MX2015005860A - Anticuerpos de antihemaglutinina y metodo de uso. - Google Patents

Anticuerpos de antihemaglutinina y metodo de uso.

Info

Publication number
MX2015005860A
MX2015005860A MX2015005860A MX2015005860A MX2015005860A MX 2015005860 A MX2015005860 A MX 2015005860A MX 2015005860 A MX2015005860 A MX 2015005860A MX 2015005860 A MX2015005860 A MX 2015005860A MX 2015005860 A MX2015005860 A MX 2015005860A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
hvr
antibody
Prior art date
Application number
MX2015005860A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerald R Nakamura
Henry Chiu
Xu Min
Ning Chai
Nancy Chiang
Zhaoyu Jin
Zhonghua Lin
Patrick J Lupardus
Hyunjoo Park
Lee R Swem
Mercedesz Balazs
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50693943&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2015005860(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of MX2015005860A publication Critical patent/MX2015005860A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
    • A61K31/24—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group having an amino or nitro group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos de antihemaglutinina, composiciones que comprenden anticuerpos de antihemaglutinina y sus métodos de uso.

Description

ANTICUERPOS DE ANTIHEMAGLUTININA Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional U. S. N° 61/725.859, presentada el 13 de noviembre de 2012, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.
LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se presentó electrónicamente en formato ASCII y se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 31 de octubre de 2013 se denomina P4982R1_SequenceListing.txt y tiene 227.588 bites de tamaño.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos de antihemaglutinina, composiciones que comprenden anticuerpos de antihemaglutinina y sus metodos de uso.
ANTECEDENTES La infección por virus de la gripe causa entre tres y cinco millones de casos de enfermedad grave y entre 250.000 y 500.000 muertes por año en el mundo entero. Sólo en los Estados Unidos, 5% al 20% de la población se infecta con virus de influenza cada año, con la mayoría de estas infecciones causadas por el virus de la gripe A. (Ver, por ejemplo, Dushoff et al., (2006) Am J Epidemiology 163:181-187; Thompson et al., (2004) JAMA 292:1333-1340; Thompson et al., (2003) JAMA 289:179-186). Aproximadamente 200.000 personas en los Estados Unidos se hospitalizan con complicaciones relacionadas con la gripe cada año, dando como resultado 7.000 a 30.000 muertes por año. La carga asociada con el virus de la infección de la gripe sobre los costos del cuidado de la salud y la productividad perdida es extensa. La hospitalización y las muertes se producen principalmente en grupos de alto riesgo, tales como las personas mayores, los niños y las personas con enfermedades crónicas.
Los virus de la gripe son virus de ARN de cadena negativa envueltos en membrana segmentada pertenecientes a la familia Ortomixoviridae. El virus de la gripe A consiste en 9 proteínas estructurales y 1 proteína no estructural, que incluye tres proteínas superficiales virales: hemaglutinina (HA o H), neuraminidasa (NA o N) y proteína de matriz 2 (M2). La naturaleza segmentada del genoma viral de la gripe permite que el mecanismo de reasignación genetica (es decir, intercambio de los segmentos del genoma) tengan lugar durante la infección mixta de una célula con diferentes cepas virales de la gripe. Las epidemias anuales de la gripe se producen cuando las propiedades antigénicas de las proteínas de superficie viral hemaglutinina y neuraminidasa se alteran. El mecanismo de antigenicidad alterada es doble: desplazamiento antigénico, causado por reordenamiento genético entre virus humanos y animales después de la coinfección de células huésped con al menos dos subtipos virales que pueden causar una pandemia; y desplazamiento antigénico causado por pequeños cambios en las proteínashemaglutinina y neuraminidasa sobre la superficie viral que pueden causar epidemias de gripe.
Los virus de la gripe A se pueden seguir clasificando en diversos subtipos según las diferentes proteínas virales hemaglutinina y neuraminidasa desplegadas sobre su superficie. Cada subtipo del virus de la gripe A se identifica por la combinación de sus proteínas hemaglutinina y neuraminidasa. Hay 16 subtipos conocidos de HA (H1 - H16) y 9 subtipos conocidos de NA (N1 - N9). Los 16 subtipos de hemaglutinina se subclasifican en dos grupos filogeneticos: el grupo 1 incluye los subgrupos de hemaglutinina H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 y H16; el grupo 2 incluye los subtipos hemaglutinina H3, H4, H7, H10, H14 y H15.
La hemaglutinina promueve la unión viral y la entrada en la célula huésped; se requiere la neuraminidasa para el virus incipiente de la célula infectada. La hemaglutinina del virus de la gripe A comprende dos regiones estructuralmente distintas -una región superior globular y una región de tallo. La región superior globular contiene un sitio de unión con receptores que es responsable de la unión de virus con una célula blanco. La región de tallo de la hemaglutinina contiene un péptido de fusión que es necesaria para la fusión de la membrana entre la envuelta viral y una membrana endosomal de la célula infectada. (Ver, por ejemplo, Bouvier y Palese (2008) Vaccine 26 Suppl 4: D49-53; Wilcy et al., (1987) Ann Rev Biochem 556:365-394).
El actual tratamiento de la infección por virus de la gripe incluye inhibidores de la neuraminidasa, tales como oseltamivir y zanamivir. El oseltamivir es una opción de tratamiento preventiva y terapéutica temprana ampliamente usada para la infección por virus de la gripe A. (Ver, por ejemplo, Kandel y Hartshorn (2001) BioDrugs: Clinical Immunotherapy, Biopharmaceuticals and Gene Therapy 15:303-323; Nicholson et al., (2000) Lancet 355:1845-1850; Treanor etal., (2000) JAMA 283:1016-1024; y Welliver et al., (2001) JAMA 285:748-754). Sin embargo, el tratamiento con oseltamivir debe comenzar dentro de las 48 horas del inicio de los síntomas para proporcionar un beneficio clínico significativo. (Ver, por ejemplo, Aoki et al (2003) J Antimicrobial Chemotherapy 51:123-129.) Esta responsabilidad compromete a la capacidad del oseltamivir para tratar a pacientes enfermos que están típicamente más allá de la ventana terapeutica óptima de 48 horas al momento de la búsqueda del tratamiento. En consecuencia, el foco significativo se colocó recientemente en la identificación de los agentes terapéuticos del virus de la gripe para tratar pacientes infectados con el virus de la gripe que están hospitalizados. Una estrategia se enfocó en el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) que se dirigen a un epítope altamente conservado en el tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe A. (Ver, por ejemplo, Corti et al., (2011) Science 333:850-856; Ekiert et al., (2009) Science 324:246-251; Ekiert et al., (2011) Science 333:843-850; Sui et al., (2009) Nature Structural & Molecular Biology 16:265-273; Drcyfus et al., (2012) Science 337:1343-1348; Wu et al., (2012) J Virology 2012.09.034; Clementi et al., (2011) PLoS One 6:1-10. Ver también las publicaciones de solicitud de patente internacional Nros: W02009/115972, WO 2011/117848, W02008/110937, WO 2010/010466, W02008/028946, WO 2010/130636, WO 2012/021786, WO 2010/073647, WO 2011/160083, WO 2011/111966, WO 2002/46235 y WO 2009/053604; patentes U. S. Nros: 5.631.350 y 5.589.174).
Varios informes han descrito anticuerpos monoclonales (mAb) que unen la hemaglutinina y neutralizan ampliamente el virus de la gripe A. Por ejemplo, Corti et al. ( supra ) describieron el anticuerpo FI6v3, que se clonó a partir de una célula de plasma humano y mostró neutralizar el virus humano de la gripe Aes perteneciente tanto a los subtipos de hemaglutinina del grupo 1 como del grupo 2. El FI6v3 mAb se descubrió como un resultado de un esfuerzo heroico por analizar aproximadamente 104.000 células de plasma humano. Además, Drcyfus et al. ( supra ) describieron recientemente la identificación del anticuerpo CR9114 por paneo de visualización de fagos; se mostró que el anticuerpo CR9114 se une con un epítope de tallo altamente conservado compartido entre hemaglutinina del virus de la gripe A y virus de la gripe B.
A pesar de estos informes, aún existe una necesidad en el arte de nuevas terapias de virus de la gripe A contra virus de la gripe A de los subtipos del grupo 1 y del grupo 2. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona otros beneficios para el tratamiento de infección por virus de la gripe A.
SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos de antihemaglutinina, composiciones que comprenden anticuerpos de antihemaglutinina y sus métodos de uso.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1 , HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 180 y 181; (d) HVR-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 185 y 186; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 188, 189 y 190.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 180 y 181 ; (d) HVR-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 185 y 186; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 188, 189 y 190.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y LVR-L3), en donde: (a) HVR-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 185 y 186; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (c) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 188, 189 y 190.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; y (c) HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 180 y 181.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena liviana (HVR), en donde: (a) HVR-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 185 y 186; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (c) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 188, 189 y 190.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; y (c) HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 180 y 181.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 111 y 115 y la región variable de cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122, 124, 126, 128, 130 y 132.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122, 124, 126, 128, 130 y 132.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 111 y 115.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 110, 114 y 120 y la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 112, 116, 118, 121, 123, 125, 127, 129 y 131.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 112, 116, 118, 121, 123, 125, 127, 129 y 131.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 110, 114 y 120.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 191 y 192; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 197, 198 y 199.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 191 y 192; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 197, 198 y 199.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1 , HVR-L2 y LVR-L3), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (c) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 197, 198 y 199.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3), en donde: (a) HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 191 y 192; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena liviana (HVR), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (c) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 197, 198 y 199.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 191 y 192; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 134, 138, 142, 148 y 234 y la región variable de cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 136, 140, 144, 146, 150, 152 y 235.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 136, 140, 144, 146, 150, 152 y 235.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 134, 138, 142, 148 y 234.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 133, 137, 141 y 147 y la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 135, 139, 143, 145, 149 y 151.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 135, 139, 143, 145, 149 y 151.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 133, 137, 141 y 147.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1 , HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 ; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205. En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1 , HVR-L2 y LVR-L3), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena liviana (HVR), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 154 y 158 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 154 y 158.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 153 y 157 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 153 y 157.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1 , HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211. En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y LVR-L3), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena liviana (HVR), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1 , HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y LVR-L3), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena liviana (HVR), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y LVR-L3), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena liviana (HVR), en donde: (a) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 ; (b) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (c) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende: al menos uno, dos y/o tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; y (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.
En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina aislado de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167.
La invención tambien proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención. La invención también proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención. La invención también proporciona celulas huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la presente invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante tal como un vector de expresión. Cualquiera de una variedad de células huésped se puede usar. En una forma de realización, una célula huésped es una célula procariota, por ejemplo, E. coli. En otra forma de realización, una célula huésped es una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero como célula de ovario de hámster chino (CHO).
La invención también proporciona un método de producción de un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para preparar un anticuerpo de antihemaglutinina (que, como se define en la presente, incluye un anticuerpo de longitud total y sus fragmentos), donde el método comprende expresar en una célula huésped apropiada un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo de antihemaglutinina o sus fragmentos, de modo que se producen el anticuerpo o sus fragmentos. En algunas formas de realización, el método comprende el cultivo de una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención (o sus fragmentos), de modo que se expresa el ácido nucleico. El método también puede comprender la recuperación del anticuerpo de antihemaglutinina o sus fragmentos del cultivo de la célula huésped o el medio de cultivo de la célula huésped.
La invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica también puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
La invención también proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención. La composición también puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, tal como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
La invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención para usar en la prevención de la infección por virus de la gripe A. En algunas formas de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención para usar en la prevención de la infección por virus de la gripe A. La invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención para usar en el tratamiento de la infección por virus de la gripe A. En algunas formas de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención para usar en el tratamiento de la infección por virus de la gripe A. La invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención para usar en la inhibición de la infección por virus de la gripe A. En algunas formas de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención para usar en la inhibición de la infección por virus de la gripe A.
Las composiciones que comprenden un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención también se pueden usar en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para usar en la inhibición, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, el medicamento también puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
La invención también proporciona un método para inhibir la infección por virus de la gripe A, donde el método comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención, inhibiendo así la infección por virus de la gripe A. La invención también proporciona un método para el tratamiento de infección por virus de la gripe A, donde el método que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención, tratando así la infección por virus de la gripe A. La invención también proporciona un método para prevenir la infección por virus de la gripe A, donde el método que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención, previniendo así la infección por virus de la gripe A.
La invención tambien proporciona un método para inhibir, tratar o prevenir una infección por virus de la gripe A, donde el método comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención y la administración al paciente de una cantidad efectiva de un agente terapéutico adicional, inhibiendo, tratando o previniendo así una infección por virus de la gripe A. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir. En otras formas de realización, el agente terapéutico adicional es otro anticuerpo de antihemaglutinina. En formas de realización más, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-M2. En diversos aspectos de tales tratamientos combinados, los agentes terapéuticos se administran a aproximadamente el mismo tiempo, se administran juntos o se administran secuencial o consecutivamente. En formas de realización particulares, se administra un inhibidor de antineuraminidasa antes de la administración de un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para usar en la inhibición, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, el medicamento también puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, tal como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para usar en la inhibición, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, el medicamento tambien puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para usar en la inhibición, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, el medicamento también puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una célula huésped de la invención en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para usar en la inhibición, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, el medicamento también puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de fabricación de la invención en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para usar en la inhibición, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, el medicamento tambien puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un kit de la invención en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para usar en la inhibición, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, el medicamento también puede comprender un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un inhibidor de neuraminidasa, tales como oseltamivir o zanamivir; otro anticuerpo, como otro anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2; etc.).
En diversos aspectos, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención une la hemaglutinina. En algunos aspectos, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención une la hemaglutinina del grupo 1 , une la hemaglutinina del grupo 2 o une la hemaglutinina del grupo 1 y del grupo 2. En otros aspectos, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención une la hemaglutinina y neutraliza el virus de la gripe A. En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención neutraliza el virus de la gripe A in vitro, in vivo o in vitro e in vivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A y 1B establece datos que muestran el análisis FACS de plasmablastos antihemaglutinina-positivos (hemaglutinina FI3+ y hemaglutinina FI1+) del día 7 de celulas mononucleares de sangre periférica humana posvacunadas (PBMCs) antes del enriquecimiento del ratón SCID/beige (Figura 1A) y día 8 después de la implantación posintrasplénica tras el enriquecimiento de ratón SCID/beige con y sin premezcla de antígeno (Figura 1B) en los paneles superior e inferior, respectivamente.
Figura 2 establece datos que muestran análisis de esplenocitos obtenidos del día 8 de implantación posintrasplénica de PBMCs de ratones individuales SCID/beige sin PBMC/premezcla de antígeno (círculos) y con PBMC/premezcla de antígeno (cuadrados), como porcentaje de plasmablastos de hemaglutinina (H1)+/CD38alt0. El rectángulo indica ratones que presentaban plasmablastos de hemaglutinina FI1+.
Figura 3 establece datos que muestran la neutralización in vitro de diversas cepas de virus de gripe A del grupo 1 y del grupo 2 por anticuerpos de antihemaglutinina de la presente invención.
Figuras 4A y 4B establecen datos que muestran la neutralización in vitro de diversas cepas de virus de la gripe A del grupo 1 (Figura 4A) y del grupo 2 (Figura 4B) por anticuerpo monoclonal 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177).
Figuras 5A y 5B establecen datos que muestran la neutralización in vitro de diversas cepas de virus de gripe A del grupo 1 (Figura 5A) y del grupo 2 (Figura 5B) por anticuerpo monocional 81.39 SVSH-NYP ("SVSH" revelado como SEQ ID NO: 171).
Figura 6 establece datos que muestran la neutralización in vitro de diversas cepas de virus de gripe A del grupo 1 por el anticuerpo monocional 39.18 B11.
Figura 7 establece datos que muestran la neutralización in vitro de diversas cepas de virus de gripe A del grupo 1 y del grupo 2 por el anticuerpo monocional 36.89.
Figura 8 establece datos que muestran la neutralización in vitro de diversas cepas de virus de gripe A del grupo 1 y del grupo 2 por el anticuerpo monocional mAb9 01 F3.
Figura 9 establece datos que muestran la neutralización in vitro de diversas cepas de virus de gripe A del grupo 1 y del grupo 2 por el anticuerpo monocional mAb23 06C2.
Figura 10 establece datos que muestran la neutralización in vitro de un pseudovirus que expresa hemaglutinina H5 por el anticuerpo monocional 39.29 NCy1.
Figura 11 establece datos que muestran la neutralización in vitro de un virus de la gripe equina H7N7 por el anticuerpo monocional 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177).
Figuras 12A, 12B, 12C y 12D establecen datos que muestran el porcentaje de supervivencia de ratones infectados con diversas cepas de virus de la gripe A (A/PR/8/1934 (PR8), Figura 12A; A/Port Chalmers/1/1973 (PC73), Figura 12B; A/Hong Kong/1/1968 (HK68), Figura 12C); y A/Aichi/2/1968 (Aichi68), Figura 12D) y se administran diversas cantidades de anticuerpo monoclonal 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177).
Figura 13 establece datos que muestran porcentaje de supervivencia de ratones infectados con A/PR/8/1934 virus de la gripe A y se administran diversas cantidades de anticuerpo monoclonal 39.29 NCy1.
Figura 14 establece datos que muestran porcentaje de supervivencia de ratones infectados con A/Hong Kong/1/1968 virus de la gripe A (un virus de la gripe A que tiene una elevada IC50) y se administran diversas cantidades de anticuerpo monoclonal 39.29 NCv1.
Figura 15 establece datos que muestran porcentaje de supervivencia de ratones infectados con virus de la gripe A A/Port Chalmers/1/1973 y se administran diversas cantidades de anticuerpo monoclonal 39.29 NCv1.
Figura 16 establece datos que muestran porcentaje de supervivencia de ratones infectados con virus de la gripe A A/Aich i/2/1968 y se administran diversas cantidades de anticuerpo monoclonal 39.29 NCv1.
Figura 17 establece datos de comparación de porcentaje de supervivencia de ratones infectados con cepa del virus de la gripe A A/PR/8/1934 y se administra una mezcla 50:50 de anticuerpo monoclonal 39.29 D8C2 y anticuerpo monoclonal 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) uo oseltamivir (Tamiflu®).
Figura 18 establece datos que muestran la comparación de porcentaje de supervivencia de ratones infectados con cepa del virus de la gripe A A/PR/8/1934 y se administra el anticuerpo monoclonal 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177), oseltamivir (Tamiflu®) o una combinación de anticuerpo monoclonal 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) y oseltamivir.
Figuras 19A y 19B establecen datos de comparación del porcentaje de supervivencia de hurones infectados con cepa del virus de la gripe A AA/ietnam/1203/04 (H5N1) y se administran anticuerpo monoclonal 39.29 D8C2 (Figura 19A), anticuerpo monoclonal 81.39 B1C1 (Figura 19B) u oseltamivir (Tamiflu®) 48 horas o 72 horas posinfección.
Figura 20 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de secuencias de aminoácidos de hemaglutinina de hemaglutinina H1, H2, H3, H5 y H7, que muestra residuos de contacto de hemaglutinina (en sombra) de anticuerpo monoclonal 39.29NCy1 y el epítope de unión con hemaglutinina.
Figuras 21 A y 21 B establecen datos de experimentos de competición ELISA de diversos anticuerpos monoclonales de la presente invención que compiten con anticuerpo monoclonal 39.29 marcado con biotina con la hemaglutinina H1 de A/NWS/1933 (Figura 21A) y hemaglutinina H3 de A/HK/8/1968 (Figura 21B).
