甲型流感病毒感染的包含本发明抗血凝素抗体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种用于抑制甲型流感病毒感染的包含本发明抗血凝素抗体的药物组合物。
包含本发明抗血凝素抗体的组合物也可以用于制造药物。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在某些实施方案中，该药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
本发明也提供一种用于抑制甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗血凝素抗体的组合物，因而抑制甲型流感病毒感染。本发明也提供一种用于治疗甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗血凝素抗体的组合物，因而治疗甲型流感病毒感染。本发明也提供一种用于预防甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗血凝素抗体的组合物，因而预防甲型流感病毒感染。
本发明也提供一种用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗血凝素抗体的组合物，并向该患者施用有效量的额外治疗药，因而抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在一些实施方案中，额外的治疗药是神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦。在其他实施方案中，额外的治疗药是另一种抗血凝素抗体。在另外的其他实施方案中，额外的治疗药是抗M2抗体。在这类联合治疗的多个方面，治疗药在大致相同的时间施用、同时施用或依次或连续施用。在具体的实施方案中，抗神经氨酸酶抑制剂在施用本发明的抗血凝素抗体之前施用。
在另一个方面，本发明提供本发明的抗血凝素抗体在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在某些实施方案中，该药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的核酸在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在某些实施方案中，该药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的表达载体在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在某些实施方案中，该药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在某些实施方案中，该药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的制造品在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在某些实施方案 中，该药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的试剂盒在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感病毒感染。在某些实施方案中，该药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥塞米韦或扎那米韦；另一种抗体如另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体；等)。
在多个方面，本发明的抗血凝素抗体结合血凝素。在一些方面，本发明的抗血凝素抗体结合群1血凝素、结合群2血凝素或结合群1及群2血凝素。在其他其他方面，本发明的抗血凝素抗体结合血凝素并中和甲型流感病毒。在一些实施方案中，本发明的抗血凝素抗体在体外、在体内，或在体外及体内中和甲型流感病毒。
附图简述
图1A和图1B描述这样的数据，所述数据在上半小图和下半小图中分别显示来自SCID/beige小鼠富集之前接种后第7日人外周血单核细胞(PBMC)的抗血凝素阳性(血凝素H3+和血凝素H1+)成浆细胞(图1A)和有抗原预混物和无抗原预混物时SCID/beige小鼠富集之后脾内植入后第8日(图1B)的FACS分析。
图2描述了显示作为血凝素(H1)+/CD38高成浆细胞百分数的脾细胞分析的数据，其中所述脾细胞从8日后来自没有PBMC/抗原预混物(圆圈)和具有PBMC/抗原预混物(正方形)的个体SCID/beige小鼠的PBMC的脾内移植获得。矩形指示展示血凝素H1+成浆细胞的小鼠。
图3描述了显示多种甲型流感群1和群2病毒株被本发明的抗血凝素抗体在体外中和的数据。
图4A和图4B描述了多种甲型流感群1(图4A)和群2(图4B)病毒株被单克隆抗体39.29NWPP(作为SEQ ID NO:117公开的“NWPP”)在体外中和的数据。
图5A和图5B描述了多种甲型流感群1(图5A)和群2(图5B)病毒株被单克隆抗体81.39SVSH-NYP(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”)在体外中和的数据。
图6描述了显示多种甲型流感群1病毒株被单克隆抗体39.18 B11在体外中和的数据。
图7描述了显示多种甲型流感群1和群2病毒株被单克隆抗体36.89在体外中和的数据。
图8描述了显示多种甲型流感群1和群2病毒株被单克隆抗体mAb 9 01F3在体外中和的数据。
图9描述了显示多种甲型流感群1和群2病毒株被单克隆抗体mAb 23 06C2在体外中和的数据。
图10描述了显示表达血凝素H5的假病毒被单克隆抗体39.29NCv1在体外中和的数据。
图11描述了H7N7马流感病毒被单克隆抗体39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)在体外中和的数据。
图12A、图12B、图12C和图12D描述这样的数据，所述数据显示被多种甲型流感病毒株(A/PR/8/1934(PR8)，图12A；A/查莫斯港/1/1973(PC73)，图12B；A/中国香港/1/1968(HK68)，图12C)和A/Aichi/2/1968(Aichi68)，图12D)感染和施用的各种量的单克隆抗体39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)的小鼠的存活百分数。
图13描述这样的数据，所述数据显示被A/PR/8/1934甲型流感病毒感染和施用的各种量的单克隆抗体39.29NCv1的小鼠的存活百分数。
图14描述这样的数据，所述数据显示被A/中国香港/1/1968甲型流感病毒(一种具有高IC50的甲型流感病毒)感染和施用的各种量的单克隆抗体39.29NCv1的小鼠的存活百分数。
图15描述这样的数据，所述数据显示被A/查莫斯港/1/1973甲型流感病毒感染和施用的各种量的单克隆抗体39.29NCv1的小鼠的存活百分数。
图16描述这样的数据，所述数据显示被A/Aichi/2/1968甲型流感病毒感染和施用的各种量的单克隆抗体39.29NCv1的小鼠的存活百分数。
图17描述了比较小鼠存活百分数的数据，所述小鼠被甲型流感病毒株A/PR/8/1934感染并对其施用单克隆抗体39.29D8C2和单克隆抗体39.29NWPP(作为SEQ ID NO:117公开的“NWPP”)或奥塞米韦 的50:50的混合物。
图18描述了比较小鼠存活百分数的数据，所述小鼠被甲型流感病毒株A/PR/8/1934感染并对其施用单克隆抗体39.29NWPP(作为SEQ ID NO:117公开的“NWPP”)、奥塞米韦或单克隆抗体39.29NWPP(作为SEQ ID NO:117公开的“NWPP”)和奥塞米韦组合。
图19A和图19B描述了比较雪貂存活百分数的数据，所述雪貂被甲型流感病毒株A/越南/1203/04(H5N1)感染并在感染后48小时或72小时对其施用单克隆抗体39.29D8C2(图19A)、单克隆抗体81.39B1C1(图19B)或奥塞米韦
图20显示来自血凝素H1、H2、H3、H5和H7的血凝素氨基酸序列的氨基酸序列比对结果，显示单克隆抗体39.29NCv1的血凝素接触残基(加阴影部分)和血凝素结合表位。
图21A和图21B描述了与生物素标记单克隆抗体39.29竞争结合来自A/NWS/1933的血凝素H1(图21A)和来自A/HK/8/1968的血凝素H3(图21B)的本发明多种单克隆抗体的竞争性ELISA实验的数据。
图22A和图22B显示单克隆抗体81.39B1C1的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:113和111)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图23A和图23B显示单克隆抗体81.39SVSH-NYP(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:117和115)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫 球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图24A和图24B显示单克隆抗体81.39B1F1的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:119和111)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图25A和图25B显示单克隆抗体81.39B1C1(作为SEQ ID NO:172公开的“SVDS”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:113和115)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图26A和图26B显示单克隆抗体81.39SVSS(作为SEQ ID NO:173公开的“SVSS”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:122和115)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图27A和图27B显示单克隆抗体81.39SVDH(作为SEQ ID NO:174公开的“SVDS”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:124和115)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图28A和图28B显示mAb 81.39SVSH(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:126和115) 与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图29A和图29B显示单克隆抗体81.39SVSH.NFP(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:128和115)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图30A和图30B显示单克隆抗体81.39SVDS.F(作为SEQ ID NO:172公开的“SVDS”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:130和115)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图31A和图31B显示单克隆抗体81.39SVDS.Y(作为SEQ ID NO:172公开的“SVDS”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:132和115)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和237)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图32A和图32B显示单克隆抗体39.29D2C4的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:136和134)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和245)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图33A和图33B显示单克隆抗体39.29D8C2的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:140和138)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和245)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图34A和图34B显示单克隆抗体39.29NCv1的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:144和142)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和245)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图35A和图35B显示单克隆抗体39.29D8E7的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:146和138)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和245)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图36A和图36B显示单克隆抗体39.29NFPP(作为SEQ ID NO:175公开的“NFPP”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:150和148)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和245)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图37A和图37B显示单克隆抗体39.29NYPP(作为SEQ ID NO:176公开的“NYPP”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:152和148)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和245)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图38A和图38B显示单克隆抗体39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ ID NO:235和234)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变3-30*01种系(IGHV3-30*01)(分别是SEQ ID NO:236和245)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图39A和图39B显示单克隆抗体39.18B11的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:156和154)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变1-69*01种系(IGHV1-69*01)(分别是SEQ ID NO:236和238)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图40A和图40B显示单克隆抗体39.18E12的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:156和158)与免疫球蛋白κ可变3-15*01种系(IGKV3-15*01)和免疫球蛋白重链可变1-69*01种系(IGHV1-69*01)(分别是SEQ ID NO:236和238)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图41A和图41B显示单克隆抗体36.89的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ IDNO:162和160)与免疫球蛋白κ可变1-5*03种系(IGKV1-5*03)和免疫球蛋白重链可变1-18*01种系(IGHV1-18*01)(分别是SEQ ID NO:239和240)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图42A和图42B显示单克隆抗体9.01F3的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQ IDNO:166和164)与免疫球蛋白轻链可变1-44*01种系(IGKV1-44*01)和免疫球蛋白重链可变1-2*02*01种系(IGHV1-2*02)(分别是SEQ ID NO:241和242)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
图43A和图43B显示单克隆抗体23.06C2的轻链可变区和重链可变区(分别是SEQID NO:170和168)与免疫球蛋白κ可变2-30*01种系 (IGKV2-30*01)和免疫球蛋白重链可变的4-39*01种系(IGHV4-39*01)(分别是SEQ ID NO:243和244)的氨基酸序列比对结果。氨基酸是根据Kabat编号的数字。显示Kabat、Chothia和Contact CDR。
本发明实施方案的详细描述
定义
