CN104634897B - 一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物（AGEs）的方法，具体包括对羧甲基赖氨酸（CML)和羧乙基赖氨酸（CEL)）的分析测定。该方法包括采用剑桥滤片捕集卷烟烟气总粒相物后，采用盐酸溶液超声萃取滤片，结合阳离子交换固相萃取柱净化方法和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）进行分析。本发明的特征在于：（1）首次建立卷烟主流烟气中AGEs的检测方法；（2）根据卷烟烟气样品基质的特征，建立了样品前处理方法，不需要衍生化反应，前处理简单高效；（3）该方法灵敏度高、定性准确度好，适用于大批量样品的分析。
Description
技术领域
本发明属于卷烟主流烟气中有害物质分析检测技术研究，具体涉及一种液相色谱-串联质谱法检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物（AGEs）（包括羧甲基赖氨酸（CML）和羧乙基赖氨酸（CEL））的方法。
背景技术
晚期糖基化终末产物（AGEs）是糖和蛋白质或脂肪反应生成，在食品中主要存在于高温加热烹制的食品。当AGEs含量较高时，人体免疫***处于发炎状态，具有促进炎症、心血管疾病、糖尿病和加速衰老等有害作用[1]。目前研究最多的AGEs是羧甲基赖氨酸（CML）和羧乙基赖氨酸（CEL）。AGEs的生成与美拉德反应有一定的关联，是还原糖和蛋白质、脂肪等反应形成的，中间产物为系列的席夫碱化合物和Amadori产物，之后形成更加稳定的AGEs[2]。烟叶富含蛋白质和还原糖类化合物，在调制、陈化、加工以及燃吸过程中，都不同程度地发生美拉德反应，生成多种烟草香味成分。卷烟在燃烧过程中，会发生美拉德反应，具备晚期糖基化终末产物的产生条件。这为烟叶中AGEs的形成提供了潜在可能性。然而，卷烟产品的最终消费形式是吸食烟气。因此，考察卷烟烟气中的AGEs十分必要，目前尚未见报道卷烟烟气中AGEs的分析检测方法。
AGEs的检测方法主要包括酶联免疫法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS)。与其它分析方法相比，LC-MS/MS法灵敏度更高，且二级质谱能更有效地排除假阳性，定性准确度更高，已被广泛用于加工食品中AGEs的检测。由于针对食品样品基质的特殊性，一般首先需对样品进行脱脂、还原、蛋白质沉淀、蛋白质水解等步骤[3]，然后进行固相萃取技术[3]或者衍生化反应[4]以提高检测灵敏度，前处理十分繁琐费时。本发明针对卷烟烟气基质建立了样品前处理方法，并直接采用LC-MS/MS技术进行分析，无需衍生化反应，前处理简单高效。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况、针对卷烟主流烟气中AGEs（包括羧甲基赖氨酸（CML）和羧乙基赖氨酸（CEL））检测而提供的一种LC-MS/MS分析方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，是通过液相色谱-串联质谱法检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物（AGEs）包括羧甲基赖氨酸（CML）和羧乙基赖氨酸（CEL）的方法，其具体步骤包括：
a、样品制备与处理：抽吸卷烟样品，并用剑桥滤片捕集卷烟烟气总粒相物。将抽吸过的滤片加入锥形瓶中，加入一定体积的盐酸溶液及混合氘代内标溶液，进行超声萃取。取部分萃取溶液上样到已活化过的固相萃取柱上，依次用一定体积的盐酸溶液和水淋洗，最后采用一定体积的氨水-甲醇溶液对固相萃取柱进行洗脱。固相萃取过程中液体保持一定的流速。洗脱液采用氮气吹干，然后加入1mL水复溶，取复溶后的溶液到色谱瓶中，进LC-MS/MS仪器分析。
b、样品分析条件：LC-MS/MS分析所用色谱柱为C18液相色谱柱；柱温：30 oC；流动相A：含有0.1%甲酸的水（体积比），流动相B：含有0.1%甲酸的乙腈（体积比）；流速300 μL/min；进样体积10 μL；梯度洗脱条件见表1。
表1：梯度洗脱条件
| 时间（min） | 流动相A （%） | 流动相B（%） |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 5.5 | 0 | 100 |
| 14 | 0 | 100 |