Figuras 22A y 22B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 B1C1 (SEQ ID NOs: 113 y 111, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 23A y 23B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 SVSH-NYP ("SVSH" revelado como SEQ ID NO: 171) (SEQ ID NOs: 117 y 115, respectivamente) con inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 germ-line (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 24A y 24B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 B1F1 (SEQ ID NOs: 119 y 111, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 25A y 25B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 SVDS ("SVDS" revelado como SEQ ID NO: 172) (SEQ ID NOs: 113 y 115, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 26A y 26B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 SVSS ("SVSS" revelado como SEQ ID NO: 173) (SEQ ID NOs: 122 y 115, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 27A y 27B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 SVDH ("SVDH" revelado como SEQ ID NO: 174) (SEQ ID NOs: 124 y 115, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 28A y 28B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de mAb 81.39 SVSH ("SVSH" revelado como SEQ ID NO: 171) (SEQ ID NOs: 126 y 115, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 29A y 29B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 SVSH.NFP ("SVSH" revelado como SEQ ID NO: 171) (SEQ ID NOs: 128 y 115, respectivamente) con la línea germinal de ¡nmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de ¡nmunoglobulina variable 3-30*01 (IGFIV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 30A y 30B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 SVDS.F ("SVDS" revelado como SEQ ID NO: 172) (SEQ ID NOs: 130 y 115, respectivamente) con la línea germinal de ¡nmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de ¡nmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 31 A y 31 B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 81.39 SVDS. Y ("SVDS" revelado como SEQ ID NO: 172) (SEQ ID NOs: 132 y 115, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 237, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 32A y 32B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.29 D2C4 (SEQ ID NOs: 136 y 134, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 245, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 33A y 33B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.29 D8C2 (SEQ ID NOs: 140 y 138, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 245, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 34A y 34B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.29 NCv1 (SEQ ID NOs: 144 y 142, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 245, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 35A y 35B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.29 D8E7 (SEQ ID NOs: 146 y 138, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 245, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 36A y 36B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.29 NFPP ("NFPP" revelado como SEQ ID NO: 175) (SEQ ID NOs: 150 y 148, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 245, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 37A y 37B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.29 NYPP ("NYPP" revelado como SEQ ID NO: 176) (SEQ ID NOs: 152 y 148, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 245, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 38A y 38B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) (SEQ ID NOs: 235 y 234, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina variable 3-30*01 (IGHV3-30*01) (SEQ ID NOs: 236 y 245, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 39A y 39B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.18 B11 (SEQ ID NOs: 156 y 154, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de la cadena pesada de inmunoglobulina variable 1-69*01 (IGHV1-69*01) (SEQ ID NOs: 236 y 238, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 40A y 40B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 39.18 E12 (SEQ ID NOs: 156 y 158, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 3-15*01 (IGKV3-15*01) y la línea germinal de la cadena pesada de inmunoglobulina variable 1-69*01 (IGHV1-69*01) (SEQ ID NOs: 236 y 238, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 41A y 41 B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 36.89 (SEQ ID NOs: 162 y 160, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina kappa variable 1-5*03 (IGKV1-5*03) y la línea germinal de la cadena pesada de inmunoglobulina variable 1-18*01 (IGHV1-18*01) (SEQ ID NOs: 239 y 240, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 42A y 42B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 9.01F3 (SEQ ID NOs: 166 y 164, respectivamente) con la línea germinal de inmunoglobulina liviana variable 1-44*01 (IGKV1-44*01) y la línea germinal de la cadena pesada de inmunoglobulina variable 1-2*02*01 (IGHV1-2*02) (SEQ ID NOs: 241 y 242, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
Figuras 43A y 43B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena liviana y la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 23.06C2 (SEQ ID NOs: 170 y 168, respectivamente) con la línea germinal de la inmunoglobulina kappa variable 2-30*01 (IGKV2-30*01) y la línea germinal de la cadena pesada de inmunoglobulina variable 4-39*01 (IGHV4-39*01) (SEQ ID NOs: 243 y 244, respectivamente). Los aminoácidos son números de acuerdo con la numeración de Kabat. Se indican las CDRs de Kabat, Chotia y de contacto.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Una “estructura humana aceptora” para los fines de la presente es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de una estructura de dominio variable de cadena liviana (VL) o una estructura de dominio variable de cadena pesada (VH) derivada de una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana. Una estructura humana aceptora “derivada de” una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de esta, o puede contener cambios de la secuencia de aminoácidos preexistente. En algunas formas de realización, el número de cambios de aminoácidos preexistentes son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas formas de realización, la estructura humana aceptora VL es idéntica en secuencia a la estructura de la secuencia de inmunoglobulina humana aceptora o secuencia de la estructura de consenso humana.
“Afinidad” se refiere a la fuerte de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión simple de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su par de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique otra cosa, como se usa en la presente, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su par Y puede estar representada, en general, por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por medio de métodos comunes conocidos en el arte, incluyendo aquellos descritos en la presente. Las formas de realización ilustrativas y de ejemplo específicas para medir la afinidad de unión se describen a continuación.
Un anticuerpo “maduro por afinidad” se refiere a un anticuerpo con una o varias alteraciones en una o varias regiones hipervariables (HVRs), en comparación con un anticuerpo principal que no posee tales alteraciones, donde tales alteraciones resultan en una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Las expresiones “anticuerpo de antihemaglutinina” y “un anticuerpo que se une con hemaglutinina” se refieren a un anticuerpo que une la hemaglutinina con suficiente afinidad de modo tal que el anticuerpo es de utilidad como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a la hemaglutinina, incluyendo dirigirse a la hemaglutinina del virus de la gripe. En una forma de realización, la extensión de la unión de un anticuerpo de antihemaglutinina con una proteína no hemaglutinina relacionada es inferior a aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo con la hemaglutinina tal como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas formas de realización, un anticuerpo que se une con hemaglutinina tiene una constante de disociación (Kd) de £ 1mM, < 100 nM, < 10 nM, £ 1 nM, < 0,1 nM, £ 0,01 nM o £ 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 1CT13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10~13 M). En determinadas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina se une con un epitope de hemaglutinina que se conserva entre hemaglutinina de diferentes cepas, subtipos y aislados de virus de la gripe Aes.
El termino “anticuerpo” se usa en la presente en el sentido más amplio y cubre varias estructuras de anticuerpo, que incluyen pero sin limitación anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que ellos exhiban la actividad biológica deseada.
Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto, que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Un fragmento de anticuerpo también se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une con hemaglutinina y neutraliza el virus de la gripe A. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2¡ diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única(por ejemplo scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
Un “anticuerpo que se une al mismo epítope” que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más. Un ejemplo de ensayo de competición se proporciona en la presente.
El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o liviana deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o liviana es deriva de una fuente o especie diferente.
La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi e lgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, g, y m, respectivamente.
El término “agente citotóxico” como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide una función celular y/o causa muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, los isótopos radiactivos {por ejemplo, At211, 31, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu), agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos; toxinas tales como toxinas de pequeñas moléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico o animal, que incluyen sus fragmentos y/o variantes, y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos que se describen a continuación.
Las “funciones efectoras” se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el ¡sotipo del anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.
Una “cantidad efectiva” de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término “región Fe” de la presente se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de la ¡nmunoglobulina, que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de la secuencia nativa y regiones Fe de la variante. En una forma de realización, la región Fe de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de los residuos de aminoácidos de la región Fe o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, tambien llamado el índice EU, que se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
“Estructura” o residuos de “FR" se refieren a los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3, y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Los términos “anticuerpo de longitud completa” “anticuerpo intacto” y “anticuerpo total” se usan en forma indistinta para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura del anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se definió en la presente.
Las expresiones “célula huésped” “línea celular césped” y “cultivo celular huésped” se usan en forma indistinta y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células Las células huésped incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen las células primarias transformadas y la progenie derivada de ellas sin tener en cuenta el número de pasajes. La progenie puede no ser exactamente identica en el contenido de ácido nucleico a una célula progenitora, pero puede contener mutaciones. Se incluyen en la presente la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica identificada o seleccionada en la célula originalmente transformada.
Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde al de un anticuerpo producido por un ser humano y/o una célula humana derivado de una fuente humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifica anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humano.
Una “estructura de consenso humana” es una estructura que representa los residuos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias estructurales VL o VH de la inmunoglobulina humana. En general, la selección de las secuencias estructurales VL o VH de la inmunoglobulina humana es de un subgrupo de las secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de las secuencias es un subgrupo de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, N1H Publicatio 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3. En una forma de realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I de Kabat et al., supra. En una forma de realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III de Kabat et al., supra.
Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de aminoácidos de FR humanas. En ciertas formas de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente el total de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que el total o sustancialmente el total de las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las del anticuerpo no humano, y el total o sustancialmente el total de las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante del anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado la humanización.
El término “región hipervariable” o “HVR” como se usa en la presente se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable del anticuerpo que son hipervariables en la secuencia (“regiones determinantes de complementariedad” o “CDRs”) y/o forman bucles definidos estructuralmente (“bucles hipervariables”) y/o contienen los residuos que contactan el antígeno (“contactos de antígeno”). En general, los anticuerpos comprender seis HVRs: tres en VH (H1, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3). Las HVRs de ejemplo en la presente incluyen: (a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chotia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDRs que se producen en residuos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contactos de antígeno que se producen en los residuos de aminoácidos 27C-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y (d) combinaciones de (a), (b), y/o (c), incluyendo residuos de aminoácidos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
A menos que se indique otra cosa, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se numeran en la presente de acuerdo con Kabat et al., supra.
Un “inmunoconjugado” es un anticuerpo conjugado con una o más moleculas heterólogas que incluyen pero sin limitación un agente citotóxico.
Un “individuo” o “sujeto” es un mamífero. Los mamíferos incluyen pero sin limitación, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos, y roedores (por ejemplo, ratones y ratas. En ciertas formas de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un anticuerpo “aislado” es uno que ha sido separado de un componente de su ambiente natural. En algunas formas de realización, un anticuerpo se purifica a más del 95% de pureza determinado, por ejemplo, por métodos electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), eletroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o fase inversa HPLC). Para la revisión de los métodos para la evaluación de la pureza del anticuerpo, ver, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Una molécula de ácido nucleico “aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en la células que normalmente expresa la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente en forma extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. “Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de antihemaglutinina” se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y liviana del anticuerpo (o sus fragmentos), que incluye tales moléculas de ácido nucleico en un vector solo o vectores separados, y tales moléculas de ácidos presentes en una o más localizaciones en una célula huésped.
El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítope, excepto por posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que se originan durante la producción de una preparación de un anticuerpo monoclonal, tales variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal, que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. En consecuencia, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpreta que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales usados de acuerdo con la presente invención se pueden obtener por una variedad de téenicas, que incluyen, pero sin limitación, el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de despliegue en fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen el total o parte del locus de inmunoglobulina humana, tales métodos y otros ejemplos de métodos para obtener anticuerpos monoclonales se describen en la presente.
Un “anticuerpo desnudo” se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un residuo heterólogo (por ejemplo, un residuo citotóxico) o radiomarca. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
“Anticuerpos nativos” se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variadas. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas livianas idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por disulfuro. Desde el extremo N- a C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada un dominio pesado variable o un dominio variable de la cadena pesada, seguida por tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3). De modo similar, desde el extremo N- a C-terminal, cada cadena liviana tiene una región variable (VL), también llamada dominio liviano variable o un dominio variable de la cadena pesada, seguido por un dominio liviano constante (CL). La cadena liviana de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (K) y lambda (l), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de su dominio constante.
El término “prospecto del envase” se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de los productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias concernientes al uso de tales productos terapéuticos.
“Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir brechas, de ser necesario, a fin de obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento a los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que son conocidas por los expertos en la téenica, por ejemplo, mediante el uso de software de computación disponible para el público tales como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluso cualquier algoritmo necesario para obtener el máximo alineamiento para la longitud total de las secuencias que se comparan. A los fines de la presente, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos son generados mediante el uso del programa de computación para comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computación para comparación de secuencias ALIGN-2 fue autorizado por Genentech, Inc., y el código de fuente se presentó con documentación de usuario en la Oficina de Copyright de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el Registro de Copyright de los Estados Unidos N.° TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público de Genentech, Inc., San Francisco Sur, California, o puede ser compilado mediante el código fuente. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las cuales se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (las cuales se pueden alternativamente parafrasear como secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos calificados como coincidencias identicas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B del programa, y en donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácido de B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. A menos que se establezca específicamente otra cosa, la totalidad de los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en la presente se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente precedente mediante el uso del programa de computación ALIGN-2.
La expresión “formulación farmaceutica” se refiere a una preparación que está en forma tal que permite que la actividad biológica contenida en este sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se debe administrar la formulación.
Un “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que es no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, un buffer, excipiente, estabilizantes, o conservante.
El término “hemaglutinina”, tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier hemaglutinina nativa de cualquier fuente de virus de gripe, a menos que se indique otra cosa. El término comprende hemaglutinina sin procesar de “longitud completa”, así como cualquier forma de hemaglutinina que resulta del procesamiento de un virus de la gripe o una célula infectada con el virus de la gripe. El término también comprende variantes naturales de hemaglutinina, por ejemplo, variantes de división o variantes alélicas. Las secuencias de aminoácidos de proteínas de hemaglutinina presentes de diversas cepas de virus de la gripe A se muestran en las SEQ ID NOs: 225 (H2 de A/Japón/305/1957), 226 (H3 de A/Pert/16/2009), 227 (H5 de A/Vietnam/1203/2004), 228 (H7 de A/gallina/NSW/1 /1997), 229 (H1 de A/California/07/2009), 230 (H1 de A/NSW/1933), 231 (H3 de A/Hong Kong/8/1968), 232 (H7 de A/Países Bajos/219/2003) y 233 (A/Carolina del Sur/1918).
Tal como se usa en la presente, “tratamiento” (y sus variaciones gramaticales tales como “tratar” o “tratado”) se refieren a una intervención clínica para intentar alterar el curso natural del individuo tratado, y se puede realizar por prevención o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero sin limitación, prevenir la aparición o la recurrencia de la enfermedad (por ejemplo, prevenir la aparición o recurrencia de infección por virus de la gripe A), reducción (por ejemplo, disminuación) o el alivio de los síntomas, la disminución de cualquiera consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminuir la velocidad del progreso de la enfermedad, aliviar y paliar el estado de enfermedad, y la remisión o el mejoramiento del pronóstico. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para frenar la progresión de una enfermedad.
El termino “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o liviana del anticuerpo que está involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena liviana (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, con cada dominio que comprende cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman y Co„ página 91 (2007).) Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Por otra parte, los anticuerpos que unen a un antígeno particular se puede aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios de VL o VH complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El término “vector” como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que se ha unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se unen operativamente. Tales vectores se denominan en la presente como “vectores de expresión”.
COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, la invención se basa en parte, en anticuerpos de antihemaglutinina y sus usos. En determinadas formas de realización, se proporcionan los anticuerpos que se unen con hemaglutinina. Los anticuerpos de la invención son de utilidad, por ejemplo, para la diagnosis, el tratamiento o la prevención de infección por virus de la gripe A.
Anticuerpos de antihemaglutinina de ejemplo En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen con hemaglutinina. En determinadas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención se une con hemaglutinina, se une con hemaglutininas del grupo 1 , se une con hemaglutininas del grupo 2 o se une con hemaglutininas del grupo 1 y del grupo 2. En otras formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención neutraliza los virus de la gripe A in vitro. En otras formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención neutraliza los virus de la gripe A in vivo. En otras formas de realización más, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención reduce la infección por virus de la gripe A, previene la infección por virus de la gripe A, inhibe la infección por virus de la gripe A o trata la infección por virus de la gripe A. En algunas formas de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención previene, inhibe o reduce la fusión mediada por hemaglutinina entre la membrana del virus de la gripe y las membranas endosomales de celulas infectadas (previniendo, inhibiendo o reduciendo así la entrada de ARN viral en el citoplasma celular infectado, previniendo, inhibiendo o reduciendo así la posterior propagación de infección por virus de la gripe).
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 189.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 189.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 180 y 181; (d) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 185 y 186; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 188, 189 y 190.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 180 y 181.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 185 y 186; (b) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 188, 189 y 190.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 188.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 189.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 188.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 188.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 188.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 188.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 190.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 190.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 189.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 111 y 115.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122, 124, 126, 128, 130 y 132.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 111 y 115 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122, 124, 126, 128, 130 y 132.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 110, 114 y 120.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 112, 116, 118, 121, 123, 125, 127, 129 y 131.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 110, 114 y 120 y una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 112, 116, 118, 121 , 123, 125, 127, 129 y 131.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antíhemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 192; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 199.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 191 y 192; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; y (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (b) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (c) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 197, 198 y 199.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 197.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 192; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 197.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 198.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 199.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 134, 138, 142, 148 y 234.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 136, 140, 144, 146, 150, 152 y 235.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 134, 138, 142, 148 y 234 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 136, 140, 144, 146, 150, 152 y 235.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 234 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 235.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 133, 137, 141 y 147.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 135, 139, 143, 145, 149 y 151.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 133, 137, 141 y 147 y una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 135, 139, 143, 145, 149 y 151.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 141 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 143.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 ; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 ; y (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (b) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (c) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 154 y 158.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 154 y 158 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 153 y 157.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 153 y 157 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; y (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (b) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (c) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; y (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (b) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (c) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; y (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; (b) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (c) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; (d) HVR-L1 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; (e) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (f) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 y una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.
En cualquiera de las formas de realización anteriores, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención es humanizado. En una forma de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina comprende HVRs como en cualquiera de las formas de realización anteriores y tambien comprende una estructura humana aceptora, por ejemplo, una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana.
En otro aspecto, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención comprende una secuencia de dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 111 , 115, 134, 138, 142, 148, 154, 158, 160, 164, 168 y 234. En determinadas formas de realización, una secuencia de VH que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones respecto de la secuencia de referencia, pero un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse con hemaglutinina. En determinadas formas de realización, un total de 1 a 10 aminoácidos fueron sustituidos, insertados y/o suprimidos en SEQ ID NOs: 111, 115, 134, 138, 142, 148, 154, 158, 160, 164, 168 ó 234. En determinadas formas de realización, sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVRs (es decir, en FRs). Opcionalmente, el anticuerpo antihemaglutinina comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 111, 115, 134, 138, 142, 148, 154, 158, 160, 164, 168 ó 234, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina, en donde el anticuerpo comprende un dominio de cadena liviana variable (VL) que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122,, 124, 126, 128, 130, 132, 136, 140, 144, 146, 150, 152, 156, 162, 166, 170 y 235. En determinadas formas de realización, una secuencia de VL que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones relativas a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse con la hemaglutinina. En determinadas formas de realización, un total de 1 a 10 aminoácidos fueron sustituidos, insertados y/o suprimidos en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 136, 140, 144, 146, 150, 152, 156, 162, 166, 170 ó 235. En determinadas formas de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVRs (es decir, en FRs). Opcionalmente, el anticuerpo de antihemaglutinina comprende la secuencia de VL en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122„ 124, 126, 128, 130, 132, 136, 140, 144, 146, 150, 152, 156, 162, 166, 170 ó 235, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las formas de realización proporcionadas con anterioridad y una VL como en cualquiera de las formas de realización proporcionadas con anterioridad. En una forma de realización, el anticuerpo comprende las secuenciasde VH y VL en SEQ ID NOs: 111, 115, 134, 138, 142, 148, 154, 158, 160, 164, 168 o 234 y SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122„ 124, 126, 128, 130, 132, 136, 140, 144, 146, 150, 152, 156, 162, 166, 170 ó 235, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une con el mismo epiítope que un anticuerpo de antihemaglutinina proporcionado en la presente. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, se proporciona un anticuerpo que se une con el mismo epítope que un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 111 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 113; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 117; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 111 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 119; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 113; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 122; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 124; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 126; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 128; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 130; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 132; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 134 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 136; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 138 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 140; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 142 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 144; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 138 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 146; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 148 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 150; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 148 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 152; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 148 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 140; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 234 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 235; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 154 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 156; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 158 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 156; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 160 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 162; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 164 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 166; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 168 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 170.
En otro aspecto de la invención, un anticuerpo de antihemaglutinina de acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, que incluye un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una forma de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de Fv, Fab, Fab’, scFv, diacuerpo o F(ab’)2. En otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud total, por ejemplo, un anticuerpo intacto, por ejemplo, de lgG1 u otra clase de anticuerpo o isotipo definido en la presente.
En otro aspecto, un anticuerpo de antihemaglutinina de acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores puede incorporar cualquiera de las características, solas o en combinación, tal como se describe en las siguientes secciones 1-7: Afinidad de anticuerpos En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente tiene una constante de disociación (Kd) de < 1mM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo 10-8 M o menos, por ejemplo de 10-8 M a 10 13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10~13 M).
En una forma de realización, se mide Kd por un ensayo de unión al antígeno radiomarcado (RIA). En una forma de realización, un RIA se realiza con la versión Fab de un anticuerpo de interes y su antígeno. Por ejemplo, la afinidad de unión en solución de los Fab para el antígeno se mide al equilibrar el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125l) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, luego se captura el antígeno unido en una placa cubierta de anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas multipocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) se recubren toda la noche con 5 mg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM de antígeno [125l] se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés {por ejemplo, compatible con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et ai, Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés posteriormente se incuba toda la noche, sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Luego, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente {por ejemplo, durante una hora). Luego la solución se elimina y la placa se lava ocho veces con 0,1% de polisorbato (TWEEN-20™ ) en PBS. Cuando las placas se han secado, se agrega 150 mI/pocillo de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se seleccionan las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual a 20% de la unión máxima para usar en los ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra forma de realización, la Kd se mide usando un ensayo de resonancia del plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, se lleva a cabo un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips de antígeno inmovilizado de CM5 a -10 unidades de respuesta (RU). En una forma de realización, los chips del biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de A/-etil-N-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4,8, a 5 mg/ml (~0,2 mM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 mI/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones de cinética, se inyectan dos diluciones seriadas dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de tensioactivo polisorbato 20 TWEEN-20™ (PBST) a 25°C con una velocidad de flujo de aproximadamente 25 ml/min. Las tasas de asociación (kon) y disociación (k0ff) se calculan usando un modelo de Langmuir simple uno a uno (programa de computación BIACORE® Evaluación versión 3.2) con ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación k0ff/k0n. Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación excede 106 M-1 s-1 por el ensayo de resonancia del plasmón superficial anterior, entonces la tasa de asociación se puede determinar por el uso de una teenica de inactivación fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25°C de 20 nM de anticuerpo antiantígeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medido en espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Fragmentos de anticuerpo En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un fragmento de anticuerpo. Los Fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, los fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, y scFv, y otros fragmentos que se describen a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, ver Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclona Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); ver también WO 93/16185; y Patentes U.S. Nros. 5.571.894 y 5.587.458. Para la discusión de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden los residuos del epítope de unión al receptor de recielaje y que tienen vida media larga, ver Patente U.S. N.° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden el total o una porción del dominio variable de cadena pesada o el total o una porción del dominio variable de cadena liviana de un anticuerpo. En ciertas formas de realización, un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por ejemplo, Patente U.S. N.° 6.248.516 B1).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por varias téenicas, que incluyen pero sin limitación digestión proteolítico de un anticuerpo intacto así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo E. coli o fago), como se describen en la presente.