出于本文目的，“接纳体人类框架”是这样的框架，它包含源自如下文定义的人免疫球蛋白框架的或人共有序列框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接纳体人类框架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人类共有框架序列相同。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间总计非共价相互作用的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗血凝素抗体”和“与血凝素结合的抗体”指这样的抗体，所述抗体以足够亲和力结合血凝素，从而该抗体可用作靶向血凝素、包括靶向流感病毒血凝素中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗血凝素抗体与不相关的非血凝素蛋白结合的程度小于该抗体与血凝素结合的程度约10％，如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，与血凝素结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如从10-8M至10-13M、例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗血凝素抗体与来自甲型流感病毒不同毒株、亚型和分离株的血凝素之间保守的血凝素表位结合。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段还指除完整抗体之外的分子，所述分子包含完整抗体的结合血凝素并中和甲型流感病毒的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
“与参考抗体结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，并且反过来，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合达50％或更多。本文提供示例性竞争测定法。
术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的 放射性同位素)；化疗药或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指以该剂量和必要的时间段有效实现所需治疗性或预防性结果的量。
术语“Fc区”在本文中用来限定免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该定义包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系进行编号，也称作EU index。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。
“人抗体”是这样的抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有框架”是这样的框架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部以及全部或基本上全部的与人抗体的那些FR对应的FR区，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR：VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。 本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则HVR残基和可变域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
“编码抗血凝素抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或独立载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现，这类变体通常以微小的量存在)。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有不定结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变域，随后是三个恒定域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变域，随后一个恒定轻链(CL)结 构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同一性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作***(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的 总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非另外说明，否则如本文所用的术语“血凝素”指来自任何流感病毒来源的任何天然血凝素。本术语涵盖“全长”、未加工的血凝素”以及因流感病毒或流感病毒感染的细胞中加工过程产生的任何形式的血凝素。本术语还涵盖天然存在的血凝素变体，例如，剪接变体或等位变体。来自各种甲型流感病毒株的示例性血凝素蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:225(来自A/日本/305/1957的H2)、226(来自A/珀斯/16/2009的H3)、227(来自A/越南/1203/2004的H5)、228(来自A/鸡/NSW/1/1997的H7)、229(来自A/加利福尼亚州/07/2009的H1)、230(来自A/NSW/1933的H1)、231(来自A/中国香港/8/1968的H3)、232(来自A/荷兰/219/2003的H7)和233(A/南加州/1918)中显示。
如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发(例如，预防甲型流感病毒感染的出现或复发)，减少(例如，减少)或减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)通常具 有相似的结构，每种结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人,Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分地基于抗血凝素抗体及其用途。在某些实施方案中，提供与血凝素结合的抗体本发明的抗体例如用于诊断、治疗或预防甲型流感病毒感染。
A.示例性抗血凝素抗体
在一个方面，本发明提供与血凝素结合的分离抗体。在某些实施方案中，本发明的抗血凝素抗体结合血凝素、结合群1血凝素、结合群2血凝素或结合群1及群2血凝素。在其他实施方案中，本发明的抗血凝素抗体在体外中和甲型流感病毒。在其他实施方案中，本发明的抗血凝素抗体在体内中和甲型流感病毒。在另外的其他实施方案中，本发明的抗血凝素抗体减少甲型流感病毒感染、预防甲型流感病毒感染、抑制甲型流感病毒感染或治疗甲型流感病毒感染。在一些实施方案中，本发明的抗血凝素抗体预防、抑制或减少血凝素介导的流感病毒膜和感染细胞内体膜之间的融合(因此预防、抑制或减少病毒RNA进入感染细胞的细胞质，因此预防、抑制或减少流感病毒感染的进一步传播)。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包 含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包 含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包 含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含选自SEQ ID NO:180和181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含选自SEQ ID NO:182、183、184、185和186的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:188、189和190的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:179的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含选自SEQ ID NO:180和181的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:182、183、184、185和186的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含选自SEQ ID NO:188、189和190的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO: 187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:189的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸 序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:188的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:190的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:190的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:187的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:189的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:111和115的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:113、117、119、122、124、126、128、130和132的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:111和115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ IDNO:113、117、119、122、124、126、128、130和132的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链的抗体，所述重链包含选自SEQ ID NO:110、114和120的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链的抗体，所述轻链包含选自SEQ ID NO:112、116、118、121、123、125、127、129和131的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:110、114和120的氨基酸序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:112、116、118、121、123、125、127、129和131的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193 的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:191和192的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含选自SEQ ID NO:197、198和199的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:197的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:197的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:198的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:196的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:199的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:134、138、142、148和234的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含选自136、140、144、146、150、152和235的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含选自134、138、142、148和234的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQID NO:136、140、144、146、150、152和235的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:234的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链的抗体，所述重链包含选自SEQ ID NO:133、137、141和147的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链的抗体，所述轻链包含选自SEQ ID NO:135、139、143、145、149和151的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:133、137、141和147的氨基酸序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:135、139、143、145、149和151的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:201的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:204的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:204的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:154和158的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含SEQID NO:156的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:154和158的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链的抗体，所述重链包含选自SEQ ID NO:153和157的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:153和157的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含 SEQ ID NO:210的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:207的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:210的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:210的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQID NO:160的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含SEQID NO:162的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:213的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:216的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:216的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQID NO:164的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含SEQID NO:166的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种抗血凝素抗体，所述抗血凝素抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:219的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:222的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的HVR-H3； (d)包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:222的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQID NO:168的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含SEQID NO:170的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含重链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种包含轻链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在以上实施方案的任一项中，本发明的抗血凝素抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗血凝素抗体包含如以上实施方案的任一项中的HVR，并且还包含接纳体人类框架，例如，人免疫球蛋白框架或人类共有框架。