| 14.5 | 100 | 0 |
| 20 | 100 | 0 |
离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：5000V；气帘气压力：30 psi；辅助气1压力：70 psi；辅助气2压力：70 psi；离子源温度：550 oC。各化合物的内标、母离子、子离子、驻留时间、碰撞能量（CE）及去簇电压（DP）参见表2。
表2：各化合物的内标、母离子、子离子、驻留时间、碰撞能量及去簇电压
a 定量离子对
在本发明中，步骤a中所述收集容器为50 mL的具塞磨口锥形瓶；步骤a中所述的抽吸卷烟为4~10支；步骤a中所述的萃取溶液为HCl溶液，浓度范围为0.1M~0.5M，用量范围为20 ~ 60 mL，超声萃取时间范围为15 ~ 60 min；步骤a中取部分萃取溶液体积为15~30mL；步骤a中混合氘代内标为d4-CML和d4-CEL，用量为100µL; 步骤a中固相萃取柱为阳离子交换固相萃取柱，型号为Dikma ProElut PXC (150mg/6mL/30pkg); 步骤a中固相萃取柱活化步骤为依次加入3mL甲醇，3mL0.1M盐酸溶液；步骤a中固相萃取柱淋洗步骤为依次加入3mL0.1M盐酸，3mL水；步骤a中固相萃取柱洗脱液组成为5%氨水-甲醇溶液，洗脱体积为5~10mL；步骤a中固相萃取过程中液体流速为靠重力自然流下；步骤a中氮气吹干采用全自动氮吹浓缩仪，水浴温度为35oC。
在本发明中，步骤b中所述的C18液相色谱柱型号为Agilent Proshell 120 SB-C18 (2.7μm，3.0×150mm)。
本发明在卷烟抽吸采用直线吸烟机按照YC/T29-1996规定的标准条件抽吸，每次实验抽吸4支卷烟。
采用水配制CML、CEL的混合母液、氘代混合内标溶液及标准工作溶液。标准工作溶液含内标d4-CML和d4-CEL浓度均为1 ng/mL。分别对标准工作溶液进行LC-MS/MS分析，并以CML、CEL与内标物峰面积比对浓度比进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线。另外，采用卷烟烟气样品前处理后的溶液为基质，加入标准溶液及氘代混合内标溶液，进行基质配标实验，样品采用LC-MS/MS分析，所得基质配标线性方程如表3所示。从表3可知，两组线性方程的斜率接近，表明本方法中采用氘代内标能有效降低基质效应的影响，可采用溶剂配标进行样品分析。取最低浓度标准工作溶液，10次平行测定，计算标准偏差，3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限，结果见表3。
表3：CML、CEL的溶剂配标和基质配标浓度范围、线性方程、
检测限及定量限
将同一卷烟样品均加入10 ng CML和CEL，一天内进行6次平行测定及分5天测定，测定结果的相对标准偏差（RSD）表示该方法的日内精密度和日间精密度。同时进行加标回收率实验，结果如表4所示。可见，本发明方法实验的精密度好、加标回收率高，适用于大批量样品的分析。
表4 方法的日内精密度、日间精密度及回收率
本发明的有益效果如下：
（1）首次建立了卷烟主流烟气中AGEs（包括CML、CEL）的分析检测方法；（2）本发明中所采用LC-MS/MS法，相比文献中报道的酶联免疫法、LC法及GC-MS法等，灵敏度高，且二级质谱能更有效地排除假阳性，定性准确度更高；（3）根据卷烟烟气样品基质的特征，建立了样品前处理方法，不需要衍生化反应，前处理简单高效。
附图说明
图1为CML的LC-MS/MS多反应监测质谱（MRM）图。
图2为d4-CML的LC-MS/MS多反应监测质谱（MRM）图。
图3为CEL的LC-MS/MS多反应监测质谱（MRM）图。
图4为d4-CEL的LC-MS/MS多反应监测质谱（MRM）图。
具体实施方式
本发明以下将结合实施例作进一步说明：
实施例1
将平衡及筛选后的卷烟按照YC/T29-1996规定的标准条件抽吸，采用剑桥滤片捕集4支卷烟总粒相物。将滤片置于50 mL具塞磨口锥形瓶中，加入100µLd4-CML和d4-CEL溶液，加入30mL0.1M盐酸溶液，超声萃取30min。取15mL萃取溶液上样到Dikma ProElut PXC(150mg/6mL/30pkg) 阳离子交换固相萃取柱上（上样前依次采用3mL甲醇和3mL0.1M盐酸活化），依次采用3mL0.1M盐酸和3mL水淋洗，最后用10mL5%氨水-甲醇溶液洗脱。固相萃取过程中液体靠重力作用自然流下。洗脱液采用氮吹浓缩仪（水浴温度为35oC）吹干，然后加入1mL水复溶，溶液加入色谱瓶中采用LC-MS/MS仪器分析。