Anticuerpos quiméricos y humanizados En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo, o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo “cambio de clase” en que la clase o subclase ha sido cambiada desde la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen los fragmentos de unión al antígeno de esto.
En ciertas formas de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano es humanizado para reducir la inmunogenicidad en los seres humanos, a la vez que se retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, CDR, (o porciones de estos) derivan de un anticuerpo no humano, y las FR (o porciones de estas) derivan de las secuencias del anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas formas de realización, algunos residuos de la FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los correspondientes residuos de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos de obtenerlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. Estados Unidos 86:10029-10033 (1989); Patentes U.S. Nros. 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321, y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de la región determinante de especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describen “revestimiento”); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe “transposición de FR”); y Osbourn et al. , Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J., cáncer 83:252-260 (2000) (que describe el metodo de “selección guiada” para la transposición de FR).
Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen pero sin limitación: regiones estructurales seleccionadas usando el método de “mejor ajuste” (ver, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia de consenso de los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena liviana o pesada (ver, por ejemplo, Cárter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras humanas (con mutación somática) o regiones estructurales de la línea germinal humana (ver, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas de la selección de bibliotecas de FR (ver, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
Anticuerpos humanos En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varias téenicas conocidas en la materia o usando técnicas conocidas en la presente. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Los anticuerpos humanos se pueden preparar por la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al estímulo antigénico. Tales animales normalmente contienen todo o una porción de los locus de la inmunoglobulina humana, que reemplaza los locus de la inmunoglobulina endógena, o que están presentes en forma extracromosómica o integrada aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, se han inactivado los locus de la inmunoglobulina endógena. Para la revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos de los animales transgénicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Ver también, por ejemplo, las Patentes U.S. Nros. 6,075.181 y 6.150.584 que describe teenología XENOMOUSE™; Patente U.S. N.° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; Patente U.S. N.° 7,041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE®, y Publicación de la solicitud de patente U.S. N.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de los anticuerpos intactos generado por tales animales se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, por la combinación con una región constante humana diferente.
Los anticuerpos humanos también se pueden por métodos basados en hibridoma. Se han descripto líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de los anticuerpos humanos monoclonales. (Ver, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de células B humanas también se describen en Li et ai., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen a los que se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de las líneas celulares del hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe los hibridomas humano-humano). La teenología del hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology y Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Los anticuerpos también se pueden generar por aislamiento de las secuencias del dominio variable del clon Fv seleccionados de las bibliotecas de despliegue en fago derivadas humanas. Tales secuencias del dominio variable luego se pueden combinar con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de las bibliotecas del anticuerpo se describen a continuación.
Anticuerpos derivados de bibliotecas Los anticuerpos de la invención se pueden aislar por medio de bibliotecas combinatorias de selección de anticuerpos actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de métodos son conocidos en la técnica para generar bibliotecas de despliegue de fagos y analizar dichas bibliotecas para hallar anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
En ciertos metodos de despliegue en fagos, Los repertorios de los genes VH y VL se pueden clonar separadamente por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar al azar en bibliotecas de fagos, que luego se pueden analizar para hallar clones de unión con el antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos normalmente despliegan fragmentos de anticuerpo, sea como fragmentos de cadena simple Fv (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de la construcción de hibridomas. Alternativamente, el repertorio inactivo se puede clonar (por ejemplo, del ser humano) para proporcionar una fuente única de anticuerpos humanos con una amplia variedad de antígenos no propios y propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas inactivas también se pueden también preparar sintéticamente por clonación de los segmentos génicos V de las células madre, y mediante los cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para obtener el cambio de lugar in vitro como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381— 388 (1992). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fago de anticuerpo humano incluyen, por ejemplo: Patente US N.° 5.750.373, y publicaciones de patente US Nros. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideren anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humanos en la presente. 6. Anticuerpos multiespecíficos En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En ciertas formas de realización, una de las especificidades de unión es para hemaglutinina y el otro es para cualquier otro antígeno. En ciertas formas de realización, anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos diferentes de hemaglutinina. Los anticuerpos biespecíficos tambien se pueden usar para localizar agentes citotóxicos en las células que expresan hemaglutinina. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las téenicas para obtener anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada -cadena liviana de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) y, manipulación genetica “botón en ojal” (ver, por ejemplo, Patente U S. N.° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden obtener por manipulación genética de los efectos inductores electrostáticos para obtener anticuerpo Fc-moléculas heterodiméricas (WO 2009/089004A1); entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ejemplo, Patente US N.° 4.676.980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cierres de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547—1553 (1992)); usando teenología “diacuerpo” para obtener los fragmentos de anticuerpo biespecífico (ver, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 90:6444-6448 (1993)); y por el uso de dímeros de cadena única Fv (sFv). (ver, por ejemplo Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y la preparación de anticuerpos triespecíficos como se describió, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
El anticuerpo o fragmento en la presente también incluye un “FAb de acción dual” o “DAF” que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a hemaglutinina, así como a otro antígeno diferente (ver, por ejemplo, US 2008/0069820). 7. Variantes de anticuerpos En ciertas formas de realización, se contemplan las variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos provistas en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar por la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o por la síntesis de peptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar alguna combinación de supresión, inserción, y sustitución para obtener la construcción final, con la condición que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión al antígeno.
Variantes de la sustitución, inserción v supresión En ciertas formas de realización, se proporcionan otras variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título de “sustituciones preferidas”. Los cambios más sustanciales, se proporcionan en la Tabla 1, bajo el título de “sustituciones de ejemplo” o como también se describe más adelante con referencia a las clases de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés y los productos se analizan, para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión al antígeno retenido/mejorado, reducción de la inmunogenicidad, mejora de ADCC o CDC.
TABLA 1 Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades de las cadenas laterales: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) ácido: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio un miembro de uno de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original ( por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, las variantes resultantes seleccionadas para posterior desarrollo tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoradas) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, aumento de afinidad, reducción de inmunogenicidad) con respecto al anticuerpo original del cual y/o tendrán ciertas propiedades biológicas sustancialmente retenidas. . Un ejemplo de variante de sustitución es un anticuerpo de afinidad madura, que se puede generar en forma conveniente, por ejemplo, usando teenicas de maduración de afinidad basadas en despliegue de fagos tales como los que se describen en la presente. En breves palabras, uno o más residuos HVR se mutan y las variantes desplegadas en el fago y se analizan para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Las alteraciones (por ejemplo, sustituciones) se pueden realizar en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Tales alteraciones se pueden realizar en “puntos calientes” de la HVR es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación en alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o residuos que contactan el antígeno con la variantes VH o VL resultante que se analiza para determinar la afinidad de unión. La maduración de afinidad por la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descripto, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas formas de realización de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos por maduración por alguno de una variedad de metodos (por ejemplo, PCR predispuesta a error, transposición de cadena, o mutagénesis dirigida a oligonucleótidos). Luego se crea una biblioteca secundaria. La biblioteca luego se analiza para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra los abordajes dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de la HVR (por ejemplo, 4-6 residuos de una vez). Los residuos de HVR involucrados en la unión al antígeno se pueden identificar específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis por barrido de alanina o modelado. A menudo se localiza selectivamente en particular CDR-H3 y CDR-L3.
En ciertas formas de realización, las sustituciones, inserciones, o supresiones ocurren dentro de una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras provistas en la presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Tales alteraciones pueden ser, por ejemplo, externas de los residuos que contactan el antígeno en las HVR. En ciertas formas de realización de las secuencias de la variante de VH y VL provistas anteriormente, cada HVR están no alterada, o contiene no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un metodo útil para la identificación de residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se llama “mutagénesis por barrido de alanina” descripto por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifican un residuo o un grupo de residuos blanco ( por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplaza con un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si se afecta la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional para las sustituciones adicionales. En forma alternativa o adicional, se puede analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos pueden ser localizados selectivamente o eliminados como candidatos para la substitución. Las variantes se pueden analizar para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen las fusiones de amino- y/o carboxilo-terminal que varían de extensión desde un residuo a los polipeptidos que contienen cien o más residuos, así como las inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen la molécula de anticuerpo con un residuo meciónilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a los extremos N- o C terminales del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media sérica del anticuerpo.
Variantes de qlicosilación En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente se altera para aumentar o disminuir el grado de glicosilación del anticuerpo. La adición o supresión de sitios de glicosilación en un anticuerpo se obtiene en forma conveniente por la alteración de la secuencia de aminoácidos de modo de crear o eliminar una o más de los sitios de glicosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el hidrato de carbono adosado se puede alterar. Los anticuerpos nativos producidos por las células de mamífero generalmente comprenden un oligosacárido ramificado con dos antenas que en general está adosado a través de un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos hidratos de carbono, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GIcNAc), galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa adosada a un GIcNAc en el “tallo” de la estructura de oligosacárido con dos antenas. En algunas formas de realización, se pueden hacer modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención a fin de crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.
En una forma de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de mucosa unida (en forma directa o indirecta) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de mucosa en tal anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de mucosa se determina por el cálculo de la cantidad promedio de mucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras de mañosa híbrida y alta, complejas) que se mide por espectrometría de masa MALDI-TOF, que se describe en, por ejemplo, WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 de la región Fe (numeración de Eu de los residuos de la región de Fe); sin embargo, Asn297 tambien se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden tener función de ADCC mejorada.. Ver, por ejemplo, Publicaciones de patente US Nros. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo “desfucosiladas” o “deficientes en fucosa” incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; W02002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen celulas CHO Lec13 deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de patente US N.° 2003/0157108 A1, Presta, L; y WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas de células inactivadas tales como el gen de alfa-1 ,6-fucosiltransferasa FUT8, células CHO inactivadas (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y W02003/085107).
También se proporcionan variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en el que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fe del anticuerpo se biseca con GIcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al ); Patente US N.° 6,602,684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas vahantes de anticuerpo pueden tener mejor función de CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
Variantes de la región Fe En ciertas formas de realización, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo provisto en la presente, de este modo se genera una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana ( por ejemplo, una región Fe de lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En ciertas formas de realización, la invención contempla una variante del anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en una candidata deseable que para muchas aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo es importante, ya que ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo se pueden realizar para confirmar la reducción/depleción de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor de Fe (FcR) se pueden realizar para asegurar que el anticuerpo carezca de la unión a FcyR (por consiguiente probablemente que carezca de actividad ADCC), pero retenga la capacidad de unión al FcRn. Las celulas principales para la mediación de ADCC, las células NK, expresan solo FcJ III, mientras que los monocitos expresan FcJ I, Fc II y FcJ III. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se sintetiza en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Los ejemplos no limitantes de los ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente U.S. N.° 5.500.362 (ver, por ejemplo Hellstrom, I. et al. Proc. Nati Acad. Sci. Estados Unidos 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nati Acad. Sci. Estados Unidos 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (ver Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). En forma alternativa, se pueden emplear métodos de ensayo no radiactivos (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactiva ACTI™ por citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). En forma alternativa o adicional, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como se describió en Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. Estados Unidos 95:652-656 (1998). Los ensayos de unión C1q también se pueden llevar a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por consiguiente carece de actividad de CDC. Ver, por ejemplo, ELISA de unión de C1q y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del commplemento, se puede realizar un ensayo CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar determinaciones de la unión de FcRn y la depuración/vida media in vivo usando métodos conocidos en la téenica (ver, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente U.S. N.° 6.737,056). Tales mutantes de Fe incluyen las mutantes de Fe con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, qie incluyen la llamada muíante de Fe “DANA” con la sustitución de los residuos 265 y 297 para alanina (Patente US N.° 7.332.581).
Se describen ciertas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a las FcR. (Ver, por ejemplo, Patente U.S. N.° 6.737,056; WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En ciertas formas de realización, una variante del anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración EU de residuos).
En algunas formas de realización, las alteraciones se realizan en la región Fe que produce unión a Ciq alterada (es decir, mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en la Patente US N.° 6.194.551, WO 99/51642, y Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178—4184 (2000).
Los anticuerpos con aumento de vida media y mejor unión al receptor neonatal receptor de Fe (FcRn), que es el responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en ella que aumentan la unión de la región Fe a FcRn. Tales variantes de Fe incluyen aquellas con sustituciones en uno o más residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, substitución del residuo 434 de la región Fe (Patente US N.° 7.371.826).
Ver también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente U.S. N.° 5.648.260; Patente U.S. N.° 5.624.821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de las variantes de la región Fe.
Variantes de anticuerpo con cistina manipulada genéticamente En ciertas formas de realización, se puede desear crear anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína, por ejemplo, “tioMAbs”, en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En formas de realización particulares, los residuos sustituidos aparecen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir estos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos en consecuencia se ubican en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo con otros residuos, tales como residuos de fármaco o residuos de fármaco-ligador, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en la presente. En ciertas formas de realización, alguno o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena liviana; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la cadena pesada de la región Fe. Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 7.521.541.
Derivados de anticuerpo En ciertas formas de realización, un anticuerpo provisto en la presente tambien se puede modificar para contener residuos no proteináceos adicionales que son conocidos en la téenica y fácilmente disponibles. Los residuos adecuados para la derivatización del anticuerpo, incluyen pero sin limitación polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli— 1 ,3— dioxolano, poli— 1 ,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n— vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas para la fabricación debida a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si más de un polímero se une, estos pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o el tipo de los polímeros usados para la derivación sobre la base de las consideraciones que incluyen pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo mejorado, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia en condiciones patológicas definidas, etc.
En otra forma de realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y residuo no proteináceo que se pueden calentar selectivamente por la exposición a la radiación. En una forma de realización, el residuo no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye pero sin limitación, longitudes de onda que no dañan las celulas comunes, pero que se calientan el residuo no proteináceo a una temperatura en la que se destruyen las células próximas al anticuerpo-residuo no proteináceo.
Métodos v composiciones recombinantes Los anticuerpos se pueden producir usando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la Patente U.S. N.° 4.816.567. En una forma de realización, se proporciona el ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de antihemaglutinina descripto en la presente. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas liviana y/o pesada del anticuerpo). En una forma de realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En una forma de realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende tal ácido nucleico. En tal forma de realización, una célula huésped comprende (por ejemplo, ha sido transformada con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una forma de realización, la celula huésped es eucariótica, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, células YO, NSO, Sp20). En una forma de realización, se proporciona un método de obtener un anticuerpo de antihemaglutinina, donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, provisto antes, en las condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped).
Para la producción recombinante de anticuerpo de antihemaglutinina, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describió anteriormente, se aísla e inserta en uno más vectores para la clonación adicional y/o para expresión en una célula huésped. Tal ácido nucleico se puede aislar fácilmente y secuenciar mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, por medio de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo).
Las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión de los vectores que codifican el anticuerpo incluyen células procarióticas o eucarióticas que se describen en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en las bacterias, en particular cuando no se necesitan la glicosilación y función efectora del Fe. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en las bacterias, ver, por ejemplo, patentes U.S. Nros. 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Ver tambien Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de los fragmentos de anticuerpo en E. coli .) Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariótico tales como los hongos filamentosos o levaduras son huésped de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos, que incluyen cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glicosilación han sido “humanizadas”, lo que origina la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o completamente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales que se pueden usar en conjunto con las células de insecto, en particular para la transfección de las células de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos celulares también se pueden utilizar como huéspedes. Ver, por ejemplo, Patentes U.S. Nros. 5.959.177, 6,040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describe la teenología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
Las celulas de vertebrados se pueden usar como huéspedes. Por ejemplo, las líneas celulares de mamífero que se adaptan a crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de las líneas de células huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 del riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7), línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 como se describió, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Viro!. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK,), células de sertoli de ratón (células TM4, como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A,), células de pulmón humano (W138 ), células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982), células MRC 5, células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) que incluyen las células DFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 77:4216 (1980)), y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, ver, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
Ensayos Los anticuerpos antihemaglutinina provistos en la presente se pueden identificar, analizar, o caracterizar por sus propiedades físicas/química y/o actividades biológicas por varios ensayos conocidos en la téenica.
Ensayos de unión v otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo de la invención se analiza para determinar su actividad de unión al antígeno por ejemplo, por métodos conocidos tales como ELISA, transferencia Western, etc.
En otro aspecto, los ensayos de competición se pueden usar para identificar un anticuerpo que compite por la unión de hemaglutinina con cualquier anticuerpo de antihemaglutinina descrito en la presente. En ciertas formas de realización, tal anticuerpo de competición se une al mismo epítope (por ejemplo, un epítope lineal o conformacional) que se une por medio de un anticuerpo de antihemaglutinina descrito en la presente (por ejemplo, un anticuerpo de antihemaglutinina que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 111 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 113; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 117; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 111 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 119; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 113; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 122; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 124; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 126; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 128; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 130; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 115 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 132; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 134 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 136; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 138 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 140; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 142 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 144; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 138 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 146; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 148 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 150; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 148 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 152; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 148 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 140; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 234 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 235; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 154 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 156; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 158 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 156; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 160 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 162; una secuencia de VH de SEQ ID NO: 164 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 166; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 168 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 170. Los ejemplos de metodos para mapeo de un epítope al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, en Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
En un ejemplo de ensayo de competición, la hemaglutinina inmovilizada se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a hemaglutinina y un segundo anticuerpo no marcado que se analizar en cuanto a su capacidad de competir con el primer anticuerpo por la unión a hemaglutinina. El segundo puede estar presente en un sobrenadante del hibridoma. Como control, la hemaglutinina inmovilizada se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Despues de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a hemaglutinina, se elimina el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marca asociada con hemaglutinina inmovilizada. Si la cantidad de marca asociada con la hemaglutinina inmovilizada está sustancialmente reducida en la muestra de ensayo con respecto a la muestra control, entonces esto indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a hemaglutinina. Ver Harlow y Lañe (1988) Anticuerpos: A Laboratory Manual ch. 14 (Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY).
Ensayos de actividad En un aspecto, los ensayos se proporcionan para identificar anticuerpos anticuerpos de antihemaglutinina y sus fragmentos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, unirse específicamente con la hemaglutinina del virus de la gripe A, neutralización los virus de la gripe A, etc. También se proporcionan anticuerpos y composiciones que comprenden anticuerpos o sus fragmentos que tienen tal actividad biológica in vivo y/o in vitro.
En determinadas formas de realización, un anticuerpo de la invención se ensaya respecto de tal actividad biológica. Ver los Ejemplos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 13 para descripciones de ejemplo de tales ensayos.
Inmunoconiuqados La invención tambien proporciona inmunoconjugados que comprenden en la presente un anticuerpo de antihemaglutinina conjugado a uno o más agentes citotóxicos tales como un agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibitorios del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, planta o animal o sus fragmentos), o isótopos radiactivos.
En una forma de realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, que incluyen, pero sin limitación un maytansinoide (ver Patentes U.S. Nros. 5.208,020, 5.416,064 y Patente Europea EP 0425 235 B1); una auristatina tal como restos DE y DF de monometilauristatina fármaco (MMAE y MMAF) (ver Patentes U.S. Nros. 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de esta (ver Patentes U.S. Nros. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773,001, y 5.877.296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antracielina tal como daunomicina o doxorrubicina (ver Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrcy et al., Bioorganic & Meó. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336—4343 (2002); y Patente U.S. N.° 6,630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otra forma de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente conjugado a una toxina enzimáticamente activa y fragmentos de estas que incluyen, pero sin limitación, cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteína Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricótesenos En otra forma de realización, un inmunoconjugado compren de un anticuerpo que se describe en la presente conjugado a un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de los radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, B¡212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu.. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para los estudios centellográficos, por ejemplo tc99m o 1123, o una marca de espín para imagen de resonancia magnetica nuclear (RMN) (también conocida como imagen de resonancia magnética, mri), tales como nuevamente yodo 123, yodo 131, indio 111, flúor 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan por medio una variedad de agentes de acoplamiento de la proteína bifuncional tales como propionato de N— succinimidil— 3— (2— piridilditiol) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imdoesteres (tal como adipimidato de dimetilo HCI), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).) Por ejemplo se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El ligador puede ser un “ligador escindible” que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un ligador lábil al ácido, ligador sensible a peptidasa, ligador fotolábil, ligador dimetilo o ligador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); Patente U.S. N.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o ADC de la presente contemplan expresamente, pero sin limitación a tales conjugados preparados con reactivos de entrecruzamiento que incluyen, pero sin limitación, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están disponibles en el comercio (por ejemplo, en Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos).
Metodos v composiciones para diagnóstico v detección En determinadas formas de realización, cualquiera de los anticuerpos de antihemaglutinina proporcionados en la presente es de utilidad para detectar la presencia de hemaglutinina o virus de la gripe A en una muestra biológica. El término “detectar” como se usa en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas formas de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tales como, por ejemplo, pulmón, tracto respiratorio superior, canal nasal, sangre, esputo o comprende una muestra biológica obtenida por hisopado nasal o de garganta.
En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina para usar en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método de detectar la presencia de hemaglutinina o virus de la gripe A en una muestra biológica. En ciertas formas de realización, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de antihemaglutinina que se describe en la presente en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo de antihemaglutinina a hemaglutinina, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo de antihemaglutinina y hemaglutinina. Tal método puede ser un método in vitro o in vivo. En una forma de realización, un anticuerpo de antihemaglutinina se usa para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo 13, por ejemplo, donde la hemaglutinina es un biomarcador para la selección de pacientes.
Los ejemplos de trastornos que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo de la invención incluyen infección por virus de la gripe A, incluyendo infección por virus de la gripe A en niños, bebes, adultos y personas mayores.