在另一个方面，本发明的抗血凝素抗体包含与选自SEQ ID NO:111、115、134、138、142、148、154、158、160、164、168和234的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗血凝素抗体保留与血凝 素结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:111、115、134、138、142、148、154、158、160、164、168或234中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗血凝素抗体包含在SEQ ID NO:111、115、134、138、142、148、154、158、160、164、168或234中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供抗血凝素抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO:113、117、119、122、124、126、128、130、132、136、140、144、146、150、152、156、162、166、170和235的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗血凝素抗体保留与血凝素结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:113、117、119、122、124、126、128、130、132、136、140、144、146、150、152、156、162、166、170或235中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗血凝素抗体包含在113、117、119、122,、124、126、128、130、132、136、140、144、146、150、152、156、162、166、170或235中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供一种抗抗血凝素抗体，其中该抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VH和如上文提供的任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体分别包含在SEQ ID NO:111、115、134、138、142、148、154、158、160、164、168和234，和SEQ ID NO:113、117、119、122、124、126、128、130、132、136、140、144、146、150、152、156、162、166、170或235中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在又一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体与本文提供的抗血凝素抗体的相同表位结合。例如，在某些实施方案中，提供与下述抗血凝素抗体的相同表位结合的抗体，所述抗血凝素抗体包含SEQ ID NO:111的VH序列和SEQ ID NO:113的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:117的VL序列；SEQ ID NO:111的VH序列和SEQ ID NO:119的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:113的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ IDNO:122的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:124的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:126的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:128的VL序列；SEQID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:130的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:132的VL序列；SEQ ID NO:134的VH序列和SEQ ID NO:136的VL序列；SEQ ID NO:138的VH序列和SEQ ID NO:140的VL序列；SEQ ID NO:142的VH序列和SEQ ID NO:144的VL序列；SEQ ID NO:138的VH序列和SEQ ID NO:146的VL序列；SEQ ID NO:148的VH序列和SEQ ID NO:150的VL序列；SEQ ID NO:148的VH序列和SEQ ID NO:152的VL序列；SEQ ID NO:148的VH序列和SEQ IDNO:140的VL序列；SEQ ID NO:234的VH序列和SEQ ID NO:235的VL序列；SEQ ID NO:154的VH序列和SEQ ID NO:156的VL序列；SEQ ID NO:158的VH序列和SEQ ID NO:156的VL序列；SEQID NO:160的VH序列和SEQ ID NO:162的VL序列；SEQ ID NO:164的VH序列和SEQ ID NO:166的VL序列，或SEQ ID NO:168的VH序列和SEQ ID NO:170的VL序列。
在本发明的又一个方面，根据任一个以上实施方案的抗血凝素抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗血凝素抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双体抗体(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。
在又一个方面，根据任一个以上实施方案的抗血凝素抗体可以单独或以组合方式合并如下文1-7部分中所述的任一特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10- 13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射标记抗原结合测定法(RIA)测量Kd。在一个实施方案中，RIA用Fab形式的目的抗体及其抗原进行。例如，通过以下方式测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最低浓度的(125I)的标记抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立该测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/mL抗Fab捕获抗体(Cappel Labs)包被过夜并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭2至5小时。在不吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释物(例如，与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中评估抗VEGF抗体Fab-12一致)混合。随后将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温温育(例如，1小时)。随后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤8次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合作用的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定法中。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法测量Kd。例如，使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定法在25℃采用固定化抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)进行。在一个实施方案中，根据供应商说明书，以盐酸 N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μl/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中Fab的2倍连续稀释物(例如，0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流法(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述荧光猝灭技术在25℃测量在PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著(Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见美国专利号5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中描述。
单一结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过多种技术产生，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体并且FR(或其部分)源自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法在例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如还在Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中综述。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的框架区(见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的框架区(见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的框架区(见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术或使用本文所述的技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181 和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M 技术的美国专利号7,041,870，和描述Veloci技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变域序列随后可以与所需的人恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等人,引自Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并且例如还在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和 Bradbury,引自Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示法中，VH基因和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其中随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自已免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以在不进行任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原的抗体和还针对自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的PCR引物，合成地产生天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一针对血凝素，并且另一种特异性针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结 合血凝素的2个不同表位。双特异性抗体也可以用来使细胞毒性剂定位于表达血凝素的细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“结-扣”工程化(例如，见美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，见美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，见kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，见Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991))中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(Octopus antibody)”(见，例如,US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重功能FAb”或“DAF”，其包含与血凝素以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基***所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、***和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
a.置换变体、***变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。表1中在“示例性置换”标题下显示参考氨基酸侧链类别并且如下文进一步描述的更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
原始残基 示例性置换 优选的置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
((5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物活性(例如，结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom等人,引自Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编著，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、***或缺失可以在一个或多个HVR内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以例如是在HVR中的抗原接触残基外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者未被改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列***包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他***性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助N联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。例如见，Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。低聚糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、 N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内部Asn297处岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸附近，即，位置294和位置300之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1，Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人,特别地在实施例11)中，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见，例如，Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
还可以为抗体变体提供双分低聚糖，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S)中描述。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的有利候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞---NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法 (CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(见，例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能减少的抗体包括置换了一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了半寿期增加和新生Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(美国专利号7,371,826)。
涉及Fc区变体的其他例子还见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以例如美国专利号7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡 咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的疗法中等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗血凝素抗体的分离核酸。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用其转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VL的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生抗血凝素抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体条件 下培养如上文提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体的核酸，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗血凝素抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并***一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。