实施例2
选取肯塔基参考卷烟3R4F及市售卷烟样品10种，分别按照YC/T 29-1996规定的标准条件抽吸，采用剑桥滤片抽吸4支卷烟总粒相物，然后按照实施例1的所述步骤进行样品处理分析。实验结果为在肯塔基参考卷烟3R4F及10种市售卷烟样品的主流烟气中均未检出CML、CEL。
参考文献
[1] 蔡成岗，张慧，李赫，陆胤等，食品研究与开发，2013,34,280-282.
[2] Vlassara HMD, Striker GMD, Current diabetes reports, 2007, 7(3):235-241.
[3] Hegele J, Buetler T, Delatour T, Analytica Chimica Acta, 2008,617, 85-96.
[4] Hashimoto C, Iwaihara Y, Chen SJ, et.al, Analytical chemistry,2013, 85, 4289-4295。
Claims (6)
1.一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：是通过液相色谱-串联质谱法检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物包括羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的方法，具体步骤包括：
a、样品制备与处理：抽吸卷烟样品，并用剑桥滤片捕集卷烟烟气总粒相物，将抽吸过的滤片加入锥形瓶中，加入20 ~ 60 mL的盐酸溶液及100µL的混合氘代内标溶液，进行超声萃取；取部分萃取溶液上样到已活化过的固相萃取柱上，依次用3mL 0.1M的盐酸溶液和3mL水淋洗，最后采用5~10mL的氨水-甲醇溶液对固相萃取柱进行洗脱，固相萃取过程中液体保持靠重力自然流下的流速，洗脱液采用氮气吹干，然后加入1mL水复溶，取复溶后的溶液到色谱瓶中，进LC-MS/MS仪器分析；
b、样品分析条件：LC-MS/MS分析所用色谱柱为C18液相色谱柱，色谱柱型号为AgilentProshell 120 SB-C18 ，规格2.7μm，3.0×150mm；柱温：30 oC；流动相A：含有0.1%甲酸的水，流动相B：含有0.1%甲酸的乙腈，流速300 μL/min，进样体积10 μL，梯度洗脱； 离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：5000V；气帘气压力：30 psi；辅助气1压力：70 psi；辅助气2压力：70 psi；离子源温度：550oC；
梯度洗脱条件如下：
时间- min 流动相A-% 流动相B-%
0 100 0
5 100 0
5.5 0 100
14 0 100
14.5 100 0
20 100 0。
2.根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：步骤a中所述的抽吸卷烟为4~10支，卷烟抽吸采用直线吸烟机按照YC/T29-1996规定的标准条件抽吸。
3.根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：步骤a中所述的萃取溶液为盐酸溶液，浓度范围为0.1M~0.5M，超声萃取时间范围为15 ~60 min。
4.根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：步骤a中混合氘代内标为d4-羧甲基赖氨酸和d4-羧乙基赖氨酸。
5.根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：步骤a中固相萃取柱为阳离子交换固相萃取柱，型号为Dikma ProElut PXC ，规格150mg/6mL/30pkg，依次加入3mL甲醇，3mL0.1M盐酸溶液进行活化。
6.根据权利要求1所述的检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：步骤a中固相萃取柱洗脱液组成为5%氨水-甲醇溶液。
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