En ciertas formas de realización, se proporcionan anticuerpos marcados antiantihemaglutinina. Las marcas incluyen, pero sin limitación, marcas o residuos que se detectan directamente (tal como marcas fluorescente, cromofórica, electrodensidad, quimioluminiscente y radioactiva), así como residuos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan en forma indirecta, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los ejemplos de marcas incluyen pero sin limitación, los radioisótopos 32P, 14C, 125l, 3H, y 131l, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rhodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense N.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acoplada con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, marcas de espín, marcas de bacteriófago, radicales libres estables y similares.
Formulaciones farmaceuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo de antihemaglutinina que se describen en la presente se preparar por la mezcla de tal anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables ( Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico, alquil parabenos tales como metil- o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, y m-cresol), polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), polipéptidos, proteínas, tal como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol, contraiones formadores de sales tales como sodio; contraiones formadores de sal tales como sodio, complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteínas), y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™; y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los ejemplos de portadores farmaceuticamente aceptables en la presente también incluyen agentes de dispersión intersticial del fármaco tales como glicoproteínas de hialuronidasa activas neuras solubles (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HILENEX®, Baxter Internacional, Inc.). Ciertos ejemplos de sHASEGPs y métodos de uso, que incluyen rHuPH20, se describen en las publicaciones de solicitud de patente US Nros. 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con uno o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.
Los ejemplos de formulaciones de anticuerpo liofilizadas se describen en la Patente US N.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las que se describen en la Patente US N.° 6.171.586 y W02006/044908, estas últimas formulaciones incluyen un buffer de histidina-acetato.
La formulación de la presente también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable también proporcionar un inhibidor de neuraminidasa, un anticuerpo de antihemaglutinina, un anticuerpo anti-M2, etc. Tales ingredientes activos están presentes de modo adecuado en combinación con cantidades que son efectivas para el propósito deseado.
Los ingredientes activos también se pueden preparar encerrados en microcápsulas, por ejemplo por téenicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales téenicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Las preparaciones de liberación sostenida se pueden preparar. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en forma de artículos definidos, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se usan para la administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Métodos v composiciones terapéuticas Cualquiera de los anticuerpos de antihemaglutinina proporcionados en la presente se puede usar en métodos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina para usar como un medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina para usar en el tratamiento, la prevención o la inhibición de infección por virus de la gripe A. En determinadas formas de realización, se proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina para usar en un método de tratamiento. En determinadas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina para usar en un método de tratamiento de un individuo que tiene infección por virus de la gripe A que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva del anticuerpo de antihemaglutinina. En tal forma de realización, el metodo también comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más abajo. En otras formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina para usar en la prevención, inhibición o reducción de fusión mediada por hemaglutinina entre la membrana viral del virus de la gripe A y las membranas endosomales celulares infectadas, previniendo así la entrada del ARN viral en el citoplasma celular infectado y evitando la posterior propagación de la invención. En determinadas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo de antihemaglutinina para usar en un método de prevención, inhibición o tratamiento de infección por virus de la gripe A en un individuo que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva del anticuerpo de antihemaglutinina para la prevención, inhibición o tratamiento de infección por virus de la gripe A. Un “individuo” de acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores es preferentemente un ser humano.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo de antihemaglutinina en la fabricación o la preparación de un medicamento. En una forma de realización, el medicamento es para el tratamiento de infección por virus de la gripe A. En otra forma de realización, el medicamento es para usar en un método de tratamiento de infección por virus de la gripe A que comprende la administración a un individuo que tiene infección por virus de la gripe A de una cantidad efectiva del medicamento. En tal forma de realización, el método también comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más abajo. En otra forma de realización, el medicamento es para prevenir, inhibir o reducir fusión mediada por hemaglutinina entre membrana viral del virus de la gripe A y las membranas endosomales celulares infectadas, previniendo así la entrada del ARN viral en el citoplasma celular infectado y previniendo luego la propagación de la infección. En otra forma de realización, el medicamento es para usar en un método de prevención, inhibición o tratamiento de infección por virus de la gripe A en un individuo que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva del medicamento para prevenir, inhibir o reducir la infección por virus de la gripe A. Un “individuo” de acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores puede ser un ser humano.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de infección por virus de la gripe A. En una forma de realización, el método comprende la administración a un individuo que tiene tal infección por virus de la gripe A de una cantidad efectiva de un anticuerpo de antihemaglutinina. En tal forma de realización, el método también comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, tal como se describe en la presente. Un “individuo” de acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores puede ser un ser humano.
La presente invención proporciona anticuerpos de antihemaglutinina efectivos para inhibir, prevenir o tratar la infección por virus de la gripe A en un individuo (por ejemplo, un sujeto o un paciente). En algunos aspectos, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención es efectivo en el tratamiento profiláctico de un individuo a fin de prevenir una infección por virus de la gripe A del individuo.
En algunos aspectos, un individuo apropiado para el tratamiento con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención es un individuo que tiene o está sospechado de tener infección por virus de la gripe A. En algunas formas de realización, estos individuos incluyen bebes, niños, adultos y personas mayores. En algunas formas de realización, el individuo se hospitaliza con infección por virus de la gripe A. En otras formas de realización, el individuo con infección por virus de la gripe A tiene una o varias comorbilidades tales como, por ejemplo, inmunodeficiencia, embarazo, enfermedad pulmonar, enfermedad cardíaca, enfermedad renal o coinfección (por ejemplo, una infección bacteriana o una infección viral tales como neumonía bacteriana o viral).
En algunos aspectos, el tratamiento de un individuo con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención reduce la gravedad por infección por virus de la gripe A, reduce la duración de la infección por virus de la gripe A o reduce la infectividad por virus de la gripe A. En otros aspectos, el tratamiento de infección por virus de la gripe A con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención proporciona un beneficio adicional, incluyendo una reducción de la duración de la estadía en un hospital, reducción o prevención de la necesidad de uso de la unidad de cuidados intensivos (ICU), reducción o prevención de la necesidad de ventilación asistida o mecánica, reducción o prevención de la necesidad de uso de oxígeno suplementario y reducción de la mortalidad. En algunos aspectos, la reducción en la duración de la estadía en el hospital es de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o más de 5 días. En algunos aspectos, la reducción en la necesidad del uso de la unidad de cuidados intensivos es 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o más de 5 días. En algunos aspectos, la reducción que necesita de ventilación asistida o mecánica es de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o más de 5 días. En algunos aspectos, la reducción en la necesidad de oxígeno suplementario es de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o más de 5 días. En algunos aspectos, el tratamiento de un individuo con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención reduce los síntomas de la enfermedad por infección por virus de la gripe A tales como, por ejemplo, fiebre, catarro, escalofríos, dolor de garganta, dolor muscular, dolores del cuerpo, cefalea, tos, congestión nasal, debilidad o fatiga, ojos irritados o acuosos y disconfort general.
En algunos aspectos, el tratamiento de un individuo con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención reduce el tiempo hasta la normalización de la función respiratoria, tal como la reducción del tiempo hasta la normalización de la tasa respiratoria o una reducción de tiempo hasta la normalización de la saturación de oxígeno. En algunos aspectos, el tratamiento de un individuo con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención reduce el tiempo hasta retornar a la saturación normal de oxígeno, por ejemplo, a una saturación de oxígeno de aproximadamente el 92% o más, tal como se mide durante un período de 24 horas sin administración suplementaria de oxígeno. En otros aspectos, el tratamiento de un individuo con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención reduce el tiempo hasta la normalización de los signos vitales, tales como la frecuencia cardíaca, la presión sanguínea, la tasa respiratoria y la temperatura.
En algunos aspectos, el tratamiento de un individuo con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención mejora los puntos terminales virológicos tales como, por ejemplo, título del virus de la gripe. El título viral se puede medir por medio de diversas vías conocidas por el experto en el arte, tales como, por ejemplo, superficie viral debajo de la curva (AUC), tal como se mide, por ejemplo, por PCR o dosis infecciosa de cultivo celular (TCID50). En algunos aspectos, el tratamiento da como resultado más o igual al 50% de reducción en AUC viral tal como se mide por qPCR o TCID50.
En diversos aspectos de la presente invención, un anticuerpo de antihemaglutinina proporcionado en la presente es efectivo en el tratamiento de infección por virus de la gripe A cuando se administra a aproximadamente 12 horas, a aproximadamente 24 horas, a aproximadamente 36 horas, a aproximadamente 48 horas, a aproximadamente 60 horas, a aproximadamente 72 horas, a aproximadamente 84 horas y a aproximadamente 96 horas despues del inicio de los síntomas (por ejemplo, inicio de la enfermedad). En otros aspectos, un anticuerpo de antihemaglutinina proporcionado en la presente es efectivo en el tratamiento infección por virus de la gripe A cuando se administra entre aproximadamente 24 horas y 48 horas después del inicio de los síntomas (por ejemplo, el individuo fue sintomático entre 24 y 48 horas), cuando se administra entre aproximadamente 48 horas y 72 horas después del inicio de los síntomas o cuando se administra entre aproximadamente 72 horas y 96 horas después del inicio de los síntomas. En determinadas formas de realización de la presente invención, un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención es efectivo en el tratamiento o reducción de la infección por virus de la gripe A y extiende la ventana de tratamiento del estándar corriente de cuidado (por ejemplo, oseltamivir) más allá de las 48 horas después del inicio de los síntomas.
En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos de antihemaglutinina proporcionados en la presente, por ejemplo, para usar en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una forma de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos de antihemaglutinina proporcionados en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra forma de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos de antihemaglutinina proporcionados en la presente y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más abajo.
Los anticuerpos de la invención se pueden usar ya sea solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. En determinadas formas de realización, un agente terapéutico adicional es un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir, fosfato de oseltamivir, amantadina, rimantadina), un anticuerpo anti-M2, un anticuerpo de antihemaglutinina, etc. En algunos aspectos, el tratamiento de un individuo que tiene infección por virus de la gripe A con un anticuerpo de antihemaglutinina de la presente invención coadministrado con un inhibidor de neuraminidasa proporciona un efecto terapeutico sinérgico comparado con el tratamiento con agente solo.
Estas terapias combinadas observadas con anterioridad comprenden la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en las mismas formulaciones o en formulaciones separadas) y la administración separada, en cuyo caso se puede producir la administración del anticuerpo de la invención antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En una forma de realización, la administración del anticuerpo de antihemaglutinina y la administración de un agente terapéutico adicional se producen dentro de un mes o dentro de aproximadamente una, dos o tres semanas, dentro de aproximadamente una, dos, tres, cuatro, cinco o seis días o dentro de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, doce, dieciséis, veinte o veinticuatro horas entre sí.
Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se pueden administrar por cualquiera de los medios adecuados, que incluyen administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, que dependen en parte de si la administración es breve o crónica. En la presente se contemplan varios esquemas de dosis, que incluyen, pero sin limitación administraciones únicas o múltiples durante varios puntos de tiempo, administración en bolo, e infusión por pulso.
Los anticuerpos de la invención pueden formular, dosificar y administrar de un modo compatible con la buena práctica medica. Los factores para considerar en este contexto incluye el trastorno particular tratado, el mamífero particular tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el esquema de administración, y otros factores conocidos para los profesionales médicos. El anticuerpo no necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores descriptos anteriormente. En general estos se usan en las mismas dosis y con las vías de administración usadas en la presente con anterioridad o aproximadamente de 1 a 99% de la dosis empleada antes en la presente, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determina en forma empírica/clínica como apropiada.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad tratada, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, antecedentes clínicos del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico asistente. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. De acuerdo con el tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 mg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) del anticuerpo puede ser una dosis inicial candidata para la administración al paciente, sea, por ejemplo por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, en general el tratamiento se debe sostener hasta se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Las dosis de ejemplo del anticuerpo estarán en el rango de aproximadamente 1 ,0 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. Así, una o varias dosis de aproximadamente 1 ,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 30 mg/kg o 45 mg/kg (o cualquiera de sus combinaciones) se puede administrar al paciente. Estas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, todos los días, cada dos días, cada tres días, etc. Se puede administrar una mayor dosis de carga inicial, seguida de una o varias dosis. La dosificación puede hacerse en una dosis fija como, por ejemplo, 200 mg, 400 mg, 600 mg, 800 mg, 1000 mg, 1200 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1800 mg, 2000 mg, 2200 mg, 2400 mg, 2500 mg, 2600 mg, 2800 mg, 3000 mg, 3200 mg, 3400 mg, 3600 mg, etc. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por téenicas y ensayos convencionales.
Se considera que cualquiera de las anteriores formulaciones o metodos terapéuticos se pueden llevar a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo de antihemaglutinina.
Artículos de manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descriptos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo frascos, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden estar construidos de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente porta una composición que por sí misma o combinada con otras composiciones efectivas para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja inyectable hipodérmica). Por lo menos un agente activo de la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección, tal como asma. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en la misma, donde la composición comprende un anticuerpo de la invención, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en este, en donde la composición comprende además un agente terapéutico citotóxico o de otro modo adicional. El artículo de manufactura de esta forma de realización de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indica que las composiciones de anticuerpos se pueden usar para tratar una afección particular. En forma alternativa o adicional, el artículo de manufactura tambien puede comprender un segundo recipiente (o tercero) que comprende un buffer farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluye otros buffer, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de manufactura anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de anticuerpo anti-blanco o un anticuerpo de antihemaglutinina.
III. EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención.
Se entiende que otras diversas formas de realización se pueden poner en práctica, dada la descripción general proporcionada con anterioridad.
Ejemplo 1. Identificación de anticuerpos de antihemaglutinina por visualización de fagos Construcción de bibliotecas de fagos de donantes humanos vacunados con virus de la gripe Los anticuerpos dirigidos contra hemaglutinina de virus de la gripe A se identificaron usando una biblioteca de visualización de fagos construida de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de donantes humanos vacunados con la vacuna de gripe estacional de la siguiente manera.
Leucopacs de donantes humanos normales que recibieron la vacuna Fluvirin® de gripe estacional (Novartis Lote N.° 111796P1) 7 días antes de su donación de sangre se obtuvieron de Blood Centers of the Pacific (San Francisco, CA). PBMCs se aislaron de los leucopacs usando metodologías estándar. Los PBMCs se clasificaron por celulas de plasmablasto CD19+/CD2(T por FACS. El ARN de plasmablastos clasificados CD19+/CD20 se extrajo usando el RNeasy purification kit (Qiagen, Estados Unidos) y se generó cADN del ARN aislado por transcripción inversa usando SuperScript® III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Estados Unidos). Los genes pesados variables humanos (VH), kappa variables (VK) y livianos variables (VL) se amplificaron por PCR de cADN usando las mezclas de cebadores de ADN directos e inversos siguientes.
VFI inverso BssHIl.HuVHI: ATCGTTT CAT AAGCGCGCCAGGT GCAGCT GGT GCAGT C (SEQ ID NO: 1) BssHII.HuVH2: ATCGTTT CAT AAGCGCGCCAG RT CACCTT GAAGGAGT C (SEQ ID NO: 2) BssHII.HuVH3.1: ATCGTTTCATAAGCGCGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 3) BssHII.HuVH3.2: ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 4) BssHII.HuVH3.3: ATCGTTT CATAAGCGCGCGAAGT GCAGCT GGTGGAGT C (SEQ ID NO: 5) BssH 11. Hu VH4.1 : ATCGTTT CATAAGCGCGCCAGGTGCAGCT GCAGGAGT C (SEQ ID NO: 6) BssHII.HuVH4.2: ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTC (SEQ ID NO: 7) BssHII.HuVH5: AT CGTTTCAT AAGCGCGCGARGT GCAGCT GGTGCAGT C (SEQ ID NO: 8) BssHII.HuVH6: ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTACAGCTGCAGCAGTC (SEQ ID NO: 9) BssHII.HuVH7: ATCGTTT CAT AAGCGCGCCAGGT GCAGCT GGTGCAAT C (SEQ ID NO: 10) BssHIl.HuVHI. A: ATCGTTTCATAAGCGCGCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTC (SEQ ID NO: 11) BssHIl.HuVHlB: AT CGTTT CAT AAGCGCGCCAGGTT C AGCTGGT GCAGT C (SEQ ID NO: 12) BssHIl.HuVHI.C: AT CGTTT CAT AAGCGCGCCAGGTCCAGCT GGT ACAGT C (SEQ ID NO: 13) BssHIl.HuVHI.D: ATCGTTT CAT AAGCGCGCCAGAT GCAGCT GGTGCAGT C (SEQ ID NO: 14) BssHIl.HuVHI.E: ATCGTTTCATAAGCGCGCCAAATCCAGCTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 15) BssHIl.HuVHI.F: ATCGTTT CAT AAGCGCGCGAGGTCCAGCT GGT GCAGT C (SEQ ID NO: 16) BssHII.HuVH3.A: ATCGTTT CATAAGCGCGCGAGGTGCAGCT GTT GGAGT C (SEQ ID NO: 17) BssHII.HuVH3.B: ATCGTTT CAT AAGCGCGCGAGGTGCAGCTGGT GGAGAC (SEQ ID NO: 18) BssHII.HuVH4.A: AT CGTTT CATAAGCGCGCCAGGTGCAGCT ACAGCAGT G (SEQ ID NO: 19) VH directo Nhel JH 2: GACATT CT ACGAGCT AGCT G AGGAGACAGT GACCAGGGT (SEQ ID NO: 20) Nhel.JH1/4/5: GAC ATT CTACGAGCT AGCT GAGGAGACGGT GACCAGGGT (SEQ ID NO: 21) Nhel.JH3: G AC ATT CT ACG AGCT AGCT G AAG AG ACGGT G ACC ATT GT C (SEQ ID NO: 22) Nhel.JH6: GACATT CTACGAGCT AGCT GAGGAGACGGT GACCGTGG (SEQ ID NO: 23) VK inverso Nhel.OL.HuVK 1: TCTCCT CAGCT AGCGGT GGCGGCGGTTCCGGAGGT GGT GGTT CTGGCGGTGGTGGCAGC GACATCCAGWT GACCCAGT C (SEQ ID NO: 24) Nhel.OL.HuVK2: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGC GATGTTGTGATGACTCAGTC (SEQ ID NO: 25) Nhel.OL.HuVK3: TCTCCT CAGCT AGCGGTGGCGGCGGTT CCGGAGGT GGT GGTT CTGGCGGT GGT GGCAGC G AAATT GT GWT GAC RC AGT C (SEQ ID NO: 26) Nhel.OL.HuVK4: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGC G AT ATT GT G AT GACCC AC AC (SEQ ID NO: 27) Nhel.OL.HuVK5: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGC GAAACGACACTCACGCAGTC (SEQ ID NO: 28) Nhel.OL.HuVK6: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGC G AAATT GTGCT G ACT C AGT C (SEQ ID NO: 29) VK directo NCOI.JK1-: AGTTCATGCCATGGTTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTT (SEQ ID NO: 30) Ncol.JK2-: AGTTCAT GCCATGGTTTT GATCTCCACCTT GGTCCC (SEQ ID NO: 31) NCOI.JK3-: AGTT CATGCCATGGTTTT GATATCCACTTT GGTCCCAG (SEQ ID NO: 32) NCOI.JK4-: AGTT CAT GCCAT GGTTTT GAT CTCCAGCTT GGTCCCT (SEQ ID NO: 33) NCOI.JK5-: AGTTCATGCCATGGTTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTT (SEQ ID NO: 34) VL inverso Nhel.OLHuVL1.1: T CTCCTCAGCT AGCGGTGGCGGCGGTT CCGGAGGT GGT GGTT CTGGCGGT GGTGGCAGCCA GTCTGTG CTGACTCAGCC (SEQ ID NO: 35) Nhel.OL.HuVL1.2: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCA GTCTGTG YTGACGCAGCC (SEQ ID NO: 36) Nhel.OL.HuVL1.3: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCA GTCTGTC GTGACGCAGCC (SEQ ID NO: 37) Nhel.OL.HuVL2: T CTCCTCAGCT AGCGGT GGCGGCGGTTCCGGAGGT GGT GGTT CT GGCGGT GGTGGCAGCCA RTCTGCC CTGACTCAGCC (SEQ ID NO: 38) Nhel.OL.HuVL3.1: T CT CCTCAGCT AGCGGT GGCGGCGGTTCCGGAGGT GGT GGTT CTGGCGGTGGT GGCAGCT C CTATGWG CTGACTCAGCC (SEQ ID NO: 39) Nhel.OL.HuVL3.2: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCTC TTCTGAG CTGACTCAGGA (SEQ ID NO: 40) Nhel.OL.HuVL4: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCA CGTTATA CTGACTCAACC (SEQ ID NO: 41) Nhel.OL.HuVL5: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCA GGCTGTG CTGACTCAGCC(SEQ IDNO:42) Nhel.OL.HuVL6: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCAA TTTTATG CTGACTCAGCC (SEQ ID NO: 43) Nhel.OL.HuVL7/8: TCTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCCA GRCTGTG GTGACYCAGGA(SEQ IDNO:44) Nhel.OL.HuVL9: T CTCCTCAGCTAGCGGTGGCGGCGGTTCCGGAGGT GGT GGTT CTGGCGGT GGTGGCAGCCW GCCTGTG CTGACTCAGCC (SEQ ID NO: 45) VL directo Ncol.JLI-: AGTT CATGCCAT GGTT AGGACGGT GACCTTGGTCC (SEQ ID NO: 46) NCOI.JL2/3-: AGTT C AT GCC ATGGTT AGGACGGT C AGCTT GGTCC (SEQ ID NO: 47) NCOI.JL7-: AGTTC ATGCCATGGT GAGGACGGTCAGCT GGGT G (SEQ ID NO: 48) Los productos de cADN amplificados resultantes se reunieron en scFv usando PCR de superposición con los siguientes cebadores de superposición.