克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以以可溶性级分形式将抗体从细菌细胞糊状物分离并且可以进一步纯化抗体。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由 SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝脏细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定法
可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定本文提供的抗血凝素抗体、筛选或表征本文提供的抗血凝素抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其他测定法
在一个方面，例如，通过已知的方法如ELISA、蛋白质印迹法等，对本发明的抗体测试其抗原结合活性。
在另一个方面，竞争测定法可以用来鉴定与本文所述的任何抗血凝素抗体竞争结合血凝素的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与本文描述的抗血凝素抗体结合的相同表位(例如，线性表位或构象表位)结合，本文描述的抗血凝素抗体例如，包含SEQ IDNO:111的VH序列和SEQ ID NO:113的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:117的VL序列；SEQ ID NO:111的VH序列和SEQ ID NO:119的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:113的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:122的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:124的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:126的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:128的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ IDNO:130的VL序列；SEQ ID NO:115的VH序列和SEQ ID NO:132的VL序列；SEQ ID NO:134的VH序列和SEQ ID NO:136的VL序列；SEQ ID NO:138的VH序列和SEQ ID NO:140的VL序列；SEQID NO:142的VH序列和SEQ ID NO:144的VL序列；SEQ ID NO:138的VH序列和SEQ ID NO:146的VL序列；SEQ ID NO:148的VH序列和SEQ ID NO:150的VL序列；SEQ ID NO:148的VH序列和SEQ ID NO:152的VL序列；SEQ ID NO:148的VH序列和SEQ ID NO:140的VL序列；SEQ ID NO:234的VH序列和SEQ ID NO:235的VL序列；SEQ ID NO:154的VH序列和SEQ ID NO:156的VL序列；SEQ ID NO:158的VH序列和SEQ ID NO:156的VL序列；SEQ ID NO:160的VH序列和SEQ IDNO:162的VL序列；SEQ ID NO:164的VH序列和SEQ ID NO:166的VL序列，或SEQ ID NO:168的VH序列和SEQ ID NO:170的VL序列的抗血凝素抗体。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,引自Methods in MolecularBiology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。
在示例性竞争测定法中，将固定的血凝素在溶液中温育，所述溶液包含与血凝素结合的第一标记抗体和正在测试与第一抗体竞争结合血凝素的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的血凝素在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与血凝素结合的条件下温育后，移除过多的未结合的抗体，并且测量与固定的血凝素结合的标记物的量。如果与固定的血凝素结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体正在与第一抗体竞争结合血凝素。见Harlow 和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
活性测定法
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的血凝素抗体及其片段的测定法。生物活性可以包括，例如，与甲型流感病毒血凝素特异性结合、中和甲型流感病毒等。还提供在体内和/或在体外具有这种生物活性的抗体或包含这类抗体或其片段的组合物。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试这种生物活性。关于此类测定法的示例性描述、参见实施例4、5、6、7、8、9、10和13。
免疫缀合物
本发明也提供了包含与一种或多种细胞毒性剂如化疗药或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素)或放射性同位素缀合的本文抗血凝素抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0 425 235 B1)；澳瑞司他汀(auristatin)如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素或其衍生物(见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人,CancerRes.53:3336-3342(1993)；和Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类如柔红霉素或阿霉素(见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇、 紫杉醇、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，mri)，再次如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、1-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science238:1098(1987)中所述那样制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与 抗体缀合的示例性螯合剂。见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
免疫缀合物或ADC在本文中明确地构思，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任一种抗血凝素抗体可用于检测血凝素或甲型流感病毒在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，例如，肺、上呼吸道、鼻道、血液、痰，或包括通过鼻拭子或咽拭子获得的生物样品。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗血凝素抗体。在又一个方面，提供一种检测血凝素或甲型流感病毒在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文所述的抗血凝素抗体在允许抗血凝素抗体与血凝素结合的条件下接触，并且检测抗血凝素抗体和血凝素之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗血凝素抗体用来选择适于用抗血凝素抗体治疗的受试者，例如其中血凝素是选择患者的生物标记物。
可以使用本发明抗体诊断的示例性病症包括甲型流感病毒感染，包括儿童、婴儿、成人和老年人中的甲型流感病毒感染。
在某些实施方案中，提供标记的抗血凝素抗体。标记物包括但不限于，直接检测到的标记物或部分(如荧光、发光团、电子致密、化学发光 和放射性标记)，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、 125I、3H和131I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。
F.药物制剂
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文所述的抗血凝素抗体的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利申请公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。水质抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些有效成分。例如，可能想要进一步提供神经氨酸酶抑制剂、抗血凝素抗体、抗M2抗体等。这种有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗血凝素抗体可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供了作为药物使用的抗血凝素抗体。在其他方面，提供用于治疗、预防或抑制甲型流感病毒感染的抗血凝素抗体。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法中的抗血凝素抗体。在某些实施方案中，本发明提供抗血凝素抗体用于治疗患有甲型流感病毒感染的个体的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的抗血凝素抗体。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗药，例如，如下文描述的治疗药。在其他实施方案中，本发明提供了防止、抑制或减少血凝素介导的甲型流感病毒病毒包膜和感染细胞膜(endosomal membranes)之间融合，因此防止病毒RNA进入感染细胞的细胞质并预防感染进一步传播的抗血凝素抗体。在某些实施方案中，本发明提供在预防、抑制或治疗个体中甲型流感病毒感染的方法中使用的抗血凝素抗体，所述方法包括向个体施用有效量的抗血凝素抗体以预防、抑制或治疗甲型流感病毒感染。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”优选地是人。
在又一个方面，本发明提供抗血凝素抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗甲型流感病毒感染。在又一个实施方案中，该药物用于治疗甲型流感病毒感染的方法中，所述方法包括向患有甲型流感病毒感染的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗药，例如，如下文描述的治疗药。在又一个实施方案中，该药物用于防止、抑制或减少血凝素介导的甲型流感病毒病毒包膜和感染细胞膜之间融合，因此防止病毒RNA进入感染细胞的细胞质并预防感染进一步传播的抗血凝素抗体。在又一个实施方案中，该药物用于预防、抑制或治疗个体中甲型流感病毒感染的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的药物以预防、抑制或减少甲型流感病毒感染。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗甲型流感病毒感染的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有甲型流感病毒感染的个体施用有效量的抗血凝素抗体。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如本文描述的至少一种额外治疗药。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
本发明提供有效抑制、预防或治疗个体(例如，受试者或患者)甲型流感病毒感染的抗血凝素抗体。在一些方面，本发明的抗血凝素抗体有效预防性治疗个体以防止甲型流感病毒感染该个体。
在一些方面，适于用本发明抗血凝素抗体治疗的个体是患有或疑似患有甲型流感病毒感染的个体。在一些实施方案中，这类个体包括婴儿、儿童、成人和老年人。在一些实施方案中，该个体在患有甲型流感病毒感染的情况下住院。在其他实施方案中，患有甲型流感病毒感染的个体有一种或多种并存病，例如，免疫缺陷、妊娠、肺部疾病、心脏病、肾疾病或共感染(例如，细菌性感染或病毒性感染，如细菌性或病毒性肺炎)。
在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体降低了甲型流感病毒感染严重程度、减少甲型流感病毒感染时间长度或减少甲型流感病毒感染性。在其他其他方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗甲型流感病毒感染提供了额外的益处，包括住院时间长度缩减、减少或阻止重症监护室(ICU)使用需求、减少或阻止辅助通气或机械通气需求、减少或阻止补充用氧需求和降低死亡率。在一些方面，住院时间长度缩减是1天、2天、3天、4天、5天、或超过5天。在一些方面，重症监护室使用需求减少是1天、2天、3天、4天、5天或超过5天。在一些方面，辅助通气或机械通气需求减少是1天、2天、3天、4天、5天或超过5天。在一些方面，补充氧需求减少是1天、2天、3天、4天、5天、或超过5天。在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体减少甲型流感病毒感染疾病症状，例如，发热、鼻炎、冷颤、咽喉痛、肌肉疼痛、身体疼痛、头痛、咳嗽、鼻充血、虚弱或乏力、眼刺激或眼流泪和周身不适。
在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体缩减了至呼吸功能正常化所需时间，如缩减了至呼吸速率正常化所需时间或缩减了至氧饱和度正常化所需时间。在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体缩减了返回正常氧饱和度(例如，氧饱和度返回约92％或更高)所需时间，如在不施用补充氧的情况下在24小时范围内测量。在其他方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体缩减了至生命体征如心率、血压、呼吸速率和温度正常化的时间。
在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体改善病毒学终点，例如，流感病毒滴度。病毒滴度可以通过本领域技术人员已知的多种方式测量，例如，曲线下病毒面积(AUC)，如通过例如qPCR或组织培养感染量(TCID50)所测量。在一些方面，治疗导致病毒AUC减少大于或等于50％，如通过qPCR或TCID50所测量。
在本发明的多个方面，在症状开始(例如，病情开始)后约12小时处、约24小时处、约36小时处、约48小时处、约60小时处、约72小时处、约84小时处和约96小时处施用时，本文提供的抗血凝素抗体有效治疗甲型流感病毒感染。在其他其他方面，在症状开始后约24小时和48小时之间(例如，个体在24小时和48小时之间具有症状)施用时、在症状开始后约48小时和72小时之间时施用或在症状开始后约72小时和96小时之间时施用时，本文提供的抗血凝素抗体有效治疗甲型流感病毒感染。在本发明的某些实施方案中，本发明的抗血凝素抗体有效治疗或减少甲型流感病毒感染并且延长现行护理标准(例如，奥塞米韦)的治疗窗口期至超出症状开始后48小时。
在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗血凝素抗体的药物制剂，例如，用于前述任一个治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗血凝素抗体和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗血凝素抗体和至少一种额外治疗药，例如，如下文描述。
本发明的抗体可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种额外治疗药共施用。在某些实施方案中，额外治疗药是神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、磷酸奥塞米韦、金刚烷胺、金刚乙胺)、抗M2抗体、一种抗血凝素抗体等。在一些方面，与单独用任一种药物治疗相比，用与神经氨酸酶抑制剂共施用的本发明抗血凝素抗体治疗患有甲型流感病毒感染的个体提供协同治疗效果。
上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗药或治疗药类之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，抗血凝素抗体的施用和额外治疗药的施用彼此相隔约1个月内，或约1周、2周或3周内，或约1、2、3、4、5或6日内、或约1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20或24小时内进行。
本发明的抗体(和任何额外的治疗药)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)损害内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注(pulse infusion)。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药物一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程，抗体是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至约45mg/kg(例如，约1.0mg/kg至约15mg/kg)抗体可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。抗体的示例性剂量将处于约1.0mg/kg至约45mg/kg、约1.0mg/kg至约30mg/kg、约1.0mg/kg至约15mg/kg、约1.0mg/kg至约10mg/kg或约1.0mg/kg至约5mg/kg范围内。因此，可以向患者施用约1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、30mg/kg或45mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以断续地施用，例如，每日、每两日、每三日等。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。也可以按固定剂量给药，例如，200mg、400mg、600mg、800mg、1000mg、1200mg、1400mg、1500mg、1600mg、1800mg、2000mg、2200mg、2400mg、2500mg、2600mg、2800mg、3000mg、3200mg、3400mg、3600mg等。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用替代抗血凝素抗体的本发明免疫缀合物或除抗血凝素抗体之外还使用本发明免疫缀合物来实施。
制造物
在本发明的另一个方面，提供一种制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的抗体。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选 择的病状。另外，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗药。在本发明的这个实施方案中制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，前述任一者制造物可以包含替代抗血凝素抗体的本发明的免疫缀合物或除抗血凝素抗体之外还包含本发明的免疫缀合物。
III实施例
以下是本发明方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1.通过噬菌体展示鉴定抗血凝素抗体
从流感病毒接种的人供体构建噬菌体文库
使用由外周血单核细胞(PBMC)构成的噬菌体展示文库如下鉴定针对甲型流感病毒血凝素的抗体，其中所述外周血单核细胞从季节性流感病毒疫苗接种的人供体分离。
从太平洋血液中心(San Francisco，CA)获得来自正常人供体的leukopac，其中所述正常人供体在他们捐赠血液之前7日接受季节性流感疫苗(Novartis批号111796P1)。使用标准方法从leukopac分离PBMC。通过FACS将PBMC对CD19+/CD20-成浆细胞分选。使用RNeasy纯化试剂盒(Qiagen，美国)从CD19+/CD20-分选的成浆细胞提取RNA，并且使用 III逆转录酶(Invitrogen，美国)通过逆转录，从分离的RNA产生cDNA。使用以下反向和正向DNA引物混合物，从cDNA以PCR方式扩增人可变重链(VH)基因、可变κ链(VK)基 因和可变轻链(VL)基因。
VH反向引物
BssHII.HuVH1：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC(SEQ ID NO：1)
BssHII.HuVH2：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGRTCACCTTGAAGGAGTC(SEQ ID NO：2)
BssHII.HuVH3.1：ATCGTTTCATAAGCGCGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC(SEQ ID NO：3)
BssHII.HuVH3.2：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC(SEQ ID NO：4)
BssHII.HuVH3.3：ATCGTTTCATAAGCGCGCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTC(SEQ ID NO：5)
BssHII.HuVH4.1：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(SEQ ID NO：6)
BssHII.HuVH4.2：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTC(SEQ ID NO：7)
BssHII.HuVH5：ATCGTTTCATAAGCGCGCGARGTGCAGCTGGTGCAGTC(SEQ IDNO：8)
BssHII.HuVH6：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTACAGCTGCAGCAGTC(SEQ ID NO：9)
BssHII.HuVH7：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTGCAGCTGGTGCAATC(SEQ IDNO：10)
BssHII.HuVH1.A：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTC(SEQ ID NO：11)
BssHII.HuVH1.B：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTC(SEQ ID NO：12)
BssHII.HuVH1.C：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTCCAGCTGGTACAGTC(SEQ ID NO：13)
BssHII.HuVH 1.D：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGATGCAGCTGGTGCAGTC(SEQ ID NO：14)
BssHII.HuVH1.E：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAAATCCAGCTGGTGCAGTC(SEQ ID NO：15)
BssHII.HuVH1.F：ATCGTTTCATAAGCGCGCGAGGTCCAGCTGGTGCAGTC(SEQ ID NO：16)
BssHII.HuVH3.A：ATCGTTTCATAAGCGCGCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTC(SEQ ID NO：17)
BssHII.HuVH3.B：ATCGTTTCATAAGCGCGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAC(SEQ ID NO：18)
BssHII.HuVH4.A：ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG(SEQ ID NO：19)
VH正向引物
NheI.JH 2：GACATTCTACGAGCTAGCTGAGGAGACAGTGACCAGGGT(SEQ ID NO：20)
NheI.JH1/4/5：GACATTCTACGAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT(SEQ ID NO：21)
NheI.JH3：GACATTCTACGAGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTC(SEQ ID NO：22)
NheI.JH6：GACATTCTACGAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ ID NO：23)
VK反向引物
NheI.OL.HuVK 1：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCGACATCCAGWTGACCCAGTC(SEQ ID NO：24)
NheI.OL.HuVK2：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCGATGTTGTGATGACTCAGTC(SEQ ID NO：25)
NheI.OL.HuVK3：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCGAAATTGTGWTGACRCAGTC(SEQ ID NO：26)
NheI.OL.HuVK4：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCGATATTGTGATGACCCACAC(SEQ ID NO：27)
NheI.OL.HuVK5：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCGAAACGACACTCACGCAGTC(SEQ ID NO：28)
NheI.OL.HuVK6：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCGAAATTGTGCTGACTCAGTC(SEQ ID NO：29)
VK正向引物
NcoI.JK1-：AGTTCATGCCATGGTTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTT(SEQ ID NO：30)
NcoI.JK2-：AGTTCATGCCATGGTTTTGATCTCCACCTTGGTCCC(SEQ ID NO：31)
NcoI.JK3-：AGTTCATGCCATGGTTTTGATATCCACTTTGGTCCCAG(SEQ ID NO：32)
NcoI.JK4-：AGTTCATGCCATGGTTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCT(SEQ ID NO：33)
NcoI.JK5-：AGTTCATGCCATGGTTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTT(SEQ ID NO：34)
VL反向引物
NheI.OL.HuVL1.1：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCAGTCTGTGCTGACTCAGCC(SEQ ID NO：35)
NheI.OL.HuVL1.2：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCAGTCTGTGYTGACGCAGCC(SEQ ID NO：36)
NheI.OL.HuVL1.3：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCAGTCTGTCGTGACGCAGCC(SEQ ID NO：37)
NheI.OL.HuVL2：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCARTCTGCCCTGACTCAGCC(SEQ ID NO：38)
NheI.OL.HuVL3.1：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCTCCTATGWGCTGACTCAGCC(SEQ ID NO：39)
NheI.OL.HuVL3.2：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCTCTTCTGAGCTGACTCAGGA(SEQ ID NO：40)
NheI.OL.HuVL4：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCACGTTATACTGACTCAACC(SEQ ID NO：41)
NheI.OL.HuVL5：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCAGGCTGTGCTGACTCAGCC(SEQ ID NO：42)
NheI.OL.HuVL6：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCAATTTTATGCTGACTCAGCC(SEQ ID NO：43)
NheI.OL.HuVL7/8：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCAGRCTGTGGTGACYCAGGA(SEQ ID NO：44)
NheI.OL.HuVL9：
TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCWGCCTGTGCTGACTCAGCC(SEQ ID NO：45)
VL正向引物
NcoI.JL1-： AGTTCATGCCATGGTTAGGACGGTGACCTTGGTCC(SEQ ID NO：46)
NcoI.JL2/3-： AGTTCATGCCATGGTTAGGACGGTCAGCTTGGTCC(SEQ ID NO：47)
NcoI.JL7-： AGTTCATGCCATGGTGAGGACGGTCAGCTGGGTG(SEQ IDNO：48)
使用具有以下重叠引物的重叠PCR，将所产生的cDNA扩增产物装配成scFv。
BssHII.VH.OL+： ATCGTTTCATAAGCGCGCSA(SEQ ID NO：49)
NotI.JK.OL-： AGTTCATGCCATGGTTTTGAT(SEQ ID NO：50)
NotI.JL.OL-： AGTTCATGCCATGGTKAGGAC(SEQ ID NO：51)
纯化的scFvc DNA片段(1μg)和噬菌粒载体p2056BNN(2μg)用BssHII和NcoI限制性核酸内切酶(New England Biolabs，美国)消化。噬菌粒载体p2056BNN是经工程化以含有BssHII、NheI、和NcoI限制性位点的pS2025e修饰形式(Sidhu等人,(2004)J Mol Biol 338:299-310)。随后使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)，将scFvcDNA片段连接至p2056BNN载体中(6:1M比率)。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，将所产生的cDNA/噬菌体连接产物纯化并转化至电感受态SS320大肠杆菌细胞中。通过将10μl 1:10稀释的文库培养物涂布到LB/羧苄青霉素平板上，估计噬菌体文库的大小。文库培养物随后在总体积60ml2YT培养基中进一步扩增并增殖，并且通过用M13KO7辅助噬菌体共感染诱导噬菌体-scFv表达。稍后将卡那霉素添加至文库培养物，并且在30℃振摇下温育30小时。随后将文库培养物离心以沉淀细胞。将含有噬菌体scFv的上清液用5×PEG/2.5M NaCl沉淀并重悬于PBS中。
噬菌体文库分选和筛选以鉴定抗血凝素抗体
使用甲型流感病毒血凝素H1和H3蛋白(如实施例2中下文描述那样产生)作为分选噬菌体文库的抗原。将血凝素H1和H3抗原包被到高结合性96孔最大吸附性平板上。平板和噬菌体文库用噬菌体封闭缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)、1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.05％(v/v)Tween-20(PBS-T))预先封闭并在室温温育2小时。将封闭的噬菌体文库(100μl)添加至血凝素包被的孔并温育3小时。使用0.05％PBS–Tween从平板洗去未结合的噬菌体，并且将结合的噬菌体用100μL的50mM HCl和500mM NaCl洗脱30分钟，随后用100μl的1MTris碱(pH 7.5)中和。在大肠杆菌XL-1Blue细胞中扩增回收的噬菌体。将所产生的噬菌体沉淀并针对血凝素蛋白经历另一轮淘洗/选择。在后续淘洗/选择轮次期间，将抗体噬菌体与相同或不同的血凝素抗原温育。将平板洗涤的严格性从洗涤15x逐渐增加到洗涤40x。
在2-3淘洗轮次和选择后，观察到血凝素特异性的噬菌体明显富集。 从文库分选过程挑出96个噬菌体克隆以确定它们是否与血凝素H1和/或H3特异性结合。对显示与血凝素蛋白特异性结合的噬菌体克隆的可变区测序以鉴定含有独特免疫球蛋白核酸序列的噬菌体克隆。进一步表征高于背景至少5倍的结合血凝素H1和/或H3的独特噬菌体抗体。通过将各个克隆的VL和VH区分别克隆至LPG3和LPG4表达载体，将噬菌体衍生的目的克隆重形成IgG，在哺乳动物293细胞瞬时表达并使用蛋白A柱纯化。鉴定两种抗体(mAb 9和MAb 23)用于进一步分析。(参见以下实施例5)
实施例2.成浆细胞富集和扩充
为了发现并鉴定针对甲型流感病毒血凝素的罕有抗体，开发了以下的成浆细胞富集和扩充技术。(参见通过引用方式完整并入本文的共同待决专利申请美国专利申请系列号61/725,764)
从太平洋血液中心(San Francisco，CA)获得来自正常人供体的leukopac，其中所述正常人供体在他们捐赠血液之前7日接受季节性流感疫苗(Novartis批号111796P1)。使用标准方法从leukopac分离外周血单核细胞细胞(PBMC)。六至八周龄雌性SCID/beige小鼠从Charles River Laboratories(Hollister,CA)购买并且在Genentech根据美国实验动物学会护理指南圈养及维持。全部实验研究均根据实验室动物护理和使用指南及适用法律和法规，在Genentech Lab Animal Research研究机构动物护理和使用委员会的批准下在AAALACi认证的设施中实施。在提供书面知情同意书并且从西部机构审查委员会给予伦理批准后从健康的人供体获得Leukopac或血液。
如下使用脾内PBMC移植，进行体内抗原驱动型(antigen-driven)成浆细胞富集和扩充。分离的PBMC与血凝素抗原(每一百万个B细胞0.1-2g)一起重悬并在37℃温育30分钟(PBMC/抗原预混)。在这次温育之后，洗涤PBMC以移走未结合的抗原。为了富集产生交叉反应性血凝素抗体的成浆细胞，特别地选择用于PBMC/抗原预混和单细胞分选的血 凝素抗原变体与流感疫苗内部所含的血凝素抗原变体不同。因此，这项研究中使用的血凝素抗原包括来自甲型流感病毒分离株A/NWS/1933的H1血凝素(甲型流感病毒血凝素群1)、来自甲型流感病毒分离株A/中国香港/8/1968的H3血凝素(甲型流感病毒血凝素群2)和来自甲型流感病毒分离株A/荷兰/219/2003的H7血凝素(甲型流感病毒血凝素群2)。使用标准分子生物学技术在Genentech产生血凝素抗原。