BssHII.VH.OL+: ATCGTTTCATAAGCGCGCSA (SEQ ID NO: 49) Notl.JK.OL-: AGTTCATGCCATGGTTTTGAT (SEQ ID NO: 50) Notl.JL.OL-: AGTT C AT GCC AT GGTKAGG AC (SEQ ID NO: 51) Los fragmentos de cADN scFv purificados (1 pg) y vector de fagemido p2056BNN (2 pg) se digirieron con endonucleasa de restricción BssHIl y Ncol (New England Biolabs, Estados Unidos). El vector de fagémido p2056BNN es una versión modificada de pS2025e (Sidhu et al., (2004) J Mol Biol 338:299-310), manipulada para contener los sitios de restricción BssHIl, Nhel y Ncol. Los fragmentos de cADN scFv luego se ligaron en el vector p2056BNN (relación 6:1 M) usando la enzima de ADN ligada T4 (New England Biolabs). Los productos de ligación de cADN/fago se purificaron usando un kit de purificación por PCR (Qiagen, Estados Unidos) y se transformaron en células electrocompetentes SS320 de E. coli. El tamaño de la biblioteca de fagos se estimó plaqueando 10 pl de cultivo de biblioteca 1:10 en placas de LB/Carbenicilina. El cultivo de biblioteca luego se amplificó y se propagó en un volumen total de 60 mi de medio 2YT y la expresión de fago-scFv se indujo por coinfección con fago asistente M13K07. Luego se añadió canamicina al cultivo de biblioteca y se incubó con agitación durante 30 horas a 30 °C. El cultivo de biblioteca luego se centrifugó para pelletizar las células. El sobrenadante que contenía el fago scFv se precipitó con 5* PEG/ NaCI 2,5 M y se resuspendió en PBS.
Clasificación de bibliotecas de fagos v selección para identificar anticuerpos antihemaqlutinina Se utilizaron proteínas H1 y H3 de hemaglutínina de virus de gripe A (producidas como se describe más adelante en el Ejemplo 2) como antígenos para la clasificación de bibliotecas de fagos. Unos antígenos H1 y H3 de hemaglutínina fueron aplicados como recubrimiento sobre una placa maxisorp de 96 cavidades de elevada ligación. Las placas y las bibliotecas de fagos fueron prebloqueadas con tampón de bloqueo de fagos (solución salina tamponada con fosfato (PBS, phosphate-buffered saline), albúmina de suero bovino (BSA, bovine serum albumin) al 1% peso/volumen, y Tween-20 (PBS-T) al 0,05 % (volumen/volumen) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La biblioteca de fagos bloqueada (100 pl) fue añadida a las cavidades recubiertas con hemaglutinina y sometida a incubación durante 3 horas. Los fagos no ligados fueron lavados de las placas mediante P BS-Tween al 0,05%, y los fagos ligados fueron eluidos con 100 pL 50 mM de HCI y 500 mM de NaCI durante 30 minutos seguido por neutralización con 100 mL de 1 M de base Tris (pH 7.5). Los fagos recuperados fueron ampliados en celulas E. coli XL-1 Blue. Los fagos resultantes fueron precipitados y sometidos a otra ronda de panning/selección contra las proteínas de hemaglutinina. Durante las rondas subsiguientes de paneo/selección, los fagos de anticuerpos fueron incubados con iguales o distintos antígenos de hemaglutinina. La severidad del lavado de las placas fue incrementada gradualmente desde lavar 15x a lavar 40x.
Después de 2 - 3 rondas de paneo y selección, se observó un enriquecimiento significativo de fago específico para hemaglutinina. 96 clones de fago fueron tomados de la clasificación de biblioteca para determinar si se ligaban específicamente a hemaglutinina H1 y/o H3. Las regiones variables de los clones de fagos que presentaban una ligación específica a las proteínas de hemaglutinina fueron secuenciadas para identificar clones de fagos que contenían secuencias de ácidos nucleicos de inmunoglobulina únicas en su especie. Los anticuerpos de fago únicos en su especie que ligaban hemaglutinina H1 y/o H2 con por lo menos 5x por arriba del segundo plano fueron objeto de mayor caracterización. Los clones derivados de fagos de interés fueron reformateados en IgGs mediante la clonación de las regiones VL y VH de clones individuales en los vectores de expresión LPG3 y LPG4, respectivamente, transitoriamente expresados en células 293 de mamíferos, y se purificó mediante una columna de proteína A. Se identificaron dos anticuerpos (mAb9 y mAb23) para análisis ulterior (Véase el Ejemplo 5 en lo que sigue.) Ejemplo 2. Enriquecimiento y expansión de plasmablasto Para descubrir e identificar anticuerpos raros contra la hemaglutinina del virus de la gripe A, se desarrolló la siguiente téenica de enriquecimiento y expansión de plasmablasto (ver solicitud de patente copendiente solicitud de patente de EE.UU. número de serie 61/725.764, incorporada en el presente en su totalidad a título de referencia).
Se obtuvieron leucopacs de donantes humanos normales que recibieron la vacuna Fluvirin® (Novartis Lot #111796P1 ) contra la gripe a los 7 días de haber donado sangre, de Centros Sanguíneos del Pacifico (San Francisco, CA). Unas células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, Peripheral blood mononuclear cells) fueron aisladas a partir de los leukopacs mediante metodologías estándar. Se compraron ratones SCID/beige hembras de seis a ocho semanas de edad a Charles River Laboratories (Hollister, CA) y se las alojó y mantuvo en Genentech de acuerdo con las directivas del American Association of Laboratory Animal Care. Todos los estudios experimentales fueron llevados a cabo bajo la aprobación de los comités de Animal Care and Use de Genentech Lab Animal Research en una instalación, aprobado por el AAALAC, que cumplía con las lcyes y regulaciones aplicables del caso. Se obtuvo leucopac o sangre de donantes humanos sanos después de haberse obtenido su consentimiento escrito y de haber recibido una aprobación ética emitida por el Western Institutional Review Board.
Se llevó a cabo el enriquecimiento y expansión de plasmablastos impulsado por antígeno \n vivo para lo cual se utilizó un trasplante intrasplénico de PBMCs como sigue. Unos PBMCs aislados fueron suspendidos con antígenos de hemaglutinina (0,1-2 mg por cada 1 millón de células B) y se sometió a incubación durante 30 minutos a 37°C (premezcla de PBMC/antígeno). Después de esta incubación, los PBMCs fueron lavados a efectos de remover los antígenos no ligados. Para lograr un enriquecimiento en plasmablastos que producían anticuerpos de hemaglutinina de reacción cruzada, las variantes de antígeno de hemaglutinina utilizadas para la premezcla de PBMC/antígeno y para la clasificación de células individuales fueron específicamente elegidas para diferir de las variantes de antígeno de hemaglutinina contenidas dentro de la vacuna Fluvirin® contra la gripe. Por lo tanto, los antígenos de hemaglutinina utilizadas en este estudio incluyeron hemaglutinina H1 procedente del aislado A/NWS/1933 del virus de gripe A (una hemaglutinina del virus de gripe A del grupo 1), hemaglutinina H3 del aislado de la gripe A/Hong Kong/8/1968 (una hemaglutinina del virus de gripe A del grupo 2), y hemaglutinina H7 del aislado de virus de gripe A /219/2003 (una hemaglutinina del virus de gripe A del grupo 2). Los antígenos de hemaglutinina fueron producidos en Genentech mediante téenicas de biología molecular estándar.
Unos ratones SCID/beige hembra de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, Hollister, CA) fueron irradiados de manera subletal con 350 rads para lo cual se utilizó una fuente de Cesio-137. Se añadieron polimixina B (110 mg/L) y neomicina (1,1 g/L) al agua de beber durante siete días después de la irradiación. Cuatro horas después de la irradiación, el flanco derecho de cada ratón fue afeitado y acondicionado con Betadine® (Purdue Pharma, Stamford, CT) y alcohol al 70%. Se llevaron a cabo procedimientos quirúrgicos bajo anestesia y utilizándose procedimientos quirúrgicos asépticos. Se efectuó una incisión en la piel de 1 cm en el borde costal de cada ratón, seguido por una incisión en la pared abdominal y en el peritoneo. Se expuso con cuidado el bazo de cada ratón y se inyectó 50*106 de PBMCs humano resuspendido en 30 pL de PBS. Las incisiones fueron cerradas en la capa muscular y en la piel para lo cual se utilizaron suturas 5-0 Vicryl® (Ethicon, Somerville, NJ) y broches quirúrgicos, respectivamente. Para los experimentos de clasificación de células específicas para antígenos, los ratones fueron sacrificados a los ocho días después del trasplante, y se cosecharon sus bazos.
Unas suspensiones celulares de células de bazos obtenidos de los ratones fueron teñidos con un cóctel de anticuerpos monoclonales anti-humanos CD38 PECy7 (BD Biosciences, San José, CA) e IgG Dylight (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) que definen plasmablastos lgG+ humanos como expresión de CD38high/lgG+. Para identificar los plasmablastos de reacción cruzada de hemaglutinina dentro de la suspensión de celulas de bazo aisladas, en las células fueron teñidas con hemaglutinina H1 obtenida del aislado de virus de gripe A /NWS/1933 y hemaglutinina H3 obtenida del aislado del virus de gripe A /Hong Kong/8/1968, que fueron previamente conjugados con FITC o PE, respectivamente, para lo cual se utilizaron kits de etiquetado Lightning-Link® (Innova Biosciences, Cambridge, UK).
La Figura 1A muestra el análisis de datos FACS representativos de plasmablastos antihemaglutinina-positivos tomados en el día 7 de PBMCs post vacunación antes del enriquecimiento con SCID/ratón beige (es decir, antes de la premezcla PBMC/antígeno). La Figura 1B nuestra el análisis de datos FACS de plasmablastos hemaglutinina-positivos tomados el día 8 después de trasplante con enriquecimiento con SCID/ratones, en comparación con ausencia de premezcla y de premezcla de antígeno en los paños superior e inferior, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, la premezcla de PBMC/antígeno antes de la inyección intrasplénica dio como resultado una mayor frecuencia de plasmablastos antihemaglutinina H3+/H1+.
En la siguiente Tabla 2 se muestra una comparación de frecuencias de plasmablastos anti-H1+/anti-H3+ antes y después del enriquecimiento con SCID descrito en el presente. Como se muestra en la Tabla 2, la frecuencia de los plasmablastos anti-H1+/anti-H3+ se incrementó considerablemente gracias a la utilización de los métodos de enriquecimiento con SCID/ratón beige de la presente invención en comparación con la observada sin enriquecimiento con SCID/ratón beige.
Tabla 2 Seguidamente se analizaron muestras en la presencia de yoduro de propidio con exclusión de células muertas en un aparato clasificador de células de elevada área conocida (BD Biosciences, San José, CA) y los plasmablastos específicos para antihemaglutinina fueron clasificados a modo de células simples en placas de cultivo para tejidos de 96 cavidades que contenían 50 ml de RPMI medio de cultivo de células complementado con suero bovino fetal 5% Low IgG (Gibco, Grand Island, NY). Se registraron 5 millones de células vivas para la totalidad de los perfiles de análisis, y los perfiles fueron analizados mediante software Flowjo versión 9.4.11.
La Figura 2 muestra el análisis de esplenocitos obtenidos a los ocho días del trasplante de ratones individuales SCID/beige que muestran una respuesta estocástica, comparándose ausencia de premezcla (círculos) y premezcla con antígeno (cuadrados). Los datos se presentan plasmablastos anti-H1+/CD38high en forma porcentual. El rectángulo indica ratones que presentaron plasmablastos anti-H1+.
Estos resultados muestran que se detectaban amplios plasmablastos de reacción cruzada con hemaglutinina sin antígenos de hemaglutinina de virus de gripe A de grupo 1 (por ejemplo, la hemaglutinina H1) y de grupo 2 (por ejemplo, hemaglutinina H3, hemaglutinina H7) eran incubados con PBMCs antes del trasplante intrasplenico. Estos resultados indican además que la estimulación in vitro de PBMCs de hemaglutinina cebado con antígeno procedente de donantes vacunados contra la gripe promovía el enriquecimiento específico para antígeno de hemaglutinina de plasmablastos dentro de los receptores SCID/ratón beige. Ejemplo 3. Clonación de IgG a partir de plasmablastos simples Unos plasmablastos humanos de reacción cruzada de hemaglutinina H1 y H3 (arriba descritos) fueron clasificados en células simples, resultando aproximadamente 950 plasmablastos. Los plasmablastos individuales fueron clasificados directamente en placas de 96 microcavidades de fondo en “U” que contenían 50 ml de RPMI y que a su vez contenían suero bovino fetal de bajo IgG al 5%. Las placas fueron centrifugadas durante cinco minutos a 600 x g (Beckman Coulter, Brea, CA) y el medio fue retirado con cuidado por aspiración. Las células fueron suspendidas y lavadas dos veces en 90 pl de PBS mediante el mismo procedimiento.
Para generar ADNc que codifique las cadenas pesadas variables y las cadenas livianas, cada célula fuera suspendida en 6 pl de mezcla reactiva de Reverse Transcriptase (RT) que contenía dos unidades de RNaseout (Invitrogen, Grand Island, NY), 0,5 mM de 4dNTP (Perkin Elmer, Waltham, MA), 1,5 mM de MgCI2, 37,5 mM de KCI, 10 mM de DTT (ditiotreitol), 0,25% de Nonidet P40 (US Biological, Marblehead, MA), 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich), 25 mM Tris pH 8,3, 0,25 pmol de oligonucleótidos específicos de región constante kappa IgGi^, constante de cadena kappa, (mostrados en lo que sigue) y 40 U Superscript III (Invitrogen, Grand Island, NY).
IgGi^ constante: GAAGTAGT CCTT GACCAGGCAG (SEQ ID NO: 52) Kappa constante: CT CAGCGT CAGGGT GYT GCT GAG (SEQ ID NO: 53) Lambda constante: GGGTKTGGTSGTCTCCAC (SEQ ID NO: 54) La reacción fue sometida a incubación durante intervalos de 3 x 30 minutos a 45 C, 50 °C y 55 °C cada uno. Despues de la incubación, la mezcla reactiva fue diluida a 15 ml con el tampón TE (10 mm Tris HCI, 1 mM EDTA). Se llevaron a cabo reacciones iniciales de cadena de polimerasa (PCR) para amplificar las cadenas pesadas de IgG, cadenas kappa y cadenas lambda para lo cual se utilizaron 2 pl del cóctel diluido de RFT anteriormente mencionado y la mezcla Advantage-GC 2 Polymerasa (Clontech, Mountain View, CA), para lo cual se siguieron los protocolos provistos por los fabricantes. Las amplificaciones de PCR fueron llevadas a cabo mediante oligonucleótidos degenerados basados en línea germinal de cadena pesada y cadena liviana y secuencias de región constante mostradas en lo que sigue.
IGVHIa CAGGT GCAGCTGGT GCAGT CT GGGGC (SEQ ID NO: 55) IGVHIb CAGGT CCAGCTGGT GCAGT CT GGGGC (SEQ ID NO: 56) IGVH2 CAGGT C ACCTT G AAGG AGT CT GGT CC (SEQ ID NO: 57) IGVH3 G AGGTGCAGCTGGT GGAGT CT GGGGG (SEQ ID NO: 58) IGVH4 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC (SEQ ID NO: 59) IGVH5 GAGGTGCAGCTGGTGCAGT CT GG (SEQ ID NO: 60) IGVH6 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCC (SEQ ID NO: 61) IGVH7 CAGGT GCAGCTGGTGCAAT CTGG (SEQ ID NO: 62) IGKV1 GHCATCCRGWTGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 63) IGKV2 GATRTT GT GAT GAC YCAGWCT C (SEQ ID NO: 64) IGKV3 G AAATWGTRWT GAC RCAGT CTC (SEQ ID NO: 65) IGKV4 GACAT CGT GAT GACCCAGTCT CC (SEQ ID NO: 66) IGKV5 G AAACG AC ACT CACGC AGT CT C (SEQ ID NO: 67) IGKV6 G AWRTT GTGMT G ACWCAGT CT C (SEQ ID NO: 68) IGLV1 CAGTCT GT GYT GACKCAGCCRCCCT C (SEQ ID NO: 69) IGLV2 CAGTCT GCCCT GACT CAGCCT (SEQ ID NO: 70) IGLV3 TCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC (SEQ ID NO: 71) IGLV4 CAGCCTGTGCTGACT CART CVCCCTC (SEQ ID NO: 72) IGLV5 CAGCCT GTGCT GACT C AGCC AACTT C (SEQ ID NO: 73) IGLV6 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC (SEQ ID NO: 74) IGLV7 CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC (SEQ ID NO: 75) IGLV8 CAGACT GTGGTGACCCAGGAGCC (SEQ ID NO: 76) IGLV9 CAGCCT GTGCT GACT C AGCC ACC (SEQ ID NO: 77) HC301 5constante GCAGCCCAGGGCSGCTGTGC (SEQ ID NO: 78) Kappal 02constante GCACACAACAGAGGCAGTTCCAG (SEQ ID NO: 79) Lambda202constante CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG (SEQ ID NO: 80) Las reacciones de amplificación de PCR de cadena liviana y pesada fueron divididas, cada una de ellas en dos reacciones como sigue: familias de cadena pesada VH.1,2,3 (cebadores IGVHIa, IGVHIb, IGVH2, IGVH3) y VH.4,5,6,7 (cebadores IGVH4, IGVH5, IGVH6, e IGVH7); familias de cadena kappa VK.1,2,3 (cebadores IGKV1, IGKV2, e IGKV3) y VK.4,5,6 (cebadores IGVK4, IGVK5, e IGVK6); y familias de cadena lambda VL.1,2, 3, 4, 5 (IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, e IGLV5) y VL.6,7,8,9 (cebadores IGLV6, IGLV7, IGLV8, e IGLV9). Se utilizó un protocolo de amplificación de PCR por “touchdown” para el cielado de las temperaturas.