使用铯137源，用350拉德对6-8周龄雌性SCID/beige小鼠(Charles RiverLaboratories，Hollister，CA)进行亚致死照射。在照射之后，添加多粘菌素B(110mg/L)和新霉素(1.1g/L)至饮用水持续7日。在照射后4小时，将每只小鼠的左侧肋腹剃毛并用(Purdue Pharma,Stamford,CT)和70％乙醇做好准备。使用无菌外科手术法，在麻醉下进行外科手术。紧邻每只小鼠的肋缘下方形成一个1cm皮肤切口，随后形成腹壁和腹膜的切口。小心地暴露每只小鼠的脾并且用重悬于30μL PBS中的50×106个人PBMC注射。分别使用5-O 缝线(Ethicon，Somerville，NJ)和外科钉(surgical staple)，闭合肌肉层中和皮肤中的切口。为了抗原特异性细胞分选实验，在移植后8日处死小鼠，并收获它们的脾。
将获得自小鼠脾细胞的单细胞悬液用限定人IgG+成浆细胞为CD38 高/IgG+表达的抗人单克隆抗体CD38PECy7(BD Biosciences,San Jose,CA)和IgG Dylight(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)的混合物染色。为了鉴定分离的脾细胞悬液内部的血凝素交叉反应性成浆细胞，将细胞用来自甲型流感病毒分离株A/NWS/1933的血凝素H1和来自甲型流感病毒分离株A/中国香港/8/1968的血凝素H3染色，其中使用Lightning-标记试剂盒(Innova Biosciences，Cambridge，UK)，将所述血凝素事先分别与FITC或PE缀合。
图1A显示在SCID/beige小鼠富集之前(即，在PBMC/抗原预混之前)来自接种PBMC后第7天的抗血凝素阳性成浆细胞的代表性FACS数据分析。图1B显示在SCID/beige小鼠富集后来自移植后第8日的血 凝素阳性成浆细胞的代表性FACS数据分析，分别在上半小图和下半小图中比较无预混和抗原预混。如图1A和图1B中所示，在脾内注射之前的PBMC/抗原预混导致更高频率的H3+/H1+抗血凝素成浆细胞。
下表2显示在如本文所述的SCID富集之前和之后抗H1+成浆细胞/抗H3+成浆细胞频率的比较。如表2中所示，与无SCID/beige小鼠富集的情况下观察到的频率相比，使用本发明的SCID/beige小鼠富集方法时，抗H1+/抗H3+成浆细胞的频率大大增加。
表2
条件 抗H1+/抗H3+成浆细胞频率(％)
接种的PBMC 0.00028±0.00008
SCID+抗原预混物 0.011±0.007
随后在碘化丙啶死细胞拒染存在下，在Aria高速细胞分选仪上(BD Biosciences，San Jose，CA)分析样品，并且将抗血凝素特异性成浆细胞以单细胞方式分选至含有50μl补充有5％低IgG胎牛血清的RPMI细胞培养基的96孔组织培养平板中。(Gibco,Grand Island,NY)。对五百万个活细胞细胞记录全部分析概况。通过9.4.11版Flowjo软件分析概况。
图2显示从来自个体SCID/beige小鼠的移植后第8日获得的脾细胞的分析，其显示随机反应，比较无预混(圆圈)和抗原预混(正方形)。数据作为抗H1+/CD38高成浆细胞百分数提出。矩形指示展示抗H1+成浆细胞的小鼠。
这些结果显示如果将甲型流感病毒血凝素抗原群1(例如，血凝素H1)和群2(例如，血凝素H3、血凝素H7)在脾内移植之前与PBMC温育，则检测到广泛的血凝素交叉反应性成浆细胞。这些结果进一步表明，在体外刺激来自流感接种的供体的血凝素抗原激发的PBMC促进SCID/beige小鼠受体内部成浆细胞的血凝素抗原特异性富集。
实施例3.从单个成浆细胞克隆IgG
对(上文描述的)血凝素H1和H3交叉反应人成浆细胞进行单细胞分选，产生大约950个成浆细胞。将单个成浆细胞直接分选至含有具有5％低IgG胎牛血清的50μl RPMI的U底96孔微量孔平板中。将平板以600x g(Beckman Coulter,Brea,CA)离心5分钟，并通过抽吸小心地移除培养基。将细胞重悬并且按照相同程序在90μl PBS中洗涤2次。
为了产生编码可变重链和轻链的cDNA，将每个细胞重悬于6μl逆转录酶(RT)反应混合物中，所述反应混合物含有2单位RNaseout(Invitrogen，Grand Island，NY)、0.5mM 4种dNTP(Perkin Elmer，Waltham，MA)、1.5mM MgCl2、37.5mM KCl、10mM DTT(二硫苏糖醇)、0.25％Nonidet P40(US Biological,Marblehead,MA)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)、25mM Tris pH 8.3、0.25pmol的IgG1-4恒定区、κ链恒定区和λ链恒定区特异性寡核苷酸(下文显示)和40U Superscript III(Invitrogen，Grand Island，NY)。
IgG1-4恒定： GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG(SEQ ID NO：52)
κ恒定： CTCAGCGTCAGGGTGYTGCTGAG(SEQ ID NO：53)
λ恒定： GGGTKTGGTSGTCTCCAC(SEQ ID NO：54)
将反应温育3次，分别在45℃、50℃和55℃温育30分钟。在温育之后，将反应混合物用TE缓冲液(10mm Tris HCl，1mM EDTA)稀释至15μl。使用来自以上的2μl稀释的RT混合物和Advantage-GC 2聚合酶混合物(Clontech，Mountain View，CA)，按照制造商提供的方案进行初始聚合酶链反应(聚合酶链反应)以扩增IgG重链、κ链和λ链。使用下文显示的基于可变重链和可变轻链种系和恒定区序列的简并寡核苷酸，进行聚合酶链反应扩增。
重链和轻链PCR扩增反应分别如下分成两个反应：重链家族VH.1、2、3(引物IGVH1a、IGVH1b、IGVH2、IGVH3)和VH.4、5、6、7(引物IGVH4、IGVH5、IGVH6和IGVH7)；κ链家族VK.1、2、3(引物IGKV1、IGKV2和IGKV3)和VK.4、5、6(引物IGVK4、IGVK5和IGVK6)；和λ链家族VL.1、2、3、4、5(IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4和IGLV5)和VL.6、7、8、9(引物IGLV6、IGLV7、IGLV8和IGLV9)。降落PCR扩增方案用于温度循环。
在反应之后，将PCR扩增产物用核酸外切酶(Exo)和虾碱性磷酸酶 (SAP)处理以从每个PCR扩增反应移除过多的核苷酸和底物(U.S.Biologicals，Marblehead，MA)。使用Sanger测序法，对初始PCR扩增产物直接测序以确定重链和轻链的可变序列。使用种系匹配的重链和轻链可变寡核苷酸，进行第二巢式PCR扩增，目的是使用以下寡核苷酸引物***哺乳动物信号和恒定区克隆序列。
sVH1a：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGG(SEQ ID NO：81)
sVH2：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGATCACCT(SEQID NO：82)
sVH3vv：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAG(SEQIDNO：83)
sVH3gl：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGG(SEQ ID NO：84)
sVH4：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGCAGG(SEQ ID NO：85)
sVH5：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGGTGCA(SEQ IDNO：86)
sVH6：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTACAGC(SEQID NO：87)
sVH7：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCA(SEQ IDNO：88)
sVK1：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG(SEQ ID NO：89)
sVK2：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGATATTGTGATGACTCAGTCTCACTCTCCCTGC(SEQ ID NO：90)
sVK3：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTG(SEQ ID NO：91)
sVK4：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTG(SEQ ID NO：92)
sVK5：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC(SEQ ID NO：93)
sVK6：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCG(SEQ ID NO：94)
sVL1：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC(SEQ ID NO：95)
sVL2：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(SEQ ID NO：96)
sVL3：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCATCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC(SEQ ID NO：97)
sVL4：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(SEQ ID NO：98)
sVL5：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTCSEQ ID NO：99)
sVL6：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAAATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC(SEQ ID NO：100)
sVL7：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC(SEQ ID NO：101)
sVL8：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC(SEQ ID NO：102)
wVL9：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC(SEQ ID NO：103)
重链恒定：GCCAGGGGGAAGACCGATG(SEQ ID NO：104)
κ恒定区：
CTGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACACAACAGAAGCAGTTCCAGATTTCAACTGCTC(SEQ IDNO：105)
λ恒定：CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG(SEQ ID NO：80)
根据制造商的推荐，使用含有GC的PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio，Shiga，日本)建立PCR扩增反应。在PCR扩增反应后，将扩增产物用如上文所述的Exo/SAP处理。使用无限制性核酸内切酶方法，将编码可变重链和可变轻链的PCR扩增产物***哺乳动物表达载体中。使用Kunkel诱变方案，使20μl PCR扩增产物复性到IgG1链、κ链和λ链的单链DNA人模板上。(参见Kunkel(1985)PNAS 82：488-492)。通过DNA测序证实正确***的构建体。使用Fugene转染试剂(Roche Diagnostic，Indianapolis，IN)，将含有编码重链和轻链的核酸的质粒共转染入293T人胚肾细胞用于瞬时表达，并如下文实施例4中所述那样分析表达和结合作用。
实施例4.血凝素ELISA筛选分析
通过如下ELISA检验使用如上文所述那样获得的每个单克隆抗血凝素抗体结合各种血凝素亚型的能力。将各种表达血凝素的质粒如上文所述那样转染至293T细胞中。这些包括来自H1N1/南加利福尼亚/1918的血凝素H1、来自H3N2/珀斯/2009的血凝素H3、来自H5N1/越南/2004的血凝素H5和来自H7N7/荷兰/2003甲型流感病毒的血凝素H7。在两日后，将细胞在50mM Tris、pH 8、5mM EDTA、150mM NaCl，1％Triton X-100外加蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中裂解。通过离心清除胞 核并且将所产生的裂解物贮存在-80℃。
对于ELISA筛选，将384孔平板(Nunc MaxiSorp)用PBS中的5μg/ml雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素(Sigma)包被。将平板洗涤并且随后用含有多种已表达的血凝素的细胞裂解物的稀释物包被。将平板洗涤并且与抗血凝素抗体的各种稀释物温育及随后与山羊抗人HRP第二抗体(Jackson)的温育。将平板洗涤并处理用于TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)底物检测。
从上文在实施例2中描述的单细胞分选获得大约950个成浆细胞。其中，840个单克隆抗体在293T细胞中瞬时表达并且通过ELISA筛选与H1、H3、H5和H7血凝素亚型的结合作用，产生结合甲型流感病毒血凝素群1或群2的82个单克隆抗体和同时结合甲型流感病毒血凝素群1和血凝素群2的20个单克隆抗体。
实施例5.体外甲型流感病毒中和作用
如下检验了本发明的抗血凝素抗体在体外引发宽范围血凝素亚型结合作用并中和一组甲型流感群1和群2病毒分离株的能力。
在96黑孔及透明底成像平板(Costar3904)中，将MDCK细胞在补充有10％FBS的DMEM培养基中培育为单一25％汇合的单层。将每个甲型流感病毒亚型/毒株稀释于流感培养基(DMEM+0.2％BSA，2μg/mlTPCK处理的胰蛋白酶)中至MOI为1并在37℃与不同浓度(范围从0.02nM至1,600nM)的每种抗体温育1小时。允许每种抗体/流感病毒混合物在37℃在5％CO2培养箱中感染MDCK细胞16小时，之后用100％冷乙醇固定细胞。固定的细胞随后用Hoechst33342(Invitrogen，目录号H3570)染色以可视化细胞核并确定总细胞数目。细胞还用对甲型流感病毒核蛋白特异的广泛反应性单克隆抗体(Millipore目录号MAB8258)染色以确定感染细胞的数目。
使用Image Express Micro(Molecular Devices)，对细胞成像，并且使用MetaXpress 3.1软件分析数据图像。确定感染细胞的百分数并且在 Y轴上相对于X-轴上的Log10抗体浓度作图。所有中和分析均一式三份完成。将数据使用非线性回归剂量-反应曲线拟合并且在图3中作为单位为nM的IC50值以95％置信区间(95％CI)提出。
在图3中所示的表中提供每个甲型流感病毒株的血凝素(HA)亚型。
使用本文所述的单克隆抗体的各种浓度，相对于一大组甲型流感群1和群2病毒株产生体外中和剂量-反应曲线。图4A和图4B分别显示mAb39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)针对一组甲型流感群1和群2病毒株的中和曲线。如图4A和图4B中所示，mAb39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)有效在体外中和测试的全部甲型流感病毒株。(还参见图3)。另外，图5A和图5B分别显示mAb81.39SVSH-NYP(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”)针对一组甲型流感群1和群2病毒株的中和曲线。如图5A和图5B中所示，mAb81.39SVSH-NYP(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”)有效在体外中和测试的全部甲型流感病毒株。(还参见图3)。
本发明的4种抗血凝素抗体(具体为mAb 39.18B11、mAb 36.89、mAb 9.01F3和mAb23.06C2)有效在体外中和群1或群2甲型流感病毒株，但是不同时中和两个群的甲型流感病毒株。具体而言，mAb 39.18B11有效在体外中和检验的整个群1甲型流感病毒组，但是不能够中和群2甲型流感病毒株。(参见图6和图3)。相反，mAb 36.89、mAb 9.01F3和mAb 23.06C2能够中和检验的整个群2甲型流感病毒组，但是不能够中和检验的任何群1甲型流感病毒分离株。(参见图7、图8和图9，分别显示mAb 36.89、mAb 9.01F3和mAb 23.06C2的体外中和曲线；还参见图3)。
总之，这些结果显示本发明的单克隆抗体能够在体外以剂量-依赖性方式中和多种甲型流感病毒分离株/毒株。另外，这些结果显示，本文所述的成浆细胞富集方法学导致仅从950个分离的成浆细胞鉴定出能够同时中和组1和组2甲型流感病毒株的单克隆抗体。
还使用经工程化以表达血凝素H5的假型病毒进行体外中和研究以 检验本发明抗体中和H5N1甲型流感病毒的效力。具体地，如下所述，在293T细胞上用mAb 39.29NCv1检验携带H5血凝素表面蛋白的HIV假型病毒的中和作用。通过用以下三种质粒共转染293T细胞产生H5假型病毒：Δ8.9、FCMV-GFP和表达来自甲型流感病毒分离株H5N1/越南/1203/2004的血凝素H5的质粒。借助20％蔗糖通过超速离心纯化病毒。为了感染，将假型病毒与多种量的mAb 39.29NCv1温育，之后添加至96孔板中培养的靶293T细胞。2日后，通过计数GFP阳性细胞确定感染细胞的数目。将感染对使用最低抗体浓度时感染细胞的数目归一化。图10中显示结果。如10图中所示，mAb 39.29NCv1针对表达血凝素H5表面蛋白的假型病毒显示剂量-依赖性体外中和作用。这些数据表明，本发明的抗体将有效治疗和预防H5N1甲型流感病毒株。