Despues de la reacción, los productos de amplificación de PCR fueron tratados con exonucleasal (Exo) y SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase, fosfatasa alcalina de camarón) a efectos de remover los nucleótidos en exceso y los cebadores de cada una de las reacciones de amplificación de PCR (U.S. Biologicals, Marblehead, MA). Los productos de amplificación de PCR iniciales fueron directamente secuenciados a efectos de determinar las secuencias variables tanto de las cadenas pesadas como de las livianas, mediante el secuenciado de Sanger. Se llevaron a cabo segundas amplificaciones de PCR anidadas para lo cual se utilizaron oligonucleótidos variables de cadena liviana y pesada concordantes en línea germinal a efectos de insertar una señal de mamífero y secuencias de clonación de región constante para lo cual se utilizaron los siguientes cebadores oligonucleótidos. sVH1a: CCACCAT GGGAT GGT CAT GT AT CATCCTTTTT CT AGTAGCAACTGCAACT GGAGT ACATTCACA GG (SEQ ID NO: 81) sVH2: CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACA GATCACCT(SEQ IDNO:82) sVH3vv: CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACA G (SEQ IDNO:83) sVH3gl: CCACC ATGGGAT GGT CAT GTAT CATCCTTTTT CT AGTAGCAACT GCAACT GGAGT ACATT CAGA GG (SEQ ID NO: 84) sVH4: CCACC ATGGGAT GGT CAT GT AT CATCCTTTTT CTAGT AGCAACTGCAACTGGAGTACATT CACA GGTGCAGCTGCAGG (SEQ ID NO: 85) sVH5: CC ACC ATGGG AT GGT C AT GT AT C AT CCTTTTT CT AGT AGC AACT GC AACT GG AGT ACATT CAGA GGTGCA (SEQ ID NO: 86) sVH6: CC ACC AT GGG AT GGT C AT GT AT C AT CCTTTTT CT AGT AGC AACT GC AACTGG AGT AC ATT CACA GGTACAGC (SEQ ID NO: 87) sVH7: CCACCAT GGGAT GGT CAT GT AT CAT CCTTTTT CTAGT AGCAACTGCAACT GGAGT ACATTCACA GGTGCA (SEQ ID NO: 88) sVK1: CCACC ATGGGAT GGT CAT GT AT CAT CCTTTTT CT AGTAGCAACT GCAACTGGAGTACATT CAGA CATCCAGAT GACCCAGTCT CCATCCTCCCT G (SEQ ID NO: 89) sVK2: CCACCAT GGGAT GGT CAT GT AT CAT CCTTTTT CT AGT AGC AACT GCAACTGGAGTACATT CAGA T ATT GT G AT G ACT C AGT CT C ACT CTCCCTGC (SEQ ID NO: 90) SVK3: CCACCAT GGGAT GGT CAT GT AT CATCCTTTTT CT AGT AGCAACT GCAACT GGAGTACATT CAGA AATT GT GTT G AC ACAGT CT CC AGCC ACCCT GT CTTT G (SEQ ID NO: 91) sVK4: CCACC ATGGGAT GGT CAT GT AT CATCCTTTTT CT AGTAGCAACT GCAACT GGAGT ACATT CAGA CATCGT GAT GACCCAGT CTCCAGACT CCCT GGCTGT G (SEQ ID NO: 92) sVK5: CCACC AT GGGAT GGT CAT GTAT CATCCTTTTT CT AGT AGCAACTGCAACT GGAGT AC ATT CAGA AACGACACTCACGCAGTCTCCAGC(SEQ IDNO:93) SVK6: CCACCATGGGAT GGT CAT GT AT CAT CCTTTTT CTAGTAGCAACTGC AACT GGAGTAC ATT CAGA AATT GTGCTG ACT C AGT CT CC AG ACTTT CG (SEQ ID NO: 94) sVL1: CCACCATGGGAT GGT CAT GTAT CATCCTTTTT CT AGT AGCAACT GCAACTGG AGT ACATT CACA GTCTGTG YT G AC KC AGC C RCCCTC (SEQ ID NO: 95) sVL2: CCACC AT GGGAT GGT CAT GTATCATCCTTTTT CT AGT AGCAACTGCAACT GGAGT ACATT CACA GTCTGCCCT GACTCAGCCT (SEQ ID NO: 96) sVL3: CCACCAT GGGAT GGT CAT GTAT CATCCTTTTT CT AGT AGCAACTGCAACTGGAGT ACATT CAT C CTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC (SEQ ID NO: 97) sVL4: CCACC ATGGGATGGT CAT GT AT CATCCTTTTT CT AGT AGCAACT GCAACT GGAGT ACATT CACA GCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(SEQ IDNO:98) sVL5: CCACCATGGGAT GGT CAT GT AT CAT CCTTTTT CT AGT AGCAACTGCAACT GGAGT ACATT CACA GCCT GTGCT GACTCAGCCAACTT C (SEQ ID NO: 99) sVL6: CCACCAT GGGAT GGT CAT GT AT CATCCTTTTT CTAGT AGCAACTGCAACT GGAGT ACATT CAAA TTTT ATGCT GACT CAGCCCCAC (SEQ ID NO: 100) sVL7: CCACCATGGGAT GGT CAT GT ATCATCCTTTTT CT AGT AGCAACTGCAACT GGAGT ACATT CACA GGCT GTGGT GACT CAGGAGCCC (SEQ ID NO: 101) sVL8: CCACC AT GGGAT GGT CAT GT AT C ATCCTTTTT CT AGT AGCAACTGCAACTGGAGTACATT CACA GACTGTGGTGACCCAGGAGCC(SEQ IDNO:102) wVL9: CCACCAT GGGAT GGTCAT GT ATCAT CCTTTTT CT AGTAGCAACTGCAACT GGAGT ACATT CACA GCCTGTGCTGACTCAGCCACC (SEQ ID NO: 103) Heavi constant: GCCAGGGGGAAGACCGATG (SEQ ID NO: 104) Kappa constante: CTGGGAT AGAAGTT ATT CAGCAGGCACACAACAG AAGCAGTT CCAGATTTCAACTGCT C (SEQ ID NO: 105) Lambda constante: CTT G RAGCT CCT C AG AGGAG (SEQ ID NO: 80) Las reacciones de amplificación de PCR fueron establecidas mediante PrimeStar HS DNA Polimerasa con GC (Takara Bio, Shiga, Japón) siguiendose las recomendaciones del fabricante. Después de las elecciones de amplificación de PCR, los productos de amplificación fueron tratados con Exo/SAP como arriba descrito. Los productos de amplificación de PCR que codifican cadena pesada variable y cadena liviana fueron insertados en un vector de expresión de mamíferos para lo cual se utilizaron procedimientos libres de endonucleasa de restricción. 20 mI de los productos de amplificación de PCR fueron tratados térmicamente sobre plantillas humanas de ADN de una sola cadena para cadena kappa y lambda de IgGi, para lo cual se utilizó el protocolo de mutagénesis de Kunkel (Véase Kunkel (1985) PNAS 82:488-492.) Los constructos correctamente insertados fueron confirmados mediante secuenciado de ADN. Los plásmidos que contenían ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y cadenas livianas fueron cotransfectados en células de riñón embriónico humanas 293T para lo cual se utilizó el reactivo de transgen Fugene (Roche Diagnostic, Indianápolis, IN) para la expresión transitoria, y se analizó para establecer la expresión y ligación como se describe en el siguiente Ejemplo 4.
Ejemplo 4. Ensayo de selección ELISA de hemaglutinina La capacidad de cada anticuerpo monoclonal antihemaglutinina anteriormente descrita para ligar diversos subtipos de hemaglutinina fue estudiada mediante ELISA, como sigue. Diversos plásmidos que expresan hemaglutinina fueron transfectados en células 293T como arriba descrito. Los mismos incluían hemaglutinina H1 de H1N1/South Carolina/1918, hemaglutinina H3 de H3N2/Perth/2009, hemaglutinina H5 de H5N1/Viet/2004, y hemaglutinina H7 de H7N7/Países Bajos/2003 de virus de gripe A. Después de dos días, las células fueron lisadas en 50 mM Tris, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% Tritón X-100 más cóctel inhibidor de proteasa (Roche). Los núcleos fueron retirados por centrifugación, y los visados resultantes fueron almacenados a -80°C.
Para la selección por ELISA, unas placas de 384 cavidades (Nunc MaxiSorp) fueron recubiertas con 5 mg/ml de lectina de Galanthus (Sigma) en PBS. Las placas fueron lavadas y seguidamente recubiertas con diluciones de los Usados de células que contenían diversas hemaglutininas expresadas. Las placas fueron lavadas y sometidas a incubación con diversas diluciones de los anticuerpos antihemaglutinina y suficientemente con anticuerpo secundario cabra-antihumano-HRP (Jackson). Las placas fueron lavadas y procesadas para detectar el sustrato de TMB (3,3’,5,5’-tetrametillbenzidina).
Aproximadamente 950 plasmablastos fueron obtenidos a partir de la clasificación de celulas individuales anteriormente descritas en el Ejemplo 2. De los mismos, 840 anticuerpos monoclonales fueron expresados transitoriamente en células 293T y seleccionadas mediante ELISA para su ligación a los subtipos de hemaglutinina H1, H3, H5, y H7, resultando 82 anticuerpos monoclonales que se ligan al virus de gripe A grupo 1 o a la hemaglutinina de grupo 2, y 20 anticuerpos monoclonales que se ligaron a las hemaglutininas del grupo 1 y grupo 2 del virus de gripe A.
Ejemplo 5. Neutralización in vitro del virus de gripe A La capacidad de los anticuerpos antihemaglutinina de la presente invención para suscitar una amplia ligación a subtipos de hemaglutinina y la neutralización de un panel de aislados del virus grupo 1 y grupo 2 de gripe A i n vitro fue examinada como sigue.
Unas células MDCK fueron cultivadas en un medio DMEM complementado con 10% FBS en forma de una única monocapa con una confluencia del 25% en placas para la formación de imágenes de fondo claro de 96 cavidades (Costar 3904). Cada subtipo/cepa de virus de gripe A fue diluido en medio de gripe (DMEM + 0,2% de BSA, 2 mg/ml de tripsina tratada con TPCK) hasta un MOI igual a 1 y sometido a incubación durante una hora a 37 °C con diversas concentraciones (que variaban entre 0,02 nM y 1.600 nM) de cada anticuerpo. Se permitió que cada mezcla de anticuerpo/tiros infectara células de MDCK durante 16 horas a 37 °C en una incubadora con dióxido de carbono 5% antes de la fijación de las células con etanol frío al 100%. Las células fijadas fueron seguidamente teñidas con Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat# H3570) para visualizar los núcleos de las celulas y para determinar la cantidad total de células. Las células fueron también teñidas con un anticuerpo monoclonal ampliamente reactivo (Millipore Cat# MAB8258) específico para la proteína del núcleo de virus de gripe A a efectos de determinar la cantidad de células infectadas.
Las células fueron expuestas a la formación de imágenes mediante el dispositivo Image Express Micro (Molecular Devices), y las imágenes de los datos fueron analizados mediante software MetaXpress 3.1. Se determinó el porcentaje de células infectadas y se gráfico sobre el eje de las Y en función de la concentración de anticuerpos Log 10 sobre el eje de las X. Todos los ensayos de neutralización fueron llevados a cabo por triplicado. Los datos se hicieron concordar mediante una curva de dosis-respuesta de regresión no lineal y se presentan en la Figura 3 como valores IC50 en nM con intervalo de confianza del 95% (Cl 95%.
El subtipo de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de gripe A ha sido indicado en la tabla mostrada en la Figura 3.
Las curvas de de dosis- respuesta de neutralización i n vitro fueron generadas mediante diversas concentraciones de los anticuerpos monoclonales descritos en la presente en función de un amplio panel de cepa de virus grupo 1 y grupo 2 de gripe A. Las Figuras 4A y 4B muestran curvas de neutralización de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) correspondiente a un panel de cepas de virus de gripe A grupo 1 y grupo 2, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) fue efectivo en la neutralización in vitro de todas las cepas de virus de gripe A ensayadas (ver tambien la Figura 3). Además, en las Figura 5A y 5B se muestran curvas de neutralización de mAb 81.39 SVSFI-NYP ("SVSFT revelado como SEQ ID NO: 171) correspondiente a un panel de cepas del virus de gripe A grupo 1 y grupo 2, respectivamente. Tal como se muestra en las Figuras 5A y 5B, mAb 81.39 SVSH-NYP ("SVSFT revelado como SEQ ID NO: 171) fue efectivo para la neutralización in vitro de todas las cepas de virus de gripe A ensayadas (véase también la Figura 3.) Cuatro anticuerpos antihemaglutinina de la presente invención (específicamente mAb 39.18 B11, mAb 36.89, mAb9.01F3, y mAb23.06C2) fueron efectivos en la neutralización in vitro de la cepas del virus A de sea el grupo 1 sea el grupo 2, pero no de ambas. Específicamente, mAb 39.18 B11 fue efectivo en la naturalización in vitro del PAN del entero del virus de gripe A grupo 1 examinado, pero no fue capaz de neutralizar las cepas del virus de gripe A del grupo 2. (Ver las Figuras 6 y 3). Inversamente, mAb 36.89, mAb9.01F3, y mAb23.06C2 fueron capaces de neutralizar el poder completo de virus de gripe A del grupo 2, pero no fueron capaces de neutralizar ningún aislado del virus de gripe A del grupo 1 ensayado (Ver las Figuras 7, 8, y 9 que muestran curvas de naturalización in vitro para mAb 36.89, mAb9.01F3, y mAb23.06C2, respectivamente; véase también da Figura 3.) Tomados en su conjunto, estos resultados mostraron que los anticuerpos monoclonales de la presente invención fueron capaces de neutralizar, de una manera función de la dosis, diversos aislados/cepas del virus de gripe A in vitro.
Adicionalmente, estos resultados mostraron que la metodología de enriquecimiento de plasmablastos descrita en la presente tuvo como resultado la identificación de anticuerpos monoclonales capaces de neutralizar cepas del virus de gripe A tanto de grupo 1 como de grupo 2 a partir de solamente 950 plasmablastos aislados.
Tambien se llevaron a cabo estudios de neutralización i n vitro para lo cual se utilizó un virus de pseudotipo diseñado para expresar la hemaglutinina H5 con el objeto de ensayar la eficacia de un anticuerpo de la presente invención para el neutralizar el virus de gripe A H5N1. En particular, se ensayó un virus pseudotipo de VIH portador de la proteína de superficie H5 hemaglutinina para su neutralización con mAb 39.29 NCy1 sobre células 293T como signo. El virus pseudotipo H5 producido mediante cotransfección de células 293T con tres plásmidos: D8.9, FCMV-GFP, y un plásmido que expresa la hemaglutinina H5 del aislado de virus de gripe A H5N1A ietnam/1203/2004. El virus fue purificado mediante ultracentrifugación a través de sacarosa al 20%. Para la infección, el virus pseudotipo fue incubado con diversas cantidades de mAb 39.29 NCv1 antes de su adición a células objetivo 293T cultivadas en placas de 96 cavidades. Después de dos días, se determinó la cantidad de células infectadas mediante el conteo de células positivas a GFP. Se normalizó la infección con respecto a la cantidad de células infectadas con la menor concentración de anticuerpos utilizada. Los resultados se presentan en la Figura 10. Como se muestra en la Figura 10, el mAb 39.29 NCv1 presentó una neutralización in vitro función de la concentración contra el seudotipo de virus que expresa la proteína de superficie hemaglutinina. Estos datos sugieren que los anticuerpos de la presente invención serían efectivos en el tratamiento y prevención de cepas de virus de gripe A H5N1.
Tambien se ensayó un virus de gripe equina para establecer la capacidad de los anticuerpos de la presente invención de presentar una actividad de neutralización in vitro, como sigue: un virus de gripe A H7N7 A/Equino/1 /Prague/56 se hizo pasar sobre células MDCK c hasta que logró un elevado nivel de infectividad. El virus de grupo A H7N7 A/Equino/1 /Prague/56 resultante fue utilizado en ensayos de neutralización (para lo cual se utilizaron métodos anteriormente descritos para mAb 39.29 NCv1) sobre células MDCK. Los resultados de los experimentos se presentan en la Figura 11. Tal como se muestra en la Figura 11, el mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) presentó una neutralización in vitro función de la dosis contra el virus de gripe H7N7 A/Equino/1 /Prague/56 que expresa la proteína de superficie hemaglutinina H7.
Tomados en su conjunto, esos resultados demuestran que los anticuerpos antihemaglutinina de la presente invención presentan una actividad de neutralización, función de la dosis, contra una variación de cepas de virus de gripe A. Específicamente, dos anticuerpos antihemaglutinina (mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) y mAb 81.39 SVSH-NYP ("SVSH" revelado como SEQ ID NO: 171)) fueron efectivos para neutralizar la totalidad de cepas de gripe A examinadas, inclusive la neutralización de las cepas de virus de gripe A del grupo 1 (A/CA/7/2009, A/Brisbane/59/2007, A/Solomon/3/2006, A/New Caledonia/20/1999, A/PR/8/1934, y A/Japón/305/1957) y del grupo 2 (A/Victoria/361/2011 , A/Perth/16/2009, A/Brisbane/10/2007, A/Wisconsin/67/2005, A/Victoria/3/1975, A/Port Chalmers/1/1973, A/HK/8/1968, y A/Aichi/2/1968).
Adicionalmente, estos resultados demostraron que los anticuerpos antihemaglutinina de la presente invención (por ejemplo, mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) (Figuras 4A y 4B) y mAb 81.39 SVSH-NYP ("SVSH" revelado como SEQ ID NO: 171) (Figuras 5A y 5B)) fueron efectivos para neutralizar una variedad de diferentes cepas estacionales de virus de grupo A H1N1, cepas de virus de gripe A H3N2, cepas del virus de gripe A H2N2, y cepas de virus de grupo A asociados con la pandemia japonesa de 1957 (A/Japón/305/1957). Estos resultados indicaron que los anticuerpos de la presente invención son efectivos en el tratamiento y prevención y de la infección por el virus de la gripe A estacional y de las cepas del virus de gripe A asociadas con las pandemias de gripe.
Ejemplo 6. Eficacia in vivo de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) en ratones La eficacia in vivo de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) sobre la infección en ratones causada por el virus de gripe A fue evaluada como sigue. Unos ratones DBA/2J (Jackson Lab, Bar Harbor, ME) fueron infectados intranasalmente con 50 ml de diversas cepas del virus de gripe S diluidas en medio de gripe (DMEM, 0,2% de BSA, 2 mg/mL de tripsina tratada con TPCK) con la dosis mínima LD10o- En esta serie de experimentos se utilizaron cuatro cepas diversas del virus de gripe A que presentaban un intervalo de valores in vitro de IC5o, inclusive: H1N1 A/PR/8/1934 (Genentech; IC50 2,0 nM), utilizado a razón de 40 PFU por ratón; H3N2 A/Hong Kong/1/1968 (ViraPur, San Diego, CA; IC5045.1 nM), utilizado a razón de 3 PFU por ratón; H3N2 A/Port Chalmers/1/1973 (ViraPur, San Diego, CA; IC50 2,2 nM), utilizado a razón de 1,5x104 PFU por ratón; y H3N2 A/Aich i/2/1968 (ViraPur, San Diego, CA; IC50 35 nM), utilizado a razón de 2x102 PFU por ratón. Se permitió a la infección causada por el virus de gripe continuar durante 72 horas antes de una distracción intravenosa de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177).
A las 72 horas despues de la infección por el virus de gripe A. se administraron por vía intravenosa diversas cantidades de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) a las ratones con una dosis de 900 pg/ratón (aproximadamente 45 mg/kg), 300 mg/ratón (aproximadamente 15 mg/kg), y 100 pg/ratón (aproximadamente 5 mg/kg) en 200 ml de PBS. A los animales de control tratados se les administró mAb gD5237 (un anticuerpo monoclonal específico para glicoproteína D del virus de herpes (HSV)) en la máxima dosis equivalente ensayada de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) ( aproximadamente , aproximadamente 45 mg/kg). Los ratones fueron supervisados diariamente en cuanto a su acondicionamiento corporal y supervivencia y también se lo pesó diariamente, hasta 21 días después de la infección. Todos las dosis de mAb39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) dosis vs. control en la totalidad de las infecciones por cepa del virus de gripe A dieron un valor de Log-rank P<0,01.
Las Figuras 12A, 12B, 12C, y 12D MUESTRAN el porcentaje de supervivencia (a lo largo del tiempo, en días) de los ratones a los que se administraron diversas cantidades de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) a las 72 horas despues de la infección con el virus de gripe A A/PR/8/1934, A/Port Chalmers/1/1973, A/Hong Kong/1/1968, y A/Aich i/2/1968, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 12A, 12B, 12C, y 12D, se observó una mortalidad del 100% al día 14 en los ratones a los que se administró el anticuerpo de control. Sin embargo, los ratones infectados a los que se administró anticuerpo monoclonal de la presente invención mostraron una mayor supervivencia. En particular, se observó una supervivencia del 100% en ratones a los que se infectó con el virus de gripe A/Port Chalmers/1/1973 o el virus de gripe A/Aichi/2/1968 con la totalidad de las dosis de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) ensayadas (Véanse las Figuras 12B y 12D.) Estos resultados mostraron que los anticuerpos monoclonales de la presente invención son efectivos para tratar diversas infecciones causadas por gripe A. Adicionalmente, estos datos muestran que los anticuerpos monoclonales de la presente invención fueron efectivos para tratar la infección causada por el virus de gripe A cuando se los administró hasta por lo menos 72 horas después de la infección con el virus de gripe A.
Ejemplo 7. Eficacia in vivo de mAb 39.29 NCv1 en ratones Para ensayar la eficacia la eficacia in vivo de mAb 39.29 NCv1 en los ratones, se administró el anticuerpo por vía intravenosa a ratones que habían sido infectados con cuatro aislado del virus de gripe A diferentes que presentaban un intervalo de valores de IC5o in vivo. Unos ratones DBA/2J (Jackson Lab, Bar Harbor, ME) fueron infectados intranasalmente con 50 mI de diferentes cepas de virus de gripe A diluidas en medios de gripe (DMEM, 0.2% de BSA, 2 ug/mL de tripsina tratada con TPCK) con la dosis LD100 mínima.
En un conjunto de experimentos, se utilizó el aislado del virus de gripe A H1N1 A/PR/8/1934 a razón de 40 PFU por ratón. A las 72 horas despues de la infección, se administró por vía intravenosa antihemaglutinina mAb 39.29 NCy1 a razón de aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 1,7 mg/kg, o aproximadamente 0,56 mg/kg en 200 ml de PBS porque intravenosa. Los animales tratados con control recibieron mAb gD5237, que es específico para la glicoproteína D de HSV en la máxima dosis equivalente de mAb 39.29 NCv1. Los ratones fueron supervisados para establecer su acondicionamiento corporal y supervivencia, y se los pesó hasta 21 días después de la infección.
Para los ratones infectados con H1N1 A/PR/8/1934, una única dosis intravenosa de mAb 39.29 NCv1 a razón de 15 mg/kg por ratón fue eficaz en comparación con la observada con el anticuerpo IgG de control (véase la Figura 13). Específicamente, se observó una mortalidad del 100% en el grupo de tratamiento del control al día 12, mientras que una única dosis de 15 mg/kg de mAb 39.29 NCv1 salvó el 87,5 % de los ratones infectados, una dosis tres veces más baja de 100 mg por ratón (aproximadamente 5 mg/kg) de Ab 39.29 NCv1 presentó alguna eficacia, por el hecho de poder proteger el 25% de los animales contra exposición mortal, mientras que las dosis de aproximadamente 1 ,7 mg/kg o de aproximadamente 0,56 mg/kg mostró una eficacia mínima más alta de la observada en el grupo de tratamiento de control (vease la Figura 13.) En otro conjunto de experimentos, se examinó con mayor detenimiento la eficacia in vivo de mAb 39.29 NCy1 contra la cepa del virus de gripe A de Flong Kong H3N2 adaptado a ratón (H3N2 A/Hong Kong/1/1968), que es difícil superior que el IC50 in vitro que A/PR8/1934. Como se observó en experimentos anteriores descritos en lo que precede, los ratones tratados con anticuerpo de control después de la infección por virus de gripe A mostraron una mortalidad del 100 % al día 12. (Véase la Figura 14.) Sin embargo, una dosis única de mAb 39.29 NCv1 corazón de aproximadamente 45 mg/kg o de aproximadamente 15 mg/kg fue capaz de proteger el 87,5% y el 75% de los ratones, respectivamente. La dosis eficaz mínima de 15 mg/kg in vivo de mAb 39.29 NCv1 en los modelos de infección por el virus de gripe A tanto de A/PR8/1934 como de A/Hong Kong/1/1968 es muy similar a pesar del contraste observado en los valores de IC50 in vivo con mAb 39.29 NCv1 entre estas dos cepas (véase las Figuras 3 y 14.) Para explorar con mayor detenimiento la eficacia in vivo del mAb 39.29 NCv1 , 60 una titulación de dosis de mAb 39.29 NCv1 contra dos cepas del virus de gripe A adicionales, Port Chalmers (FI3N2 A/Port Chalmers/1/1973) y Aichi (FI3N2 A/Aichi/2/1968). El mAb 39.29 NCv1 tiene un IC50 in vitro contra Port Chalmers de 2,9 nM, que es muy similar al del A/PR8/1934, mientras que Aichi tiene un IC50 in vitro de C50 35,0 nM, valor éste más cercano al de A/Flong Kong/1/1968. Como se muestra en las Figuras 15 y 16, se observó una mortalidad del 100% en los animales tratado del control al día 12 y al día 10 para los modelos Port Chalmers y Aichi, respectivamente. El anticuerpo monoclonal 39.29 NCy1 demostró ser muy eficaz contra ambos cepas de virus de gripe A en la totalidad de las dosis ensayadas (por ejemplo, 45 mg/kg, 15 mg/kg, 5 mg/kg, y 1 ,7 mg/kg).
Estos datos indicaron en parte que existía poca correlación entre el IC50 in vitro IC50 de mAb 39.29 NCv1 y la dosis eficaz mínima in vivo. Sin embargo, una dosis única de 15 mg/kg administrada por vía intravenosa a las 72 horas después de la infección fue eficaz en la totalidad de los cuatro modelos de ratón expuestos al virus de gripe A a pesar del intervalo de los valores de IC50 in vitro para estas cepas de virus de gripe A.
Ejemplo 8. Eficacia in vivo de mAb 39.29 y de oseltamivir en infecciones serias por virus de gripe A en ratones Para comparar la eficacia de los anticuerpos antihemaglutinina de la presente invención con la del oseltamivir fosfato (Tamiflu®) en los ratones, se llevaron a cabo los siguientes estudios. Unos ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Hollister, CA) fueron infectados a las 6 semanas de edad intranasalmente con 50 mI de H1N1 A/PR/8/1934 a 100 veces la dosis letal (5X104 PFU/ratón). A las 48 horas después de la infección, se administró anticuerpo antihemaglutinina 39.29 (una mezcla 50:50 de mAb 39.29 D8C2 y mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177)) en forma de una dosis única de aproximadamente 15 mg/kg o de IgG de control en 200 mI de PBS por vía intravenosa. En estos experimentos, se comparó un régimen de dosificación con oseltamivir de 2 mg dosificado dos veces por día (BID) durante cinco días, con una única dosis intravenosa de 300 mg (~15 mg/kg) de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177). Un ensayo de log-rank de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) o de oseltamivir vs. control dio p<0.01 y un ensayo de máxima probabilidad de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) vs. oseltamivir dio p<0.05. (Oseltamivir ( aproximadamente , Tamiflu®) fue provisto por Toronto Research Chemicals, Cat. No.0701000.) Como se muestra en la Figura 17, se observó una mortalidad del 100% en el día 9 en los animales tratados con control-lgG (mAb gD5237). El tratamiento BID de oseltamivir durante 5 días protegió solamente el 37,5% de los ratones contra la letalidad. Sin embargo, una dosis única de 15 mg/kg de la mezcla de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) protegió el 87,5% de los animales infectados contra la exposición letal al virus de la gripe A. (vease la Figura 17.) La dosis completamente eficaz de 15 mg/kg de la mezcla de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) tuvo una mejor performance que el oseltamivir en los ratones severamente infectados con el virus de gripe A.
Estos resultados demostraron que una dosis única de un anticuerpo monoclonal de la presente invención era más efectiva en el tratamiento de la infección por el virus de gripe A que un tratamiento de 5 días con oseltamivir. Ejemplo 9. Eficacia in vivo de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) en ratones con y sin coadministración de oseltamivir La administración de oseltamivir es eficaz para reducir la infección por el virus de gripe A humano si se lo administra dentro de las 48 horas después de iniciado los síntomas. Lamentablemente, el oseltamivir muestra una eficacia mínima en pacientes que han sido sintomáticos durante más de 48 horas. Por lo tanto, se llevaron a cabo los siguientes experimentos para verificar si la administración conjunta o simultánea de un anticuerpo monoclonal de la presente invención y oseltamivir muestran una eficacia mejorada con respecto a cualquiera de los tratamientos individuales. Estos experimentos fueron llevados a cabo utilizando del modelo de infección severa de ratón por gripe anteriormente descrito en el Ejemplo 8. En pocas palabras, unos ratones Balb/C hembra (Charles River Laboratories) fueron infectados con 100 veces la dosis letal (5x104 pfu) de A/PR/8/193472 antes de la administración intravenosa de una dosis única de 100 pg de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) (aproximadamente 6 mg/kg, una dosis subeficaz anteriormente determinada), IgG de control, 2 mg BID de oseltamivir, o una combinación de una dosis única de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) y tratamiento con oseltamivir durante cinco días. Un ensayo de log-rank del tratamiento combinado vs. mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) o de oseltamivir da p<0,01.
Como se previa, los animales tratados con IgG de control presentaron una mortalidad del 100% a los nueve días después de la infección (véase la Figura 9). La mortalidad observada por los animales tratados de control era muy similar a la de los grupos que recibieron solamente oseltamivir o una dosis subeficaz de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177). Sin embargo, la administración conjunta de una dosis subeficaz de mAb 39.29 NWPP ("NWPP" revelado como SEQ ID NO: 177) más oseltamivir declaró significativamente la supervivencia en comparación con la observada en cualquier tratamiento solo, resultando una supervivencia del 87,5% (Véase la Figura 18.) Estos resultados mostraron que se presentó un efecto sinérgida en el tratamiento de la infección por virus de gripe A durante la terapia combinada en la que se utiliza un anticuerpo monoclonal de la presente invención en combinación con oseltamivir, que es un inhibidor de la neuraminidasa.
Ejemplo 10. Los anticuerpos antihemaglutinina de la presente invención tienen una mejor performance que el oseltamivir en un modelo de infección por virus de gripe A H5N1 en los hurones Los modelos hurón de infección por virus de gripe A se utilizan frecuentemente para examinar la eficacia profiláctica y terapéutica de los métodos y composiciones antigripales. Se considera que los hurones son un modelo animal clínicamente relevante para estudiar la infección humana por virus de gripe A (Véase Matsuoka et al., (2009) Current Protocols ¡n Microbiology, Chapter 15, Unit 15G 12.) Para estallar la eficacia in vivo de mAb 39.29 D8C2 y mAb 81.39 B1C1 contra un aislado humano del virus de gripe A H5N1 en los hurones, se llevaron a cabo los siguientes estudios. El estudio de H5N1 sobre los hurones fue llevado a cabo bajo contrato en el Lovelace Respiratory Research Institute (Albuquerque, NM). Unos hurones macho ( Mustela putorius furo) fueron expuestos con una dosis internasal de 1x103 pfu de la cepa de virus de gripe A sumamente virulenta H5N1 AA/ietnam/1203/04 (dosis LD90). Los animales fueron infectados a las 48 o 72 horas antes de recibir anticuerpo por vía intravenosa u oseltamivir (Tamiflu®) mediante cebado oral. Los animales tratados de control recibieron una dosis de 25 mg/kg intravenosa de mAB gD5237, que es un anticuerpo monoclonal específico para la glicoproteína D de HSV. Los animales tratados contra la gripe recibieron una dosis única intravenosa de 25 mg/kg de sea mAb 39.29 D8C2 sea mAb 81.39 B1C1 a las 48 o 72 horas despues de infección por el virus de gripe. Cada grupo de tratamiento con anticuerpo incluía 10 hurones. Los animales tratados con oseltamivir recibieron una dosis oral dos veces por día de 25 mg/kg durante cinco días. Los animales fueron supervisados diariamente para establecer la pérdida de peso, fiebre, y acondicionamiento corporal.
De manera compatible con una infección por H5N1 , la mayoría de los hurones infectados mostraron signos tempranos de enfermedad respiratoria superior a las 48 horas después de la infección. Tal como se preveía con una dosis letal de H5N1, el grupo de tratamiento con anticuerpo del control negativo presentó una mortalidad del 90% a los 14 días después de la inoculación (véanse las Figuras 19A y 19B.) En cambio, los hurones que recibieron una dosis única de mAb 39.29 D8C2 a las 48 o 72 horas después de la infección por virus de gripe mostraron una supervivencia del 80% y 90% (una mortalidad del 20 y del 10% ), respectivamente (Ver la Figura 19A). De manera similar, los hurones que recibieron una dosis única de mAb 81.39 B1C1 sea a las 48 horas sea a las 72 horas después de la infección mostraron una supervivencia del 100% y del 80% (0% y 20% de mortalidad), respectivamente (véase la Figura 19B). Independientemente del momento de la iniciación del tratamiento, los grupos tratados con oseltamivir mostraron una mortalidad del 50%.
Estos resultados mostraron que los anticuerpos antihemaglutinina ampliamente neutralizantes de la presente invención eran altamente protectores en el tratamiento de una infección severa causada por el virus H5N1 de gripe A el los hurones y tuvo mejor comportamiento que el oseltamivir cuando se lo administraba sea las 48 sea a las 72 horas después de la infección con el virus de gripe A.
Ejemplo 11. Cristalización y recolección de datos A efecto de estudiar la base estructural de la reactividad cruzada con hemaglutinina de los anticuerpos de la presente invención, un fragmento de mAb 39.29 NCy1 Fab fue cocristalizado con hemaglutinina H3 recombinante del virus humano de gripe A /Perth/16/2009 como sigue.
Expresión v purificación de proteínas Para entender mejor la base estructural de la neutralización de la hemaglutinina, la estructura cristalina del fragmento mAb 39.29 NCv1 Fab el complejo con hemaglutinina fue determinada como sigue. Un ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de la hemaglutinina Perth H3 (FI3HA, A/Perth/16/2009, los residuos de aminoácidos 25-520 (SEQ ID NO: 226 para la secuencia de aminoácidos de la hemaglutinina H3 de longitud completa (H3HA)) fue donado en vector pACGP67 vector (BD Biosciences) en marco con un sitio de desdoblamiento de trombina (LVPRGS, SEQ ID NO: 106), secuencia “foldón" de trimerización (PGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG, SEQ ID NO: 107), y un rótulo 6xHis C-terminal (SEQ ID NO: 108). Se generó el báculovirus recombinante mediante cotransfección de celulas Sf9 con el vector H3HA-pACGP67 y ADN de báculovirus linealizado (Pharmingen).
Para generar proteína para generar H3HA recombinante, unas células T ríchoplusia ni PRO fueron infectadas con el báculovirus recombinante para lo cual se utilizó un MOI igual a 1 y se cultivó durante 72 horas a 27 °C. Los sobrenadantes fueron tratados con 50 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM de CaCfe, y 1 mM de NiC^ seguido por centrifugación y filtrado. Seguidamente se concentró el medio y se intercambió el tampón con 10 mM Tris, pH 8,0, y 150 mM de NaCI (TBS) que contenía 20 mM de imidazol mediante filtración de flujo tangencial, se capturó la proteína con Ni-agarosa y se eluyó en TBS que contenía 200 mM de imidazol. El rótulo de foldón fue desdoblado durante la noche con trombina, y el y H3HA reconcentrado y sometido a purificación adicional en una columna de exclusión de tamaño Superdex 200 16/60 equilibrada en TBS.
Para generar el complejo de hemaglutinina-Fab, el mAb 39.29 NCy1 Fab (bajo el control del promotor PhoA) fue expresado en E. coli durante la noche a 30°C. Las células fueron pelletizadas por centrifugación a 6.000 revoluciones por minuto durante 15 minutos y lisadas por microfluidización en PBS completado con 25 mM de EDTA y 1 mM de PMSF. Los residuos de las células fueron removidos por centrifugación a 10.000 rpm durante una hora a 4°C. El material sobrenadante resultante se hizo pasar a través de una columna de Proteína G y se eluyó el Fab con ácido acético al 0,58%. La purificación adicional de mAb 39.29 NCv1 Fab de llevar a cabo mediante cromatografía de sefarosa SP para lo cual se utilizó un gradiente de O a 1 M de NaCI en 20 mM de MES, pH 5,5. Para generar el complejo HA/39.29, se incubó el H3HA durante la noche con un exceso de mAb 39.29 NCy1 Fab, seguido por concentración y cromatografía de exclusión de tamaño S200 en TBS para aislar el complejo. El complejo fue concentrado a 10 mg/ml para los ensayos de cristalización.
Cristalización Se encontró una generación de cristales para el complejo H3HA/39.29 NCv1 Fab en 0,1 M tampón fosfato/citrato, pH 4,2, para lo cual se utilizó 40% de PEG 300 como precipitante (condición C6, criba de matriz dispersa JCSG+, Qiagen). Los cristales de calidad de difracción fueron cultivados en última instancia a 19 °C en gotas asentadas que contenían 0,1 ml de proteína y 0,1 mI 0,1 M de fosfato/citrato, pH 4,2, 40% de PEG 300, y 0,7% de 1-butanol. Los cristales fueron críoprotegidos en licor madre seguido por congelación instantánea y almacenamiento en nitrógeno líquido. Se lo conectaron los datos bajo condiciones criorefrigeradas en el Canadian Light Source Beamline CMCF-08ID y se procesó mediante MOSFLM y SCALA. El cristal formaba parte del grupo espacial 1213, y las dimensiones celulares unitarias eran de a=b=c=204,4 y a=b=g=90°. Determinación de la estructura Se obtuvieron fases iniciales mediante reemplazo molecular con PHASER para lo cual se utilizó la estructura de un H3HA (PDB 3SDY) como un modelo de investigación. Subsiguientemente se colocaron las porciones Fe y Fv del Fab por separado mediante el PHASER, y experimentaron rondas iniciales de refinación del cuerpo rígido con Phenix. El modelo experimentó varias rondas iterativas con COOT y tratamiento térmico simulado, coordinado y refinación del factor con Phenix. Se añadieron moléculas de azúcar hallados en los sitios de glicosilación Asn-ligados para lo cual se utilizó el paquete Carboload de Phenix, y se llevaron a cabo rondas finales de refinación mediante REFMAC5. El modelo final fue refinado a 3.1Á con valores de R/Rlibre de 19,9 y 25,9%, respectivamente. Las estadísticas de Ramachandran calculadas mediante probidad Mol indien que el 89,7 % de los residuos se encuentra en regiones favorecidas con 1,1 % de situados fuera. Los contactos fueron analizados mediante el software Protein Interfaces, Surfaces, and Assemblies (PISA), y las figuras estructurales fueron preparadas con PYMOL. Ejemplo 12. Caracterización estructural del epítope 39.29 sobre hemaglutinina H3 Como se describió en lo que precede en el Ejemplo 11 , el fragmento mAb 39.29 NCy1 Fab fue cocristalizado con hemaglutinina H3 recombinante de la cepa de virus humano de gripe A/Perth/16/2009. La zona cristalina del complejo anticuerpo/hemaglutinina se determinó con una resolución de 3,1A. La estructura global de la A/Perth/16/2009 H3 hemaglutinina era similar a la de las estructuras de hemaglutinina previamente determinadas con la excepción de ligeros reordenamientos y desorden en el ligador HA2/hélice 1 /hélice 2. El desorden en estos lugares ha sido visto anteriormente bajo condiciones de cristalización de bajo pH, lo que es compatible con el hecho de que este complejo se cristaliza a pH 4,2 (Ekiert et al., (2011) Science 333:843-850). La estructura cristalina del complejo anticuerpo/HA mostró una única molécula de mAb 39.29 Fab ligada a cada monómero del trímero H3 HA no desdoblado. Tanto los fragmentos de cadena liviana como los de cadena pesada de mAb 39.29 NCv1 Fab está muy bien resueltos en toda su extensión, lo que permite un examen detallado de la interacción de Fv con HA.
El epítope para mAb 39.29 NCv1 resultó estar en la región de tallo de H3 hemaglutinina, aproximadamente sobre la parte superior de la helice A de HA2. Esta región del tallo de hemaglutinina fue inicialmente identificada como epítope ampliamente neutralizante para los virus de gripe A que expresan subtipos de hemaglutinina de grupo 1 (Ekiert etal., (2009) Science 324:246-251; Sui et al., (2009) Nature Structural & Molecular Biology 16:265-273)), y más recientemente como un epítope neutralizante para cepas del virus de gripe A que llevan subtipos de hemaglutinina de grupo 1 y grupo 2 (Corti et al., (2011) Science 333:850-856). El anticuerpo Ab 39.29 NCv1 utiliza extensivamente contactos de cadenas pesadas y medianas para enterrar aproximadamente 175 A2 del área superficial del tallo de hemaglutinina. La cadena pesada de mAb 39.29 NCv1 contribuye a ligar ampliamente a través de un bucle hidrofobia extendido CDRH3 que se inserta en una ranura no polar poco profunda adyacente a la hélice A de HA2 y por debajo de un sitio de glicosilación de hemaglutinina de grupo 2 conservado en Asn54. Este bucle de CDRH3 prolonga la cadena lateral de Phe99 de manera que tuve con la hemaglutinina H3 Thr334, Ile390, y Ile393, además de hacer contactos polares de cadena principal con el GIcNAc fijado a H3 hemaglutinina Asn54. El bucle de CDRH3 de mAb 39.29 NCv1 también efectúa un giro b en Gly100, que es probablemente estabilizado por contactos de cadena principal entre bucles entre Val98 y llelOOA. llelOOA mira hacia abajo de manera de interactuar con una H3 hemaglutinina conservada Trp366, mientras que Val98 y ProlOOC tambien efectúan contactos de van der Waals con el tallo H3 hemaglutinina. Al residir en la interfaz de cadenas pesada/liviana, ProlOOD y TrplOOE terminan el gran bucle CDRH3 y actúan de manera de anclar el bucle en su lugar.
La cadena liviana de mAb 39.29 NCy1 también contribuye de manera significativa a la interacción con el tallo H3 hemaglutinina, al hacer contactos con el tallo de H3 hemaglutinina con la totalidad de los tres bucles CDR de cadena liviana como también con los residuos de armazón. De los aproximadamente 1.100 A2 y precise enterada de hemaglutinina, aproximadamente el 60% es aportada por la cadena liviana (640A2 vs 480A2 para cadena liviana y cadena pesada, respectivamente). El CDRL1 Asn32 efectúa el enlace de hidrógeno con los residuos Asp391 y ASsn394 de hélice A de H3 HA2, mientras que CDRL1 His31 se apilan contra la cadena lateral Asn376 de H3 aglutinina. Ser52 en el bucle de CDRL2 también efectúa un contacto polar con Asn398. Dentro del bucle de CDRL3, la columna vertebral de Asn93 hace contacto con Asp391 mientras que Trp94 lleva a cabo una infracción de catión-p con Lys384 en la hélice A de HA2. Es interesante observar que mAb 39.29 también lleva a cabo una cantidad de contactos de armazón con hemaglutinina, primariamente por intermedio de acciones de columna vertebral de la repetición SGSGSG (SEQ ID NO: 109) en la hebra beta 6 del lgKV3 con los residuos de aminoácidos 403 a 405 en el polipéptido de H3 hemaglutinina. Ser67 de mAb 39.29 NCv1 también lleva a cabo contactos polares con Asp48 y Thr404 de H3 hemaglutinina.
La totalidad de los tres bucles CDR de cadena liviana de mAb 39.89 NCy1 contribuye a la ligación del epítope de tallo H3 HA, lo que representa aproximadamente el 60% del área superficial enterrada. Esta gran dependencia de los contactos de cadena liviana es única entre los anticuerpos ligantes y neutralizantes de los grupo 1 y grupo 2 de hemaglutinina conocidos, en donde la cadena liviana F16v3 del anticuerpo contribuye en solamente el 20% del área superficial enterrada y la cadena liviana CR9114 del anticuerpo no hace contacto con el epítope.
Si bien están estructuralmente conservados, los subtipos de hemaglutinina del grupo 1 y grupo 2 divergen de manera significativa en el nivel de las secuencias de aminoácidos primarias. Para comparar los residuos de contacto de mAb 39.29 NCv1 H3HA con otros subtipos de hemaglutinina, procedimos a alinear la secuencia de aminoácidos H3 de virus de gripe A/Perth/16/2009 con secuencias de aminoácidos de hemaglutinina representativas de otras cepas de virus de gripe: H1HA de A/California/07/2009; H2HA de A/Japón/305/1957; H5HA de A/Vietnam/1203/2004; y H7HA de A/pollo/NSW/1 /1997. La numeración de aminoácidos de H3 hemaglutinina de A/Perth/16/2009 en la estructura cristalina concuerda con la secuencia de hemaglutinina H3 utilizada en la alineación. La alineación de secuencia de hemaglutinina fue generada mediante el uso de W clustal y la secuencia de aminoácidos correspondientes a hemaglutinina H1 de A/California/07/2009, hemaglutinina H2 de A/Japón/305/1957, hemaglutinina H3 de A/Perth/19/2009, hemaglutinina H5 de A/Vietnam/1203/2004, y hemaglutinina H7 de A/pollo/NSW/1 /1997. La estructura cristalina fue utilizada para determinar los residuos del contacto entre el fragmento 39.29 NCy1 Fab y el tallo de hemaglutinina H3.