如下所述，还检验本发明抗体针对马流感病毒显示出体外中和活性的能力。将H7N7A/马/1/布拉格/56甲型流感病毒在MDCK细胞上传代直至它实现高度的感染性。所得到的H7N7A/马/1/布拉格/56甲型流感病毒在中和测定法中对MDCK细胞使用(使用如上文对mAb 39.29NCv1所述的方法)。图11中显示这些实验的结果。如图11中所示，mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)针对表达血凝素H7表面蛋白的H7N7A/马/1/布拉格/56流感病毒显示体外剂量-依赖性中和作用。
总之，这些结果显示本发明的抗血凝素抗体针对多种甲型流感病毒株显示剂量-依赖性中和活性。具体而言，两种抗血凝素抗体(mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)和mAb 81.39SVSH-NYP(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”))有效中和检验的全部甲型流感病毒株，包括中和甲型流感病毒株群1(A/CA/7/2009、A/布里斯班/59/2007、A/Solomon/3/2006、A/新喀里多尼亚/20/1999、A/PR/8/1934和A/日本/305/1957)和甲型流感病毒株群2(A/维多利亚/361/2011、A/珀斯/16/2009、A/布里斯班/10/2007、A/威斯康辛/67/2005、A/维多利亚/3/1975、A/查莫斯港/1/1973、A/HK/8/1968和A/Aichi/2/1968)。
额外地，这些结果显示，本发明的抗血凝素抗体(例如，mAb 39.29NWPP(作为SEQID NO:177公开的“NWPP”)(图4A和4B)和mAb81.39SVSH-NYP(作为SEQ ID NO:171公开的“SVSH”)(图5A和图5B))有效中和多种不同季节性H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、H2N2甲型流感病毒株和与1957年日本大流行相关的甲型流感病毒株(A/日本/305/1957)。这些结果表明，本发明的抗体有效治疗和预防季节性甲型流感病毒感染和与流感大流行相关的甲型流感病毒株。
实施例6.mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)在小鼠中的体内效力
如下进行针对甲型流感病毒感染的mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)在小鼠中的体内效力。DBA/2J小鼠(Jackson Lab，Bar Harbor，ME)用按照最小LD100剂量稀释于流感培养基(DMEM，0.2％BSA，2μg/mlTPCK处理的胰蛋白酶)中的50μl各种甲型流感病毒株鼻内感染。在这个系列实验中使用了显示一系列体外IC50值的4个不同甲型流感病毒株，包括：H1N1A/PR/8/1934(Genentech；IC50 2.0nM)，每只小鼠按40PFU使用；H3N2A/中国香港/1/1968(ViraPur，圣迭戈，CA；IC50 45.1nM)，每只小鼠按3PFU使用；；H3N2A/查莫斯港/1/1973(ViraPur，圣迭戈，CA；IC50 2.2nM)，每只小鼠按1.5x104PFU使用；和H3N2A/Aichi/2/1968(ViraPur，圣迭戈，CA；IC5035nM)每只小鼠按2x102PFU使用。允许流感病毒感染进展72小时，之后静脉内施用mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)。
在甲型流感病毒感染72小后，将各种量的mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)以200μl PBS中900μg/小鼠(大约45mg/kg)、300μg/小鼠(大约15mg/kg)和100μg/小鼠(大约5mg/kg)的剂量静脉内施用至小鼠。向对照处理的动物以mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)的最高测试的等同剂量(即，大约45 mg/kg)施用mAb gD5237(对单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白D特异的单克隆抗体)。对小鼠每日监测体况和存活，并且还每日称重，直至感染后21日。全部4个甲型流感病毒株感染中全部mAb 39.29NWPP(作为SEQID NO:177公开的“NWPP”)剂量相对于对照产生P<0.01的对数秩检验。
图12A、图12B、图12C和图12D分别显示以甲型流感病毒A/PR/8/1934、A/查莫斯港/1/1973、A/中国香港/1/1968和A/Aichi/2/1968感染后72小时施用多种量mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)的小鼠的存活百分数(随时间推移，以日计)。如图12A、图12B、图12C和图12D中所示，截止第14日在施用对照抗体的感染小鼠中观察到100％死亡率。但是，施用本发明单克隆抗体的感染小鼠显示存活增加。特别地，在流感病毒A/查莫斯港/1/1973或流感病毒A/Aichi/2/1968感染的小鼠中在测试的全部mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)剂量观察到100％存活率。(参见图12B和图12D)。
这些结果显示本发明的单克隆抗体有效治疗各种甲型流感病毒感染。额外地，这些数据显示当甲型流感病毒感染后直至至少72小时施用时，本发明的单克隆抗体有效治疗甲型流感病毒感染。
实施例7.mAb 39.29NCv1在小鼠中的体内效力
为了检验mAb 39.29NCv1在小鼠中的体内效力，将该抗体静脉内施用至用显示一系列体外IC50值的4种不同甲型流感病毒分离株感染的小鼠以。DBA/2J小鼠(Jackson Lab，Bar Harbor，ME)用按照最小LD100剂量稀释入流感培养基(DMEM，0.2％BSA，2μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶)中的50μl不同甲型流感病毒株鼻内感染。
在一个实验集合中，每只小鼠使用40PFU的甲型流感病毒分离株HINI A/PR/8/1934。在感染后72小时，将抗血凝素mAb 39.29NCv1按200μl PBS中的大约15mg/kg、大约5mg/kg、大约1.7mg/kg或大约0.56mg/kg静脉内施用。向对照处理的动物以等同于mAb39.29NCv1的最 高测试剂量的量给予(对HSV糖蛋白D特异的)mAb gD5237。对小鼠监测体况和存活，并且还称重，直至感染后21日。
对于H1N1A/PR/8/1934感染的小鼠，与对照IgG抗体观察的结果相比，mAb39.29NCv1按15mg/kg/小鼠的单次静脉内剂量是有效的。(参见图13)。具体而言，截止第12天，在对照治疗组中观察到100％死亡率，而15mg/kg mAb 39.29NCv1的单次剂量挽救87.5％的感染小鼠。三倍较低的剂量100μg/小鼠(大约5mg/kg)mAb 39.29NCv1显示出一些效力，能够保护25％的动物免受致死性攻击影响，而大约1.7mg/kg或大约0.56mg/kg的剂量显示超出对照处理组中所观察到效力之外的最低效力。(参见图13)。
在另一个实验组中，针对H3N2中国香港甲型流感病毒株(H3N2A/中国香港/1/1968)小鼠适应株进一步检验mAb 39.29NCv1的体内效力，该毒株具有比A/PR8/1934高10倍的体外IC50。如上文描述的此前实验中所观察，截止第12日，甲型流感病毒感染之后用对照抗体治疗的小鼠显示100％死亡率。(参见图14)。但是，mAb 39.29NCv1按大约45mg/kg或大约15mg/kg单次给药分别能够保护87.5％和75％的小鼠。在A/PR8/1934甲型流感病毒感染模型和A/中国香港/1/1968甲型流感病毒感染模型中，mAb 39.29NCv1的体内15mg/kg最小有效剂量是非常相似，不过在这两个毒株之间观察到mAb 39.29NCv1体外IC50值的反差。(参见图3和图14)。
为了进一步探索mAb 39.29NCv1的体内效力，针对以下的额外两个甲型流感病毒株检验mAb 39.29NCv1的剂量滴定：查莫斯港(H3N2A/查莫斯港/1/1973)和Aichi(H3N2A/Aichi/2/1968)。mAb 39.29NCv1针对查莫斯港毒株具有2.9nM体外IC50，这与A/PR8/1934的体外IC50十分相似，而Aichi具有35.0nM体外IC50，一个更接近于A/中国香港/1/1968的值。如15和图16图中所示，截止第12日和第10日，在对照治疗的动物中分别对查莫斯港模型和Aichi模型观察到100％死亡率。单克隆抗体39.29NCv1在检验的全部剂量(例如，45mg/kg、15mg/kg、5mg/kg 和1.7mg/kg)均显示非常有效地对抗两种甲型流感病毒株。
这些数据部分地表明，在mAb 39.29NCv1的体外IC50和体内最低有效剂量之间几乎不存在相关性。然而，尽管这些甲型流感病毒株存在一系列体外IC50值，但是感染后72小时静脉内施用的15mg/kg单次剂量在全部4个甲型流感病毒小鼠模型中均有效。
实施例8.mAb 39.29和奥塞米韦在小鼠的严重甲型流感病毒感染中的体内效力
为了在小鼠中比较本发明抗血凝素抗体与磷酸奥塞米韦的效力，进行以下研究。将6周龄的Balb/c小鼠(Charles River实验室，Hollister，CA)用100x致死剂量(5X104PFU/小鼠)的50μl H1N1A/PR/8/1934鼻内感染。在感染后48小时，将抗血凝素抗体39.29(mAb 39.29D8C2和mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)的50:50混合物)作为在200μl PBS中的大约15mg/kg的单次剂量或对照IgG静脉内施用。在这些实验中，由2mg每日二次给药(BID)持续五日组成的奥塞米韦给药方案与单次300μg静脉内剂量(约15mg/kg)的mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)比较。mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)或奥塞米韦与对照的对数秩检验产生p<0.01，并且mAb39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)与奥塞米韦的最大似然检验产生p<0.05。(奥塞米韦(即，)从Toronto Research Chemicals获得，目录号0701000)。
如17图中所示，截止第9日在对照IgG(mAb gD5237)治疗的动物中观察到100％死亡率。BID奥塞米韦治疗5日仅保护37.5％的小鼠免于死亡。但是，单次15mg/kg剂量的mAb39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)混合物保护87.5％的感染动物幸免于致死性甲型流感病毒攻击。(参见图17)。充分有效的15mg/kg剂量mAb 39.29NWPP(作为SEQ IDNO:177公开的“NWPP”)混合物在遭甲型流感病毒重度 感染的小鼠中比奥塞米韦表现得更好。
这些结果显示单次剂量的本发明单克隆抗体在治疗甲型流感病毒感染方面比奥塞米韦治疗5日更有效。
实施例9.mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)在共施用或不共施用奥塞米韦情况下在小鼠中的体内效力
如果在症状发作后48小时内给予奥塞米韦的施用有效减少人甲型流感病毒感染。不幸地，奥塞米韦在已经出现症状超过48小时的患者中显示最低效力。因此，进行以下实验以检验本发明的单克隆抗体和奥塞米韦共施用是否显示胜过单独任一种治疗药的改进效力。使用上文在实施例8中描述的严重小鼠流感感染模型进行这些实验。简而言之，将雌性BALB/c小鼠(Charles River实验室)用100x致死剂量(5x104pfu)A/PR/8/1934感染，72小时后，静脉内施用单次剂量100μg mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)(大约6mg/kg，事先确定的次有效剂量)、对照IgG、2mg BID奥塞米韦或单次剂量mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)和持续5日的奥塞米韦治疗的组合。联合治疗与mAb39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)或奥塞米韦的对数秩检验产生p<0.01。
如预期，感染后9日，对照IgG治疗的动物显示100％死亡率。(参见图18)。观察到的对照处理动物的死亡率十分相似于仅接受奥塞米韦或次有效剂量mAb39.29NWPP(为SEQ IDNO:177公开的“NWPP”)的组。但是，与单一任一种治疗中观察到的存活相比，次有效剂量的mAb 39.29NWPP(作为SEQ ID NO:177公开的“NWPP”)外加奥塞米韦的共施用显著地改善存活，产生87.5％存活率。(参见图18)。
这些结果显示治疗甲型流感病毒感染方面的协同效应在使用与神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦组合使用的本发明单克隆抗体的联合疗法期间出现。
实施例10.本发明的抗血凝素抗体在雪貂H5N1甲型流感病毒感染模型中比奥塞米韦表现更好
雪貂甲型流感病毒感染模型经常用来检验抗流感治疗药的预防效力和治疗效力。将雪貂视为人甲型流感病毒感染在临床上有关的动物模型。(参见Matsuoka等人,(2009)Current Protocols in Microbiology，第15章，第15G 12单元)。
为了在雪貂中检验mAb 39.29 D8C2和mAb 81.39 B1C1针对人H5N1甲型流感病毒分离株的体内效力，进行以下研究。雪貂H5N1研究按照合同在Lovelace RespiratoryResearch Institute完成(Albuquerque，NM)。将雄性雪貂(Mustela putorius furo)用鼻内剂量1x103pfu的高毒力H5N1A/越南/1203/04甲型流感病毒株(LD90剂量)攻击。使动物感染，48或72小时后，动物通过静脉内方式接受抗体或通过经口管饲法接受奥塞米韦对照治疗的动物接受25mg/kg静脉内剂量的mAB gD5237，一种对HSV糖蛋白D特异的单克隆抗体。抗流感治疗的动物在流感病毒感染后48或72小时接受单次25mg/kg静脉内剂量的mAb 39.29 D8C2或mAb 81.39 B1C1。每个抗体治疗组包括10只雪貂。奥塞米韦治疗的动物接受每日2次口服剂量的25mg/kg持续5日。每日监测动物的体重减轻、发热和体况。
与H5N1感染一致，大部分感染的雪貂截止感染后48小时显示上呼吸道疾病早期体征。如采用致死剂量H5N1时所预期，阴性对照抗体治疗组截止接种后第14日显示90％死亡率。(参见图19A和图19B)。
与之相反，在流感病毒感染后48小时或72小时接受单次剂量mAb 39.29 D8C2的雪貂分别显示80％存活率和90％存活率(20％死亡率和10％死亡率)。(参见图19A)。同样地，在感染后48小时或72小时接受单次剂量mAb 81.39 B1C1的雪貂分别显示100％存活率和80％存活率(0％死亡率和20％死亡率)。(参见图19B)。无论治疗起始时间是什么，奥塞米韦治疗组总是显示50％死亡率。
这些结果显示，具有广泛中和作用的本发明抗血凝素抗体在治疗雪 貂中的严重甲型流感病毒H5N1感染方面具有高度保护性并且在甲型流感病毒感染后48和72小时施用时，表现得比奥塞米韦更好。
实施例11.结晶和数据采集
为了检验本发明抗体的血凝素交叉反应性的结构基础，mAb 39.29NCv1Fab片段与来自人甲型流感病毒株A/珀斯/16/2009的重组血凝素H3如下共结晶。
蛋白质表达和纯化
为了更好地理解血凝素中和作用的结构基础，如此测定与血凝素复合的mAb39.29NCv1 Fab片段的晶体结构。编码珀斯H3血凝素(H3HA，A/珀斯/16/2009，氨基酸残基25-520(全长血凝素H3(H3HA)氨基酸序列为SEQ ID NO:226)的胞外结构域的核酸连同凝血酶切割位点(LVPRGS，SEQ ID NO:106)、三聚化“foldon”序列(PGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG，SEQ ID NO：107)和C端6x His标签(SEQ ID NO:108)一起以符合可读框方式克隆至pACGP67载体中(BD Biosciences)。通过用H3HA-pACGP67载体和线性化杆状病毒DNA(Pharmingen)共转染Sf9细胞，产生重组杆状病毒。
为了产生重组H3HA蛋白，使用MOI 1，将粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)PRO细胞用重组杆状病毒感染，并在27℃培育72小时。将细胞上清液用50mM Tris-HCl，pH 7.5，5mMCaCl2和1mM NiCl2处理，随后离心并过滤。随后将培养基浓缩并通过切线流过滤法交换缓冲液至含有20mM咪唑的10mM Tris，pH 8.0和150mM NaCl(TBS)中，并将蛋白质用Ni-琼脂糖捕获并洗脱至含有200mM咪唑的TBS中。用凝血酶切割foldon标签过夜，并且将H3HA浓缩并在TBS中平衡的Superde x 20016/60大小排阻柱上进一步纯化。
为了产生血凝素-Fab复合物，将mAb 39.29NCv1Fab(在PhoA启动子控制下)在大肠杆菌中在30℃表达过夜。将细胞通过在6,000转/分钟离心15分钟沉淀并且在补充有25mMEDTA和1mM PMSF的PBS 中通过微流化法裂解。通过在4℃以10,000转/分钟离心1小时，移除细胞残片。使所产生的上清液穿过蛋白G柱，并将Fab用0.58％乙酸洗脱。使用20mM MES，pH5.5中从0至1M NaCl的梯度通过SP琼脂糖凝胶色谱实现mAb 39.29NCv1Fab的进一步纯化。为了产生HA/39.29复合物，将H3HA与过量的mAb 39.29NCv1Fab温育过夜，随后浓缩并在TBS中S200大小排阻层析以分离该复合物。将复合物浓缩至10mg/ml用于结晶试验。
结晶