La alineación ha sido representada en la Figura 20. Los residuos de contacto de hemaglutinina (sombreados en gris) se definen como residuos dentro de 4,5Á de mAb 39.29 NCv1. Cada residuo de aminoácido que tenga una cantidad superior al 50% de su área superficial disponible enterrada por mAb 39.29 NCv1 Fab está marcado con un asterisco.
Se observa un elevado grado de conservación de secuencia entre los residuos de contacto que contribuyen de manera significativa a la ligación de mAb 39.29 NCv1 a este epítope. (Ver Figura 20.) Esta observación sugiere que mAb 39.29 NCv1 liga las moleculas de hemaglutinina de grupo 1 y grupo 2 por intermedio del mismo el epítope de tallo visto en la estructura cristalina anteriormente descrita. Este epítope es similar a un epítope de hemaglutinina identificada para el anticuerpo FI6v3 antihemaglutinina (Corti et al., (2011), supra). Sin embargo, mAb 39.29 NCv1 se liga con respecto al talio de hemaglutinina en una orientación que distinta de la de FI6v3. La comparación de las estructuras 39.29 NCv1, F16v3, y CR9114 en el complejo con HA revela que la totalidad de los tres anticuerpos se liga a un epítope r que incluye la hélice A de HA y grupos no polares adyacentes. Sin embargo, cada uno de los tres anticuerpos tiene una única orientación de ligación; cada cadena pesada está ligada a una posición topográfica similar sobre HA pero estando el posicionamiento de la cadena liviana rotada en aproximadamente 60° (F16v3) o aproximadamente 120° (CR9114) en comparación con 39.29 NCv1. También de manera única con respecto a mAb 39.29 NCy1, en la cadena liviana lgKV3 la repetición SGSGSG (SEQ ID NO: 109) en el armazón de hebra beta 6 hace contacto con H3 HA. Por ello, la estructura 39.29 representa una tercera solución a la ligación de este epítope muy conservado y confirma la importancia de acoplar la hélice A de HA2 para una amplia neutralización del virus de gripe A.
Los datos cristalográficos de mAb 39.29 el complejo con la H3 hemaglutinina de la secta de virus de gripe A humana A/Perth/16/2009 revelaron las siguientes posiciones de contacto: 34, 36, 54, 70, 292, 294, 305, 307, 334, 363, 364, 365, 366, 379, 380, 382, 383, 384, 386, 387, 390, 391, 393, 394, 395, 397, 398, 401, 403, 404, y 405. El anticuerpo FI6v3 mostró las siguientes posiciones de contacto: 334, 352, 356, 363, 364, 365, 366, 381, 383, 384, 386, 387, 388, 390, 391, 393, 394, 397, 398, 401, y 402. Las posiciones de los residuos de aminoácidos corresponden a la H3 hemaglutinina de la cepa de virus de gripe A A/Perth/16/2009 (SEQ ID NO:226). (Ver: Publicación internacional de patentes números WO 2010/010466 y WO 2013/011347; Corti et al. (2011) Science 333:850-856.) Si bien se observa alguna superposición, mAb 39.29 mostró un número de posiciones de contacto dentro de la hemaglutinina mayor que FI6v3.
El hecho de que los CDRs de mAb 39.29 NCv1 y anticuerpo no tienen homología de secuencias y que ambos anticuerpos entran en contacto con un epítope de tallo similar pero no idéntico sugiere que hay varias maneras para que los anticuerpos se liguen al epítope de talio conservado y neutralizan ampliamente los virus de gripe A.
Ejemplo 13. ELISA de Competición Se desarrollaron ensayos de ELISA de competición en los que se utiliza hemaglutinina H1 del virus de gripe A/WSN/1933 y hemaglutinina H3 de virus de gripe A/Hong Kong/8/1968. Se dejó que unas placas de ELISA recubiertas de hemaglutinina se ligaran a anticuerpo de ensayo en diversas concentraciones (eje de las X) antes de la adición de concentraciones saturadas de mAb 39.29 etiquetado con biotina. Si el anticuerpo de ensayo competía por el epítope de hemaglutinina de mAb 39.29, la señal de ELISA de biotina (eje de las Y) disminuía en función del aumento de la concentración del anticuerpo. Los datos de ligación fueron hechos concordar con una curva de dosis - respuesta no lineal a efectos de determinar el valor EC5o dado en nM.
Se biotiniló mAb 39.29 IgG mediante acoplamiento de amina de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (Sulfo-NHS-LC-LC, Pierce, Rockford, IL). La concentración final del compuesto de trabajo del mAb biotinilado era de 13,2 mM. Para determinar la concentración óptima para el uso, el 39,29 biotinilado fue titulado en serie contra H1 hemaglutinina inmovilizada de virus de gripe A A/WSN/1933 y H3 hemaglutinina de virus de gripe A A/Hong Kong/8/1968. Las proteínas hemaglutinina recombinante H1 y H3 fueron diluidas a 2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y dispensadas (100 pl) sobre placas de Nunc Maxisorp de 96 cavidades (Nunc, Rochester, NY). Las placas fue recubierta durante la noche a 4°C, enjuagadas en PBS, y seguidamente bloqueadas durante una hora a temperatura ambiente con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Cada la que recibió seguidamente 100 mI de mAb 39.29 biotinilado diluido en serie con una concentración inicial de 88 nM con ilusiones 1/3 en PBS que contenían 1.0% de BSA y 0.05% de Polysorbate 20 (Sigma-Aldrich). Despues de una incubación de una hora, las placas fueron lavadas y seguidamente incubadas con 100 mI de una dilución 1:5.000 de peroxidasa de rábano picante conjugado con peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina (Caltag Laboratories, Carlsbad, CA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas fueron lavadas y reveladas con 100 mI de sustrato de TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD). Las placas fueron leídas en una lectora de placas SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA.) a O.D. 450 nM. Se determinó que la concentración óptima del mAb biotinilado era de 1 nM.
Diversas concentraciones (eje de las x) de anticuerpos monoclonales 39.18, 36.89, 81.39 39.29, mAb 9 , mAb 23 de la presente invención e IgG de control fueron sometidos a incubación con las placas recubiertas de hemaglutinina durante 30 minutos a temperatura ambiente. La concentración inicial era de 200 nM seguido por soluciones en serie de tres. Se añadió mAb 39.29 biotinilado hasta una concentración final de subsaturación de 1 nM. Después de una incubación durante una hora, las placas fueron lavadas y sometidas a incubación con 100 mI de una dilución 1:5.000 de peroxidasa de rábano picante conjugado con estreptavidina durante 45 minutos. Las placas fueron lavadas y seguidamente reveladas con solución de TAMBIÉN. Si el anticuerpo de ensayo competía por el epítope de HA de mAb 39.29, la señal de Elisa de la biotina (eje de las Y) disminuía como una función de la concentración creciente del anticuerpo de ensayo. Los datos de ligación fueron hechos concordar con una curva de dosis respuesta no lineal a efecto de determinar el valor de EC50 dado en nM.
Las Figuras 21 A y 21 B muestran los resultados del análisis de ELISA de competición del análisis de ELISA de los mAbs en cuanto a la ligación a H1HA de A/NWS/1933 (Figura 21 A) o a H3HA de /HK/8/1968 (Figura 21 B). Los resultados mostraron que mAb 39.29, mAb 81.39, mAb 39.18, y mAb 36.89 se ligan, todos ellos, a un epítope de talio de hemaglutinina superpuesto (Figuras 21A y 21 B). Específicamente, mAb 81.39 y mAb 39.18 compiten por la ligación de mAb 39.29 sobre el tallo de hemaglutinina H1 (Figura 21 A), mientras que mAb 81.39 y mAb 36.89 compiten por la ligación con mAb 39.29 para el epítope de tallo identificado sobre la hemaglutinina H3 (Figura 21 B).
Mediante la utilización de ensayos ELISA de competición se estableció que los anticuerpos monoclonales 81.39, 39.18, 36.89, mAb 9, y mAb 23 se ligan al epítope de tallo sumamente conservado de hemaglutinina identificada por el análisis estructural. Específicamente, el mAb 81.39 y el mAb 39.18 compiten por la ligación de mAb 39.29 sobre el tallo de la hemaglutinina H1 del grupo 1. Adicionalmente, mAb 81.39, mAb 36.89, mAb 9, y mAb 23 compiten por la ligación con mAb 39.29 para el epítope de tallo identificado sobre la hemaglutinina H3 del grupo 2. Como se predijo, ya que el mAb 39.18 neutraliza solamente aislados de gripe A del grupo 1, no compite para ligar con el epítope mAb 39.29 sobre la hemaglutinina del grupo 2. De manera similar, mAb 36.89, mAb 9, y mAb 23 solamente neutralizan aislados de gripe A del grupo 2, por lo que no compiten para ligar con mAb 39.29 sobre la hemaglutinina H1 del grupo 1. Los datos resultantes de estos experimentos han sido adicionalmente resumidos en la siguiente Tabla 3.
Tabla 3 EC50 expresado en nM - Indica EC50 >200 nM Análisis estadísticos Se calcularon los datos estadísticos mediante el software JMP versión 9.0.2 (SAS Institute). Los experimentos de supervivencia fueron comparados mediante el ensayo log-rank. Los valores de P <0,05 fueron considerados significativos. Se graficaron las curvas de IC50 y se hicieron los cálculos utilizando el software Graphpad Prism versión 5.0.
Si bien la presente ha sido descrita con algún detalle a título de ilustración y con ejemplos a los fines de claridad de entendimiento, no debe interpretarse que las descripciones y ejemplos tienen por objeto limitar los alcances de la invención. Las revelaciones de la totalidad de la bibliografía de patentes y científica mencionada en la presente se incorporan expresamente en la presente en su totalidad a título de referencia.

Claims (53)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:
1. Un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 191 y 192; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; y (f) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 197, 198 y 199.
2. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 136, 140, 144, 146, 150, 152 y 235.
3. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 134, 138, 142, 148 y 234.
4. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 134, 138, 142, 148 y 234 y la región variable de cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 136, 140, 144, 146, 150, 152 y 235.
5. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 135, 139, 143, 145, 149 y 151.
6. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 133, 137, 141 y 147.
7. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 133, 137, 141 y 147 y la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 135, 139, 143, 145, 149 y 151.
8. Un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; (c) HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 180 y 181; (d) HVR-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 185 y 186; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; y (f) HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 188, 189 y 190.
9. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122, 124, 126, 128, 130 y 132.
10. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 111 y 115.
11. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 111 y 115 y la región variable de cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 113, 117, 119, 122, 124, 126, 128, 130 y 132.
12. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 112, 116, 118, 121, 123, 125, 127, 129 y 131.
13. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 110, 114 y 120.
14. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 110, 114 y 120 y la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 112, 116, 118, 121, 123, 125, 127, 129 y 131.
15. Un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205.
16. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
17. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 154 y 158.
18. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 154 y 158 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
19. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
20. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 153 y 157.
21. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 153 y 157 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
22. Un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211.
23. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
24. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160.
25. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
26. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.
27. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159.
28. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.
29. Un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
30. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
31. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164.
32. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
33. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.
34. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163.
35. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.
36. Un anticuerpo de antihemaglutinina aislado que comprende tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3), en donde: (a) HVR-H1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; (b) HVR-H2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219; (c) HVR-H3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; (d) HVR-L1 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; (e) HVR-L2 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; y (f) HVR-L3 comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
37. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
38. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
39. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y la región variable de cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
40. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.
41. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167.
42. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 y la cadena liviana comprende secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.
43. El anticuerpo de antihemaglutinina aislado de claims 1-42, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.
44. Un método para tratar, inhibir o prevenir infección por virus de la gripe A en un individuo que lo necesita, que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de una composición que comprende el anticuerpo de antihemaglutinina de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-28, tratando, inhibidiendo o previniendo así infección por virus de la gripe A.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 44, que también comprende la administración al individuo de un agente terapéutico adicional.
46. El método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de neuraminidasa, un anticuerpo de antihemaglutinina o un anticuerpo anti-M2.
47. Una composición que comprende el anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-28.
48. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-28 y un portador farmacéuticamente aceptable.
49. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-28.
50. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 49.
51. Un método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 50 de modo de producir el anticuerpo.
52. Uso del anticuerpo de antihemaglutinina de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-28 en la fabricación de un medicamento.
53. El uso de acuerdo con la reivindicación 52, en donde el medicamento es para tratar, inhibir o prevenir una infección por virus de la gripe A.
MX2015005860A 2012-11-13 2013-11-12 Anticuerpos de antihemaglutinina y metodo de uso. MX2015005860A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261725859P 2012-11-13 2012-11-13
PCT/US2013/069567 WO2014078268A2 (en) 2012-11-13 2013-11-12 Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2015005860A true MX2015005860A (es) 2015-08-10

Family

ID=50693943

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2015005860A MX2015005860A (es) 2012-11-13 2013-11-12 Anticuerpos de antihemaglutinina y metodo de uso.
MX2019001026A MX2019001026A (es) 2012-11-13 2015-05-08 Anticuerpos de antihemaglutinina y metodos de uso.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2019001026A MX2019001026A (es) 2012-11-13 2015-05-08 Anticuerpos de antihemaglutinina y metodos de uso.

Country Status (24)

Country Link
US (5) US9284365B2 (es)
EP (2) EP3461501A1 (es)
JP (2) JP6386465B2 (es)
KR (1) KR20150083124A (es)
CN (1) CN104968367B (es)
AR (1) AR093446A1 (es)
AU (1) AU2013345072B2 (es)
BR (1) BR112015010817A8 (es)
CA (1) CA2890669A1 (es)
CL (1) CL2015001266A1 (es)
CR (1) CR20150247A (es)
EA (2) EA201892509A1 (es)
ES (1) ES2701746T3 (es)
HK (1) HK1215856A1 (es)
IL (2) IL238684A0 (es)
MA (1) MA38176A1 (es)
MX (2) MX2015005860A (es)
PE (1) PE20150945A1 (es)
PH (1) PH12015501059A1 (es)
SG (2) SG10201700488QA (es)
TW (2) TWI657095B (es)
UA (1) UA116999C2 (es)
WO (1) WO2014078268A2 (es)
ZA (1) ZA201503403B (es)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3255110B1 (en) 2011-07-08 2022-08-17 Seiko Epson Corporation Photocurable ink composition for ink jet recording and ink jet recording method
WO2014078268A2 (en) * 2012-11-13 2014-05-22 Genentech, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use
KR102501920B1 (ko) 2013-10-02 2023-02-20 메디뮨 엘엘씨 중화 항-인플루엔자 a 항체 및 이의 용도
RU2682049C2 (ru) * 2014-01-27 2019-03-14 Дженентек, Инк. Лечение вируса гриппа а h7n9
CN113563462A (zh) * 2014-07-15 2021-10-29 免疫医疗有限责任公司 中和抗乙型流感抗体及其用途
TWI702229B (zh) 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
WO2016164835A1 (en) * 2015-04-08 2016-10-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Humanized influenza monoclonal antibodies and methods of use thereof
HUE056407T2 (hu) 2015-06-01 2022-02-28 Medimmune Llc Neutralizáló influenzaellenes kötõmolekulák és alkalmazásaik
KR20180101436A (ko) 2016-01-13 2018-09-12 메디뮨 엘엘씨 인플루엔자 a의 치료 방법
WO2017192589A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
JP2020503316A (ja) 2016-12-22 2020-01-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 凍結乾燥ポリペプチドの再構成時間を低減するための方法及び製剤
WO2018170273A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 University Of Washington De novo designed hemagglutinin binding proteins
CN111094335B (zh) * 2017-05-15 2022-08-23 罗切斯特大学 广泛中和的抗流感单克隆抗体及其用途
CN109666070B (zh) * 2017-10-13 2021-02-19 清华大学 单克隆抗体mers-4v2及其编码基因和应用
EA202091563A1 (ru) 2018-01-26 2020-10-08 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Человеческие антитела к гемагглютинину вируса гриппа
WO2020036811A1 (en) * 2018-08-14 2020-02-20 Merck Sharp & Dohme Corp. A virus neutralization assay utilizing imaging cytometry
WO2020093159A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 Mcmaster University Broadly-neutralizing antibody and neuraminidase inhibitor combinations to prevent or treat influenza virus infections
JP2023544143A (ja) * 2020-09-29 2023-10-20 イノベント バイオロジクス（シンガポール）プライベート リミティド 抗クローディン１８．２および抗ｃｄ３二重特異性抗体およびその使用

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5589174A (en) 1992-09-17 1996-12-31 Takara Shuzo Co., Ltd. Anti-human influenza virus antibody
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
FR2817869B1 (fr) 2000-12-07 2005-01-14 Technopharm Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
PL2059532T3 (pl) 2006-09-07 2013-05-31 Crucell Holland Bv Ludzkie cząsteczki wiążące zdolne do neutralizowania wirusa grypy H5N1 i ich zastosowania
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN102046654A (zh) 2007-03-13 2011-05-04 胡马斯有限公司 针对甲型流感病毒h5n1株系的抗体
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
FR2921928B1 (fr) 2007-10-08 2011-03-04 Sanofi Pasteur Anticorps monoclonaux specifiques de l'hemagglutinine du virus grippal
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
US8871207B2 (en) * 2008-07-25 2014-10-28 Humabs, LLC Neutralizing anti-influenza A virus antibodies and uses thereof
WO2010010466A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Institute For Research In Biomedicine Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
US8975378B2 (en) 2008-12-25 2015-03-10 Osaka University Human anti-human influenza virus antibody
US8470327B2 (en) 2009-05-11 2013-06-25 Crucell Holland B.V. Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus H3N2 and uses thereof
CN102791734B (zh) 2010-03-08 2014-10-15 赛特瑞恩股份有限公司 源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体
SI2552485T1 (sl) 2010-03-26 2017-05-31 Pomona Ricerca S.R.L. Imunoglobulini polne dolžine igg izotipa, sposobni prepoznave heteropodtipskega nevtralizacijskega epitopa na hemagglutininskem izvornem področju in njih uporaba kot zdravilo proti gripi
RU2635999C2 (ru) 2010-06-17 2017-11-17 ТРЕЛЛИС БАЙОСАЙЕНС, ЭлЭлСи Антитела, подходящие для пассивной иммунизации против гриппа
JP2013540701A (ja) 2010-08-12 2013-11-07 セラクローン サイエンシーズ， インコーポレイテッド 抗赤血球凝集素抗体組成物およびその使用方法
US9534042B2 (en) * 2010-09-03 2017-01-03 Fujita Health University Influenza virus-neutralizing antibody and screening method therefor
US9832528B2 (en) 2010-10-21 2017-11-28 Sony Corporation System and method for merging network-based content with broadcasted programming content
ES2841899T3 (es) 2011-07-18 2021-07-12 Inst Res Biomedicine Anticuerpos neutralizantes del virus de la influenza A y usos de los mismos
WO2014078268A2 (en) * 2012-11-13 2014-05-22 Genentech, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018108086A (ja) 2018-07-12
UA116999C2 (uk) 2018-06-11
JP2016503413A (ja) 2016-02-04
CN104968367A (zh) 2015-10-07
US20140161822A1 (en) 2014-06-12
SG10201700488QA (en) 2017-02-27
ES2701746T3 (es) 2019-02-25
US9284365B2 (en) 2016-03-15
US20150259400A1 (en) 2015-09-17
JP6538216B2 (ja) 2019-07-03
US9908931B2 (en) 2018-03-06
US20190023770A1 (en) 2019-01-24
US9067979B2 (en) 2015-06-30
AU2013345072A1 (en) 2015-06-04
EP2919813B1 (en) 2018-10-24
TWI613214B (zh) 2018-02-01
IL263320A (en) 2018-12-31
IL238684A0 (en) 2015-06-30
US9598481B2 (en) 2017-03-21
HK1215856A1 (zh) 2016-09-23
SG11201503734UA (en) 2015-06-29
BR112015010817A8 (pt) 2018-01-23
MA38176A1 (fr) 2017-06-30
CL2015001266A1 (es) 2015-08-28
EP2919813A2 (en) 2015-09-23
AU2013345072B2 (en) 2017-12-07
BR112015010817A2 (pt) 2017-11-28
TWI657095B (zh) 2019-04-21
EA201590731A1 (ru) 2015-11-30
KR20150083124A (ko) 2015-07-16
WO2014078268A3 (en) 2014-11-27
JP6386465B2 (ja) 2018-09-05
US20140248286A1 (en) 2014-09-04
CN104968367B (zh) 2018-04-13
US20160168230A1 (en) 2016-06-16
CR20150247A (es) 2015-06-11
TW201420599A (zh) 2014-06-01
TW201829457A (zh) 2018-08-16
PE20150945A1 (es) 2015-06-26
EP3461501A1 (en) 2019-04-03
WO2014078268A2 (en) 2014-05-22
EA201892509A1 (ru) 2019-04-30
ZA201503403B (en) 2016-11-30
MX2019001026A (es) 2023-04-12
WO2014078268A8 (en) 2015-01-22
CA2890669A1 (en) 2014-05-22
AR093446A1 (es) 2015-06-10
PH12015501059A1 (en) 2015-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6538216B2 (ja) 抗ヘマグルチニン抗体及び使用方法
US9745365B2 (en) Anti-influenza B virus hemagglutinin antibodies and methods of use
TWI714805B (zh) 抗登革熱病毒抗體、含有變異Fc區的多肽及使用方法
US9879066B2 (en) Influenza A H7N9 virus therapies
RU2757135C2 (ru) Композиции антител к вич и способы их применения