使用40％PEG300作为沉淀剂，在0.1M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液，pH 4.2(条件C6，JCSG+稀疏矩阵筛选法，Qiagen)中进行H3HA/39.29NCv1Fab复合物的晶体生成。衍射质量的晶体最终在19℃在含有0.1μl蛋白质和0.1μl 0.1M磷酸盐/柠檬酸盐，pH 4.2，40％PEG300和0.7％1-丁醇的坐滴中长出。将晶体在母液中冷冻保护是，随后快速冷冻并贮存在液氮中。数据在低温冷却条件下在Canadian Light Source beamline CMCF-08ID采集并使用MOSFLM和SCALA处理。晶体属于I213空间群，晶胞尺度为a＝b＝c＝204.4和α＝β＝γ＝90°。
结构测定
使用H3HA(PDB3SDY)的结构作为检索模型，通过分子置换法用PHASER获得初始相。随后，使用PHASER分别安置Fab的Fc部分和Fv部分，并且这些部分接受初始轮次采用Phenix的刚体修正。该模型经历几个迭代轮次的COOT调整并模拟复性、配位和采用Phenix的b-因子修正。使用来自Phenix的Carboload软件包，添加在Asn联糖基化位点处存在的糖分子，并且使用REFMAC5，实施最终轮次的修正。最终模型以修正，R/Rfree值分别是19.9％和25.9％。由Molprobity计算的Ramachandran统计结果表明，89.7％的残基位于有利的区域中，离群值为1.1％。使用蛋白质界面、表面和装配(PISA)软件分析触点，并且用PYMOL制备结构图。
实施例12.H3血凝素上39.29表位的结构表征
如上文在实施例11中描述，mAb 39.29NCv1Fab片段与来自人甲型流感病毒株A/珀斯/16/2009的重组H3血凝素共结晶。以分辨率测定抗体/血凝素复合物的晶体结构。A/珀斯/16/2009H3血凝素的总体结构类似于先前测定的血凝素结构，例外是HA2螺旋1/螺旋2接头中的轻微重排和混乱。在这些位置的混乱先前已经在低pH结晶条件下见到过，与这种复合物在pH 4.2结晶一致(Ekiert等人,(2011)Science333:843-850)。抗体/HA复合物的晶体结构显示单个mAb 39.29Fab分子与未切割的H3HA三聚体的每个单体结合。mAb39.29NCv1Fab片段的轻链片段和重链片段也均彻底解析，从而允许靠近检验Fv与HA相互作用。
确定mAb39.29NCv1的表位在H3血凝素的茎区上，大致在HA2螺旋A的顶部上。首先确定血凝素茎部的这个区域为表达群1血凝素亚型的甲型流感病毒的广泛地中和性表位(Ekiert等人,(2009)Science324:246-251；Sui等人,(2009)Nature Structural&Molecular Biology16:265-273))，并且最近确定为携带血凝素亚型群1和群2的甲型流感病毒株的中和性表位(Corti等人,(2011)Science 333:850-856。mAb 39.29NCv1抗体使用广泛的重链接触和轻链接触以埋入大约的血凝素茎部表面积。mAb 39.29NCv1的重链主要借助延长的CDRH3疏水环贡献结合作用，所述疏水环***与HA2螺旋A毗邻的非极性浅沟中并且在Asn54处保守的血凝素群2糖基化位点下面。这个CDRH3环使Phe99侧链伸出以与H3血凝素Thr334、Ile390和Ile393相互作用，同时使主链与连接至H3血凝素Asn54的GlcNAc产生极性接触。mAb 39.29NCv1的CDRH3环还在Gly100产生可能由Val98和Ile100A之间的环间主链接触稳定化的β转角。Ile100A面向下方以与保守的H3血凝素Trp366相互作用，而Val98和Pro100C还与H3血凝素茎部产生范德瓦尔斯接触。停留在重链/轻链界面处，Pro100D和Trp100E终止长CDRH3环并且发挥作用以固定该环就位。
mAb 39.29NCv1的轻链还显著地贡献与H3血凝素茎部的相互作用，使得H3血凝素茎部与全部三个轻链CDR环以及框架残基接触。大约血凝素覆盖表面积当中，约60％由轻链贡献(轻链和重链分别贡献与)。CDRL1Asn32与H3HA2螺旋A残基Asp391和Asn394产生氢键，而CDRL1His31依住H3血凝素Asn376侧链堆叠。CDRL2环中的Ser52还与Asn398产生极性接触。在CDRL3环内部，Asn93的主链接触Asp391，而Trp94与HA2螺旋A中的Lys384发生阳离子-π相互作用。有趣地，mAb 39.29还与血凝素产生众多框架接触，主要通过IgKV3的β-链6中的SGSGSG重复序列(SEQ ID NO:109)与H3血凝素多肽中氨基酸残基403至405的主链相互作用接触。mAb 39.29NCv1的Ser67还与H3血凝素的Asp48和Thr404发生极性相互作用。
全部三个mAb 39.89NCv1轻链CDR环促进结合H3HA茎部表位，占大约60％的总覆盖表面积。这种巨大的轻链接触依赖性在已知的血凝素群1和群2结合抗体及中和抗体当中是独特的，抗体F16v3轻链仅向覆盖表面积作出20％贡献并且抗体CR9114轻链不与表位接触。
虽然在结构上保守，但是群1和群2血凝素亚型在一级氨基酸序列水平明显趋异。为了将mAb 39.29NCv1H3HA接触残基与其他血凝素亚型比较，我们比对来自流感病毒A/珀斯/16/2009的H3血凝素的氨基酸序列与其他流感病毒株的代表性血凝素氨基酸序列：来自A/加利福尼亚州/07/2009的H1HA；来自A/日本/305/1957的H2HA；来自A/越南/1203/2004的H5HA；和来自A/鸡/NSW/1/1997的H7HA。晶体结构中来自A/珀斯/16/2009的H3血凝素的氨基酸编号匹配比对中使用的血凝素H3序列。使用clustalW和与来自A/加利福尼亚/07/2009的血凝素H1、来自A/日本/305/1957的血凝素H2、来自A/珀斯/19/2009的血凝素H3、来自A/越南/1203/2004的血凝素H5和来自A/鸡/NSW/1/1997的血凝素H7相对应的氨基酸序列，生成血凝素序列比对结果。晶体结构用来确定39.29NCv1Fab片段和血凝素H3茎部之间的接触残基。
图20中展示比对结果。血凝素接触残基(加灰色阴影)定义为mAb39.29NCv1的范围内的残基。用星号标记其超过50％有效表面积被mAb 39.29NCv1Fab覆盖的每个氨基酸残基。
在显著有助于mAb 39.29NCv1与这种表位结合的接触残基之间观察到高度的序列保守性。(参见图20)。这个观察结果表明mAb 39.29NCv1通过上文描述的晶体结构中所见的相同茎部表位结合群1和群2血凝素分子。这个表位类似于对FI6v3抗血凝素抗体鉴定到的血凝素表位(Corti等人,(2011),上文)。然而，相对于血凝素茎部，mAb 39.29NCv1以不同于FI6v3的方向结合。与HA复合的39.29NCv1、F16v3和CR9114结构的比较显示，全部三个抗体均结合包含HA2螺旋A和相邻非极性基团的表位。但是，这三种抗体各自具有独特的结合取向，每条重链与HA上的相似形貌位置结合，但是与39.29NCv1相比时，轻链转动约60°(F16v3)或约120°(CR9114)定位。mAb 39.29NCv1也是还独特的，β-链6框架中的IgKV3轻链SGSGSG重复序列(SEQ ID NO:109)与H3HA接触。因此，39.29结构表示这种高度保守表位的结合作用的第三解决方案并且巩固了结合HA2螺旋对于中和广泛类型甲型流感病毒的重要性。
MAb 39.29与来自人甲型流感病毒株A/珀斯/16/2009的H3血凝素复合的结晶学数据揭示以下接触位置：34、36、54、70、292、294、305、307、334、363、364、365、366、379、380、382、383、384、386、387、390、391、393、394、395、397、398、401、403、404和405。抗体FI6v3显示以下接触位置：334、352、356、363、364、365、366、381、383、384、386、387、388、390、391、393、394、397、398、401和402。氨基酸残基位置对应于来自甲型流感病毒株A/珀斯/16/2009的H3血凝素(SEQ ID NO:226)。(参见国际申请公开号：WO 2010/010466和WO 2013/011347；Corti等人,(2011)Science 333:850-856)。尽管观察到某种重叠，mAb 39.29在血凝素内部显示比FI6v3更多的接触位置个数。
mAb 39.29NCv1和FI6v3抗体CDR无序列同源性和两种抗体以不同方式结合相似的但是不相同茎部表位的事实表明，存在抗体结合甲型 流感病毒保守茎部表位并广泛中和甲型流感病毒的多种方式。
实施例13.竞争ELISA
使用来自流感病毒A/WSN/1933的血凝素H1和来自流感病毒A/中国香港/8/1968的血凝素H3，开发竞争ELISA测定。使血凝素包被的ELISA平板结合处于多种浓度的测试抗体(X-轴)，之后添加饱和浓度的生物素标记mAb 39.29。如果测试抗体竞争mAb 39.29的血凝素表位，则生物素ELISA信号(Y-轴)随测试抗体浓度渐增而减少。将结合数据用非线性剂量反应曲线拟合以确定按nM给出的EC50值。
通过胺偶联法，根据制造商的推荐方案(Sulfo-NHS-LC-LC,Pierce,Rockford,IL)，将mAb 39.29IgG进行生物素酰化。生物素酰化mAb最终母液浓度是13.2mM。为了确定最佳使用浓度，将生物素酰化的39.29针对固定化的来自甲型流感病毒A/WSN/1933的H1血凝素和来自甲型流感病毒A/中国香港/8/1968的H3血凝素系列滴定。将重组血凝素H1和H3蛋白在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至2μg/ml并且分配(100μl)到96孔Nunc Maxisorp平板(Nunc,Rochester,NY)上。将平板在4℃包被过夜，在PBS中淋洗，并且随后在室温用含有1％牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的PBS封闭1小时。
每块平板随后接受100μl在含有1.0％BSA和0.05％聚山梨醇酯20(Sigma-Aldrich)的PBS中以初始浓度88nM开始按1/3稀释度连续稀释的生物素酰化mAb 39.29。在1小时温育后，将平板洗涤并且随后在室温与100μl链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(Caltag Laboratories,Carlsbad,CA)的1:5000稀释物温育30分钟。在温育之后，将平板洗涤并且用100μl TMB底物(Kirkegaard and Perry Laboratories,Inc.Gaithersburg,MD)显色。在SpectraMax平板读数仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA.)上在O.D.450nM处读取平板。确定生物素酰化mAb的最佳浓度是1nM。
将各种浓度(x-轴)的本发明单克隆抗体39.18、36.89、81.39、39.29、 mAb 9、mAb23和对照IgG在室温与血凝素包被的平板温育30分钟。初始浓度是200nM，随后连续3倍稀释。将生物素酰化的mAb 39.29添加至最终次饱和浓度1nM。在1小时温育后，将平板洗涤并且随后与100μl链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶的1:5000稀释物温育45分钟。将平板洗涤并且随后用TMB溶液显色。如果测试抗体竞争mAb 39.29的HA表位，则生物素ELISA信号(Y-轴)随测试抗体浓度渐增而减少。将结合数据用非线性剂量反应曲线拟合以确定按nM给出的EC50值。
图21A和图21B显示mAb与来自A/NWS/1933的H1HA(图21A)或来自A/HK/8/1968的H3HA(图21B)结合的竞争ELISA分析结果。结果显示mAb 39.29、mAb 81.39、mAb 39.18和mAb36.89均与重叠性血凝素茎部表位结合(图21A和图21B)。具体而言，mAb 81.39和mAb 39.18竞争mAb 39.29与血凝素H1茎部的结合(图21A)，而mAb 81.39和mAb36.89竞争mAb 39.29对血凝素H3上已鉴定的茎部表位的结合作用(图21B)。
通过使用竞争ELISA测定，确立单克隆抗体81.39、39.18、36.89、mAb 9和mAb 23与通过结构性分析鉴定的高度保守的血凝素茎部表位结合。具体而言，mAb 81.39和mAb39.18竞争mAb 39.29在群1H1血凝素茎部上的结合作用。另外，mAb 81.39、mAb 36.89、mAb9和mAb 23与mAb 39.29竞争对群2H3血凝素上鉴定的茎部表位的结合。如预测，由于mAb39.18仅中和群1甲型流感分离株，所以它不竞争结合群2血凝素上的mAb 39.29表位。同样地，mAb 36.89、mAb 9和mAb23仅中和群2甲型流感分离株并且因此不竞争结合群1H1血凝素上的mAb 39.29表位。来自这些实验的数据进一步汇总于下表3中。
表3
按nM给出的EC50
-显示EC50>200nM
实施例14：抗甲型流感病毒抗体在健康志愿者中的安全性和药代动力学
在年龄18岁或以上的健康人类男性和女性受试者中进行mAb39.29-NWPP的I期单次剂量递增研究。通过静脉内施用单次剂量(1.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg或45mg/kg)mAb39.29进行初始给药以在健康成人受试者中研究安全性、耐受性和药代动力学。在对45mg/kg剂量水平的至少58天随访期和对1.5mg/kg剂量水平的至少120天随访期后后，mAb 39.29在全部剂量水平均安全和良好耐受。未报告与研究药物相关的严重不良事件。
mAb 39.29的血清浓度显示双相性质：一个初始快速分布相，随后是一个缓慢清除相。mAb 39.29展示线性药代动力学(PK)。对于1.5mg/kg剂量组，平均Cmax按照与剂量成正比的方式增加33.5μg/mL，并且对于45mg/kg剂量组，增加1180μg/ml。类似地，对于1.5mg/kg和15mg/kg剂量组，组平均AUC0-无限分别是518μg/mL*日和5530μg/mL*日，并且大约与剂量成正比。基于健康男性和女性受试者中可获得的PK数据，mAb 39.29似乎具有与平均半寿期大约20天(平均范围19.3-22.2)的常见IgG1人抗体一致的PK谱。
实施例15抗甲型流感病毒血凝素抗体的II期研究
本发明的抗甲型流感病毒血凝素抗体的II期临床研究如下进行。向患有甲型流感病毒感染的住院个人按1.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg或45mg/kg剂量通过静脉内施用本发明的抗甲型流感病毒血凝素抗体。可选地，向个人按固定剂量120mg、400mg、1200mg或3600mg施用抗体。也可以在施用抗甲型流感病毒血凝素抗体之前、同时或之后向个人施用奥塞米韦(当前标准护理)。通常，使用抗体的单次给药 方案，不过构思后续给药。
本发明抗甲型流感病毒血凝素抗体的施用显示有效治疗甲型流感病毒感染，包括减少甲型流感病毒感染性、住院时间长度缩减、减少或阻止重症监护室使用需求，减少或阻止辅助通气或机械通气需求或减少或阻止补充用氧需求。
通过至呼吸功能正常化的时间(如至呼吸速率正常化的时间的缩减或至氧饱和度正常化的时间的缩减)缩减、返回正常氧饱和度(例如，氧饱和度返回约92％或更高)的时间缩减，如在不施用补充氧的情况下在24小时范围内测量，或者生命体征如心率、血压、呼吸速率和温度正常化的时间缩减，施用本发明抗甲型流感病毒血凝素抗体的结果显示治疗甲型流感病毒感染的有效性。
统计分析
使用JMP第9.0.2版软件(SAS Institute)计算统计结果。使用对数秩检验比较存活率实验。将P值<0.05视为显著。使用Graphpad Prism第5.0版软件绘制IC50曲线并计算IC50值。
虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。

Claims (14)

1.分离的抗血凝素抗体，包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1由SEQ ID NO:191的氨基酸序列所示；
(b)HVR-H2由SEQ ID NO:193的氨基酸序列所示；
(c)HVR-H3由SEQ ID NO:194的氨基酸序列所示；
(d)HVR-L1由SEQ ID NO:195的氨基酸序列所示；
(e)HVR-L2由SEQ ID NO:196的氨基酸序列所示；并且
(f)HVR-L3由SEQ ID NO:197的氨基酸序列所示。
2.根据权利要求1所述的分离的抗血凝素抗体，其中抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的抗血凝素抗体，其中抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:234的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的抗血凝素抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:234的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ IDNO:235的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的抗血凝素抗体，其中抗体包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:139的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的抗血凝素抗体，其中抗体包含重链，所述重链包含SEQID NO:147的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的抗血凝素抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含由SEQ ID NO:147组成的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述分离的抗血凝素抗体，其中所述抗体是人抗体。
9.组合物，包含根据权利要求1-8中任一项所述的抗体。
10.药物组合物，包含根据权利要求1-8中任一项所述的抗体和可药用载体。
11.分离的核酸，编码根据权利要求1-8中任一项所述的抗体。
12.宿主细胞，包含根据权利要求11所述的核酸。
13.产生抗体的方法，包括培养根据权利要求12所述的宿主细胞，从而产生抗体。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的抗血凝素抗体在制造药物中的用途，其中药物用于治疗、抑制或预防甲型流感病毒感染。
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